一種疫苗組合物及其製備方法與流程

2023-04-28 19:06:56

本發明屬於獸用生物製品
技術領域：
，具體涉及一種疫苗組合物及其製備方法。
背景技術：
：h9n2亞型禽流感屬於低致病性禽流感，發病率高，但死亡率低。主要臨床表現僅為輕度呼吸道症狀，採食量減少，產蛋率可從90％降至20％以下，甚至絕產，對商品肉雞可導致30％左右死亡，極易與大腸桿菌混合感染，嚴重影響家禽的生產性能，給養禽業帶來嚴重的經濟損失。更重要的是，該亞型aiv可以穿越宿主障礙感染哺乳動物包括人，也有機會在人類大流行，給人類健康帶來了嚴重的威脅。目前h9n2亞型是我國雞群中存在的aiv主要亞型，佔禽流感總發病率的90％以上。各種防控措施中，疫苗免疫為最重要的措施。目前，雖然h9亞型禽流感滅活疫苗已廣泛應用，該病也得到了有效控制，但是近幾年來h9亞型禽流感在免疫雞群中時有發生。為此，通過高適應載體表達高質量的有效抗原同時減少原有的生產成本達到針對同源/非同源h9亞型aiv流行株提供免疫保護的疫苗尤為必要。我國的禽流感h9亞型主要是通過雞胚尿囊腔接種流感病毒而獲得，該生產體系具有一些缺陷，如大流行時疫苗的供給量往往受到spf雞胚數量的限制；有些毒株無法在雞胚中複製，因此難以獲得足夠量的病毒，只有雞胚適應株才能獲得高產量病毒；受體結合特異位點的變異導致抗原性降低；疫苗生產下遊技術一成不變且十分繁重、易於汙染等等。利用動物傳代細胞生產禽流感疫苗，能夠在短期內大量增殖病毒，且無外源因子汙染，能較好的維持病毒抗原穩定，彌補傳統雞胚生產體系的諸多不足。國內外現在採用的動物傳代細胞培養禽流感病毒主要是mdck細胞，且在培養過程中需要添加一定量的胰蛋白酶，這對大規模生產帶來一些繁瑣，而採用本專利所述的動物傳代細胞lmh細胞在培養流感病毒時無需添加胰蛋白酶，且培養出的流感病毒血凝價和免疫原性明顯好於mdck細胞培養的。禽i群腺病毒是家禽常見的感染病原體，呈世界性分布，目前發現所有年齡的家禽均易感，只是鑑於家禽的品種、年齡所形成的致病力不同。目前發現禽i群腺病毒對雞具有強致病性，臨床上常常出現包涵體肝炎及心包積液-肝炎症候群，該病可直接引發養雞場20-40天齡雞隻出現30％以上的死亡率，此外其臨床上也常常與傳染性支氣管炎病毒，呼腸孤病毒，h9亞型禽流感病毒等並發感染，導致種蛋雞出現明顯呼吸道病，關節炎，及嚴重的產蛋下降及畸形蛋等問題。因此目前該病已經成為嚴重影響養雞場生產性能的重大疫病之一。禽i群腺病毒中的禽腺病毒4型(fav-4)目前是世界上的研究熱點，其具備高致病性，可直接引發的心包積液-肝炎症候群(或安卡拉病)，該病於1987年首發於巴基斯坦，在不到一年的時間內殃及整個巴基斯坦肉雞養殖企業，之後在科威特、伊朗、前蘇聯，日本，中南美洲及墨西哥等地具有發生，甚至該病在鴿子也曾大面積爆發。禽呼腸孤病毒在全球的感染十分普遍，病毒可感染雞、火雞及其他禽類。病毒性關節炎主要發生於肉雞，也可發生於蛋雞和火雞。病毒的易感性與年齡有關，日齡越大易感性越低，1日齡雛雞最易感，16周齡以後顯著降低。傳播途徑分為垂直傳播與水平傳播兩種方式，其中垂直傳播的機率比較低，不同毒株的水平傳播能力差異較大，病毒可長期存在於盲腸扁桃體和跗蹠關節內，因此帶毒雞是潛在的接觸感染源。目前，禽白血病已經呈世界性分布,歐洲、亞洲、非洲、南美洲、北美洲的一些國家和地區均有禽白血病的發生,如荷蘭、瑞士、德國、法國、捷克、英國、美國、朝鮮、韓國、日本、澳大利亞、馬來西亞、哥斯大黎加、以色列、伊朗等很多國家和地區報導了禽白血病的發生，嚴重危害了這些國家的養雞業的發展。自禽白血病被報導以來，世界各國的禽白血病疫情此起彼伏，給世界養禽業造成了巨大的損失。到目前為止，還沒有有效的治療藥物，也沒有可以用於預防的疫苗，防制禽白血病難度很大。因此，國內外涉及到養禽的相關部門、企業與人員對禽白血病高度重視。在國外，一些大型肉用型種雞公司已在過去幾十年中花巨資對種雞群的alv感染開展了系統的淨化工作，已把alv的感染率降低到了非常低的程度。