大黃素、蘆薈大黃素在製備抗腦缺血損傷藥物方面的應用的製作方法

2023-11-11 07:52:42 2

專利名稱：大黃素、蘆薈大黃素在製備抗腦缺血損傷藥物方面的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於中藥技術領域，特別涉及一種從大黃中提取大黃素和蘆薈大 黃素的方法及大黃素和蘆薈大黃素在抗腦缺血損傷方面的應用。
背景技術：
蓼科植物大黃或其他變種的植物根莖中含有大黃素、蘆薈大黃素。大黃 素異名朱;61 蓮甲素(Frangula emodin, Rheum emodin, Archin， Frangulic acid)， 化學名9，10-Anthracenedione, 1,3，8-thihydroxy-6-methyl，結構式為
大黃豕
分子式為C15H1Q05，分子量270.33;為橙色針狀結晶(乙醇或12毫米以下減 壓升華)，熔點256-257°C，幾乎不溶於水，溶於乙醇及鹼溶液。其植物來源 為廖科植物掌葉大黃根莖、齒果酸模、齒果酸模根和葉、皺葉酸模的根、 羊蹄根、槓板歸根和根莖、豆科植物決明新鮮種子、望江南根。蘆薈大黃素異 名戸薈瀉素 (Rhabarberone )， 化學名 9,10-Anthracenedione， 1, 8誦dihydroxy國3-(hydroxymethyl)，結構式為
蘆薈大黃素
分子式為C15H105，分子量270.23;為橙色針狀結晶(甲苯)，熔點223-224 °C，易溶於熱乙醇，在乙醚及苯中呈黃色、氨水及硫酸中呈緋紅色。其植物 來源為廖科植物掌葉大黃根莖、藥物大黃根莖、巴天酸模根、齒果酸模葉、 決明種子、望江南種子、豆科植物山扁豆根、鼠李科植物鼠李的果實。
藥理研究表明，大黃素(1)體外可抑制金黃色葡萄球菌、白喉桿菌、
枯草桿菌、大腸桿菌等各種細菌、還可抑制胃幽門螺桿菌。(2)可抑制不同 有絲分裂原(Con A， LPS)刺激的小鼠脾細胞增殖反應；抑制Con A誘導脾 細胞IL2的產生，其抑制作用與大黃素的濃度成正比。(3) 30mg/kg於家兔灌 胃有利尿作用。(4)體外對艾氏腹水癌細胞的50%的抑制濃度為20mg/kg。 (5) 42mg/kg連續7天於小鼠腹腔注射，使肝微粒體細胞色素瘤的抑制率為75%[15]; 10ug/kg的濃度對肺癌A-549細胞的分裂和DNA的生物合成有抑制作用； 42mg/kg連續7天小鼠腹腔注射，使肝微粒體細胞色素P-450含量較對照組下 降41.7%;使戊巴比妥鈉誘導的小鼠睡眠時間比對照組延長18.7%。 (6)對淋 巴細胞外鈣內流有明顯的促進作用，對淋巴細胞免疫功能有抑制作用；也可 促進細胞內鈣釋放。(7) 100mg/kg給大鼠腹腔注射，可使腸梗阻所致腸黏膜 降低了的組胺水平恢復到正常。(8)體外18. 5umol/L可使NE和高鉀誘導的 主動脈條收縮的量效曲線左移，可能與鈣激動作用有關，92. 5 umol/L可抑制 主動脈條的收縮作用是量效曲線右移，可能與大黃素絡合鈣離子作用有關。
(9)可抑制正常動脈硬化的動脈及球囊損傷動脈壁血管平滑肌細胞增殖，主 要機制為抑制細胞從G。期向G5期轉化，並呈劑量相關性。(10)在5X10—7—5 XKT5m0l/L濃度範圍內，可抑制大鼠腹腔巨嗜細胞白三烯的生物合成，量效 關係明顯。(11)將大黃素純品直接加入細胞培養液可抑制細胞增殖，25mg/L 可抑制腎小管原癌基因mRNA的表達；還可抑制平滑肌細胞增殖。蘆薈大黃素
