用於預防結核病和免疫治療的嵌合型dna疫苗的製作方法

2023-11-11 09:47:02 1

專利名稱：用於預防結核病和免疫治療的嵌合型dna疫苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新型結核疫苗，具體地說涉及一種能誘導和增強人或動物體內保護性免疫應答(體液免疫和細胞免疫)的嵌合DNA分子。這種DNA分子作為疫苗，用於結核病的預防和治療；同時作為免疫增強劑，能提高人或動物體內的免疫功能，達到防治病毒疾病和腫瘤的作用。
背景技術：
繼第一次和第二次世界大戰全球出現兩次結核病回升高峰之後，80年代中期，由於世界範圍內結核病疫情又急劇惡化而形成第三次回升高峰，據《世界衛生組織簡報》報導，1996年全球所有年齡死亡人數，結核病排列於缺血性心臟病、腦血管疾病和急性下呼吸道感染死亡例數之後，位居第四位，佔全球單病種引起死亡例數之首，創百年歷史之最高記錄。全球每年死於結核病的人數達300萬，每天有8000人死於結核病，每10秒種就有1人死於結核病。貧窮、流動人口、耐多藥結核病增多以及愛滋病的流行使結核病更加成為全球性的嚴重公共衛生問題(Cole ST.Why sequence the genome of Mycobacterium tuberculosis？Tubercle Lung.Dis.1996；77486-490.)，因而引起國際社會的極大關注。應用現代分子生物學方法揭示分枝桿菌的秘密是目前研究策略的中心問題。通過分析結核桿菌基因組DNA序列將獲得大量有關結核桿菌的生物信息，應用這些信息可以了解結核病的發生、發展過程，並可以加強對結核病的診斷、治療和預防新措施的研究。
卡介苗(BCG)是至今為至唯一被批准使用的預防肺結核的疫苗，每年市場使用超過1億劑。但是卡介苗卻不是理想的疫苗。雖然卡介苗對兒童有一定的保護作用，它對成人卻沒有效用。
目前使用的卡介苗已經過度軟化。卡介苗是活菌疫苗。自從卡介苗由法國人在1908-1921年研製成功以後，菌株被各國實驗室在培養液中連續傳代，一直到1961年低溫(零下80度)冰箱的出現才被低溫保存。最近的基因庫(Genome)研究表明，目前在全世界使用的十幾種卡介苗已經不再是同一菌株，許多基因片段已經失落。這是造成卡介苗保護效應減弱的原因之一，也解釋了為什麼早期的臨床實驗，卡介苗表現出很好的保護性(1930年，英國，80％保護率)，而後期卡介苗結果遠不盡人意(1970年，印度，0％保護率)(劉軍，加拿大國家衛生院。肺結核(TB)的診斷與預防新技術 中國防癆雜誌。2003，25，增刊20-22)；1995年WHO也發表聲明指出，BCG複種沒有科學依據，所以不提倡複種。BCG免疫失敗也與下列因素有關(Baldwin SL，D』Souza C，Roberts A D，et al.Evaluation of new vaccines in themouse and guinea pig model of tuberculosis.Infect.Immun.1998，66(6)2951-2959.)(1)BCG不能提高由於其他因素已具有免疫力人群的保護水平，(2)個體隨著年齡增長，有可能繼續接觸到周圍環境的分支桿菌抗原，從而將該免疫反應從Th1型推向Th2型(這就是BCG預防兒童結核效果良好，而對成人效果差的主要原因)。鑑於這種情況，一種合格的新疫苗應該可以恢復到Th1型的保護性和記性免疫狀態；因此，研製安全、有效、價廉的新一代疫苗成為一項緊迫而重要的工作。
熱休克蛋白(heat shock protein，hsp)是一類具有重要生物和免疫功能的高度保守的蛋白質，存在於原核和真核細胞中。分支桿菌hsp70包含多個T細胞和B細胞表位，免疫原性非常強，具有免疫優勢抗原(immunodominant antigen)的特點，能誘導出特異性Th1型細胞反應，並產生r-幹擾素(r-IFN)和白細胞介素12，對結核桿菌的攻擊可產生較強的保護性免疫效應(Mckenzie.KR，Adams E，BrittonWJ，et al.Sequence and immunogenicity of the 70-kDa heat shock protein ofMycobacterium leprae.J.Immune.1991；147312-319.)。
