檢測基因組核酸中遺傳異常的測定法的製作方法

2023-12-01 08:47:31

專利名稱：檢測基因組核酸中遺傳異常的測定法的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因組核酸的檢測。
背景技術：
提供下面的描述來協助讀者理解。提供的信息或引用的參考文獻都不被承認為本 發明的現有技術。遺傳異常例如重複、缺失、染色體易位、點突變常常導致病理狀態。一些疾病，諸如癌症，歸因於生命過程中少數細胞中後天獲得的遺傳異常；而在其 它的疾病中，遺傳異常存在於機體的所有細胞中，並且從受孕時就存在。為了檢測遺傳異常，有必要檢測含有異常的基因組核酸。檢測遺傳異常諸如非整 倍性、易位、重複和缺失的方法是本領域熟知的。一種這樣的方法包括細胞遺傳學分析，其 中染色體的中期伸展被染色和顯影。中期染色體顯示出在染色體帶型中顯現的特殊的明暗 染色模式。分子細胞遺傳學方法的發展提供了具有更大靈敏度的測定法。這些技術將DNA雜 交與放射標記的或螢光標記的探針相結合。例如，在螢光原位雜交(FISH)分析中，螢光探 針與中期或分裂間期染色體雜交。然後用螢光顯微鏡檢測雜交的探針。然而，這些方法需 要完整的細胞或完整的或部分完整的細胞核。檢測染色體異常的非原位雜交方法在本領域也是已知的。美國專利公開 2006/0292576描述了通過在固相支持體上雜交、捕獲和檢測基因組DNA來檢測染色體異常 的方法。這種方法利用了對基因組核酸有特異性的兩個探針。一個探針錨定在固相支持體 上，另一個探針是可檢測到地標記的。第一個探針與基因組核酸的雜交將基因組核酸捕獲 在固相支持體上，而來自第二個探針的可檢測標記的信號用於檢測基因組核酸。這種方法 需要通過核酸雜交將基因組核酸捕獲到固相支持體上。一種檢測單核苷酸多態性的方法是通過動力等位特異性雜交(DASH)。這種方法利 用錯配鹼基對的不穩定性導致的DNA解鏈溫度(Tm)的差異。基因組片段例如通過PCR被擴 增，並粘附在固相支持體上。在結合於雙鏈DNA時發螢光的分子存在的情況下，加入等位基 因特異的寡核苷酸。隨著溫度升高測量強度，直到Tm被確定。突變會導致較預期低的Tm， 從而可以與野生型序列區分開來。另一種檢測單核苷酸多態性的方法是通過微陣列技術。基因組核酸最初被擴增， 然後通過與錨定在固相表面的探針雜交而被捕獲到固相表面上。通過使用帶有可檢測標記 的第二探針的雜交來檢測基因組核酸。發明概述本發明提供了檢測測試樣品中感興趣的基因組核酸的方法，該方法沒有擴增，也 不需要完整的細胞或細胞核。大體上，使基因組核酸與標記的探針雜交並通過與核酸雜交 不同的方式錨定在固相支持體上。通過檢測固相支持體上的雜交複合體中的標記來檢測基 因組核酸。該方法可用於檢測遺傳異常，例如點突變、基因重複或缺失以及染色體易位。該 方法還可用於疾病的診斷或預後。
一方面，本發明提供一種檢測基因組核酸中的靶序列的方法，其如下實施a.將含有靶序列的基因組核酸樣品與對所述靶序列有特異性的探針相接觸，且在 固相支持體上形成包含所述基因組核酸和雜交到所述靶序列的探針的複合體，其中所述探 針含有可檢測標記，所述基因組核酸通過除核酸雜交外的方式被錨定在固相支持體上，且 所述基因組核酸的靶序列還未被擴增；和b.通過檢測標記與固相支持體的關聯(或締合，association)來檢測基因組核酸 中靶序列的存在。另一方面，本發明提供一種檢測基因組核酸中遺傳異常存在或不存在的方法，其 如下實施a.將基因組核酸樣品與對遺傳異常有特異性的探針相接觸，如果在基因組核酸中 存在遺傳異常，則在固相支持體上形成包含基因組核酸和探針的複合體，基因組核酸通過 除核酸雜交外的方式被錨定在固相支持體上，且基因組核酸的靶序列還未被擴增；b.通過檢測標記與固相支持體的關聯來檢測遺傳異常的存在。另一方面，本發明提供一種檢測基因組核酸中遺傳異常的方法，其如下實施a.將含有遺傳異常的基因組核酸樣品與對遺傳異常有特異性的第一探針相接觸， 且在固相支持體上形成包含基因組核酸和第一探針的第一複合體，其中探針含有可檢測標 記，基因組核酸通過除核酸雜交外的方式被錨定在固相支持體上且基因組核酸的靶序列還 未被擴增；b.將基因組核酸樣品與對參考核酸有特異性的第二探針相接觸，且在固相支持體 上形成包含參考核酸和第二探針的第二複合體，其中第二探針含有可檢測標記；和c.通過檢測與第一複合體相關的第一探針的可檢測標記來測量形成的第一複合 體的量，以及通過檢測與第二複合體相關的第二探針的可檢測標記來測量形成的第二複合 體的量；和d.將第一複合體的量與第二複合體的量比較，其中兩個複合體的量的差異指示遺 傳異常。在一個任何上述方面的實施方式中，基因組核酸和參考核酸來自同一樣品。在另 一個任何上述方面的實施方式中，基因組核酸和參考核酸來自不同樣品，其可來自相同或 不同的個體。在另一個實施方式中，用相同的固相支持體測定第一複合體的量和第二複合 體的量，且第一探針和第二探針的可檢測標記是不同的。另一方面，本發明提供一種檢測基因組核酸中遺傳異常的方法，其如下實施a.將含有遺傳異常的基因組核酸樣品與對該遺傳異常有特異性的第一探針相接 觸，且在固相支持體上形成包含基因組核酸和第一探針的第一複合體，其中探針含有可檢 測標記，基因組核酸通過除核酸雜交外的方式被錨定在固相支持體上，且基因組核酸的靶 序列還未被擴增；b.將基因組核酸樣品與對參考核酸有特異性的第二探針相接觸，且在固相支持體 上形成包含參考核酸和第二探針的第二複合體，其中第二探針含有可檢測標記；和c.通過檢測與第一複合體相關的第一探針的可檢測標記來測量形成的第一複合 體的量，和通過檢測與第二複合體相關的第二探針的可檢測標記來測量形成的第二複合體 的量；和
d.獲得第一與第二複合體的量之比；和e.將獲得的比與使用來自參考樣品的基因組核酸而同樣獲得的比進行比較，其中 比值的差異指示遺傳異常。在優選的實施方式中，基因組核酸和參考核酸通過生物素和抗生物素蛋白的相互 作用被錨定在固相支持體上。在另一個優選的實施方式中，固相支持體是珠子。在另一個 優選的實施方式中，用流式細胞術來檢測第一和第二複合體。在本發明的所有方面的優選實施方式中，遺傳異常是點突變、染色體易位、重複或 缺失。在一個實施方式中，本發明提供一種檢測HER-2基因重複的方法。另一方面，本發明提供一種在個體中診斷的方法，其如下實施a.將來自個體的基因組核酸樣品和與對疾病有特異性的核酸序列互補的探針相 接觸，如果基因組核酸含有對疾病有特異性的核酸序列，則在固相支持體上形成包含基因 組核酸和探針的複合體，其中探針含有可檢測標記，基因組核酸通過除核酸雜交外的方式 被錨定在固相支持體上，且基因組核酸的靶序列還未被擴增；和b.通過檢測與支持體相關的可檢測標記的量來測量在固相支持體上形成的複合 體的量；和c.將形成的複合體的量和使用來自在相似條件下檢測的參考樣品的基因組核酸 形成的複合體的量進行比較，其中從所述個體形成的複合體的量與參考樣品相比的差異對 疾病有診斷價值。在一個實施方式中，參考樣品可從假定為沒有疾病的個體獲得。在另一個實施方 式中，參考樣品可從已知患有疾病的個體獲得。在另一個實施方式中，參考樣品從獲得第一 個樣品後的同一個體獲得。在一個實施方式中，該方法可用於測量懷疑患有癌症的個體的 腫瘤負荷。在另一個實施方式中，該方法可用於疾病的預後。基因組核酸可被共價或非共價地錨定在固相支持體上。在本發明的所有方面的一 些實施方式中，基因組核酸可通過「結合對」被非共價地錨定在固相支持體上，在本文「結合 對」是指通過特異性相互作用形成複合體的兩個分子。因此，基因組核酸能通過連接到基因 組核酸的結合對的一個成員與偶聯到固相支持體的結合對的另一個成員之間的相互作用 被捕獲在固相支持體上。在優選的實施方式中，結合對是生物素和抗生物素蛋白，或抗生物素蛋白的變體 例如鏈黴抗生物素和NeutrAvidin 。在其它實施方式中，結合對可以是配體_受體、激素_受體、抗原_抗體。在本發明的所有方面的一些實施方式中，基因組核酸可通過共價連接被錨定在固 相支持體上。在一個實施方式中，基因組核酸與固相支持體的共價連接是通過光活化基團 例如疊氮基、疊氮苯甲醯甲基、4-硝基苯基3-重氮丙酮酸鹽、補骨脂素(psolarens)、補骨 脂素衍生物來完成的。在另一個實施方式中，基因組核酸能通過UV交聯而交聯到各種固相 表面。在另一個實施方式中，基因組核酸可通過使用化學連接體的化學偶聯被錨定在固相 支持體上。在另一個優選的實施方式中，基因組核酸是基因組DNA。在另一個實施方式中，參 考核酸是持家基因或染色體中的單拷貝序列。在本發明的所有方面的一個實施方式中，分別含有基因組核酸和參考核酸的測試
