一種特異和高效的南瓜pp2基因啟動子的製作方法

2023-08-07 04:27:31

>轉基因植株GUS活性pmol./min..mgLUC活性counts/min..10pg校正GUS活性pmol./min..mg最大GUS值/最小GUS校正前校正後N1N2N3C1C2C34312410167238420381269.802.001.0713.1910.401.0744020515618119610126192.81.9注N1,N2和N3為三株轉pBL3NG基因菸草；C1,C2和C3為三株轉pBL3CG基因菸草。以上結果為每株植株測3次的平均值。對22株有GUS表達的轉pBL3NG菸草及13株轉pBL3CG菸草葉片組織GUS活性進行校正，分別計算兩者的平均值，結果前者為後者的168％。考慮到在本發明所涉及的南瓜PP2啟動子的韌皮部組織特異性，推測GUS活性在含有更多韌皮部細胞的葉脈組織高於葉片組織，故分別對轉基因菸草葉脈和葉片組織測定了GUS活性，再以葉脈組織活性除以葉片GUS活性，結果轉pBL3NG菸草葉脈GUS活性為葉片的2-4倍，11株平均為2.6倍；轉pBL3CG菸草葉脈GUS活性為葉片的2-8倍，5株平均為5倍。葉脈組織的GUS活性高於葉片組織的結果從另一個方面反應了南瓜PP2啟動子和CoYMV啟動子的韌皮部組織特異性。另外，以LUC活性校正葉脈組織GUS活性後進行比較，發現南瓜PP2啟動子855bp片段驅動GUS基因在葉脈組織表達活性為CoYMV啟動子882bp片段的87％。吳標等(吳標等竹節花黃班駁病毒啟動子的缺失分析及其功能微生物學報39卷1期1999年2月)的研究結果表明，CoYMV啟動子882bp片段(-870～+12)驅動GUS基因在菸草葉脈組織表達活性為35S啟動子的70％左右，但考慮到韌皮部細胞佔葉脈總細胞量的比例不超過10％，認為在韌皮部CoYMV啟動子驅動GUS表達活性可能會與35S啟動子驅動GUS表達活性相當或更高，CoYMV啟動子在韌皮部是一個強啟動子，由前述可知在葉脈組織南瓜PP2啟動子855bp片段驅動GUS表達活性為CoYMV啟動子882bp片段的87％，兩者相差僅13％，故發明人認為本發明所涉及的南瓜PP2啟動子855bp片段也應是一個韌皮部組織特異性的強啟動子。六．轉基因菸草的Southern分析由實施例三步驟1所產生的兩種基因構建體pBL3NG和pBL3CG，在其約8.7kb整合區所含有的GUS基因表達框架的5』端有-個HindⅢ位點，如果用HindⅢ酶解轉基因菸草的基因組DNA，然後進行Southern雜交分析，可以鑑定目的基因是否整合進菸草基因組以及整合的拷貝數情況。按實施例一步驟1中所述方法製備轉基因菸草基因組DNA約30ug，以HindⅢ按如下條件進行酶解在500ul反應體系中含有30ug基因組DNA、50ul酶解緩衝液(10×)、20ulHindⅢ酶(200units)及2ul無DNA酶的RNA酶(20ug)，加無菌重蒸水至終體積為500ul；37℃酶解24小時後再補加5ulHindⅢ酶(50units)繼續酶解10小時。取5ul酶解物在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳檢查，DNA酶解很好。酒精沉澱上述HindⅢ酶解後的DNA，重新溶解到40ulTE(10mmol/LTris-HCl,pH8.0,0.1mmol/LEDTA)裡,在0.8％瓊脂糖凝膠上進行電泳，以由HindⅢ和BamHⅠ酶解pBI221質粒所產生並回收純化的含有GUS基因的4.7kb片段(命名為「4.7H/B」)10ng和用BamHⅠ及SacⅠ酶解pBI221質粒所產生並回收純化的GUS基因編碼區1.8kb片段(命名為「GUS1.8f」)5ng作為陽性對照，以由HindⅢ酶解的非轉基因菸草k326的基因組DNA30ug作為陰性對照，在40V電壓下電泳12小時，然後按AmershamLIFESCIENCE公司的雜交尼龍膜操作說明(HybondTM-N+；positivehychargednylonmembraneVersion2.0)對膠進行處理以200ml0.25mol/L鹽酸淨化處理膠兩次，每次15分鐘，然後以蒸餾水洗膠30秒；以200ml鹼變性溶液(0.5mol/LNaOH,1.5mol/LNaCl)變性處理膠兩次，每次20分鐘，然後蒸餾水洗膠30秒；以200ml中和溶液(0.5mol/LTris-HCl,pH7.2,1.5mol/LNaCl和1.0mmol/LEDTA)處理膠兩次，每次20分鐘，最後再以蒸餾水洗30秒，接著進行DNA真空轉膜。使用HYBAID公司的真空轉膜系統，在40V真空泵電壓下以20×SSC(0.3mol/檸檬酸鈉、3.0mol/L氯化鈉，pH7.0)作轉移緩衝液轉移DNA2小時。