B7-1(B7-1)是重要的具有免疫活化功能的共刺激分子(costimulatory molecule)之一。近年來對免疫調控的研究表明，T細胞活化時，必需兩個信號，即T細胞受體(TCR)與抗原遞呈細胞(APCs)表面的MHC-Ag結合產生的第一信號，和由共刺激分子提供的第二信號(協同刺激信號)，如果缺乏協同刺激信號，T細胞則不能被完全活化而呈現無反應狀態(Anergy)，或者出現細胞凋亡(Apoptosis)。B7-1(與其共刺激受體CD28和/或CTLA-4間相互作用可提供T細胞活化所必需的協同刺激信號，誘導T細胞產生r-IFN，對體液免疫和細胞免疫具有全面的活化作用，通過實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)模型，證明B7-1可以促進Th1型細胞反應(Orme I M.Progress in the development of new vaccines against tuberculosis.Int.J.Tuberc.Lung.Dis.1997；1(2)95-100和Lenschow DJ，Walunas TL andBluestone J A.CD28/B7 system of Tcell costimulation.Annu.Rev.Immunol 1996；14233.)。
r-IFN主要由T細胞產生；主要活性是參與免疫調節，是體內重要的免疫調節因子，通過增強機體免疫機制、加強免疫監督功能來實現其抗病毒、抗腫瘤作用。r-IFN的免疫調節作用表現在對宿主免疫細胞的活性的影響，如對巨噬細胞可使其表面MHCII類分子的表達，增強其抗原遞呈能力；此外還能增強巨噬細胞表面表達Fc受體，促進巨噬細胞吞噬免疫復活物、抗體包被的病原體和腫瘤細胞。同時，對B細胞和CD8+T細胞的分化有促進作用，能增強Th1細胞的活性，增強細胞免疫功能(Hathcock KS，Laszlo G，Pucillo C，et al. Comparitive analysis of B7-1 and B7-2costimulatory ligandsExpression and function.J.Exp.Med.1994；180631-640.)。

發明內容
由於BCG不能將免疫狀態從TH2型轉向TH1型，導致了BCG作為疫苗預防結核病所存在的缺陷性，本發明的目的是通過選擇分支桿菌hsp70基因與人B7-1基因在分子水平進行嵌合，構建成新型結核病DNA疫苗；其中hsp70提供免疫特異性信號，誘導出特異性Th1型細胞反應，產生r-IFN和白介素-12；B7-1提供第二信號即協同刺激信號，間接誘導T細胞產生r-IFN，全面活化細胞和體液免疫。通過兩者的共同作用，將人和動物的免疫狀態由Th2型推向Th1型，達到預防和治療結核病和其他感染性疾病的效果。
根據本發明的一方面，本發明的新型DNA疫苗包含如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的全長開放讀碼框架，及其保守性變異體，SEQ ID NO.1中包含了分支桿菌hsp70基因與人B7-1基因，該兩個基因之間通過設計一接頭序列(SEQ ID NO.3)將二者連接。
在本發明中，術語「全長開放讀碼框架」是指不受終止密碼幹擾的閱讀框架，其來源一般是從DNA順序中推論得出的。
術語「保守性變異體」是指相同或不同生物體中編碼相同產物的同工基因，如結核桿菌hsp60、hsp65，麻風桿菌hsp70等。
本發明設計的用於合成SEQ ID NO.1序列的共有P3～P8六條引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6～11所示。其中用於擴增分枝桿菌部分hsp70基因和接頭的引物組合，上遊引物P3(SEQ ID NO.6)為一條長30個核苷酸的單鏈DNA，下遊引物P4(SEQ ID NO.7)為一條長76個核苷酸(含接頭)的單鏈DNA。上遊引物P3的鹼基序列與SEQ ID NO1開放讀碼框架1593-1623位核苷酸相同，並在其5』端設計酶切位點；下遊引物P4的鹼基序列與SEQ ID NO1開放讀碼框架1844～1920位核苷酸相同，含SEQ ID NO3的負鏈序列，以質粒pcDNA3.1(+)-hsp70為模板進行擴增分枝桿菌部分hsp70基因及接頭。
用於擴增人B7-1基因和部分接頭的引物組合，上遊引物P5(SEQ ID NO.8)為一長53個核苷酸的單鏈DNA，下遊引物P6(SEQ ID NO.9)為一長39個核苷酸的單鏈DNA。上遊引物P5的鹼基序列與SEQ ID NO1開放讀碼框架1896-1948位核苷酸相同，在其5』端為SEQ ID NO3之3』端24個核苷酸(部分接頭序列)；下遊引物P6的鹼基序列與SEQ ID NO1開放讀碼框架2745～2784位核苷酸相同，在終止密碼TAA後設計有酶切位點，以質粒pcDNA3.1(+)-B7-1為模板擴增人B7-1基因和部分接頭。將以上兩段目的基因作為模板用P3和P6進行第三次擴增，將所得目的基因定向插入進經酶切真核細胞表達載體pcDNA3.1(+)中，構建成pcDNA3.1(+)和含部分hsp70-B7-1質粒。