8樣品或參考樣品可從細胞、組織、體液、血漿、血清、尿液、中樞神經系統液體、糞便、膽管、石 蠟包埋的組織、細胞裂解物、組織裂解物等等獲得或在其中得到。測試和參考核酸可從任何 數目的來源通過任何方法獲得。在本發明的所有方面的一個優選的實施方式中，探針可以是寡核苷酸、人工染色 體、片段化人工染色體、基因組DNA、RNA、重組核酸、肽核酸(PNA)、髮夾寡核苷酸或雜環寡 聚體。在一個實施方式中，探針優選是大片段DNA ( > 20kb，包括粘粒、YAC或BAC克隆)。在本發明的所有方面的優選的實施方式中，與探針相關的可檢測標記可以是螢光 團、納米顆粒、同位素、化學發光化合物、酶或半抗原。在本發明的所有方面的優選的實施方式中，可檢測標記可通過標記的試劑被檢測 到。在一個優選的實施方式中，標記的試劑可以是能檢測到與探針相關的標記的標記抗體。 在另一個實施方式中，標記的試劑是能檢測到與探針相關的標記的一抗/ 二抗對，且一抗 或二抗或兩者與可檢測標記相關。在本發明的所有方面的一些實施方式中，錨定到固相支持體的基因組核酸、具有 可檢測標記並雜交到基因組核酸的探針的複合體用流式細胞術來檢測。在本發明的所有方面的一些實施方式中，基因組核酸首先與帶有可檢測標記的探 針在溶液中雜交，然後雜交的複合體可被錨定在固相支持體上。在本發明的所有方面的一些實施方式中，探針可以是至少50個核苷酸長度。在 其它的實施方式中，一個或更多個探針的長度大於約1，000,1, 500,2, 000,2, 500,3, 000、 4，000,5, 000,7, 500、10，000,20, 000,50, 000、100，000 或更多個核苷酸。除非另外說明，本文使用的單數形式「一 (a) 」、「一 (an) 」和「所述(the) 」包括復 數的指示物。因此，例如，提及「一個寡核苷酸」包括多個寡核苷酸分子，提及固相支持體是 指一個或更多個固相支持體，提及標記是指一個或更多個標記，提及探針是指一個或更多 個探針，提及「一個核酸「是指一個或更多個多核苷酸。本文使用的術語「基因組核酸」指細胞中的核酸，它存在於生物體的細胞染色體 (一個或更多個)中，含有編碼該生物體的細胞的各種蛋白質的基因。基因組核酸還指提 供病毒信息的病毒核酸。基因組核酸通常是DNA，也可以是RNA，諸如在mRNA或RNA中，諸 如在一些病毒中。基因組核酸的優選的類型是存在於真核細胞的細胞核中的核酸。基因組 核酸可以是雙鏈或單鏈、或部分雙鏈、或部分單鏈或髮夾分子。基因組核酸可以是完整的或 片段化的(例如用限制性內切酶消化、或用超聲或應用剪切力用本領域已知的方法)。在 某些情況下，基因組核酸可包括來自單個基因的全部或一部分的序列或來自多個基因的序 列、來自一個或更多個染色體的序列或來自細胞所有染色體的序列。眾所周知，基因組核酸 包括基因編碼區、內含子、5'和3'非翻譯區、5'和3'側翼DNA和結構區段諸如端粒和著 絲粒DNA、複製起點和基因間DNA。代表基因組的全部核酸的基因組核酸被稱為「總基因組 核酸」。基因組核酸可通過從細胞提取/純化的方法獲得，這是本領域熟知的。獲得基因 組核酸的細胞可以是正常的細胞或可以是在基因組核酸中含有一個或更多突變例如重複、 缺失、易位和顛換的細胞。基因組核酸可直接從細胞提取或可以是從細胞提取的核酸的拷 貝。從基因組核酸含義中排除的是已經受擴增步驟的基因組核酸，相對於基因組核酸中的 其它核酸序列，所述擴增步驟增加想要檢測的感興趣靶序列的數量。
基因組核酸可以是約10個鹼基、約20個鹼基、約50個鹼基、約100個鹼基、約500 個鹼基、約1，000個鹼基、約2，000個鹼基、2，500個鹼基、約3，000個鹼基、約3，500個鹼 基、約4，000個鹼基、約5，000個鹼基、約7，500個鹼基、約10，000個鹼基、約20，000個鹼 基、約30，000個鹼基、約40，000個鹼基、約50，000個鹼基、約75，000個鹼基、約100，000 個鹼基、約1，000, 000個鹼基、約2，000, 000個鹼基、5，000, 000個鹼基或更多。本文使用的術語「參考核酸」指為了與研究的基因組核酸比較而要被鑑定的核酸。 參考核酸可以是DNA或RNA，天然的或合成的。在一些情況下，參考核酸可含有相對不變的 序列即持家基因或基因座或其它基因，或不預期在變化的條件下(例如正常狀態或疾病狀 態)改變的染色體中的其它序列。參考核酸還可表示正常或野生型狀態中的核酸，即缺少 點突變、易位、缺失或重複。在另一個情況下，參考核酸可表示帶有點突變、易位、缺失或重 復的核酸序列。在一些情況下，研究的基因組核酸和參考核酸可從同一樣品獲得。在其它 的情況下，基因組核酸和參考核酸可從不同樣品獲得。在一些情況下，參考核酸可從與基因 組核酸不同的來源獲得。在一些情況下，參考核酸可從與基因組核酸不同的生物體獲得。術語「靶核酸」和「靶序列」在本文中可互換地使用，指代意圖被鑑定的核酸序列。 靶序列可以是DNA或RNA。「靶序列」可以是基因組核酸。靶序列可包括野生型序列，含有點 突變、缺失或重複的核酸序列，來自單個基因的全部或一部分的序列或來自多個基因的序 列，來自一個或更多個染色體的序列或任何其它的感興趣序列。靶序列可代表特定基因的 可選序列或等位基因。靶序列可以是雙鏈或單鏈、或部分雙鏈、或部分單鏈或髮夾分子。靶 序列可以是約1-5個鹼基、約10個鹼基、約20個鹼基、約50個鹼基、約100個鹼基、約500 個鹼基、約1，000個鹼基、約2，000個鹼基、2，500個鹼基、約3，000個鹼基、約3，500個鹼 基、約4，000個鹼基、約5，000個鹼基、約7，500個鹼基、約10，000個鹼基、約20，000個鹼 基、約30，000個鹼基、約40，000個鹼基、約50，000個鹼基、約75，000個鹼基、約100，000 個鹼基、約1，000, 000個鹼基或更多。除非另外說明，本文使用的「約」表示加或減10%。術語「同一性」和「相同的」指序列之間的同一性程度。可以有部分同一性或完全 同一性。部分相同的序列是與另一個序列少於100%相同的序列。優選地，部分相同的序 列具有至少70%或至少75%、更優選地至少80%或至少85%、最優選地至少90%或至少 95%的總體同一性。在檢測來自可檢測標記的信號來表明基因組核酸在樣品中的存在的上下文中，本 文使用的術語「檢測」不需要該方法提供100%的靈敏度和/或100%的特異性。眾所周知， 「靈敏度」是如果那個人具有基因組核酸序列，則測試是陽性的概率；而「特異性」是如果那 個人不具有基因組核酸序列，則測試是陰性的概率。至少50%的靈敏度是優選的，儘管至 少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %和至少99 %的靈敏度是顯然更優選的。至少50 % 的特異是優選的，儘管至少60%、至少70%、至少80%、至少90%和至少99%的特異性是 顯然更優選的。檢測還包括帶有假陽性和假陰性的測定。假陰性率可以是1%、5%、10%、 15%、20%或甚至更高。假陽性率可以是1%、5%、10%、15%、20%或甚至更高。在基因片段或染色體片段的上下文中，「片段」指至少約10個核苷酸、至少約20個 核苷酸、至少約25個核苷酸、至少約30個核苷酸、至少約40個核苷酸、至少約50個核苷酸、 至少約100個核苷酸、至少約250個核苷酸、至少約500個核苷酸、至少約1，000個核苷酸、
10至少約2，000個核苷酸、至少約5，000個核苷酸、至少約10，000個核苷酸、至少約20，000 個核苷酸、至少約50，000個核苷酸、至少約100，000個核苷酸、至少約500，000個核苷酸、 至少約1，000, 000個核苷酸或更多個核苷酸的核苷酸殘基序列。在某些實施方式中，分離的或純化的分子可為優選的。本文使用的術語「分離的」、 「純化的」或「基本上純化的」指核酸或胺基酸序列分子，它們從其自然環境被去除，是分離 的或單獨的，並且至少60%、優選75%、最優選90%不含與它們天然地相關的其它成分。分 離的分子因此是基本上純化的分子。本文使用的術語「測試樣品」指含有基因組核酸的樣品或用做用於本發明方法的 基因組核酸來源的樣品。本文使用的術語「參考樣品」指含有參考核酸的樣品或用做用於本發明方法的參 考核酸來源的樣品。術語「固相支持體」和「固相表面」在本文可互換地使用，指珠子、微粒、微球、平的 或包含孔或淺的凹陷或凹槽的板、微孔表面、載玻片、玻璃表面、塗層玻璃表面、反應器的表 面、層析柱、膜、過濾器、微晶片、石英、矽石、紙、塑料、硝化纖維素、尼龍、聚丙烯、聚苯乙烯 或其它聚合物等等，它們錨定基因組核酸。本文使用的術語「探針」指能雜交到基因組核酸或參考核酸的至少一部分的物體。 探針可以是寡核苷酸、人工染色體、片段化人工染色體、基因組核酸、片段化基因組核酸、 RNA、重組核酸、片段化重組核酸、肽核酸(PNA)、鎖定核酸、環狀雜環寡聚體或核酸偶聯物。探針可以是約10個鹼基、約20個鹼基、約30個鹼基、約40個鹼基、約50個鹼 基、約75個鹼基、約100個鹼基、約200個鹼基、約300個鹼基、約400個鹼基、約500個鹼 基、約750個鹼基、約1，000個鹼基、約1，500個鹼基、約2，000個鹼基、約2，500個鹼基、 約3，000個鹼基、約3，500個鹼基、約4，000個鹼基、約5，000個鹼基、約7，500個鹼基、約 10，000個鹼基、約15，000個鹼基、約20，000個鹼基、約25，000個鹼基、約30，000個鹼基、約 40，000個鹼基、約50，000個鹼基、約75，000個鹼基、約100，000個鹼基、約500，000個鹼基、 1，000, 000個鹼基、約2，000, 000個鹼基、約5，000, 000個鹼基或更多。長度約1，OOO(Ikb) 至約5，000，000 (5Mb)或更多核苷酸的較長探針可來自含有感興趣的核酸區段的染色體或 人工染色體。在本發明的一個實施方式中，探針優選是大的DNA片段(> 20kb，包括粘粒、 YAC或BAC克隆)。本文使用的術語「可檢測標記」指與探針相關的分子或化合物或一組分子或一組 化合物，它們用於鑑定雜交到基因組核酸或參考核酸的探針。在一些情況下，可檢測標記可被直接地檢測。在其它情況下，可檢測標記可以是結 合對的一部分，它可然後被接著檢測。來自可檢測標記的信號可通過各種方式被檢測，並將 依賴於可檢測標記的性質。檢測可檢測標記的方式的例子包括但並不限於分光鏡的、光化 學的、生物化學的、免疫化學的、電磁的、放射化學的或化學的方式，諸如螢光、化學螢光或 化學發光或任何其它的合適方式。本文使用的術語「雜交」指通過互補鹼基對之間的氫鍵形成，基本上互補的核苷酸 序列(核酸鏈)配對形成雙鏈體或異源雙鏈體。它是兩個互補多核苷酸之間的特異的、即 非隨機的相互作用。雜交和雜交的強度(即核酸之間的連接強度)受諸如核酸之間的互補 程度、所涉及條件的嚴格性和所形成雜交體的Tm的因素的影響。