關掉真空轉膜儀，將膠移下進行EB染色，紫外燈下檢查膠中的DNA已轉移乾淨。以2×SSC溶液洗膜10秒，放濾紙上室溫晾乾(30分鐘)後，用美國SanGobriel公司的紫外交聯儀(CL-1000ULTRAVIOLETCROSSLINKER,CA91778)進行處理，設定條件能量參數1200，時間2分鐘，共處理2次。使用寶靈曼公司的隨機引物DNA標記盒(Cat.No.1004760)，以隨機引物標記法標記雜交探針，步驟為取前述的GUS1.8f片段25ng作為模板，100℃變性5分鐘，冰上驟冷後加入含有1uldATP(0.5mmol/L)、1uldGTP(0.5mmol/L)、1uldTTP(0.5mmol/L)、50uCi[α-32P]dCTP、2ul隨機引物、1ulklenow酶(lunit)溶液和重蒸水若干微升補足剩餘體積的20ul標記反應體系中，混勻，37℃標記反應1小時。按AmershamLIFESCIENCE公司的雜交尼龍膜操作說明(NybondTM-N+；positivehychargednylonmembraneVersion2.0)中的雜交程序進行雜交，步驟為將膜放入雜交杯中，加入25ml預雜交液(6.25ml20×SSC、2.5ml50×Denhardt′溶液、6.25ml2％SDS、500微克經超聲處理並在100℃變性5分鐘後再冰上驟冷的魚精DNA和重蒸水若干毫升定容至25ml)，使用HYBAID公司的MIDIDUAL14雜交箱，65℃預雜交1小時；將標記好的探針在100℃變性5分鐘，冰上驟冷，加入到雜交液中，65℃雜交16小時。雜交完畢後洗膜，步驟為以40ml溶液Ⅰ(2xSSC,0.1％SDS)在室溫洗2次，每次10分鐘；用40ml溶液Ⅱ(1xSSC,0.1％SDS)在65℃洗10分鐘；用40ml溶液Ⅲ(0.1xSSC,0.1％SDS)在65℃洗10分鐘。用同位素探測器檢查雜交膜放射性，如果背景放射性過高則再以溶液Ⅲ在65℃洗膜直至背景放射性低於50CPM。取出濾膜於紙巾上吸去大部分液體，用保鮮膜包好，放入曝光夾中壓上X光片(Bio-Rad公司產品，貨號170-7320)及增感屏，置於-70℃曝光12-36小時。對X光片進行顯影、定影后得到了Southern雜交的陽性結果(如附圖10所示)。Southern雜交結果證明，經GUS染色和GUS活性檢測均為陽性的轉pBL3NG菸草植株和轉pBL3CG菸草植株的基因組DNA中均含有與探針特異雜交的GUS基因片段，且皆為單拷貝，而對照非轉基因菸草植株的基因組DNA中未檢測到上述片段。總之，本發明克隆的南瓜PP2基因啟動子序列，與報告基因融合構建成植物表達中間載體後，通過農桿菌介導轉化菸草，證明該啟動子序列能夠驅動目的基因編碼區的核苷酸序列在植物韌皮部高效、特異地表達，該啟動子可用於植物的抗蟲、抗病等基因工程的研究和開發利用。權利要求1．一種新克隆的編碼植物韌皮部蛋白的基因的啟動子，其特徵在於選自下列的蛋白質基因啟動子的核苷酸-1078至+37的1115bp序列。-1078GCTGCCTAAAAGTGCAACCCCATATCTACTTGGGTGATTT-1038AAATTAGTTAAATGTATATTTGGATATGTTATGACATATA-998AATATAATTTAAATAAGTTATATCTTAACAAATTAGATAC-958ATTCGACTCATATTCTTGTAAATAAGACTATTGGATGAGT-918CAAAAAGCATCTTGTCTGTCTATGGGAATTCTCCCTAAAT-878ATTTTTTCTAATTTATTAAAAAATTTCTTTAGAGATTTTT-838ACAAACCTTAACTCGAAGATTTTGCCGGAGGAGTTGAAGC-798TAGTAAATTAAAAATTAGCCAGAACTTTCTTCATATTTCT-758TATAAATTTAGGTAACTTTTTGTTTAGTTTAATTCTAAAT-718AAAATTAAAGTTGATCCTAATGCTTATGCCACGGGAATAA-678AGCCGTTCATTCTCAACCATATCTTCAAAATATTCATTTG-638ATATCTTTCCAAATAAAGATCATATACTCATTCAACACAT-598CGTCACATATATTTAATTTATTCTTTATAATCAAACATCA-558CATTATAAAAAATAAATAAATAAATAAAACTTGAGGTAAG-518CTCAATTTTTATAAATTTTAAAATACTTTAAAAATCAATA-478GTGAATAAATAAATGTGATTAACTGGCAATATCTACTAAT-438AAAAACTCTAGAAAATATTTATCTTTCAACAAAAAAAAAT-398