pcDNA3.1(+)-hsp70用KpaI酶切後所獲得的目的基因連入pcDNA3.1(+)和含部分hsp70-B7-1質粒中，構建成pcDNA3.1(+)Hsp70/B7-1嵌合質粒嵌合基因。
在下面的擴增中，上遊引物P7(SEQ ID NO.10)的鹼基序列與SEQ ID NO1開放讀碼框架1-21位核苷酸相同，並在其5』端設計酶切位點；下遊引物P8(SEQID NO.11)的鹼基序列與SEQ ID NO1開放讀碼框架2764～2784位核苷酸相同，在終止密碼TAA後設計有酶切位點。用以上所構建pcDNA3.1(+)Hsp70/B7-1嵌合質粒的作為摸板，擴增出hsp70/B7-1嵌合目的基因。
將hsp70/B7-1DNA轉染真核細胞，提取mRNA進行逆轉錄PCR，擴增產物顯示有hsp70/B7-1基因表達。
hsp70/B7-1嵌合DNA疫苗接種小鼠，用結核桿菌強毒株攻擊，觀察該疫苗對結核桿菌感染的預防作用；並進行先用結核桿菌強毒株攻擊，形成小鼠結核模型後，用hsp70/B7-1嵌合DNA疫苗進行治療，觀察小鼠的血清IFN-γ產生水平和肝、脾組織塗片細菌計數及組織培養菌落計數。以hsp70/B7-1嵌合DNA疫苗免疫和治療獼猴結核模型，通過CT肺掃描，觀察其免疫保護和治療作用。
本發明的SEQ ID No1中所包含的分支桿菌hsp70基因，可通過多種方法獲得。如本領域內熟知的①克隆化基因(含hsp70基因的質粒)酶切、聚合酶鏈(PCR)擴增，或②提取分支桿菌基因組後PCR擴增。在本發明的一個實施方案中，hsp70基因來源於結核桿菌強毒株H37RV基因組DNA，經PCR擴增，將獲得的擴增產物酶切後連入pcDNA3.1(+)，獲得真核表達質粒pcDNA3.1(+)-hsp70。
本發明的SEQ ID No1所包含的人B7-1基因，也可通過多種方法獲得。如①克隆化基因(含人B7-1基因)酶切、聚合酶鏈(PCR)擴增，或②提取外周血單個核細胞總RNA，逆轉錄cDNA，然後進行PCR擴增，或③用特異性探針，從相應cDNA文庫中獲取，或商購。在本發明的一個實施方案中，採用人工合成的PCR引物，以上述pcDNA3.1(+)-hsp70為模板，合成hsp70/B7-1嵌合基因。
本發明的嵌合基因序列中，通過PCR擴增，在hsp70與B7-1之間插入了SEQID No3序列，該段DNA序列所編碼的胺基酸殘基序列為(GGGGS)3，因為其獨特的理化特性，可以在整個SEQ ID No1編碼的分支桿菌hsp70和人B7-1蛋白質之間，形成一段鋼性間隔，將hsp70和人B7-1分開，使它們在空間結構上互不幹擾，能形成各自的天然構像，發揮各自生物學功能。
根據本發明的另一方面，提供含有本發明SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的表達載體。在本發明的一個實施方案中，採用質粒pcDNA3.1(+)為載體，通過限制性內切酶酶切，將獲得的嵌合基因裝載入質粒中，構建成表達載體。除質粒pcDNA3.1(+)外，其它多種表達載體系統可用於SEQ ID No1的表達，這些載體包括它真核表達質粒、腺病毒和腺相關病毒、逆轉錄病毒等，這些載體一旦克隆了SEQ ID No1全長開放讀碼框架，可在機體內起到相同或類似的作用。採用本領域內技術人員熟知的方法可用於構建含SEQ ID No1全長開放讀碼框架表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、合成技術和體內重組/基因重組。見如由Maniatis等，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，N.Y.，第12章(1982)所述。
本發明還提供包含本發明表達載體的宿主細胞，多種宿主表達載體系統可用於體外表達DNA，這些系統包括但不限於以含有SEQ ID No1序列的重組噬菌體DNA、質粒DNA或粘粒DNA表達載體轉化的微生物如細菌；以含有SEQ ID No1序列的表達載體的重組酵母菌；以含有SEQ ID No1序列的表達載體的重組表達病毒表達載體(如杆狀病毒)感染的昆蟲細胞系統；以含有SEQ ID No1序列的表達載體的重組表達病毒表達載體(如腺病毒、腺相關病毒或逆轉錄病毒)感染的動物細胞系統。其實驗方法如酶切、連接、轉化、PCR等也為本分子生物學領域熟知的方法。
本發明的疫苗可以以裸DNA的形式直接免疫動物，經宿主肌細胞攝取，利用宿主細胞表達系統在體內表達除了能直接在體內表達相應蛋白質，還可在體外真核細胞中表達相應蛋白質，採用適當方法分離純化的蛋白質，注射機體後，也能產生相同或類似的作用，因此本發明還包含了SEQ ID NO.1所編碼的胺基酸序列，該序列如SEQ ID NO.2所示。
根據本發明的又一方面，提供一種藥物組合物，其含有本發明的DNA嵌合疫苗和藥學上可接受的載體和賦形劑。