到20世紀的80年代，西方各主要養禽國家已經將經典的外源性alv(alv-a和alv-b)從雞群中基本消除。1987年以後世界上發達國家的大型種雞公司就宣布將外源性alv淨化了。但在中國，不同類型雞群如何實施淨化，還沒有成熟經驗。我國政府有關部門已經著手制定禽白血病的檢測技術、淨化措施等方面的示範與相關標準的研究。由於禽白血病病毒的特殊性質，導致淨化此病方面遇到極大的挑戰。因此開發一種高效的疫苗是防治和淨化該病的重要武器。目前禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型主要還是通過spf雞胚載體進行病毒增殖，病毒滴度不高且用spf雞胚載體大規模生產其生產成本非常昂貴；目前國內還沒有用傳代細胞源細胞進行該病毒增殖，進而用其生產滅活疫苗。技術實現要素：為解決上述問題，本發明提供了一種疫苗組合物及其製備方法。本發明疫苗組合物包括禽流感病毒h9亞型抗原、禽腺病毒4型抗原、禽呼腸孤2型病毒抗原和禽白血病j型抗原以及佐劑，對禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型、禽呼腸孤2型和禽白血病j型病毒均具有良好的免疫效果。本發明通過以下技術方案實現：一種疫苗組合物，所述禽流感病毒h9亞型抗原、禽腺病毒4型抗原、禽呼腸孤2型病毒抗原和禽白血病j型抗原以及佐劑。優選地，所述禽流感病毒h9亞型抗原、禽腺病毒4型抗原、禽呼腸孤2型病毒抗原和禽白血病j型抗原均為滅活全病毒抗原。所述疫苗組合物的製備方法，包括以下步驟：s1.細胞製備：將lmh細胞用胰酶消化分散，用含5～10％v/v新生牛血清和1.0～1.2％v/v雙抗的dmem培養液在37℃、5％co2培養至細胞單層後，再用無血清dmem培養液清洗細胞3次，用於禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤2型病毒接種；將df-1細胞用胰酶消化分散，用含5～10％v/v新生牛血清和0.8～1.0％v/v雙抗的dmem/f12培養液在37℃、5％co2培養至細胞單層後，再用無血清dmem培養液清洗細胞3次，用於禽白血病病毒j型接種；s2.病毒的接種和培養：分別將禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型毒種按終體積1:50～1:500接種到步驟s1製備的lmh細胞；將禽白血病病毒j型毒種按終體積1:50～1:500接種到步驟s1製備的df-1細胞，並在37℃吸附30～60分鐘後吸棄病毒液，再用細胞維持液於37℃、5％co2培養120小時，得細胞培養液；s3.病毒收集、濃縮和純化：將步驟s2得到的病變的細胞培養液凍融2～3次，於4℃、5000rpm的條件下離心8～12min，分別收集禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型、禽呼腸孤病毒2型和禽白血病病毒j型上清液，接著進行tcid50和eid50檢測，合格後，將上述上清液分別超濾濃縮，得禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型、禽呼腸孤病毒2型和禽白血病病毒j型病毒液；s4.病毒滅活：採用0.05％～0.2％福馬林滅活上述步驟s3得到的禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型、禽呼腸孤病毒2型和禽白血病病毒j型制苗病毒液，即為疫苗抗原；s5.疫苗組合物的配製，即得。優選地，所述步驟s2中細胞維持液包含dmem/f12培養液93～95％，新生牛血清2～4％，右旋糖苷0.5％～2％，甘油1～2％和雙抗0.8～1.0％。優選地，所述步驟s5疫苗組合物的配製方法，包括以下步驟：i.