本文關於多核苷酸(即，核苷酸諸如寡核苷酸或基因組核酸的序列)使用的術語 「互補物」、「互補的」或「互補性」與鹼基配對原則有關。本文使用的核酸序列的互補物指 寡核苷酸，當與核酸序列對齊以便一個序列的5'端與另一個序列的3'端配對時，該寡核 苷酸處在「反向平行關聯」中。例如，序列「5' -A-G-T-3」是與序列「3' -T-C-A-5』」互補 的。在天然的核酸中通常不被發現的某些鹼基可包括在本發明的核酸中，包括例如肌苷和 7-脫氮鳥嘌呤。互補性不需要是完全的，穩定的雙鏈體可含有錯配的鹼基對或不匹配的鹼 基。核酸技術領域的技術人員能經驗性地考慮許多變量來確定雙鏈體穩定性，所述變量包 括例如，寡核苷酸的長度、寡核苷酸的鹼基組成和序列、離子強度和錯配鹼基對的發生率。互補性可以是「部分的」，其中只有核酸鹼基中的一些根據鹼基配對原則是匹配 的。或者，核酸之間可以有「完全的」、「全體的」或「全部的」互補性。本文使用的術語「嚴格性」指溫度、離子強度和其它化合物存在的條件，在這個條 件下進行核酸雜交。在高度嚴格性條件下，核酸鹼基配對將只發生在具有高頻率互補鹼基 序列的核酸之間。本文使用的術語「遺傳異常」指核酸序列與野生型或正常的遺傳序列的偏差。遺 傳異常可反映生物體或其任何部分的完全遺傳互補與該生物體中的所有染色體的正常的 完全遺傳互補相比之間的差別。例如，遺傳異常可包括染色體拷貝數(例如非整倍性)或 其部分(例如缺失、重複、擴增)的改變；或染色體結構的改變(例如易位、點突變)。遺傳 異常可以是遺傳的，即世代相傳；或非遺傳的。遺傳異常可存在於生物體的一些細胞中或該 生物體的所有細胞中。本文使用的術語「非整倍體細胞」或「非整倍性」指在分裂間期具有異常數目的至 少一條染色體的細胞。「試驗值」是通過在含有雜交到可檢測探針的來自測試樣品的基因組核酸的固相 支持體上形成的複合體的量的測定而獲得的。在一個實施方式中，來自測試樣品的基因組 核酸被懷疑具有遺傳異常。在一個實施方式中，試驗值還可通過檢測參考樣品中的同一染 色體或基因序列來獲得。「對照值」是通過在含有雜交到可檢測探針的來自參考樣品的基因組核酸的固相 支持體上形成的複合體的量的測定而獲得的。在一個實施方式中，雜交的靶被懷疑不具有 遺傳異常。在另一個實施方式中，雜交的靶已知具有遺傳異常。在一個實施方式中，測試樣 品和參考樣品是相同的。「參考值」指已被關聯於一些其它特性的值。一組參考值可被用作標準曲線。試驗值或對照值可被表達為複合體的「量」或拷貝數。複合體的量可以是與摻入 的標記的檢測水平(例如螢光強度)相應的單個值或一定範圍的值。例如，一定範圍的值 可用於產生形成的複合體量與一些其它量(例如腫瘤負荷)之間的標準曲線關聯。試驗值或對照值可被表達為一種複合體的量對另一種複合體的量的「相對量」或 「比率」。在本發明方法的某些實施方式中，使用同一靶基因可獲得兩種複合體，其中第二 複合體的量代表歷史值或在平行測定中獲得的值。在其它的實施方式中，使用兩種不同的 基因獲得兩種複合體，第一個是感興趣的基因，第二個是不期望改變的基因(例如持家基 因)。相對的量可以是單個值或一定範圍的值。例如，一定範圍的值可用於產生形成的複合 體的相對量與一些其它量(例如腫瘤負荷)之間的標準曲線關聯。
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術語「等位基因」和「等位基因變體」在本文可互換地使用。等位基因是同一基因 的許多可選形式或序列中的任何一個，該基因佔據染色體上給定的基因座或位置。每個基 因座的單個等位基因從每個親本獨立地遺傳，導致每個基因有兩個等位基因。具有特定基 因的同一等位基因的兩個拷貝的個體在那個基因座是純合的，而具有特定基因的兩個不同 等位基因的個體是雜合的。本文使用的術語「診斷(diagnose) 」或「診斷(diagnosis) 」指通過評價疾病或病 症的體徵和症狀來鑑定或確定生物體或植物中的疾病或狀況或疾病或狀況的原因的行為 或過程。通常，疾病或病症的診斷基於一個或更多個指示疾病的因子和/或症狀的評價。 即，診斷可以基於指示疾病或狀況的存在或不存在的因子的存在、缺乏或量而作出。被認為 指示特定疾病的診斷的每個因子或症狀不需要與特定的疾病唯一相關；即，可能存在可從 診斷因子或症狀推論出的鑑別診斷。同樣，可能有這樣的情況，其中指示特定疾病的因子或 症狀存在於不具有該特定疾病的個體中。本文使用的術語「預後」指臨床狀況或疾病的可能的過程和結果的預測。患者的 預後通常是通過評價疾病的因子或症狀而作出的，該因子或症狀指示疾病的有利或不利的 過程或結果。本文使用的術語「確定預後」指技術人員能預測患者狀況的過程或結果的過程。術 語「預後」不是指100%準確度地預測狀況的過程或結果的能力。而是技術人員會理解，術 語「預後」指某些過程或結果會發生的概率增加；即，與沒有表現給定狀況的那些個體相比， 過程或結果更有可能在表現給定狀況的患者中發生。預後可表示為患者可預期存活的時間 量。可選地，預後可指疾病減輕的可能性或指疾病可預期保持減輕的時間量。預後可以多 種方式表示；例如預後可被表示為患者一年後、五年後、十年後或類似時間後會生存的機會 百分比。可選地，預後可被表示為作為狀況或疾病的結果患者可預期生存的平均年數。患 者的預後可被認為是相對論的表示，許多因素影響最終的結果。例如，對於具有某些狀況的 患者，預後可被適當地表示為狀況可能是可治療的或可治癒的可能性或疾病會減輕的可能 性，而對於具有更嚴重狀況的患者，預後可被更適當地表示為特定時間段的生存可能性。預後經常通過檢查一個或更多個預後因子或指示物來確定。它們是標記物，諸如 特定染色體易位的存在，其在患者(或從患者獲得的樣品)中的存在或量發出給定過程或 結果會發生的概率的信號。技術人員會理解，將預後指示物與不利結果的傾向相關聯可涉 及統計學分析。本文使用的術語「腫瘤負荷」指個體中腫瘤的體積或質量的量。這個量可以在一 個位點，諸如原發性腫瘤，或可以是來自多個位點諸如原發灶和/或轉移灶的總計量。發明詳述本發明提供檢測固相支持體上的未擴增的基因組核酸的方法，其不需要完整的細 胞或細胞核。該方法可用於檢測測試樣品中的遺傳異常，諸如點突變、易位、缺失和重複。該 方法還可用於疾病的診斷或預後。遺傳異常類型、相關的疾病遺傳異常可反映生物體的完全遺傳互補或其任何部分與該生物體中的所有染色 體的正常的完全遺傳互補相比之間的差別。例如，遺傳異常可包括染色體拷貝數(例如非 整倍性)或其部分(例如缺失、重複、擴增)的改變；或染色體結構的改變(例如易位、點突變)。遺傳異常可導致病理狀態。儘管一些疾病諸如癌症歸因於生命過程中少數細胞中後 天獲得的遺傳異常，但術語「遺傳性疾病」最通常地指在身體的所有細胞中存在並且從受孕 起就存在的疾病。遺傳異常可以是遺傳的或非遺傳的。遺傳重複是基因組序列的區域的任何重複。它可作為錯誤發生在同源重組、逆轉 錄轉座事件或整個染色體複製中。基因重複與多種疾病相關聯，諸如一些畸形性骨炎骨肉 瘤的病例與MYC基因的重複相關聯(Sarcoma, vol. 1，no. 3-4，pp. 131-134，1997)，一些乳腺 癌的病例與 HER-2/neu 基因的重複相關聯(Ann Oncol.，12 (suppl 1) :S3_S8，2001)，一些 膀胱腫瘤的病例與c-erb-2基因的重複相關聯(Cancer Res.，55，2422-2430，1995)。缺失(也被稱作基因缺失、缺陷或缺失突變)是遺傳畸變，其中部分染色體或DNA 序列丟失。缺失是遺傳物質的喪失。任何數目的核苷酸都可被缺失，從單個鹼基到染色體 的整個片段。缺失可由減數分裂過程中染色體交換中的錯誤引起。缺失與一組遺傳病相關 聯，包括一些男性不育症的病例和三分之二的迪謝內肌營養不良的病例，5號染色體部分短 臂的缺失導致被稱作貓叫樣哭泣(Cri du chat)的症候群，也被稱為「貓樣哭泣」症候群。染色體「易位」是異源染色體之間的部分互換。它通常是通過受累細胞的細胞遺傳 學或核型分析來檢測的。有兩種主要的類型相互易位，其中全部的染色體物質都被保留； 羅伯遜易位，其中一些染色體物質丟失。此外，易位可以是平衡的(在沒有額外的或丟失的 遺傳信息的物質均等互換中)或不平衡的(其中染色體物質的互換是不均等的，導致額外 的或丟失的基因)。9號染色體和22號染色體之間的相互易位導致被稱作費城染色體的細胞遺傳學 不同的近端著絲粒染色體。這種易位融合了 22號染色體的BCR基因座和9號染色體的原癌 基因 ABL基因座，形成bcr/abl 致癌蛋白(Tefferi et a 1. Mayo Clin Proc80 (3) :390_402， 2005)。儘管費城染色體最初與CML相關，但是現在它被已知為其它血液病諸如急性淋巴母 細胞白血病(ALL)中預後的指示物。易位已與其它疾病相關。例如，通過11號和16號染色體之間的易位的、16號染 色體的CBP基因與11號染色體的MLL基因的融合已與白血病相關聯(Zhang et al. Genes Chromosomes Cancer 41 (3) :257_65，2004)。相似地，導致 AMLl 和 ETO 基因的融合的 8號和21號染色體之間的易位涉及幾乎15%的急性髓性白血病(AML)病例(Zhang et al. Science 305 1286-9, 2004) 0此外，許多染色體易位已在多種形式的淋巴瘤中被鑑定。 例如，涉及c-myc基因的8號和14號染色體之間的易位被報導存在於大約80-85%的伯基 特淋巴瘤 / 白血病病例中(Vega ct al. Arch Pathol Lab Medl27 :1148_1160，2003)。突變可以是點突變插入或缺失。點突變或置換是引起單個鹼基核苷酸被另一核苷 酸替換的突變類型。插入和缺失包括單個鹼基對的插入或缺失。基因或染色體中的突變常 常與疾病諸如鐮狀細胞性貧血、囊性纖維化、血友病、苯丙酮尿、脊柱裂等相關聯。遺傳變異的診斷包括含有與野生型序列的序列變異的基因組核酸序列的鑑定。在 優選的實施方式中，含有基因組核酸的測試樣品被收集，且基因組核酸的存在被鑑定，其中 基因組核酸的存在或不存在是有診斷價值的。生物樣品收集和製備測試樣品和參考樣品測試樣品和參考樣品分別含有基因組核酸和參考核酸。測 試樣品和參考樣品可以是人類或非人類來源。測試樣品和參考樣品可以從真核或原核生物