本發明還提供含有SEQ ID NO.1序列的嵌合DNA疫苗的應用，本發明的疫苗可用於結核病的預防和治療，還可作為免疫增強劑，用於提高免疫功能。
本發明提供製備一種新型結核疫苗的設計思想、技術路線，特別涉及用於人和動物體內誘導和增強保護性免疫應答(體液免疫和細胞免疫)的DNA。選擇分枝桿菌hsp70和人的B7-1基因在分子水平進行嵌合，構建新型結核疫苗，其中hsp70提供免疫特異性信號，誘導出特異性Th1型細胞反應產生，r-IFN和白介素12；B7-1提供第二信號即協同刺激信號，間接誘導T細胞產生r-IFN，全面活化細胞和體液免疫。通過兩者的共同作用，將人和動物的免疫狀態由Th2型推向Th1型。
本發明的疫苗可用於結核桿菌所致的結核病；或者在體外真核細胞中表達相應的蛋白質，用作預防和治療結核病，特別是對耐多藥結核病(MDR-TB)的治療；本發明的疫苗也可作為一種免疫增進劑，用於相應的病毒性疾病以及腫瘤的免疫治療。
附圖的簡要說明

圖1為hsp/B7-1嵌合型質粒構建路線圖；圖2為pcDNA3.1(+)載體圖譜；圖3為分支桿菌hsp70-接頭-人B7-1全基因序列開放讀碼框架(SEQ ID NO1)，起始密碼子和終止密碼子均表示為黑體下劃線；圖4為pcDNA3.1(+)-hsp70/B7-1嵌合質粒構建的PCR鑑定圖；
圖5為pcDNA3.1(+)-hsp70/B7-1嵌合質粒的酶切鑑定圖；圖6為pcDNA3.1(+)hsp70/B7-1嵌合DNA在COS.7細胞中的表達產物瓊脂糖凝膠電泳圖。
具體實施例方式
下面，結合附圖，通過對本發明較佳實施方式的描述，詳細說明但不限制本發明。
實施例1pcDNA3.1(+)-hsp70/B7-1嵌合質粒的構建。
參見圖1和圖2主要實驗材料一、質粒和菌株；pcDNA3.1(+)-B7-1(含人B7-1編碼基因及兩側調控基因)和質粒pcDNA3.1(+)購置於Invitrogen，工程菌Dh5α購置上海生工生物工程公司。
二、寡核苷酸引物設計根據發表的人結核桿菌H37Rv株hsp70的基因序列(Mckenzie.KR，Adams E，Britton WJ，et al.Sequence and immunogenicity of the 70-kDa heatshock protein of Mycobacterium leprae.J.Immune.1991；147312-319.)和人B7-1序列(GenBank accession number NM005191)設計。
1.重組pcDNA3.1(+)-hsp70質粒引物P1(SEQ ID NO.4)5′ggagccATGGCTCGTGCGGTCGGGATC 3′(含BamHI位點和起始密碼ATG)P2(SEQ ID NO.5)5′gaattcATGGCTCGTGCGGTCGGGATC3′(含EcoRI位點)。
2.hsp70-linker-B7-1引物P3GGTGGTTCGAAggtaccTGAAGACACGCTG，位於hsp70序列的1604bp處(含KapI位點)；P4ACTCCCTCCGCCACCGCTCCCTCCGCCACCACTCCCTCCGCCACCCTTGGCCTCCCGGCCGTCGTCGACCACCTCC畫線部分為linkerP5GGAGGGAGCGGTGGCGGAGGGAGTGGCCACACACGGAGGCAGGGAACATCACC畫線部分為linker互補序列P6GACACtctagaTTATACAGGGCGTACACTTTCCCTTCTC(含XbaI位點和終止密碼TTA)3.重組pcDNA3.1(+)hsp70/B7-1質粒鑑定引物P75′aagcttATGGCTCGTGCGGTCGGGATC 3′(含HindIII位點和起始密碼ATG)P85′tctagaTTATACAGGGCGTACACTTTC 3′(含XbaI位點和終止密碼TTA)以上引物均由上海生工生物工程公司合成。
三、相關酶限制性內切酶、Taq+Pfu酶購自上海生工生物工程公司；T4 DNA連接試劑盒購自寶生物大連公司。
四、質粒提取試劑盒購自上海華舜公司，用於質粒提取。
五、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自上海華舜公司，用於DNA電泳產物的回收。
六、PCR產物純化試劑盒為上海華舜公司產品，用於PCR產物的純化。
七.真核細胞mRNA提取試劑和盒以及RT-PCR試劑盒為上海生工產品。
八.COS-7細胞購置於中國科學院上海細胞庫。
九、結核桿菌強毒株H37Rv，由四川省結核病防治研究所惠贈。
十.陽離子脂質體轉染試劑盒購置與深圳晶美公司。
十一.一步法RT-PCR試劑為上海生工生物工程公司產品十二.實驗動物C57BL小鼠，清潔級；購置於重慶醫科大動物研究所。獼猴，2級；購置於中國科學院蘇州西山實驗動物中心。
