一種肝素鈉的高效提取工藝的製作方法

2023-11-30 16:47:06

專利名稱：：一種肝素鈉的高效提取工藝的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種動物腸衣的肝素鈉的提取工藝，具體涉及一種利用蛋白酶將肝素鈉與動物腸衣中的蛋白進行分離，從而有效獲得肝素鈉的提取工藝。
背景技術：
：目前全球肝素鈉製劑總銷售額已超過40億美元，肝素鈉已成為全球第一大生化藥物，我國是肝素鈉原料的主要出口國，目前國內粗品肝素鈉生產企業有500多家，大多數企業規模較小，所得產品收率低，純度低，且在生產過程中樹脂再生困難，產生的廢水汙染環境嚴重。本發明所對應的現有技術中的動物腸衣肝素鈉的提取工藝有以下兩種鹽解法提取、酶解法提取和酶解加鹽解法提取。鹽解法工藝概述imageseeoriginaldocumentpage3上述步驟中主要鹽解法提取法為將5%NaCL或鹽水混勻後波美氏表大約4.5度作為鹽解液，對動物小腸進行鹽解，分離出肝素。該工藝的缺點在於分解不完全，殘留量比較大。酶解法工藝概述imageseeoriginaldocumentpage3上述步驟中，主要酶解法提取法為將4.5%NaCl或鹽水混勻後波美氏表大約4.5度；在鹽水4.3度時加10萬單位蛋白酶3-4KG作為酶解液，對動物小腸進行酶解，該工藝的缺點在於分解後的雜質比較多，純度低。
發明內容本發明的主要任務在於提供一種肝素鈉的高效提取工藝，具體是一種採用蛋白酶提取肝素鈉時採用超聲作介質，利用超聲波的機械振動作用和空化作用，加速肝素與蛋白的結合部位切斷，有利於肝素在溶劑中的溶解和下一步的分離純化。為了解決以上技術問題，本發明的一種肝素鈉的高效提取工藝，所述肝素鈉的提取工藝步驟為先對新鮮腸衣黏膜進行酶解，然後進行吸附、脫附處理，最後沉澱、烘乾獲得肝素鈉，其創新點在於所述對新鮮腸衣的酶解工藝為超聲波酶解工藝，所述超聲波酶解工藝為將PH值為8-9的料液與單根小腸混合水在45°C的溫度下與3%體積比的蛋白酶在以超聲為介質的條件下酶解，將肝素鈉與蛋白的結合部位快速切斷，獲得肝素鈉；所述介質超聲的超聲時間為10-60min，超聲功率為240-440W，單次超聲時間為1_5S，超聲時間與間歇時間的比值為1:1-5:1。進一步地，所述工藝中料液與單根小腸混合水的體積比為1.2-61。進一步地，所述超聲時間優選值為30-40min。進一步地，所述超聲功率優選320W。進一步地，所述單次超聲時間優選值為3S。進一步地，所述超時間與間歇時間的優選比值為31。本發明的優點在於超聲波提取以其提取溫度低、提取率高、提取時間短的獨特優勢被廣泛應用於中藥材和各種動、植物有效含量的提取，是替代傳統剪切工藝方法實現高效、節能、環保式提取的現代高新技術手段。將超聲波酶解法應用於肝素鈉提取，確定最佳工藝條件，市場需求量大，該工藝大大縮短生產周期，且產品得率高，純度高，經濟效益十分顯者ο該提取工藝包括以下步驟首先對新鮮腸衣黏膜進行超聲波酶解，然後進行吸附、脫附處理，最後沉澱、烘乾獲得肝素鈉。在上述工藝中酶解過程利用超聲波的機械振動作用和空化作用，加速肝素與蛋白的結合部位切斷，有利於肝素在溶劑中的溶解和下一步的分離純化。採用該提取工藝提取肝素鈉，單根小腸可提取肝素鈉0.53g，產品效價為106U，比單獨的酶法提取量提高15.2%，比單獨的超聲波法提取量提高35.07%，提取時間節省了2.5小時。該工藝簡單，生產周期短，得率高，質量穩定，蛋白質殘留量小，肝素鈉純度高。圖為本發明的工藝流程圖。具體實施例方式本發明的肝素鈉提取的整個工藝流程如附圖所示，首先進行小腸黏膜溶液的ph值調試1，然後進行超聲酶解2、以及過濾3、樹脂吸附4、樹脂吸附飽後進行洗滌5、洗脫6、冷凍離心7、過濾取上清液8、乙醇沉澱9、冷凍乾燥10、包裝11、保藏12。具體操作步驟如下首先進行小腸黏膜溶液的ph值調試1的步驟將小腸黏膜溶液和料液進行配比，將單根小腸與料液按體積比作單根小腸加水2.4L的比例進行混合，選其混合後的ph值為8-9。