(1)體外可抑制金黃色葡萄球菌、鏈球菌、白喉桿菌、枯草桿菌、大腸桿菌 等各種細菌、對胃幽門螺桿菌有抑制生長作用。(2) 70mg/kg連續7天腹腔注 射於小鼠，對免疫系統有不同程度的抑制作用。(3)為一種強的平滑肌細胞 抑制劑，對平滑肌細胞有抑制作用，呈劑量依賴關係。

發明內容
本發明目的在於提供一種從大黃中提取大黃素、蘆薈大黃素的方法及大 黃素、蘆薈大黃素在製備抗腦缺血損傷藥物方面的應用。
為達上述目的，本發明採用如下技術方案從大黃中提取大黃素、蘆薈 大黃素的方法，依次包括如下步驟(1)取大黃藥材粉碎，加乙醇水溶液浸 泡、加熱回流提取，提取液濾過、回收乙醇得浸膏；(2)浸膏用無機酸水溶
液水解，酸水液濾過去渣；(3)去渣酸水液通過聚醯胺層析柱，用乙醇水溶 液洗脫除去雜質，繼用乙醇與丙酮混合液梯度洗脫，分段收集洗脫液，回收 溶劑，濃縮至幹，分別得到蘆薈大黃素、大黃素；或者，去渣酸水液用三氯 甲烷提取，提取液回收三氯甲烷至近幹，通過矽膠層析柱，用乙酸乙酯與丙 酮混合液梯度洗脫，分段收集洗脫液，減壓回收溶劑至幹，分別得到蘆薈大 黃素、大黃素0
步驟(1)中粉碎後的大黃藥材加藥材重量6 — 16倍的重量百分比濃度40 %—80%的乙醇水溶液常溫浸泡0. 5 — 4小時，加熱回流提取3—6次，每次0. 5 一3小時，濾過，減壓回收乙醇得浸膏。
步驟(2)中浸膏用其重量5 — 20倍的重量百分比濃度5%—20%的無機酸 水溶液水浴加熱水解0. 5 — 1. 5小時，酸水液濾過去渣。
步驟(3)中去渣酸水液通過聚醯胺層析柱，用4 —12倍層析柱體積的重 量百分比濃度10% — 50%乙醇水溶液洗脫除去雜質，繼用重量百分比濃度60% 一95%乙醇水溶液與丙酮混合液梯度洗脫，乙醇水溶液與丙酮體積比為1 : 30 30 : 1,分段收集洗脫液，減壓回收溶劑，濃縮至幹，分別得到蘆薈大黃 素、大黃素；或者，去渣酸水液用三氯甲垸提取3—6次，減壓回收三氯甲垸 至近幹，通過矽膠層析柱，用乙酸乙酯與丙酮混合液梯度洗脫，乙酸乙酯與
丙酮體積比為i : 20 20 : i，分段收集洗脫液，減壓回收溶劑至幹，分別得
到蘆薈大黃素、大黃素。
大黃素、蘆薈大黃素在製備抗腦缺血損傷藥物方面的應用，以大黃素或 者蘆薈大黃素為有效成分。
本發明以在國內廣泛種植的大黃藥材為原料，原料價廉易得；以乙醇水 溶液作為提取溶劑進行提取，原料成本低，提取效果好，且生產過程中無三 廢產生，環保效益好；提取並經無機酸(鹽酸或者硫酸)水解後採用層析純 化，所得提取物中大黃素、蘆薈大黃素含量高，可達80—98%。
下面通過大黃素、蘆薈大黃素抗腦缺血損傷的動物實驗研究證明大黃素、 蘆薈大黃素的抗腦缺血損傷作用
(1) 實驗材料SD大鼠，3 4月齡，90隻，雌雄各半，體重300土 50g，由河南省實驗動物中心提供(編號2003LA—130，合格證號0001012 號)。大黃素、蘆薈大黃素注射劑(均由河南中醫學院藥物分析學學科提 供)，川芎嗪注射液(山東濰坊製藥有限公司；規格2ml， 40mg;批號 030314)。
(2) 分組與處理大鼠按隨機數字表法分為假手術組、模型組、川芎 嗪組、大黃素組，蘆薈大黃素組，其中後2組又各分為低、中、高3個劑 量組。每組10隻大鼠。各組大鼠均於造模前3天腹腔注射用藥川芎嗪 注射液(7.2mg 'kg—1 'cf1)、大黃素(l,40mg .kg-1 'd—\ 2. 80mg kg—1 cT1、 5. 60 mg kg—1 d—"，蘆薈大黃素(0. 04mg kg—1 d_1、 0. 08mg kg—1 cf1、 0. 16mg.kg—、d—1)，每日用藥一次，造模前2h加用藥一次。注射液體積 為lml/100g，假手術組和模型組分別腹腔注射同等體積的生理鹽水。所 有實驗大鼠均於術前12h禁食不禁水。造模後6h依神經症狀八級評分標 準進行評分。