實驗方法1.Hsp70目的基因的準備提取結核桿菌強毒株H37RV基因組DNA，進行PCR擴增，其反應體系為H37RV基因組DNA2μl5′引物溶液(P1) 3μl3′引物溶液(P2) 3μldNTP 2.5μlTaq+Pfu酶 1μl10×PCR緩衝液 5μl滅菌雙蒸水33.5μl2.
為50μl體系，PCR條件參數為94℃預變性5分鐘，熱啟動後轉為94℃變性1分鐘，56℃退火1分鐘，72℃延伸1.5分鐘，進行25個循環後，72℃延伸10分鐘。反應所得片段大小約1875bp，取5μl電泳。並送上海生工生物公司分別測序證實。PCR產物的純化按上海華舜公司小量PCR產物純化試劑盒提供的說明書進行。
2.pcDNA3.1(+)質粒的提取按上海華舜公司的小量質粒提取試劑盒操作，BamHI和EcoRI雙酶切載體質粒pcDNA3.1(+)，BamHI和EcoRI雙酶切hsp70目的基因，連入pcDNA3.1(+)，採用大連寶生物公司的連接試劑盒，獲得真核表達質粒pcDNA3.1(+)-hsp70。
3.hsp70/B7-1目的基因的準備三次PCR反應。
第一次PCR反應(獲取部分Hsp70-linker)，反應體系為pcDNA3.1(+)-hsp70質粒DNA6.01μM 2μl5′引物溶液(P1) 17.5μM 3μl3′引物溶液(P2) 10mM 3μldNTP 2.5μlTaq+Pfu酶 1μl10×PCR緩衝液 5μl滅菌雙蒸水 33.5μl第二次PCR反應(獲取linker-B7-1)，反應體系為6.01μM質粒pcDNA3.1(+)-B7-1 2μl溶液3μl16.6μM5′引物溶液(P3) 3μl16.0μM3′引物溶液(P4) 2.5μl10mM dNTP 1μlTaq+Pfu酶 5μl10×PCR緩衝液 33.5μl滅菌雙蒸水均為50μl體系，PCR條件參數為94℃預變性5分鐘，熱啟動後轉為94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘，進行25個循環後，72℃延伸10分鐘。第一次PCR反應所得片段大小約327bp，第二次PCR反應所得片段大小約915bp，取5μl電泳。同時以滅菌雙蒸水作空白對照。並送上海生工生物公司分別測序證實。PCR產物的純化按上海華舜公司小量PCR產物純化試劑盒提供的說明書進行。
第三次PCR反應(獲取部分hsp70-linker-B7-1目的基因)，反應體系如下第一次PCR產物(純化) 2μl第二次PCR產物(純化) 2μl16.0μM5′引物溶液(P1) 3μl16.0μM3′引物溶液(P4) 3μl10mM dNTP 2.5μlTaq+Pfu酶 1μl10×PCR緩衝液 5μl滅菌雙蒸水 31.5μl50μl反應體系，PCR條件參數為94℃5分鐘，45℃2分鐘，70℃10分鐘，進行1個循環後，轉為94℃2分鐘，50℃2分鐘，70℃2分鐘，進行25個循環後，72℃延伸10分鐘。取全部PCR產物電泳，發現所得片段中包括大小約1197bp的片段。同時以滅菌雙蒸水作空白對照。PCR產物的膠回收按前述方法將約1197bp的片段進行膠回收，取5μl電泳可見相應電泳帶，嵌合基因經KpaI和XbaI雙酶切後，65℃滅活獲得了部分hsp70接頭B7-1，目的基因cDNA準備完成。
4.KpaI和XbaI雙酶切載體質粒pcDNA3.1(+)，與第三次PCR產物連接，採用大連寶生物公司的連接試劑盒，按說明書操作；構建成pcDNA3.1(+)部分hsp70(327bp)-Linker-B7-1質粒。
5.KpaI單酶切pcDNA3.1(+)-hsp70，獲得1.6KbHsp70基因；KpaI單酶切pcDNA3.1(+)部分hsp70(327bp)-Linker-B7-1質粒，將1.6KbHsp70基因連入其中。採用大連寶生物公司的連接試劑盒，按說明書操作；構建成pcDNA3.1(+)hsp70-Lenker-B7-1質粒。用上述連接產物轉化大腸桿菌DH5α，按《分子克隆》的方法進行。並送上海生工生物公司測序(序列如圖3)證實嵌合真核表達質粒pcDNA3.1(+)hsp70/B7-1構建成功。
構建過程中進行鑑定的瓊脂糖電泳圖如圖4和圖5所示。
實施例2pcDNA3.1(+)hsp70/B7-1嵌合DNA在真核細胞中的表達將pcDNA3.1(+)hsp70/B7-1嵌合DNA用脂質體包裹轉染真核細胞(COS.7)，24.48.72小時提取細胞mRNA進行RT-PCR，取產物進行瓊脂糖電泳，見目的帶(圖6)。