14體、或植物、或環境獲得。測試樣品和參考樣品可以是固體、液體、半固體、氣體，帶有或沒有 任何細胞或組織。測試樣品和參考樣品可包括但並不限於羊水、活組織檢查物、血液、血細 胞、骨髓、腦脊液、糞便樣品、排洩物、細針活組織檢查樣品、腹膜液、血漿、胸水、支氣管肺泡 灌洗液、支氣管衝洗液、唾液、精液、血清、痰、眼淚、頰拭子、組織、組織勻漿、冷凍的組織、組 織的石蠟切片、組織培養基、細胞、細胞裂解物、來自培養物的細胞、細胞培養上清、胎兒、胚 胎、尿、微生物、病毒、支原體。在一個實施方式中，測試樣品可以從懷疑患有疾病或具有遺傳異常的個體獲得。 在另一個實施方式中，測試樣品可以從假定未患疾病或沒有遺傳異常的健康個體獲得。樣品收集獲得測試樣品和參考樣品的方法是本領域技術人員熟知的，包括佰並 不限於吸出、組織切片、抽血或抽取其它液體、手術或針刺活組織檢查、石蠟包埋組織的收 集、體液的收集、糞便的收集等等。發明的方法可使用任何類型的含有胚胎或胎兒細胞或核酸體液用於進行產前診 斷。胎兒細胞可通過懷孕女性或從胚胎樣品獲得。因此，胎兒細胞存在於通過羊膜腔穿刺 術獲得的羊水、通過注射器吸出的絨毛膜絨毛、經皮臍帶血、胎兒皮膚活組織檢查、來自四 細胞或八細胞階段胚胎的卵裂球(植入前)、或來自胚泡的滋養外胚層樣品(植入前或通過 子宮灌洗)中。基因組核酸在一個實施方式中，基因組核酸可以是完整的。在另一個實施方式 中，基因組核酸可以是片段化的(例如用限制性內切酶消化的，或用超聲處理或應用剪切 力用本領域已知的方法片段化)。樣品製備核酸(DNA或RNA)可根據本領域技術人員熟知的任何方法從樣品中分 離。需要時，樣品可通過離心等被收集或濃縮。樣品可進行裂解，諸如用酶、加熱、表面活性 劑、超聲破碎或其組合來處理。為了獲得足夠量的核酸，進行裂解處理。樣品可進行液相色 譜來部分地純化基因組核酸。適合的DNA分離方法包括酚氯仿提取。參見Maniatis et al. , Molecular Cloning, ALaboratory Manual,2d, Cold Spring Harbor Laboratory Press, page 16. 54(1989)。很多商品化試劑盒也生產合適的DNA，包括但並不限於QIAamp 小型血 液試齊[J 盒、Agencourt Genfind 、Roche Cobas Roche MagNA Pure 或使用 Eppendorf PhaseLock Gels 的酚氯仿提取。總DNA(例如基因組的、線粒體的、微生物的、病毒的)可使用商業上可買到的試劑 盒例如來自Qiagen的QIAamp DNA和QIAamp DNA Blood小型試劑盒從任何生物樣品諸如全 血、血漿、血清、血沉棕黃層、骨髓、其它的體液、淋巴細胞、培養的細胞、組織和法醫樣本中 純化。病毒RNA可使用商業上可買到的試劑盒例如QIAamp病毒RNA小型試劑盒從全血、血 漿、血清、血沉棕黃層、骨髓、其它的體液、淋巴細胞、培養的細胞、組織和法醫樣本中純化。基因組DNA可使用標準的方法從細胞或組織中分離，參見Sambrook，et al., 1989, Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY。在另一個實施方式中，基因組核酸可以是mRNA或從mRNA產生的cDNA，或可以使 用總RNA。使用標準技術從細胞或組織樣品中分離RNA，參見例如Sambrook，et al.，1989. Molecular Cloning :A Laboratory Manual,Second Edition,Cold SpringHarbor Press,Plainview, NY0此外，分離mRNA和合成cDNA的試劑盒是商業上可買到的，例如來自Qiagen 的 RNeasy Protect Mini i式劑盒、RNeasy Protect Cell Mini i式劑盒。在一個實施方式中，基因組核酸是從石蠟包埋的組織中分離的DNA。從石蠟包埋的 組織中提取DNA的方法是本領域熟知的，例如，收集含有組織的石蠟塊、用二甲苯處理來脫 蠟、用蛋白酶處理以去除蛋白汙染物、然後用酚和氯仿最後提取、接下來乙醇沉澱。可選地， 來自石蠟包埋的組織的DNA可用商業上可買到的試劑盒分離，例如，可使用來自Qiagen的 EZl DNA試劑盒、QIAamp DNA Mini試劑盒從石蠟包埋的組織分離DNA。核酸不需要提取，但是可通過合適的細胞或組織處理諸如美國專利申請 11/566169中描述的那樣被製成可利用的。固相支持體固相支持體可用於通過共價的或非共價的方式錨定基因組核酸。在優選的實施 方式中，固相支持體是珠子。在一些實施方式中，珠子或微粒是基本上相同尺寸的。在其 它的實施方式中，珠子或微粒是一種或更多種尺寸的。在一個實施方式中，珠子或微粒可 以是磁性的。這些珠子或微粒可由例如聚苯乙烯或乳膠組成。珠子或微粒可以是直徑大約 0. 1 μ m-10 μ m或可以是直徑大如50 μ m-100 μ m,但是，較小的和較大的珠子尺寸也是可能 的。在優選的實施方式中，固相表面是鏈黴抗生物素包被的珠子。鏈黴抗生物素包被 的珠子是商業上可買到的，例如來自Bang實驗室(目錄號214、217)、EMDBiosciences (目 錄號 70716-3,70716-4)、來自 Invitrogen Corporation 的 Dynal 珠子(目錄號 658-0ID、 602-10)。在一些實施方式中，固相表面可具有能直接或間接地通過化學連接體共價地連接 基因組核酸的官能團。官能團的例子包括但並不限於聚L賴氨酸、氨基矽烷、環氧矽烷、醛 類、氨基、環氧基、氰基、乙烯基、羥基、硫羥基。核酸在固相支持體上的錨定基因組核酸或參考核酸對固相支持體的錨定可在基因組核酸或參考核酸與帶有 可檢測標記的探針雜交之前、之後或同時進行。核酸可被共價地或非共價地錨定到載體上。非共價地錨定核酸到固相表面的優選方法是通過「結合對」，它在本文是指通過特 異性相互作用形成複合體的兩個分子。因此，核酸可通過與核酸連接的結合對的一個成員 和與固相支持體偶聯的結合對的另一個成員之間的相互作用被捕獲在固相支持體上。在優選的實施方式中。結合對是生物素和抗生物素蛋白、或抗生物素蛋白的變體 諸如鏈黴抗生物素，NeutrAvidin 。固相表面包含鏈黴抗生物素或其變體，且基因組核酸 被修飾以包含生物素。對核酸進行生物素化的方法是本領域已知的(例如，通過用來自 Pierce Chemical Co.的EZ-連接補骨脂素-PEO生物素的光交叉連接，通過使用來自Minis Bio Corp.的 Label IT pArray Biotin Labeling Kit、來自 Pierce Chemical Co.的 PFP Biotin的化學偶聯，通過使用來自Invitrogen公司的BioNick DNA標記系統的切口 平移，或通過使用商業上可買到的試劑盒例如來自Pierce的Biotin 3-末端標記試劑盒的 3'-末端標記)。在其它的實施方式中，結合對包含配體-受體、激素-受體、抗原_抗體。這樣的 結合對的例子包括但並不限於地高辛配基和抗地高辛配基抗體；6-(2，4-二硝基苯基)氨基己酸和抗二硝基苯基抗體；5-溴-dUTP (BrdUTP)和抗BrdUTP抗體；N-乙醯基2-氨基芴 (AAF)和抗AAF抗體。這些情況中的固相表面包含抗體，且基因組核酸被修飾以含有抗原。 將地高辛配基、2，4- 二硝基苯基、5-溴-dUTP基摻入到DNA中的方法可通過切口平移或通 過末端轉移酶反應來實現，其例子在本領域被詳細地記錄或可通過使用商業上可買到的試 劑盒例如來自Roche Applied Sciences的試劑盒DIG DNA標記試劑盒而實現。地高辛配 基可用地高辛配基-NHS-酯化學偶聯到核酸上。N-乙醯基2-氨基芴(AAF)可被共價地偶 聯到基因組核酸上。在另一個實施方式中，基因組核酸可通過使用化學連接體的化學偶聯被共價地錨 定到固相支持體上。如果基因組核酸與表面之間的共價結合是期望的，固相表面將通常是 官能化的或可以被官能化。用於連接的官能團的例子包括但並不限於羧酸、醛、氨基、氰
基、乙烯基、羥基、硫羥基。在一些實施方式中，固相支持體可包被有環氧基、氨基、巰基、聚賴氨酸。包被的 固相支持體是商業上可買到的，例如包被有官能團的珠子可從InvitrogenCorpotation、 BD Biosciences買到；包被有官能團的載玻片可從Pierce、Asper Biotech、Full Moon Biosystems、ThermoFisher 買至丨J。基因組核酸可被修飾以含有官能團。基因組核酸的5'磷酸基可用碳二亞胺交聯 劑EDC (Pierce產品no. 22980)和咪唑偶聯於含伯胺分子。核酸的5'磷酸基可被修飾以 含有胺基，其應用過量的乙二胺並應用碳二亞胺交聯劑EDC(Pierce產品no. 22980)和咪 唑，如在Pierce Technote no. 30中描述的。依賴使用的含有胺的分子，交聯策略能適於以 許多方式直接或間接地修飾、標記或結合基因組核酸。例如，為了產生光活化(隨機-反應 的)的核酸，對-疊氮苯甲醯基醯胼(ABH，PierCe目錄號21510)可用於代替默認反應中的 乙二胺。為了產生巰基_反應性核酸，[N-e-馬來醯亞胺己酸]醯胼、三氟乙酸鹽(EMCH， Pierce目錄號22106)、n-[k_馬來醯亞胺4^一烷酸]醯胼(KMUH，Pierce目錄號22111)、 或4-(4-N-馬來醯亞胺苯基)丁酸醯胼鹽酸鹽(MPBH，Pierce目錄號22305)可用於代替 默認反應中的乙二胺。為了獲得可逆的巰基交聯，3-(2_吡啶基二硫代)丙醯醯胼(PDPH， Pierce目錄號22301)可用於代替乙二胺。這個策略對將基因組核酸連接到含有巰基的固 相支持體上是有用的。為了在基因組核酸上產生巰基，胱胺(nh2-ch2-ch2-s-s-ch2-ch2-nh2) 可被用於代替默認反應中的乙二胺，然後用DTT或相似的試劑還原二硫鍵。