油相製備：按以下重量份稱取各物質：優質注射用白油90～92份，卵磷脂1～5份，硬脂酸鋁1～3份，司班-802～6份；先將白油緩慢加溫至75～85℃，待完全溶解後依次加入卵磷脂、司班-80和硬脂酸鋁，攪拌至均勻；ii.水相製備：將滅活後的禽流感病毒h9亞型抗原、滅活後禽腺病毒4型、禽呼腸孤病毒2型和禽白血病病毒j型按體積比1:1:1:1混合均勻得抗原混合液，向抗原混合液中加入滅菌後的吐溫-80、巴戟天多糖和丙氨酸，攪拌至均勻；各24份加入滅菌後的吐溫-804份，開始攪拌，使吐溫-80完全溶解為止，製成水相；iii.乳化：按油相:水相＝2:1的體積比，先將油相倒入乳化罐，攪拌轉速為10000～15000rpm，溫度10～20℃的情況下，將水相以0.2～0.8ml/s的速度加入油相中，再繼續以速度13500～17500rpm乳化3～7min，即得。優選地，所述油相中各物質及其重量份為：優質注射用白油91份，卵磷脂3份，硬脂酸鋁2份，司班-804份。優選地，所述水相中各物質重量份為：抗原混合液85～90份、吐溫2～6份、巴戟天多糖3～7份和丙氨酸1～5份。優選地，所述水相中各物質重量份為：抗原混合液88份、吐溫-804份、巴戟天多糖5份和丙氨酸3份。與現有技術相比，本發明疫苗組合物具有以下技術優點：(1)本發明疫苗組合物含有禽流感四聯滅活疫苗，對禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型、禽呼腸孤2型和禽白血病j型病毒均具有良好的免疫效果。具體實施方式下面將結合實施例進一步的詳細說明本發明。需要指出的是，以下說明僅僅是對本發明要求保護的技術方案的舉例說明，並非對這些技術方案的任何限制。本發明的保護範圍以所附權利要求書記載的內容為準。實施例1一種疫苗組合物所述疫苗組合物，由禽流感病毒h9亞型抗原、禽腺病毒4型抗原、禽呼腸孤2型病毒抗原和禽白血病j型抗原以及佐劑組成。實施例2一種疫苗組合物的製備方法所述疫苗組合物的製備方法，包括以下步驟：s1.細胞製備：將lmh細胞用胰酶消化分散，用含10％v/v新生牛血清和1.0％v/v雙抗的dmem培養液在37℃、5％co2培養至細胞單層後，再用無血清dmem培養液清洗細胞3次，用於禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤2型病毒接種；將df-1細胞用胰酶消化分散，用含10％v/v新生牛血清和1.0％v/v雙抗的dmem/f12培養液在37℃、5％co2培養至細胞單層後，再用無血清dmem培養液清洗細胞3次，用於禽白血病病毒j型接種；s2.病毒的接種和培養：分別將禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型毒種按終體積1:120接種到步驟s1製備的lmh細胞、將禽白血病病毒j型毒種按終體積1:150接種到步驟s1製備的df-1細胞，並在37℃吸附30～60分鐘後吸棄病毒液，再用細胞維持液於37℃、5％co2培養120小時，得細胞培養液；所述步驟s2中細胞維持液包含dmem/f12培養液94％，新生牛血清2％，右旋糖苷1.5％，甘油1.6％和雙抗0.9％；s3.病毒收集、濃縮和純化：將步驟s2得到的病變的細胞培養液凍融2～3次，於4℃、5000rpm的條件下離心8～12min，分別收集禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型、禽呼腸孤病毒2型和禽白血病病毒j型上清液，接著進行tcid50和eid50檢測，合格後，將上述上清液分別超濾濃縮，得禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型、禽呼腸孤病毒2型和禽白血病病毒j型病毒液；s4.病毒滅活：採用0.15％福馬林滅活上述步驟s3得到的禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型、禽呼腸孤病毒2型和禽白血病病毒j型制苗病毒液，即為疫苗抗原；s5.