實施例3pcDNA3.1(+)hsp70/B7-1嵌合DNA疫苗對小鼠的免疫預防效果研究動物預防實驗DNA疫苗的接種實驗動物6-8周齡、清潔級的健康小鼠C57BL/6N(購自重慶醫科大學動物實驗中心)。每組8隻，雌雄各半，分為實驗組和對照組，實驗組分別注射pcDNA.3.1(+)、pcDNA.3.1(+)-hsp70、pcDNA.3.1(+)-hsp70/B7-1 100μg(0.5ml)，BCG按體重注射；對照組注射生理鹽水0.5ml。注射部位均為兩側脛前肌，每側劑量各半。接種3周和6周各自按原方案加強接種一次。第三次免疫後三周每隻小鼠用H37RV尾靜脈注射104-105CFU。
實施例4動物治療實驗小鼠分組、疫苗接種及H37RV攻擊方法、均與「先免疫後感染的動物實驗」相同。唯在本次實驗中，攻擊轉染結核桿菌在前，相應的DNA疫苗的接種在後(對照組則僅注射生理鹽水)，疫苗接種時間為H37RV攻擊後的第7天和第14天各一次。
IL-4、γ-INF的體外檢測預防組在H37RV尾靜脈注射兩周，治療組第二次疫苗接種後14天後處死動物，取血清進行檢測，檢測方法按晶美公司小鼠ELISA檢測試劑盒說明書。
病理改變觀察觀察小鼠肝、脾組織塗片、切片病理改變及以及培養結核桿菌記數。
統計學處理方法採用SPSS for windows10.0統計軟體包進行數據處理。
研究結果1.γ-IFN、IL-4的體外檢測用ELISA法檢測接受接種pcDNA3、pcDNA3-hsp70、pcDNA3-hsp70/B7-1、BCG、生理鹽水各組小鼠血清中γ-IFN、IL-4。
表1γ-IFN、IL-4的體外檢測(X±SD)γ-IFN(pg/ml) IL-4(pg/ml)組別預防 治療 預防 治療生理鹽水146.58±62.41 132.66±74.68 141.86±81.23 20.61±7.65(n＝8)BCG134.74±55.32 121.54±56.39 175.70±72.35 45.32±9.45(n＝8)pcDNA3516.94±58.76△192.00±64.38 171.25±63.24 106.67±34.12△(n＝8)hsp70542.82±92.34△542.33±99.77△1224.38±98.64△215.44±61.25△(n＝8)hsp70/B7-13230.80±114.35▲1336.98±129.61423.70±86.19 843.57±97.34▲△(n＝8)△4注▲與生理鹽水、BCG、pcDNA3和HSP70比較，p＜0.001；△與生理鹽水、BCG比較，p＜0.01。
1.病理觀察預防組在H37RV尾靜脈注射兩周，治療組第二次疫苗接種後14天後處死動物取肝、脾組織研磨後培養，並取少量組織進行塗片。
表2肝、脾組織塗片(Z-N染色)肝組織塗片 脾組織塗片組別預防 治療預防 治療生理鹽水++++ ++++++++ ++++(n＝8)BCG++++++++++(n＝8)pcDNA3++++△+++++(n＝8)hsp70+△++△+△+△(n＝8)hsp70/B7-1-▲+▲-▲-▲(n＝8)注，+為50個菌落以下，++為500個菌落以下，+++為1000個菌落以下，++++為5000個菌落以上。▲與其他組比較，p＜0.01；△與其他組(無標記)比較，p＜0.05表3.肝、脾結核菌培養菌落記數肝組織 脾組織組別預防治療 預防治療生理鹽水+++ ++++ ++++++++(n＝8)BCG+++ ++++ ++ ++(n＝8)pcDNA3+++ ++ +++ +++(n＝8)hsp70++ ++ + +(n＝8)hsp70/B7-1+ + + +(n＝8)注，+為50個菌落以下，++為500個菌落以下，+++為1000個菌落以下，++++為5000個菌落以上。
實施例5hsp70/B7-1嵌合DNA疫苗的免疫獼猴預防效果研究動物預防實驗組DNA疫苗的接種實驗動物獼猴、2級，(購自中國科學院蘇州西山實驗動物中心)。每組2隻，雌雄各半；分為hsp70/B7-1嵌合DNA疫苗預防組、BCG預防組、感染組和正常對照組；實驗組注射pcDNA.3.1(+)-hsp70/B7-1500μg(1ml)，BCG按體重注射；對照組注射生理鹽水1ml。注射部位均為右臂三角肌。實驗組接種3周和6周各自按原方案加強接種一次。第三次免疫後三周每隻獼猴用結核桿菌強毒株H37RV肘靜脈注射50CFU。攻擊後一月用螺旋CT掃描，見BCG預防組雙肺散在結節影大小為1-5mm左右，感染組已出現數1-10mm個空洞，hsp70/B7-1嵌合DNA疫苗預防組只見下肺野少許結節；第二、三個月用螺旋CT掃描雙肺結節逐漸減少；然後每兩個月一次螺旋CT掃描雙肺，6個月後見結節明顯減少並吸收；生理鹽水組為正常胸部改變。