(3) 模型製備採用改良的Longa法製備局灶性腦缺血模型(MCAO)， 假手術組不插入栓線。實驗過程中保持大鼠肛溫(37.0±0.5) °C、室溫
(26±1) °C。
(4) 取材與樣品製備術後6小時冰盤上取出全腦，用冷生理鹽水(4 'C)衝洗3遍，除去積血，用濾紙吸去表面水份，去除嗅球、小腦和腦幹。 於冰盤上迅速分離大腦半球，取左側半球，從額極向後4mm處冠狀切取腦 組織3mm，待側腦組織含水量；再向后冠狀切取腦組織2mm，放入2。/。四氮 唑，進行TTC染色，待測腦梗塞面積。
(5) 觀察指標①神經症狀評分。造模後6h觀察大鼠神經症狀體徵， 參照評分標準進行評分，記錄分值；②腦組織含水量測定。切取的用於測 定含水量的腦組織迅速用電子天平稱取溼重(精確度為0. lmg)後放入幹 燥箱中乾燥(100°C±2°C)， 24h後稱取乾重。計算公式腦組織含水量=
(腦溼重一腦幹重)/腦溼重X100;③腦梗塞面積測定。切取腦組織2mm， 放入2%四氮唑，37'C水浴鍋溫孵30min後放入10%甲醛溶液，15min後取 出腦組織，數位相機分別對腦片額側和枕側進行拍照，應用計算機軟體測 定腦組織梗塞面積與相應側總面積，計算面積比值。計算公式面積比值 =梗塞面積/總面積。
(6)統計學處理數據用SPSS 11. 0統計分析軟體處理。計量資料以 G)土標準差")表示，進行單因素方差分析。 [結果]
(1)神經症狀評分腦缺血大鼠的神經症狀評分增高(5.75土0.57); 大黃素高(4. 50±0.52)、中(3.90±0. 99)、低(2. 70±0. 48)劑量組大鼠 的神經症狀評分降低；蘆薈大黃素高(3. 10±0.73)、中(4.30±0.48)、低 (5.20±0.91)劑量組的神經症狀評分降低；其中大黃素低劑量組 (1. 40mg kg—' d-1)和蘆薈大黃素高劑量組(0. 16mg kg-1 d-1)降低尤 為顯著。
(2) 腦組織含水量腦缺血大鼠腦組織含水量明顯增高(83.42士1.50); 大黃素高(80.98±4. 31)、中(79. 11±1.22)、低(76. 55±1.08)劑量組大 鼠的腦組織含水量明顯降低；蘆薈大黃素高(76.86±1.43)、中(81.75± 1.22)、低(83.02±1.39)劑量組的腦組織含水量降低；其中大黃素低劑量 組(1. 40mg kg—1 d—1和蘆薈大黃素高劑量組(0. 16mg kg-1 d—1)降低尤為 顯著。
(3) 腦梗塞面積腦缺血大鼠腦梗塞面積明顯增高(34.87土1.33);大黃 素高(32.90±2.92)、中(32. 75±1.24)、低(27.70±1.28)劑量組大鼠的 腦梗塞面積明顯降低；蘆薈大黃素高(29.00±1.59)、中(30. 95± 1. 10)、 低(33.33 ±1.67)劑量組的腦梗塞面積降低；其中大黃素低劑量組
(1.40mg kg1 cf1)和戸薈大黃素高劑量組(0. 16mg kg—1 cf1)腦梗塞面 積降低尤為顯著。通過研究，我們發現從大黃中提取的大黃素、蘆薈大黃素可以改 善腦缺血後的神經症狀，減輕腦組織水腫，減小腦梗塞面積，對缺血性腦損 傷具有明顯的保護作用，其中以大黃素低劑量(1.40mg'kg、d—"和蘆薈大 黃素高劑量(0. 16mg kg" d—0對腦缺血損傷的保護作用尤為明顯。