然後將配比後的混合溶液進行超聲酶解2的步驟在該步驟中，所用的超聲機為功率在240-440W、可間息性進行超聲的普通超聲機，超聲機的工作溫度設在45°C。本步驟中混合液與蛋白酶的配比按體積比為為3%。具體工作時，為了更快速、有效地將蛋白與肝素分解，將混合液與蛋白酶在超聲波為介質的條件下酶解，即將超聲波導入溶液中。酶解原理與一般酶解相同，在此不再累述。但酶解時採用的超聲波介質的要求具體如下超聲時間為10-60min，超聲功率為240-440W，單次超聲時間為1-5S，超聲時間與間歇時間的比值為1-51。通過上述超聲酶解後，肝素與蛋白分離，肝素保留於溶液中形成母液，蛋白成為固體雜渣，通過過濾3的步驟，用100目的濾布將母液中的固體雜渣過濾，然後將過濾後的母液輸至吸附池。在吸附池中，將上述過濾後的母液進行樹脂吸附4步驟的處理將母液的溫度調節至45°C，用D208樹脂與母液按質量比例為4-5%的比例配置利用樹脂的物理性能進行攪拌吸附8小時接下來是樹脂吸附飽和後進行洗滌5的步驟將吸附後的溶液用100目的濾布過濾取出樹脂，先將樹脂用清水洗淨，然後加2波美度，ph值為2的鹽水，鹽水的加入量與樹脂的重量比例為11，加入後，攪拌半小時後放出，用清水將樹脂清洗乾淨。第6個步驟是洗脫配置20波美度左右的鹽水，升溫至60°C，按重量比11的比例加到已經洗淨的樹脂中，加鹽控制放出的鹽度為18波美度並攪拌，進行一次洗脫，攪拌洗脫3小時。取出洗脫液，按重量比11比樹脂加清水到經2次洗脫的樹脂，加鹽控制放出鹽度為20波美度進行3次洗脫，洗脫時間為2小時。第7個步驟是冷凍離心將待冷凍產品放入冷凍離心機，在冷凍離心溫度為4°C，離心轉速為14000r/min的環境下離心15min後停止離心，完成冷凍過程。第8個步驟即過濾採用100-120目多層布篩進行過濾取離心管中的上清液。第9個步驟乙醇沉澱加入等體積的100%冷乙醇，加入1/10體積的NaAC(3M，pH5.2)後上下顛倒混勻，-20度30分鐘，12000轉4°C離心10分鐘。倒掉上清，加入70%的冷乙醇，輕輕混勻，12000轉4°C離心10分鐘；倒掉上清，放在室溫中乾燥，標準是聞不到乙醇的味道。加入適當體積水或者TE緩衝液溶解即可。第10個步驟冷凍乾燥先將準備乾燥的物品置於低溫冰箱或液氮中，使物品完全冰凍結實，然後將已準備好的待乾燥物品置於乾燥盤中，密封罩上有機玻璃筒，然後置於冷凍機中抽真空至_20Pa以下，進行冷凍乾燥12-24小時完成該步驟。完成上述步驟後，就進行包裝11、保藏12，該兩步驟為常規步驟，在此不再累述。實施例1、超聲功率對提取肝素鈉的影響取單根小腸小腸黏膜配成等體積溶液，pH為8.5，提取時間40!^11，超聲單次發生時間3s，發生時間與間歇時間的比值為31，超聲強度分別為240W、280W、320W、360W、400W、440W，反應結束後測試溶液中肝素鈉的濃度，平行三次取平均值，在320W超聲條件下，溶液中肝素鈉的產量最大。tableseeoriginaldocumentpage52、超聲時間對提取肝素鈉的影響取單根小腸小腸黏膜配成等體積溶液，ρΗ為8.5，超聲單次發生時間3s，超聲強度320W，發生時間與間歇時間的比值為31，提取時間分別為10min、20min、30min、40min、50min、60min，反應結束後測試溶液中肝素鈉的濃度，平行三次取平均值，在反應40min後，溶液中肝素鈉的含量達到最大值，反應時間延長，溶液中肝素鈉的含量保持不變。超聲時間(miη)IOmin20min30min40min5Omin6Omin肝素產量(g)079083095Γθ4Τθ41.043、超聲頻率對提取肝素鈉的影響取單根小腸小腸黏膜配成等體積溶液，ρΗ為8.5，反應時間為60min，採用發散超聲方式，發聲頻率分別為40KHZ與60KHZ，分別於10min、20min、30min、40min、50min、60min，採集溶液樣品測肝素鈉的濃度，平行三次取平均值，隨著但應時間的增加，溶液中肝素鈉的產量變化不大，因此採用發散超聲作用方式不能運用於提取肝素鈉。