AAAAAAAACCGTTCTAGATTTATAATTTATTAACGAACAA-358AATATTATATTTAAATAATGTTTCATACAAAAATGAGATA-318TACTTGCATCAAGTATTACTCGAAAGTACTCGGTTACTTT-278TTAAAAGAACGGAATAAAGGGCCACCTTTTTTTATTTACA-238AATAATTTAAATATATATTAAAATATTGTTAATTATTTTT-198CAACTATAGAAAAACACAAATATAAATGAAAAGGTAAAAT-158ACATAAAATTTACTTTTTTAAAGAATTAAAATGTCTTTTC-118ATTTCTTTTACAACCTCGTAAACGGAAAATAATATAACAA-78TTGTGCATGGCTTATCTTCAAAATATTGTACCAAAGAAGG+1-38GGTTATATATATCCCTTCTTCCCTCTCACTTTTAACTCAT+3ATCACAATTCAGTTCATAAAAAGGAAGACACTATA+372．根據權利要求1所述的核苷酸序列，其特徵在於其中所包含的855bp核苷酸序列片段完全足以驅動外源基因編碼區的核苷酸序列在轉基因植物的韌皮部組織特異性表達。-839AAGCTTCCTTAACTCGAAGATTTTGCCGGAGGAGTTGAAG-799CTAGTAAATTAAAAATTAGCCAGAACTTTCTTCATATTTC-759TTATAAATTTAGGTAACTTTTTGTTTAGTTTAATTCTAAA-719TAAAATTAAAGTTGATCCTAATGCTTATGCCACGGGAATA-679AAGCCGTTCATTCTCAACCATATCTTCAAAATATTCATTT-639GATATCTTTCCAAATAAAGATCATATACTCATTCAACACA-599TCGTCACATATATTTAATTTATTCTTTATAATCAAACATC-559ACATTATAAAAAATAAATAAATAAATAAAACTTGAGGTAA-519GCTCAATTTTTATAAATTTTAAAATACTTTAAAAATCAAT-479AGTGAATAAATAAATGTGATTAACTGGCAATATCTACTAA-439TAAATAACTCTAGAAAATATTTATCTTTCAACAAAAAAAA-399AAAAAAAAACCGTTCTAGATTTATAATTTATTAACGAACA-359AAATATTATATTTAAATAATGTTTCATACAAAAATGAGAT-319ATACTTGCATCAAGTATTACTCGAAAGTACTCGGTTACTT-279TTTAAAAGAACGGAATAAAGGGCCACCTTTTTTTATTTAC-239AAATAATTTAAATATATATTAAAATATTGTTAATTATTTT-199TCAACTATAGAAAAACACAAATATAAATGAAAAGGTAAAA-159TACATAAAATTTACTTTTTTAAAGAATTAAAATGTCTTTT-119CATTTCTTTTACAACCTCGTAAACGGAAAATAATATAACA-79ATTGTGCATGGCTTATCTTCAAAATATTGTACCAAAGAAG-39GGGTTATATATATCCCTTCTTCCCTCTCACTTTTAACTCA+1+2TATCACACGGGATCC+163．重組質粒，其特徵在於含有權利要求1和2所述的核苷酸序列的全部或部分片段與所需目的基因的編碼區核苷酸序列相連接。4．能在植物韌皮部組織特異表達的一組重組質粒，它們含有權利要求1,2和3所述的核苷酸序列的全部或部分片段。5．根據權利要求4所述的重組質粒，它們是pBNG和pBL3NG。6．兩種重組微生物，是由權利要求5所述重組質粒分別轉化微生物所獲得的。7．根據權利要求6所述的重組微生物，其特徵在於所述微生物是大腸埃希氏桿菌(Escherichiacoli)DH5α。8．重組微生物，含有權利要求4和5所述的質粒。9．根據權利要求8所述的重組微生物，其中所述重組微生物是土壤農桿菌。10．根據權利要求8和9所述的土壤農桿菌，其特徵在於可應用於植物轉化。全文摘要本發明提供了採用基因組DNA步移法克隆的南瓜韌皮部蛋白2(PP2)基因啟動子的序列;包含所述的DNA序列與GUS報告基因的融合基因構建體;用所說的構建體轉化植物外植體所產生的在韌皮部組織特異性高效表達GUS轉基因的植株。文檔編號C12N15/63GK1302891SQ9912189公開日2001年7月11日申請日期1999年10月22日優先權日1999年10月22日發明者田穎川,袁正強申請人:中國科學院微生物研究所