疫苗組合物的配製，即得；所述疫苗組合物的配製方法，包括以下步驟：i.油相製備：按以下重量份稱取各物質：優質注射用白油91份，卵磷脂3份，硬脂酸鋁2份，司班-804份；先將白油緩慢加溫至80℃，待完全溶解後依次加入卵磷脂、司班-80和硬脂酸鋁，攪拌至均勻；ii.水相製備：將滅活後的禽流感病毒h9亞型抗原、滅活後禽腺病毒4型、禽呼腸孤病毒2型和禽白血病病毒j型按體積比1:1:1:1混合均勻得抗原混合液，向抗原混合液中加入滅菌後的吐溫-80、巴戟天多糖和丙氨酸，攪拌至均勻；所述水相中各物質重量份為：抗原混合液88份、吐溫-804份、巴戟天多糖5份和丙氨酸3份。iii.乳化：按油相:水相＝2:1的體積比，先將油相倒入乳化罐，攪拌轉速為13000rpm，溫度10℃的情況下，將水相以0.6ml/s的速度加入油相中，再繼續以速度16000rpm乳化5min，即得。實施例3一種疫苗組合物的製備方法所述疫苗組合物的製備方法，包括以下步驟：s1.細胞製備：將lmh細胞用胰酶消化分散，用含5％v/v新生牛血清和1.0％v/v雙抗的dmem培養液在37℃、5％co2培養至細胞單層後，再用無血清dmem培養液清洗細胞3次，用於禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤2型病毒接種；將df-1細胞用胰酶消化分散，用含10％v/v新生牛血清和0.8％v/v雙抗的dmem/f12培養液在37℃、5％co2培養至細胞單層後，再用無血清dmem培養液清洗細胞3次，用於禽白血病病毒j型接種；s2.病毒的接種和培養：分別將禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型毒種按終體積1:50接種到步驟s1製備的lmh細胞、將禽白血病病毒j型毒種按終體積1:50接種到步驟s1製備的df-1細胞，並在37℃吸附60分鐘後吸棄病毒液，再用細胞維持液於37℃、5％co2培養120小時，得細胞培養液；所述細胞維持液包含dmem/f12培養液93％，新生牛血清2％，右旋糖苷2％，甘油2％和雙抗1.0％；s3.病毒收集、濃縮和純化：將步驟s2得到的病變的細胞培養液凍融2～3次，於4℃、5000rpm的條件下離心8～12min，分別收集禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型、禽呼腸孤病毒2型和禽白血病病毒j型上清液，接著進行tcid50和eid50檢測，合格後，將上述上清液分別超濾濃縮，得禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型、禽呼腸孤病毒2型和禽白血病病毒j型病毒液；s4.病毒滅活：採用0.2％福馬林滅活上述步驟s3得到的禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型、禽呼腸孤病毒2型和禽白血病病毒j型制苗病毒液，即為疫苗抗原。s5.疫苗組合物的配製，即得；所述疫苗組合物的配製方法，包括以下步驟：i.油相製備：按以下重量份稱取各物質：優質注射用白油90份，卵磷脂5份，硬脂酸鋁3份，司班-802份；先將白油緩慢加溫至85℃，待完全溶解後依次加入卵磷脂、司班-80和硬脂酸鋁，攪拌至均勻；ii.水相製備：將滅活後的禽流感病毒h9亞型抗原、滅活後禽腺病毒4型、禽呼腸孤病毒2型和禽白血病病毒j型按體積比1:1:1:1混合均勻得抗原混合液，向抗原混合液中加入滅菌後的吐溫-80、巴戟天多糖和丙氨酸，攪拌至均勻；所述水相中各物質重量份為：抗原混合液85份、吐溫6份、巴戟天多糖7份和丙氨酸1份；iii.乳化：按油相:水相＝2:1的體積比，先將油相倒入乳化罐，攪拌轉速為10000rpm，溫度10℃的情況下，將水相以0.2ml/s的速度加入油相中，再繼續以速度13500rpm乳化3min，即得。實施例4一種疫苗組合物的製備方法所述疫苗組合物的製備方法，包括以下步驟：s1.