這個策略對共 價地偶聯到馬來醯亞胺活化的固相支持體上是有用的。為了將核酸固定到飾以珠子的親和 載體上，UltraLinkHydrazide (Pierce目錄號53149)可用於代替默認反應中的乙二胺。基因組核酸可被酶促修飾以含有官能團諸如氨基，例如通過切口平移或通過末端 轉移酶反應摻入氨基烯丙基dUTP。將多樣的官能團彼此連接的方式是熟知的並且在文獻中被詳細舉例說明。在一個 實施方式中，化學連接體可用於共價地連接兩個官能團，一個在固相支持體上，另一個在基 因組核酸上。化學連接體可以是單官能的、雙官能的、多官能的、異_雙官能的、或異_多官 能的。在優選的實施方式中，化學連接體可具有間隔臂以避免位阻。將氨基偶聯到氨基的 化學連接體的例子包括但並不限於乙二醇雙[琥珀醯亞胺基琥珀酸鹽]、雙琥珀醯亞胺基 辛二酸鹽、1，5- 二氟-2，4- 二硝基苯。將硫羥基偶聯到硫羥基的化學連接體的例子包括但 並不限於1，4_雙-[3' -(2' _吡啶基二硫代)_丙醯胺基]丁烷、二巰代-雙馬來醯亞胺基乙烷。多樣的合適的交聯劑和交聯的方法可購自Pierce。在另一個實施方式中，基因組核酸通過光活化部分被錨定到固相支持體上。在一 個實施方式中，固相表面可錨定能通過光活化作用偶聯基因組核酸的光活化部分。在另一 個實施方式中，基因組核酸的5'磷酸基可被結合到能光交聯到固相表面上的官能團的光 活化基團。在另一個實施方式中，基因組核酸可通過連接體被錨定於固相表面，該連接體具 有兩個或更多個光活化部分，每端有一個或更多個，其中用合適波長的輻射在連接體存在 的情況下暴露固相表面和基因組核酸後，連接體偶聯到固相表面和基因組核酸。光活化部 分的例子包括但並不限於疊氮化物、芳基疊氮化物、疊氮苯甲醯甲基、4-硝基苯基3-重氮 丙酮酸鹽、補骨脂素(psolarens)、補骨脂素衍生物。在另一個實施方式中，基因組核酸可通過暴露固相表面和基因組核酸於紫外輻射 而被交聯到尼龍、硝基纖維素、或尼龍加強的硝基纖維素膜、包被的玻璃表面。核酸交聯結 合到各種表面的方式是熟知的，並且在文獻中被詳細地舉例說明(例如使用Stratagene紫 外交聯劑)。Mt探針能雜交到基因組核酸的至少一部分。在優選的實施方式中，核酸探針來自 BAC Resource Consortium編譯的細菌人工染色體(BACs)的概要提供的一個、幾個或所有 的人類基因組核酸區段。這些探針通常在本領域通過它們的RPI或CTB克隆名被提及，參 見Cheung等，Nature 409 =953-958, 2001 該概要含有人基因組草圖序列中的7，600個 細胞遺傳學定義的界標(參見McPherson等，Nature 409 =934-41, 2001) 這些界標是大 的插入克隆，通過螢光原位雜交繪製到染色體帶上，每個含有定位到基因組序列上的序列 標籤。這些克隆代表所有24條人類染色體，解析度約1Mb。BAC基因組收集的來源包括 BACPAC Resources Center(CH0RI-Children『 s HospitalOakland Research Institute)、 ResGen (Research Genetics，Invitrogen)禾口 The Sanger Center(UK)0探針包括一個可檢測標記或多個可檢測標記。在一個優選的實施方式中，與探針 相關的可檢測標記可直接產生可檢測的信號。在另一個實施方式中，與探針相關的可檢測 標記可使用試劑被間接地檢測，其中該試劑包括可檢測標記，並結合到與探針相關的標記 上。在一個實施方式中，包括可檢測標記的試劑是標記的抗體。在另一個實施方式中，包 括可檢測標記的試劑是一抗/ 二抗對，其中可檢測標記可以在一抗中或在二抗中或在兩者 中。^^核酸鏈之間的互補性的程度對核酸鏈之間的雜交效率和強度具有顯著的影響。這 在依賴核酸之間的結合的檢測方法中具有特別的重要性。在一個實施方式中，探針和基因 組核酸之間的互補性可以是「部分的」，其中核酸鹼基中只有一些根據鹼基配對原則是配對 的。在另一個實施方式中，探針和基因組核酸之間的互補性可以是「完全的」、「全體的」或 「全部的」。為了進行DNA雜交，本發明的方法可結合所有已知的方法和手段及其變化，參見， 例如 Sambrook等，1989，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，Second Edition, Cold Spring Harbor Press，Plainview, NY。基因組核酸和參考核酸和為核酸選擇的探針在雜交條件下相接觸。在本發明的方
18法中的核酸雜交條件是本領域熟知的。例如，雜交條件可以是高嚴格性、中嚴格性或低嚴格 性條件。理想地，核酸將只與樣品中的互補核酸雜交而不會與其它非互補核酸雜交。雜交 條件可以被改變以改變雜交的嚴格性並降低背景信號，這是本領域已知的。例如，如果雜交 條件是高嚴格性條件，核酸將以非常高度的互補性可檢測地結合到核酸靶序列上。低嚴格 性雜交條件會允許帶有一些程度的序列趨異的序列雜交。雜交條件將會依賴生物樣品以及 核酸的類型和序列而變化。本領域的技術人員會知道如何優化雜交條件來實施本發明的方 法。示例性的雜交條件如下。高嚴格性通常指只允許那些在65°C、0.018M NaCl中形 成穩定雜交體的核酸序列雜交的條件。高嚴格性條件可被提供，例如，通過在42°C在50% 甲醯胺、5XDenhardt' s液、5XSSC(檸檬酸鈉鹽水)0. 2% SDS(十二烷基硫酸鈉)中雜 交，接下來在65°C在0. IX SSC和0. 1% SDS中衝洗。中嚴格性指與在42°C在50%甲醯胺、 5XDenhardt' s 液、5XSSC、0. 2% SDS 中雜交，接下來在 65°C在 0. 2XSSC、0. 2% SDS 中衝 洗相等的條件。低嚴格性指與在10%甲醯胺、5XDenhardt' s液、6XSSC、0. 2% SDS中雜 交，接下來在50°C在1 XSSC、0. 2% SDS中衝洗相等的條件。可檢測標記本文使用的術語「可檢測標記」指與探針相關的分子或化合物或一組分子或一組 化合物，它用於鑑定雜交到基因組核酸或參考核酸上的探針。可檢測標記包括但並不限於螢光團、同位素(例如，籲、呷、353、3!1、14(、1251、1311)、電 子緻密試劑(例如，金、銀)、納米顆粒、在ELISA中通常使用的酶(例如，辣根過氧化物酶、 β -半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)、化學發光化合物、比色標記(例如，膠體金)、磁性 標記(例如，Dynabeads )、生物素、地高辛配基、半抗原、可得到其抗血清或單克隆抗體的 蛋白質、配體、激素、能與相應的互補寡核苷酸形成複合體的寡核苷酸。在優選的實施方式中，可檢測標記是螢光團。本文使用的術語「螢光團」指在特定 的波長(激發頻率)吸收光，隨後響應發出不同波長、一般為較長波長(激發頻率)的光的 分子。在一個實施方式中，可檢測標記是緊密接近猝滅劑部分的供體螢光團。合適的螢光部分包括但並不限於單獨或聯合起作用的下列螢光團4_乙醯胺 基-4'-異硫氰酸根合均二苯乙烯_2，2' 二磺酸；吖啶及其衍生物吖啶、吖啶異硫氰酸 鹽；Alexa Fluors =Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 647(分子探針)；5-(2 『-氨 乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS) :4_氨基-N-[3-乙烯磺醯基)苯基]萘二甲醯亞胺_3， 5 二磺酸鹽(Lucifer Yellow VS) ；N-(4_苯胺基萘基)馬來醯亞胺；氨茴內酐醯胺 (anthranilamide) ；Black Hole Quencher (BHQ )染料(biosearch Technologies)； BODIPY染料BODIPY R-6G、BOPIPY 530/550、BODIPY FL ；Brilliant Yellow ；香豆素 及衍生物香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，Coumarin 120)、7_氨基-4-三氟醚甲基 香豆素(Coumarin 151) ；Cy2 、Cy3 、Cy3.5 、Cy5 、Cy5.5 ;焰紅染料(cyanosine)； 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI) ；5'，5〃 - 二溴連苯三酚-磺酞(Bromopyrogallol Red) ；7-二乙氨基-3-(4'-異硫氰酸根合苯基)-4_甲基香豆素；二乙烯三胺五乙酸酯； 4,4' - 二異硫氰酸根合二氫-均二苯乙烯_2，2' -二磺酸；4，4' - 二異硫氰酸根合均二 苯乙烯_2，2' -二磺酸；5-[二甲氨基]萘-1-磺醯氯(DNS，丹磺醯氯)；4-(4' - 二甲氨