實施例6hsp70/B7-1嵌合DNA疫苗的免疫獼猴治療效果研究動物治療實驗組4隻獼猴，雌雄各半，用結核桿菌強毒株H37RV肘靜脈注射50CFU。攻擊後一月用螺旋CT掃描，見雙肺瀰漫分布大小不等之結節。2隻獼猴，雌雄各半用hsp70/B7-1嵌合DNA疫苗500ug/ml進行治療，每三周注射一次；2隻獼猴，雌雄各半每天用異煙肼50mg、利副平75mg、吡秦醯氨125mg、鏈黴素100mg治療，一月後用螺旋CT掃描結果無明顯改變，第二、三個月用螺旋CT掃描雙肺結節逐漸減少；然後每兩個月一次螺旋CT掃描雙肺結節明顯減少並逐漸吸收；6各月後見雙肺hsp70/B7-1嵌合DNA疫苗組結核結節有一定的吸收；與抗癆藥物組相比較有一定治療作用。
序列ST25 txtSEQUENCE LISTING110 鍾，森丁，慧忠史，小玲鍾，林120用於預防結核病和免疫治療的嵌合型DNA疫苗130A209516013170PatentIn version 3.121012112784212DNA213人工序列(Artificial)220
221CDS222(4)..(2781)223
4001atg gct cgt gcg gtc ggg atc gac ctc ggg acc acc aac tcc gtc gtc 48Ala Arg Ala Val Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Asn Ser Val Val1 5 10 15tcg gtt ctg gaa ggt ggc gac ccg gtc gtc gtc gcc aac tcc gag ggc 96Ser Val Leu Glu Gly Gly Asp Pro Val Val Val Ala Asn Ser Glu Gly20 25 30tcc agg acc acc ccg tca att gtc gcg ttc gcc cgc aac ggt gag gtg 144Ser Arg Thr Thr Pro Ser Ile Val Ala Phe Ala Arg Asn Gly Glu Val35 40 45ctg gtc ggc cag ccc gcc aag aac cag gca gtg acc aac gtc gat cgc 192Leu Val Gly Gln Pro Ala Lys Asn Gln Ala Val Thr Asn Val Asp Arg50 55 60acc gtg cgc tcg gtc aag cga cac atg ggc agc gac tgg tcc ata gag 240Thr Val Arg Ser Val Lys Arg His Met Gly Ser Asp Trp Ser Ile Glu65 70 75att gac ggc aag aaa tac acc gcg ccg gag atc agc gcc cgc att ctg 288Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Thr Ala Pro Glu Ile Ser Ala Arg Ile Leu
80 85 90 95atg aag ctg aag cgc gac gcc gag gcc tac ctc ggt gag gac att acc 336Met Lys Leu Lys Arg Asp Ala Glu Ala Tyr Leu Gly Glu Asp Ile Thr100 105 110gac gcg gtt atc acg acg ccc gcc tac ttc aat gac gcc cag cgt cag 384Asp Ala Val Ile Thr Thr Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ala Gln Arg Gln115 120 125gcc acc aag gac gcc ggc cag atc gcc ggc ctc aac gtg ctg cgg atc 432Ala Thr Lys Asp Ala Gly Gln Ile Ala Gly Leu Asn Val Leu Arg Ile130 135 140gtc aac gag ccg acc gcg gcc gcg ctg gcc tac ggc ctc gac aag ggc 480Val Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala Tyr Gly Leu Asp Lys Gly145 150 155gag aag gag cag cga atc ctg gtc ttc gac ttg ggt ggt ggc act ttc 528Glu Lys Glu Gln Arg Ile Leu Val Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe160 165 170 