細胞製備：將lmh細胞用胰酶消化分散，用含10％v/v新生牛血清和1.2％v/v雙抗的dmem培養液在37℃、5％co2培養至細胞單層後，再用無血清dmem培養液清洗細胞3次，用於禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤2型病毒接種；將df-1細胞用胰酶消化分散，用含10％v/v新生牛血清和0.8％v/v雙抗的dmem/f12培養液在37℃、5％co2培養至細胞單層後，再用無血清dmem培養液清洗細胞3次，用於禽白血病病毒j型接種；s2.病毒的接種和培養：分別將禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型和禽呼腸孤病毒2型毒種按終體積1:500接種到步驟s1製備的lmh細胞、將禽白血病病毒j型毒種按終體積1:500接種到步驟s1製備的df-1細胞，並在37℃吸附30分鐘後吸棄病毒液，再用細胞維持液於37℃、5％co2培養120小時，得細胞培養液；所述細胞維持液包含dmem/f12培養液95％，新生牛血清2％，右旋糖苷0.5％，甘油1.5％和雙抗1.0％；s3.病毒收集、濃縮和純化：將步驟s2得到的病變的細胞培養液凍融2～3次，於4℃、5000rpm的條件下離心8～12min，分別收集禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型、禽呼腸孤病毒2型和禽白血病病毒j型上清液，接著進行tcid50和eid50檢測，合格後，將上述上清液分別超濾濃縮，得禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型、禽呼腸孤病毒2型和禽白血病病毒j型病毒液；s4.病毒滅活：採用0.2％福馬林滅活上述步驟s3得到的禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型、禽呼腸孤病毒2型和禽白血病病毒j型制苗病毒液，即為疫苗抗原；s5.疫苗組合物的配製，即得；所述疫苗組合物的配製方法，包括以下步驟：i.油相製備：按以下重量份稱取各物質：優質注射用白油92份，卵磷脂1份，硬脂酸鋁3份，司班-806份；先將白油緩慢加溫至85℃，待完全溶解後依次加入卵磷脂、司班-80和硬脂酸鋁，攪拌至均勻；ii.水相製備：將滅活後的禽流感病毒h9亞型抗原、滅活後禽腺病毒4型、禽呼腸孤病毒2型和禽白血病病毒j型按體積比1:1:1:1混合均勻得抗原混合液，向抗原混合液中加入滅菌後的吐溫-80、巴戟天多糖和丙氨酸，攪拌至均勻；所述水相中各物質重量份為：抗原混合液90份、吐溫2份、巴戟天多糖3份和丙氨酸1份；iii.乳化：按油相:水相＝2:1的體積比，現將油相倒入乳化罐，攪拌轉速為10000rpm，溫度10℃的情況下，將水相以0.2ml/s的速度加入油相中，再繼續以速度13500rpm乳化3min，即得。對比例1一種疫苗組合物的製備方法所述疫苗組合物的製備方法，與實施例2的區別在於所述細胞維持液中不含右旋糖苷，甘油含量增加至4％，其他步驟均與實施例2類似。對比例2一種疫苗組合物的製備方法所述疫苗組合物的製備方法，與實施例2的區別在於所述油相中不含卵磷脂，其他步驟均與實施例2類似。對比例3一種疫苗組合物的製備方法所述疫苗組合物的製備方法，與實施例2的區別在於所述水相中不含巴戟天多糖，其他步驟均與實施例2類似。試驗例1疫苗組合物中的病毒含量測定1、試驗材料：實施例2、實施例3、實施例4和對比例1的步驟s3製備的禽流感病毒h9亞型抗原、滅活後禽腺病毒4型、禽呼腸孤病毒2型和禽白血病病毒j型上清液。2、試驗方法：分別檢測實施例2、實施例3、實施例4和對比例1的步驟s3製備的禽流感病毒h9亞型抗原、滅活後禽腺病毒4型、禽呼腸孤病毒2型和禽白血病病毒j型上清液的tcid50。