19基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL) ；4-二甲氨基苯基偶氮苯基-4'-異硫氰酸酯(DABITC)； Ecl ipse (Epoch Biosciences Inc.)；伊紅及衍生物伊紅、伊紅異硫氰酸酯；赤蘚紅 及衍生物赤蘚紅B、赤蘚紅異硫氰酸酯；二氨乙苯啡啶(ethidium)；螢光素及衍生物 5-羧基螢光素爾六1)、5-(4，6-二氯三嗪-2-基)氨基螢光素(01六朽、2'，V - 二甲氧 基-4' 5' -二氯-6-羧基螢光素(JOE)、螢光素、異硫氰酸螢光素(FITC)、六氯-6-羧 基螢光素(HEX)、QFITC(XRITC)、四氯螢光素(TET)；螢光胺；IR144 ;IR1446 ；鑭發光體 (lanthamide phosphors)；孔雀綠(Malachite Green)異硫氰酸酯；4~甲基傘形酮；鄰甲 酚酞；硝基酪氨酸；副品紅；酚紅(Phenol Red) ；B-藻紅蛋白、R-藻紅蛋白；別藻藍蛋白； 鄰_苯二甲醛；Oregon Green ；碘化丙啶；芘和衍生物芘、芘丁酸鹽、琥珀醯亞胺基1_芘 丁酸鹽；QSY 7 ;QSY 9 ;QSY 21 ;QSY 35(分子探針)Reactive Red 4(Cibacron Brilliant Red3B-A)；羅丹明及衍生物6_羧基-X-羅丹明(ROX)、6_羧基羅丹明(R6G)、麗 絲胺羅丹明B磺醯氯、羅丹明(Rhod)、羅丹明B、羅丹明123、羅丹明綠、羅丹明X異硫氰酸 酯、核黃素、玫紅酸、磺基羅丹明B、磺基羅丹明101、磺基羅丹明101的磺醯氯衍生物(Texas Red)；鋱螯合衍生物；N，N，N' ,N'-四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA)；四甲基羅丹明；四甲 基羅丹明異硫氰酸酯(TRITC)。其它的螢光核苷酸類似物可以被使用，參見，例如，Jameson, Meth. Enzymo 1. 278 363-390，1997 ；Zhu, Nucl. Acids Res. 22 :3418_3422，1994。美國專利第 5，652，099 和 6，268，132號也描述了通過酶或化學合成而結合到核酸，例如DNA和/或RNA或寡核苷酸中 的核苷酸類似物，以產生螢光寡核苷酸。美國專利5，135，717描述了作為螢光標記使用的 酞菁和四苯並三氮雜卟啉試劑。可檢測標記可被摻入到、締合或結合到核酸上。標記可通過具有各種長度的間隔 臂被連接，以減少潛在的位阻或賦予其它有用的或期望的性質。參見，例如，Mansfield, MoI. Cell. Probes 9:145-156,1995。可檢測標記可通過共價的或非共價方式，例如通過轉錄諸如通過使用Klenow聚 合酶的隨機引物標記、或切口平移或擴增或本領域已知的等同方法被摻入到核酸探針中。 例如，核苷酸鹼基被結合到可檢測的部分，諸如螢光染料，例如Cy3 或Cy5 ，然後在核酸合 成或擴增過程中被摻入到核酸探針中。當用與未標記的dCTP混合的Cy3 _或Cy5 -dCTP 結合物合成時，核酸探針可因此被標記。核酸探針可通過使用PCR或切口平移在存在標記的前體核苷酸時被標記。例如， 通過將烯丙胺-dUTP偶聯到螢光染料或半抗原(諸如生物素或地高辛配基)的琥珀醯亞胺 酯衍生物而合成的修飾的核苷酸可被使用；這種方法允許最常見的螢光核苷酸的定製，參 見，例如，Henegariu，Nat. Biotechnol. 18 345-348, 2000 核酸探針可通過本領域已知的非共價方式被標記。例如，Kreatech Biotechnology 的 Universal Linkage System (ULS )提供了非酶促標記技術，其中鉬基 通過結合到鳥苷的N7位置與DNA、RNA或核苷酸形成配位鍵。這種技術還可通過結合到含 有氮和硫的胺基酸側鏈上而用於標記蛋白質。參加，例如，美國專利5，580，990、5，714，327 和5，985，566號及歐洲專利0539466號。用可檢測標記加標記還可包括與另一個生物分子諸如核酸，例如寡核苷酸或以 莖環結構形式作為「分子信標(molecular beacon) 」或「適體信標(aptamer beacon)」的核酸連接的核酸。作為可檢測的部分的分子信標是本領域熟知的；例如，SokoKProc. Natl. Acad. ScL USA 95:11538-11543,1998)合成了「分子信標」報告分子寡脫氧核苷酸， 其在5'和3'端帶有匹配的螢光供體和受體生色團。在缺少互補核酸鏈的情況下，分子 信標保持在莖環構象中，其中螢光共振能量轉移阻止信號釋放。與互補的序列雜交時，莖 環結構打開，增加供體和受體部分之間的物理距離，因此減少螢光共振能量轉移並在信標 被適當波長的光激活時允許可檢測信號被發出。也參見，例如Antony (Biochemistry 40 9387-9395，2001)，其描述了包含形成寡脫氧核苷酸的富含G的18-mer三鏈體的分子信標。 也參見美國專利第6，277，581和6，235，504號。適體信標與分子信標相似；參見，例如，Hamaguchi, Anal. Biochem. 294 :126_131， 2001 ；Poddar, Mol.Cell. Probes 15 161-167,2001 ；Kaboev, Nucl. Acids Res. 28 :E94， 2000。適體信標可採用兩個或更多個構象，其中之一允許配體結合。螢光猝滅對用於報告配 體結合引起的構象改變。也參見，例如Yamamoto，Genes Cells 5 389-396, 2000 ；Smimov, Biochemistry 39 :1462_1468，2000。核酸探針可通過肽被間接地可檢測地標記。肽可通過插入被次級報告分子(例 如，亮氨酸拉鏈對序列、二抗的結合位點、轉錄激活因子多肽、金屬結合結構域、表位標籤) 識別的預定的多肽表位被製成可檢測的。標記還可通過與第一個肽相互作用(例如，S-S締 合)的第二個肽被連接。如本領域的技術人員容易地知曉，含有雜交到標記探針的基因組核酸的複合體的 檢測可通過抗探針標記的標記抗體的使用來實現。在優選的實施方式中，探針用地高辛配 基標記並用螢光標記的抗地高辛配基抗體來檢測。在另一個實施方式中，探針用FITC標記 並用螢光標記的抗FITC抗體來檢測。這些抗體是商業上容易買到的。在另一個實施方式 中，探針用FITC標記並用抗FITC抗體的一抗和標記的抗-抗FITC 二抗來檢測。基因組核酸和探針複合體的檢測摻入到雜交的基因組核酸、探針和固相支持體複合體中的可檢測標記探針的檢測 方法是本領域已知的，並隨著標記的性質而改變。螢光染料通過將標記暴露於由外源諸如白熾燈或雷射提供的一個波長能量的光 子，引起螢光團轉化為激發態而被檢測。螢光團然後在比激發波長長的波長下釋放吸收的 能量，該能量可作為螢光被含有螢光檢測器的標準儀器測量。示例性的螢光儀器包括螢光 分光光度計和小平板讀數器、螢光顯微鏡、螢光掃描儀和流式細胞儀。用於多螢光團的檢測的裝置和方法是本領域熟知的，參見，例如美國專利第 5, 539, 517,6, 049, 380,6, 054, 279,6, 055, 325 和 6, 294, 331 號。任何已知的裝置和方 法或其變化都可用於或適於實施本發明的方法，包括陣列讀數或「掃描」裝置，諸如掃 描和分析多色螢光圖像；參見，例如，美國專利第6，294，331,6, 261,776,6, 252,664、 6，191，425,6，143，495,6，140，044,6，066，459,5，943，129,5，922，617,5，880，473, 5，846，708,5, 790，727號和本文的陣列論述中引用的專利。還參見公開的美國專利申請 第 2001/0018514、2001/0007747 號和公開的國際專利申請第 W0/0146467A、W0/9960163A、 W0/0009650A, W0/0026412A, W0/0042222A, W0/0047600A 和 W0/0101144A 號。電荷耦合器件或CCDs在微陣列掃描系統中使用，包括實施本發明的方法。顏色辨 別也可基於3色CCD視頻影像，這些可通過測量色調值來進行。色調值被引入以便用數字詳細說明顏色。計算是基於相機的分離通道記錄的紅、綠和藍光(RGB)的強度。然而，用於 將RGB值轉換為色調的公式簡化了數據，而且沒有對光的真實的物理性質進行參考。可選 地，光譜成像可被使用；它將光分析為每一波長的強度，這是唯一的量，通過它來正確地描 述光的顏色。此外，光譜成像可提供空間數據，因為它含有圖像中每個像素的光譜信息。可 選地，光譜圖像可使用亮視野顯微鏡製作。參見，例如，美國專利6，294，331號。在優選的實施方式中，使用流式細胞儀檢測雜交的複合體。流式細胞術是本領域 熟知的技術。流式細胞儀水動力地將顆粒(例如，細胞或合成的微粒或珠子)的液體懸液 聚焦成基本上單行的顆粒流，這樣每個顆粒可被單獨分析。流式細胞術能測量與顆粒大小 相關的前向和側向光散射。因此，不同大小的顆粒可同時用在本發明的方法中來檢測不 同的核酸片段。此外，一個或更多波長下的螢光可同時被測量。結果，顆粒可按大小被分 類，且可為每個顆粒分析一個或更多個螢光標記探針的螢光。示例性的流式細胞儀包括 Becton-Dickenson Immunocytometry Systems FACSCAN。等效的流式細胞儀也可在本發明 的方法中使用。在另一個實施方式中，含有錨定到固相支持體並與探針雜交的基因組核酸的複合 體可用表面等離子共振檢測。在本發明所有方面的一些實施方式中，方法適合大的異常，諸如涉及至少50個鹼 基，更優選至少100個鹼基，更優選至少200個鹼基，更優選至少500個鹼基，更優選至少 lkb，更優選至少2kb，更優選至少4kb，更優選至少8kb，以及甚至更優選至少IOkb或更多。 但是，較小的異常——包括至少1個鹼基、至少5個鹼基、至少10個鹼基、至少25個鹼基、 至少25-50個鹼基可通過探針和雜交條件的適當調整被檢測到，這是本領域熟知的。檢測染色體區段或基因的重複或缺失的方法顯示在實施例1-4中。在這些具體實 施例中的感興趣的序列是人HER-2基因。HER-2基因的擴增已被證明與乳腺癌相關。對於 測試實例，基因組DNA從被證明患有乳腺癌的個體的血清中分離出來。對於對照實例，基因 組DNA從證明沒患有乳腺癌的個體中分離出來。基因組DNA被生物素化，並與兩個探針雜 交。一個探針與HER-2基因的區域互補，並用FITC標記。另一個探針與17號染色體特異 的單拷貝序列(17-SSC)區域互補，並用Cy5標記。與兩個探針雜交的生物素化基因組DNA 然後被錨定到商業上可買到的鏈黴抗生物素包被的珠子上。來自HER-2探針的信號通過將 複合體結合到兔抗FITC/山羊抗兔Alcxa-488抗體而進一步加強。流式細胞術被用來檢測 被捕獲到珠子上的雜交複合體。測量從HER-2探針/抗體對和從17-SSC獲得的信號的比 率。將來自測試實例的信號的比率與對照實例相比。較大的比率被認為是HER-2基因的擴