tableseeoriginaldocumentpage64、發聲時間與間歇時間的比值對提取肝素鈉的影響取單根小腸小腸黏膜配成等體積溶液，ρΗ為8.5，超聲單次發生時間3s，超聲強度320W，發生時間與間歇時間的比值分別為51、41、31、21、11，提取時間為40min，反應結束後測試溶液中肝素鈉的濃度，平行三次取平均值。發聲時間與間歇時間的比值為31時，溶液中肝素鈉的產量最大。tableseeoriginaldocumentpage65、單次發生時間對對提取肝素鈉的影響取單根小腸小腸黏膜配成等體積溶液，ρΗ為8.5，時間3s，超聲強度320W，發生時間與間歇時間的比值為31，提取時間為40min，超聲單次發生時間分別為ls、2s、3s、4s、5s，反應結束後測試溶液中肝素鈉的濃度，平行三次取平均值。超聲單次發生時間3s時，溶液中肝素鈉的產量最大。tableseeoriginaldocumentpage76、料液比對提取肝素鈉的影響取單根小腸小腸黏膜配成不同體積溶液，pH為8.5，時間3s，超聲強度320W，發生時間與間歇時間的比值為31，提取時間為40min，超聲單次發生時間為3s，料液比分別設定為單根小腸加入1.2L、2.4L、3.6L、4.8L、6L。反應結束後測試溶液中肝素鈉的濃度，平行三次取平均值。超聲單次發生時間3s時，溶液中肝素鈉的產量最大。tableseeoriginaldocumentpage7以豬小腸黏膜為原料，在單因素數的基礎上，選取超聲功率、超聲時間、超聲溫度、料液比四個因素，應用二次回歸正交試驗對超聲波酶解提取肝素的工藝條件進行優化，優化結果為料液比為單根小腸混合水2.4L，反應溫度45°C，超聲時間40min，超聲功率320W，單次超聲時間為3S，超時間與間歇時間的比值為31，ρΗ*8.5.。肝素的提取率為單根小腸提取肝素鈉0.53g，產品效價為106U，比單獨的酶法提取量提高15.2%，比單獨的超聲波法提取量提高35.07%，提取時間節省了2.5小時。權利要求一種肝素鈉的高效提取工藝，所述肝素鈉的提取工藝步驟為先對新鮮腸衣黏膜進行酶解，然後進行吸附、脫附處理，最後沉澱、烘乾獲得肝素鈉，其特徵在於所述對新鮮腸衣的酶解工藝為超聲波酶解工藝，所述超聲波酶解工藝為將pH值為8-9的料液與單根小腸混合水在45℃的溫度下與3％體積比的蛋白酶在以超聲為介質的條件下酶解，將肝素鈉與蛋白的結合部位快速切斷，獲得肝素鈉；所述介質超聲的超聲時間為10-60min，超聲功率為240-440W，單次超聲時間為1-5S，超聲時間與間歇時間的比值為1-5∶1。2.根據權利要求1所述的一種肝素鈉的高效提取工藝，其特徵在於所述工藝中料液與單根小腸混合水的體積比為1.2-61。3.根據權利要求1所述的一種肝素鈉的高效提取工藝，其特徵在於所述超聲時間優選值為30-40min。4.根據權利要求1所述的一種肝素鈉的高效提取工藝，其特徵在於所述超聲功率優選320W。5.根據權利要求1所述的一種肝素鈉的高效提取工藝，其特徵在於所述單次超聲時間優選值為3S。6.根據權利要求1所述的一種肝素鈉的高效提取工藝，其特徵在於所述超時間與間歇時間的優選比值為31。全文摘要本發明主要公開了一種肝素鈉的高效提取工藝，所述肝素鈉的提取工藝步驟為先對新鮮腸衣黏膜進行酶解，然後進行吸附、脫附處理，最後沉澱、烘乾獲得肝素鈉，其創新點在於所述對新鮮腸衣的酶解工藝為超聲波酶解工藝，所述超聲波酶解工藝為將pH值為8-9的料液與單根小腸混合水在45℃的溫度下與3％體積比的蛋白酶在以超聲為介質的條件下酶解，將肝素鈉與蛋白的結合部位快速切斷，獲得肝素鈉。本發明的優點在於將超聲波酶解法應用於肝素鈉提取，確定最佳工藝條件，市場需求量大，該工藝大大縮短生產周期，且產品得率高，純度高，經濟效益十分顯著。文檔編號C12P19/04GK101805764SQ201010137850公開日2010年8月18日申請日期2010年4月2日優先權日2010年4月2日發明者於海,方維明,汪志君,葛慶豐,金昌海申請人:揚州大學