2.1、tcid50的檢測方法：分別將收集的禽流感病毒h9亞型抗原、滅活後禽腺病毒4型、禽呼腸孤病毒2型和禽白血病病毒j型細胞病毒液於-20℃反覆凍融兩次後，於4℃、5000rpm離心10min，取離心後上清液分別用於超濾濃縮；將上述離心後的上清液分別用50k中空纖維柱將其濃縮後，取濃縮後的病毒液用dmem細胞培養液做10倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-6、10-7、10-85個稀釋度接種48孔鋪滿單層lmh細胞培養板，每個稀釋度重複5孔，同時設立陰性對照細胞，每孔0.1ml，37℃吸附30min後，補加含1～2％新生牛血清、適量雙抗和2mm穀氨醯胺的dmem培養液0.3ml於37℃、5％co2培養120小時，觀察細胞病變(cpe)，計算tcid50；2.2、eid50的檢測方法將收集的禽流感h9亞型細胞病毒液於-20℃反覆凍融兩次後，於4℃、5000rpm離心10min，取離心後上清液保存備用。將上述離心濃縮後的禽流感病毒h9亞型上清液用pbs按照10倍系列稀釋，取10-6、10-7、10-8、10-9、10-10共5個稀釋度經尿囊腔接種spf雞胚，0.1ml/胚，每個稀釋度接種5枚雞胚，於37℃培養箱中培養觀察7天，每天記錄雞胚死亡情況，如果有死亡雞胚放入4℃冰箱保存，觀察時間結束後利用reed-muench方法計算離心收穫的上清液的eid50；2.3、ha的檢測方法：按微量法在v型血凝試驗微量板上進行，雞紅細胞濃度為1％(v/v)，反應總量均為0.050ml。3.試驗結果：試驗結果如表1所示。表1疫苗組合物中的病毒含量檢測表實施例1實施例2實施例3對比例1禽流感病毒h9亞型(tcid50)108.9108.6108.8108.2禽流感病毒h9亞型(eid50)108.8108.5108.6107.8禽流感病毒h9亞型(ha)210.12921028禽腺病毒4型(tcid50)108.9108.6108.7107.6禽呼腸孤病毒2型(tcid50)108.8108.6108.7108.0禽白血病病毒j型(tcid50)109.0108.7108.8107.7由表1可知，本發明製備得到的疫苗組合物中病毒含量高，禽流感病毒h9亞型≥108.6tcid50，禽流感病毒h9亞型≥108.5eid50，禽流感病毒h9亞型ha≥29，禽腺病毒4型≥108.6tcid50，禽呼腸孤病毒2型≥108.6tcid50，禽白血病病毒j型≥108.7tcid50，可以有效的提高禽流感病毒h9亞型、禽腺病毒4型、禽呼腸孤病毒2型和禽白血病病毒j型四聯滅活疫苗的疫苗效果。說明本發明細胞維持液中添加右旋糖苷可以有效提高病毒的增殖，增加疫苗的病毒含量，提高疫苗的疫苗效果。試驗例2疫苗效力試驗取21日齡spf雞60隻，分為六組，每組10隻，分別相應注射實施例2、實施例3、實施例4及對比例1～3製備得到的疫苗組合物，注射劑量為0.3ml/只。免疫後7、14、21、28、35、42、49天，分別測定其禽流感病毒h9亞型hi抗體效價，如表2所示。表2免疫後不同時間(天)禽流感病毒h9亞型抗體水平由表2可知，本發明製備得到疫苗組合物能夠免疫spf雞能產生高水平的抗禽流感病毒h9亞型的hi抗體，而且本發明實施例2～4疫苗組合物產生的抗禽流感病毒h9亞型的hi抗體效價均高於對比例1抗體效價，說明將右旋糖苷添加到細胞維持液中能夠增強免疫效果；本發明實施例2～4疫苗組合物產生的抗禽流感病毒h9亞型的hi抗體效價均高於對比例2、3抗體效價，說明本發明添加的佐劑對免疫原具有保護作用，同時能夠強化免疫功效。免疫後35天測定禽腺病毒4型、禽呼腸孤病毒2型和禽白血病病毒j型血清中和抗體效價，結果如表3所示。表3禽腺病毒4型、禽呼腸孤病毒2型和禽白血病病毒j型血清中和抗體效價由表3可知，本發明疫苗組合物免疫spf雞能產生高水平的禽腺病毒4型、禽呼腸孤病毒2型和禽白血病病毒j型中和抗體，且抗體效價均高於對比例1～3，因此說明本發明疫苗組合物對禽腺病毒4型、禽呼腸孤病毒2型和禽白血病病毒j型均具有良好的免疫效果。當前第1頁12