+飽
+曰ο現在將參考下面的非限制實施例更詳細地描述本發明。實施例1基因組核酸的分離和生物素化基因組核酸的分離在本實施例中，基因組核酸是含有來自被證明為乳腺癌的個體或來自沒有乳腺 癌的對照個體的人HER-2基因序列的基因組DNA。DNA從個體的血清中提取，或使用來自 Qiagen的EZl DNA試劑盒從石蠟包埋的組織中分離基因組DNA。基因組DNA是從21個隨機選擇的具有乳腺癌的個體和52個沒有乳腺癌的對照個
22體的血清中獲得的。基因組DNA也從石蠟包埋的組織中被分離出來，基因組DNA是從92個 隨機選擇的具有乳腺癌的石蠟包埋的組織樣品和26個沒有乳腺癌的對照樣品中獲得的。QIAamp MinElute Virus Spin Kit (Qiagen，Valencia，CA)被用來從石賭包埋的組 織(FFPE)中提取DNA。簡要地，用二甲苯/乙醇脫蠟後，FFPE組織切片用蛋白酶K處理、加 熱失活(96°C，10min)，在二氧化矽膜填充的旋轉柱上純化DNA。來自血漿或血清(200 μ 1) 的無細胞循環DNA根據製造廠商的方案在相同的試劑盒上純化。用DpnII在37°C消化基因 組DNA 1小時。通過在65°C熱失活10分鐘來終止消化。分離DNA的牛物素化遵循試劑盒的說明書，使用Biotin-Nick TranslationMix (Roche Applied Science，Basel，瑞士)用生物素-16-dUTP 使 DNA 生物素 化。混合物中生物素-16-dUTP對dTTP的摩爾比率被調整為確保新合成的DNA中的每20-25 個核苷酸都被生物素標記，這為檢測帶來了最高的靈敏度。在典型的切口平移反應中獲得 的標記的片段顯示了 200至500個鹼基對的大小分布。使用標準的切口平移(NT)方案使來自上述步驟的分離的和片段化的DNA生物素 化。含有 ο μ 1 DNA的反應混合物與NT酶、緩衝液和在65°C溫育的生物素-16-dUTP混 合1.5小時。加入0. 5M EDTA來終止反應，混合物在65°C溫育10分鐘。通過在73°C溫育 7分鐘、然後在冰上溫育5分鐘，在變性液(70%的去離子甲醯胺，0.2XSSC)中對基因組 DNA(Iyg)進行變性。可選地，用商業上可買到的試劑盒(例如LabelIT pArray Biotin Labeling Kit)，用生物素直接地標記分離的DNA。實施例2標記的探針和生物素化的靶DNA的雜交與人HER-2基因的區域互補的FITC標記的探針和Cy5標記的17號染色體特異 的單拷貝序列(17-SSC)被用來與從血清或石蠟包埋的組織樣品分離的生物素化的基因組 DNA雜交。17-SSC的序列提供如下5' Cy5-TGTATTTATC CTCTCTCTAG CCATCCATAGC TGTAGCTGGCTCACTCACT 3' (SEQ ID NO 1)探針在Hybrisol VII 雜交液(MP Biomedicals, Solon, OH)中再懸浮，在 37°C溫 育30分鐘，並在73°C變性10分鐘。探針混合物然後在冰上被冷卻5分鐘。然後將變性液 (70%的去離子甲醯胺，0. 2XSSC)加入探針混合物。變性的探針混合物和變性的基因組DNA然後被結合併在37°C溫育過夜。實施例3固相支持體上雜交複合體的捕獲和用流式細胞術檢測含有生物素標記的基因組DNA的雜交複合體被捕獲到鏈黴抗生物素包被的珠子 上。鏈黴抗生物素包被的微球(Bangs Laboratories, Fishers, IN)在結合前連續地用 BlockAid(Invitrogen, Carlsbad, CA)和剪切的鮭精DNA(100 μ g/mL)處理以減少非特異性 結合。用 100 μ 1 結合緩衝液(IOOmM Tris-HCL ；ρΗ 8. 0,0. 1% Tween 20 禾Π IM LiCl)清洗 5μ 1鏈黴抗生物素珠子(Bangs Lab, Fishers, IN) 一次，將其在20 μ 1的結合緩衝液中再 懸浮。5 μ 1探針-DNA複合體被加入到珠子中，且混合物在室溫震蕩下室溫溫育1小時以形
23成珠子-DNA複合體。偶聯的珠子用10%甲醯胺/0. 2 X SSC清洗一次，用0. 2 X SSC清洗2 次。珠子複合體在含有兔抗-FITC抗體(BD Bioscience)的溶液中再懸浮。珠子複合體用 在磷酸鹽緩衝液(PBS)中的2%BSA清洗三次，在4%的封閉奶中再懸浮，並用在PBS中的 2% BSA清洗一次。珠子複合體以1 500稀釋在含有Alexa-488標記的山羊抗兔抗體(BD Bioscience)的溶液中再懸浮，並在暗處室溫旋轉30分鐘。珠子複合體然後用CW_2Cell清 洗器在PBS中的2% BSA清洗一次，以清洗並沉澱珠子。通過使用FITC/Alexa-488染料組合，來自FITC的螢光信號被進一步地放大。來 自珠子上FITC/Alexa-488和Cy5的螢光信號被檢測為每個珠子的螢光改變，如遵循製造廠 商的說明書在流式細胞儀(Canto，BD San Jose, CA)上測量的。使用儀器(Diva)的軟體 (BD, San Jose, CA)，對每個樣品計算至少5000個事件的平均螢光強度(MFI)。實施例4檢測基因組核酸中的遺傳異常的測定結果測量了來自FITC/Alexa-488和Cy-5的信號比率。這個比率代表HER-2 :17_SSC的 比率。基於從對照個體或對照樣品獲得的結果，2. 14(平均值士3SD)的比率被認為是HER-2 基因的擴增。將使用實施例4的方法獲得的結果與FISH、免疫組織化學(IHC)和ELISA方法獲 得的結果進行比較。使用血清樣品，本方法與FISH和IHC的結果之間具有90. 5 %和90 %的一致 性。使用本方法從血清樣品獲得的HER-2水平進一步與用ELISA方法並用12. 3ng/ml血 清作為截斷獲得的HER-2水平相比較。兩種方法的結果之間具有52%的一致性。這種 一致性水平類似於報導的ELISA和IHC/基於細胞的檢測方法l)Kong SY, et al Serum HER-2concentration in patients with primary breast cancer J Clin Pathol 59373-736,2006 ；2)Former MN et al Serum HER_2extracellular domain in metastatic breast cancer patients treated with weekly trastuzumab and paclitaxel association with HER_2status by immunohistochemistry and fluorescence in situ hybridization and with response rate. Ann Oncol 16:234-239,2005。來自乳腺癌患者的石蠟包埋的組織樣品通過實施例4的方法、IHC和常規的FISH 方法檢測。只有IHC 3+或在常規的FISH中樣品與對照的信號比率大於2. 2的樣品才被認 為是HER-2擴增陽性的，而具有IHC 0/1+染色或在常規的FISH中樣品與對照的信號比率 小於1.8的情況被解釋為HER-2擴增陰性。具有IHC 2+的樣品被分類為不確定的(或意 義不明確的)。在檢測的122個病例中，在103例中獲得了來自常規的FISH和實施例4的方法的 匹配的結果。在常規的FISH中比率大於2. 2的四例被發現用實施例4的方法為陰性，而根 據常規的FISH認為是陰性(比率1.8或更小)的15例用實施例4的方法檢測為陽性。總 體上，常規的FISH與實施例4的方法之間的一致性是84. 4% (P < 0. 001)。在檢測的80例中，在63例中獲得了來自IHC和實施例4的方法的匹配的結果。 IHC方法認為HER-2過表達陽性的8例被發現用實施例4的方法為陰性，而IHC方法認為是 陰性的9例被發現用實施例4的方法為陽性。總體上，IHC與實施例4的方法之間的一致 性是 78. 8% (P < 0. 001)。
除非另有定義，本文使用的所有的技術和科學術語具有與本發明所屬領域的普通 技術人員通常理解的意義相同的意義。本文提供的所有核苷酸序列都表示為5'至3'方 向。本文例證性地描述的發明可在缺少本文沒有具體公開的任何一個要素或更多個 要素、一個限制或更多個限制的情況下合適地實施。因此，例如，術語「包含」、「包括」、「含 有」等應被可擴展地閱讀並且沒有限制。此外，本文使用的術語和表述已被作為描述而非限 制性術語使用，使用這樣的術語和表述並不是要排除顯示和描述的這些特徵或其部分的任 何等價物，而是認為，各種修改在本發明要求保護的範圍內是可能的。因此，應理解為儘管本發明已通過優選的實施方式和可選的特徵被具體公開，但 是本文公開的其中體現的本發明的修改、改進和變化可以被本領域的技術人員尋求，而且 這樣的修改、改進和變化被認為是在本發明的範圍之內。這裡提供的材料、方法和實例代表 優選的實施方式，是示例性的，並不是要作為本發明範圍的限制。本發明已在本文中被概括地和一般性地描述。落入本一般性公開的每一較窄的種 類和亞類也形成本發明的一部分。這包括本發明的一般性描述，其帶有從所述種類中去除 任何主題的附加條件或負限定，不管所去除的物質是否在本文中具體陳述。此外，在本發明的特徵或方面針對馬庫什組描述的情況下，本領域的技術人員會 認識到，本發明從而還針對馬庫什組的任何個體成員或亞族成員進行描述。本文提到的所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻都以其全部做為參考明 確地併入，併入的程度與每一個被單獨地做為參考併入相同。在矛盾的情況下，以本說明書 為準，包括定義在內。其它的實施方式在所附權利要求書中提出。