從大黃中提取的大黃素、戶薈大黃素可以改善腦缺血後的神經症狀，減 輕腦組織水腫，減小腦梗塞面積，對缺血性腦損傷具有明顯的保護作用，其
中以大黃素低劑量(1.40mg -kg1 *d—')和蘆薈大黃素高劑量(0. 16mg 'kg—1 'd—') 對腦缺血損傷的保護作用尤為明顯。結合目前腦缺血的治療研究進展和大黃 素、蘆薈大黃素的研究現狀，本發明關於大黃素及蘆薈大黃素的提取方法以 及所提取的大黃素及蘆薈大黃素在抗缺血性腦損傷方面的研究結果，為臨床 治療腦缺血及其他缺血性腦血管疾病的防治提供了直接依據。
具體實施例方式
實施例l、從大黃中提取大黃素、蘆薈大黃素的方法，取大黃藥材，粉碎 為粗粉，加藥材重量10倍的重量百分比濃度60%的乙醇水溶液常溫浸泡2小 時，加熱回流提取4次，每次1小時，濾過，減壓回收乙醇得浸膏；(2)浸 膏用其重量10倍的重量百分比濃度15%的鹽酸水溶液水浴加熱水解1小時， 酸水液濾過去渣；(3)去渣酸水液用等量三氯甲烷提取4次，減壓回收三氯 甲烷至近幹，通過矽膠層析柱，用乙酸乙酯與丙酮混合液(體積比1 : 20 1 : 1)洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑至幹，得到蘆薈大黃素；用乙酸乙酯與
丙酮混合液(體積比i : 1 20 : i)洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑至幹，
得到大黃素、蘆薈大黃素。
實施例2、從大黃中提取大黃素、戸薈大黃素的方法，取大黃藥材，粉碎 為粗粉，加藥材重量12倍的重量百分比濃度70%的乙醇水溶液常溫浸泡4小 時，加熱回流提取3次，每次40分種，濾過，減壓回收乙醇得浸膏；(2)浸 膏用其重量8倍的重量百分比濃度20%的硫酸水溶液水浴加熱水解40分種， 酸水液濾過去渣；(3)去渣酸水液通過聚醯胺層析柱，用30%乙醇洗脫除去雜 質，繼用80%乙醇與丙酮(體積比l : 30 1 : 1)混合液洗脫，收集洗脫液，
減壓回收溶劑，濃縮至幹，得到蘆薈大黃素，繼用80%乙醇與丙酮(體積比i: 1 30: i)混合液洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑，濃縮至幹，得到大黃
素、蘆薈大黃素。
實施例3、從大黃中提取大黃素、蘆薈大黃素的方法，取大黃藥材，粉碎
為粗粉，加藥材重量8倍的重量百分比濃度50%的乙醇水溶液常溫浸泡3小時， 加熱回流提取5次，每次30分種，濾過，減壓回收乙醇得浸膏；(2)浸膏用 其重量6倍的重量百分比濃度15%的硫酸水溶液水浴加熱水解50分種，酸水 液濾過去渣；(3)去渣酸水液通過聚醯胺層析柱，用40%乙醇洗脫除去雜質， 繼用70%乙醇與丙酮(體積比1 : 30 1 : 1)混合液洗脫，收集洗脫液，減壓 回收溶劑，濃縮至幹，得到蘆薈大黃素；繼用70%乙醇與丙酮(體積比1 : l
30: i)混合液洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑，濃縮至幹，得到大黃素、
盧薈大黃素。
實施例4、從大黃中提取大黃素、戸薈大黃素的方法，取大黃藥材，粉碎 為粗粉，加藥材重量6倍的重量百分比濃度40%的乙醇水溶液常溫浸泡3小時， 加熱回流提取5次，每次30分種，濾過，減壓回收乙醇得浸膏；(2)浸膏用 其重量6倍的重量百分比濃度15%的硫酸水溶液水浴加熱水解50分種，酸水 液濾過去渣；(3)去渣酸水液通過聚醯胺層析柱，用40%乙醇洗脫除去雜質， 繼用70%乙醇與丙酮(體積比1 : 30 1 : 1)混合液洗脫，收集洗脫液，減壓 回收溶劑，濃縮至幹，得到蘆薈大黃素；繼用70%乙醇與丙酮(體積比1 : l