權利要求
檢測基因組核酸中靶序列的方法，包括a.將包含所述靶序列的基因組核酸樣品與對所述靶序列有特異性的探針相接觸，並在固相支持體上形成含有所述基因組核酸和雜交於所述靶序列的所述探針的複合體，其中所述探針包含可檢測標記，所述基因組核酸通過除核酸雜交外的方式被錨定在所述固相支持體上，並且所述基因組核酸的所述靶序列還未被擴增；和b.通過檢測所述標記與所述固相支持體的關聯來檢測所述基因組核酸中所述靶序列的存在。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述固相支持體包含結合對的第一成員，並且所 述基因組核酸包含所述結合對的第二成員，其中所述結合對成員的結合將所述基因組核酸 錨定到所述固相支持體上。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述基因組核酸被共價地錨定到所述固相支持體上。
4.根據權利要求1-3的任一項所述的方法，其中所述固相支持體是珠子、微孔板或玻璃表面。
5.根據權利要求2所述的方法，其中所述結合對是配體_受體、激素_受體或抗原_抗體。
6.根據權利要求2所述的方法，其中所述結合對是生物素和鏈黴抗生物素或鏈黴抗生 物素的變體。
7.根據權利要求1-6的任一項所述的方法，其中所述探針是寡核苷酸、人工染色體、片 段化人工染色體、基因組DNA、RNA或肽核酸。
8.根據權利要求1-7的任一項所述的方法，其中所述的探針的長度是至少50個核苷酸。
9.根據權利要求1-8的任一項所述的方法，其中所述可檢測標記是螢光團、納米顆粒、 同位素、化學發光化合物、酶或半抗原。
10.根據權利要求1-9的任一項所述的方法，其中所述複合體通過流式細胞術在所述 固相支持體上被檢測。
11.根據權利要求1-10的任一項所述的方法，其中所述複合體通過檢測結合到所述探 針的所述可檢測標記的標記試劑被檢測。
12.根據權利要求12所述的方法，其中所述標記試劑是對所述可檢測標記有特異性的 標記抗體。
13.根據權利要求1-12的任一項所述的方法，其中所述基因組核酸存在於測試樣品 中，並且其中所述測試樣品是細胞、組織、體液、糞便、石蠟包埋的組織、細胞裂解物或組織 裂解物。
14.檢測基因組核酸中遺傳變異的存在或不存在的方法，包括a.將基因組核酸樣品與對所述遺傳異常有特異性的探針相接觸，以及如果所述遺傳異 常存在於所述基因組核酸中，則在固相支持體上形成含有所述基因組核酸和所述探針的復 合體，其中所述基因組核酸通過除核酸雜交外的方式被錨定在所述固相支持體上，並且所 述基因組核酸的所述靶序列還未被擴增；b.通過檢測所述標記與所述固相支持體的關聯來檢測所述遺傳異常的存在。2
15.根據權利要求14所述的方法，其中所述遺傳異常是染色體易位，並且所述探針的 第一部分雜交到所述易位的第一條染色體的區域，以及所述探針的第二部分雜交到所述易 位的第二條染色體的區域。
16.根據權利要求14所述的方法，其中所述遺傳異常是與特定的染色體區段或基因相 關的重複或缺失。
17.根據權利要求14-16的任一項所述的方法，其中所述固相支持體包含結合對的第 一成員，並且所述基因組核酸包含所述結合對的第二成員，其中所述結合對成員的結合將 所述基因組核酸錨定到所述固相支持體上。
18.根據權利要求14-16的任一項所述的方法，其中所述基因組核酸被共價地錨定在 所述固相支持體上。
19.根據權利要求14-18的任一項所述的方法，其中所述基因組核酸是基因組DNA。
20.根據權利要求14-19的任一項所述的方法，其中所述固相支持體是珠子、微孔板或玻璃表面。
21.根據權利要求17所述的方法，其中所述結合對是配體_受體、激素_受體或抗 原-抗體。
22.根據權利要求21所述的方法，其中所述結合對是生物素和鏈黴抗生物素或鏈黴抗 生物素的變體。
23.根據權利要求14-22的任一項所述的方法，其中所述探針是寡核苷酸、人工染色 體、片段化人工染色體、基因組DNA、RNA或肽核酸。
24.根據權利要求14-23的任一項所述的方法，其中所述探針的長度是至少50個核苷酸。
25.根據權利要求14-24的任一項所述的方法，其中所述探針用螢光團、納米顆粒、同 位素、化學發光化合物、酶或半抗原標記。
26.根據權利要求14-25的任一項所述的方法，其中所述複合體通過流式細胞術在所 述固相支持體上被檢測。
27.根據權利要求14-26的任一項所述的方法，其中所述複合體通過檢測結合到所述 探針的所述可檢測標記的標記試劑被檢測。
28.根據權利要求27所述的方法，其中所述標記試劑是對所述可檢測標記有特異性的 標記抗體。
29.根據權利要求14-28的任一項所述的方法，其中所述基因組核酸存在於測試樣品 中，並且其中所述測試樣品是細胞、組織、體液、糞便、石蠟包埋的組織、細胞裂解物或組織 裂解物。
30.檢測基因組核酸中遺傳變異的存在或不存在的方法，包括a.將含有所述遺傳異常的基因組核酸樣品與對所述遺傳異常有特異性的第一探針相 接觸，並且在固相支持體上形成包含所述基因組核酸和所述第一探針的第一複合體，其中 所述探針包含可檢測標記，所述基因組核酸通過除核酸雜交外的方式被錨定在所述固相支 持體上，並且所述基因組核酸的所述靶序列還未被擴增；b.將參考核酸與對所述參考核酸有特異性的第二探針相接觸，並且在固相支持體上形 成包含所述參考核酸和所述第二探針的第二複合體，其中所述第二探針包含可檢測標記；和c.通過檢測與所述第一複合體相關的所述第一探針的所述可檢測標記來測量形成的 所述第一複合體的量，通過檢測與所述第二複合體相關的所述第二探針的所述可檢測標記 來測量形成的第二複合體的量；和d.將所述第一複合體的量與所述第二複合體的量進行比較，其中兩個複合體的量的差 異指示遺傳異常。
31.根據權利要求30所述的方法，其中所述參考核酸是持家基因或染色體中的單拷貝 序列。
32.根據權利要求30-31的任一項所述的方法，其中所述基因組核酸和所述參考核酸從同一樣品獲得。
33.根據權利要求30-32的任一項所述的方法，其中所述基因組核酸和所述參考核酸 從不同的樣品獲得。
34.根據權利要求30-33的任一項所述的方法，其中所述第一探針和所述第二探針的 可檢測標記是不同的。
35.根據權利要求30-31和33-34的任一項所述的方法，其中所述第一探針和所述第二 探針是相同的，並且其中所述基因組核酸和所述參考核酸從不同的樣品獲得。
36.檢測基因組核酸中遺傳異常的存在或不存在的方法，包括a.將含有所述遺傳異常的基因組核酸樣品與對所述遺傳異常有特異性的第一探針相 接觸，並且在固相支持體上形成包含所述基因組核酸和第一探針的第一複合體，其中所述 探針含有可檢測標記，所述基因組核酸通過除核酸雜交外的方式被錨定在所述固相支持體 上，並且所述基因組核酸的所述靶序列還沒被擴增；b.將基因組核酸樣品與對參考核酸有特異性的第二探針相接觸，並且在固相支持體上 形成包含所述參考核酸和第二探針的第二複合體，其中所述第二探針含有可檢測標記；和c.通過檢測與所述第一複合體相關的所述第一探針的可檢測標記來測量形成的所述 第一複合體的量，並通過檢測與所述第二複合體相關的所述第二探針的可檢測標記來測量 形成的第二複合體的量；和d.獲得所述第一複合體與所述第二複合體的量之比；和e.將獲得的所述比與使用來自參考樣品的基因組核酸而同樣獲得的比進行比較，其中 所述比的差異指示遺傳異常。
37.根據權利要求36所述的方法，其中所述遺傳異常是與特定的染色體區段或基因相 關的重複或缺失。
38.根據權利要求36-37的任一項所述的方法，其中所述第一複合體和第二複合體通 過流式細胞術在所述固相支持體上被檢測。
39.根據權利要求36-38的任一項所述的方法，其中所述第一探針或所述第二探針的 長度是至少50個核苷酸。
40.根據權利要求36-39的任一項所述的方法，其中所述固相支持體包括結合對的第 一成員，並且所述基因組核酸包含所述結合對的第二成員，其中所述結合對成員的結合將 所述基因組核酸錨定到所述固相支持體上。
41.根據權利要求40所述的方法，其中所述結合對是生物素和鏈黴抗生物素或鏈黴抗生物素的變體。
42.根據權利要求36-41的任一項所述的方法，其中所述基因組核酸是基因組DNA。
43.根據權利要求36-42的任一項所述的方法，其中所述參考核酸是持家基因或染色 體中的單拷貝序列。
44.個體中疾病的診斷方法，包括a.將來自所述個體的基因組核酸樣品和與對所述疾病有特異性的核酸序列互補的探 針相接觸，以及如果所述基因組核酸含有對所述疾病有特異性的核酸序列，則在固相支持 體上形成包含所述基因組核酸和所述探針的複合體，其中所述探針含有可檢測標記，所述 基因組核酸通過除核酸雜交外的方式被錨定在所述固相支持體上，並且所述基因組核酸的 所述靶序列還未被擴增；和b.通過檢測與所述支持體相關的可檢測標記的量來測量在所述固相支持體上形成的 所述複合體的量；和c.將形成的複合體的量與使用來自在相似條件下分析的參考樣品的基因組核酸形成 的複合體的量進行比較，其中從所述個體形成的複合體的量與所述參考樣品相比的差異對 所述疾病有診斷價值。
45.根據權利要求44所述的方法，其中所述參考樣品取自正常的個體。
46.根據權利要求44-45的任一項所述的方法，其中所述方法用於測量懷疑患有癌症 的個體中的腫瘤負荷。
47.根據權利要求44-46的任一項所述的方法，其中所述參考樣品從獲得測試樣品之 後的同一個體獲得。
全文摘要
本發明提供了檢測錨定在固相支持體上的未擴增的基因組核酸的方法。該方法對檢測與各種疾病相關的遺傳異常、診斷和預後是有用的。
文檔編號C12Q1/68GK101925677SQ200880125631
公開日2010年12月22日 申請日期2008年11月14日 優先權日2007年11月29日
發明者M·阿爾比塔 申請人:奎斯特診斷投資公司