30 : i)混合液洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑，濃縮至幹，得到大黃素、
蘆薈大黃素。
實施例5、從大黃中提取大黃素、蘆薈大黃素的方法，取大黃藥材，粉碎 為粗粉，加藥材重量16倍的重量百分比濃度80%的乙醇水溶液常溫浸泡3小 時，加熱回流提取5次，每次30分種，濾過，減壓回收乙醇得浸膏；(2)浸 膏用其重量6倍的重量百分比濃度15%的硫酸水溶液水浴加熱水解50分種， 酸水液濾過去渣；(3)去渣酸水液通過聚醯胺層析柱，用40%乙醇洗脫除去雜 質，繼用70%乙醇與丙酮(體積比1 : 30 1 : 1)混合液洗脫，收集洗脫液， 減壓回收溶劑，濃縮至幹，得到蘆薈大黃素；繼用70%乙醇與丙酮(體積比1 :
i 30:i)混合液洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑，濃縮至幹，得到大黃
素、盧薈大黃素。
實施例6、大黃素在製備抗腦缺血損傷藥物方面的應用，以其製備大黃素
注射劑。製法提取所得大黃素用乙醇溶解，緩緩加入丙三醇液中，攪拌均 勻後，加注射用水至近總量時，用重量百分比濃度ly。的氫氧化鈉水溶液調PH
值至3.5 4.5，加入注射用水至總量，混合均勻，0.45um微孔濾膜濾過， 通氮氣灌封於2ml安瓿中，10(TC滅菌30min，即得。規格2ml;組成大黃 素50mg、 8%乙醇、20%丙三醇、蒸餾水；用法用量每日一次，每次1支，肌 肉注射。
實施例7、大黃素在製備抗腦缺血損傷藥物方面的應用，以其製備大黃素 片。製法提取所得大黃素粉碎成細粉，加澱粉、硬脂酸鎂、滑石粉混合均 勻，製成顆粒，壓片，包薄膜衣，即得。規格0.25g;組成蘆薈大黃素20mg、 澱粉0.2g、硬脂酸鎂0.02g、滑石粉適量；用法用量口服， 一日3次，每次l片。
實施例8、蘆薈大黃素在製備抗腦缺血損傷藥物方面的應用，以其製備盧
薈大黃素膠囊。製法提取所得蘆薈大黃素粉碎成細粉，加澱粉、滑石粉混 合均勻，製成顆粒，乾燥後裝入膠囊殼，即得。規格0.15g;組成蘆薈大 黃素0.5mg、澱粉0.14g、滑石粉適量；用法用量口服， 一日3次，每次l 粒。
實施例9、盧薈大黃素在製備抗腦缺血損傷藥物方面的應用，以其製備蘆
薈大黃素注射劑。製備方法提取所得蘆薈大黃素用乙醇溶解，緩緩加入丙 三醇液中，攪拌均勻後，加注射用水至近總量時，用重量百分比濃度1%的氫
氧化鈉水溶液調PH值至3.5 4.5，加入注射用水至總量，混合均勻，0.45 "m微孔濾膜濾過，通氮氣灌封於2ml安瓿中，10(TC滅菌30min，即得。
規格lml;組成蘆薈大黃素lmg、 5%乙醇、10%丙三醇、蒸餾水；用法用量:
每日一次，每次1支，肌肉注射。
權利要求
1、大黃素、蘆薈大黃素在製備抗腦缺血損傷藥物方面的應用，其特徵在於，以大黃素或者蘆薈大黃素為有效成分。
全文摘要
大黃素、蘆薈大黃素在製備抗腦缺血損傷藥物方面的應用，以大黃素或者蘆薈大黃素為有效成分，可製成片劑、膠囊劑、針劑(注射液)。可以改善腦缺血後的神經症狀，減輕腦組織水腫，減小腦梗塞面積，對缺血性腦損傷具有明顯的保護作用。
文檔編號A61P9/10GK101342161SQ20081021008
公開日2009年1月14日 申請日期2006年4月30日 優先權日2006年4月30日
發明者軻 劉, 劉敬霞, 李建生, 梁生旺, 鄭曉珂 申請人:河南中醫學院