175gac gtt tcc ctg ctg gag atc ggc gag ggt gtg gtt gag gtc cgt gcc 576Asp Val Ser Leu Leu Glu Ile Gly Glu Gly Val Val Glu Val Arg Ala180 185 190act tcg ggt gac aac cac ctc ggc ggc gac gac tgg gac cag cgg gtc 624Thr Ser Gly Asp Asn His Leu Gly Gly Asp Asp Trp Asp Gln Arg Val195 200 205gtc gat tgg ctg gtg gac aag ttc aag ggc acc agc ggc atc gat ctg 672Val Asp Trp Leu Val Asp Lys Phe Lys Gly Thr Ser Gly Ile Asp Leu210 215 220acc aag gac aag atg gcg atg cag cgg ctg cgg gaa gcc gcc gag aag 720Thr Lys Asp Lys Met Ala Met Gln Arg Leu Arg Glu Ala Ala Glu Lys225 230 235gca aag atc gag ctg agt tcg agt cag tcc acc tcg atc aac ctg ccc 768Ala Lys Ile Glu Leu Ser Ser Ser Gln Ser Thr Ser Ile Asn Leu Pro240 245 250 255tac atc acc gtc gac gcc gac aag aac ccg ttg ttc tta gac gag cag 816Tyr Ile Thr Val Asp Ala Asp Lys Asn Pro Leu Phe Leu Asp Glu Gln260 265 270ctg acc cgc gcg gag ttc caa cgg atc act cag gac ctg ctg gac cgc 864Leu Thr Arg Ala Glu Phe Gln Arg Ile Thr Gln Asp Leu Leu Asp Arg275 280 285
act cgc aag ccg ttc cag tcg gtg atc gct gac acc ggc att tcg gtg 912Thr Arg Lys Pro Phe Gln Ser Val Ile Ala Asp Thr Gly Ile Ser Val290 295 300tcg gag atc gat cac gtt gtg ctc gtg ggt ggt tcg acc cgg atg ccc 960Ser Glu Ile Asp His Val Val Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Met Pro305 310 315gcg gtg acc gat ctg gtc aag gaa ctc acc ggc ggc aag gaa ccc aac1008Ala Val Thr Asp Leu Val Lys Glu Leu Thr Gly Gly Lys Glu Pro Asn320 325 330 335aag ggc gtc aac ccc gat gag gtt gtc gcg gtg gga gcc gct ctg cag1056Lys Gly Val Asn Pro Asp Glu Val Val Ala Val Gly Ala Ala Leu Gln340 345 350gcc ggc gtc ctc aag ggc gag gtg aaa gac gtt ctg ctg ctt gat gtt1104Ala Gly Val Leu Lys Gly Glu Val Lys Asp Val Leu Leu Leu Asp Val355 360 365acc ccg ctg agc ctg ggt atc gag acc aag ggc ggg gtg atg acc agg1152Thr Pro Leu Ser Leu Gly Ile Glu Thr Lys Gly Gly Val Met Thr Arg370 375 380ctc atc gag cgc aac acc acg atc ccc acc aag cgg tcg gag act ttc1200Leu Ile Glu Arg Asn Thr Thr Ile Pro Thr Lys Arg Ser Glu Thr Phe385 390 395acc acc gcc gac gac aac caa ccg tcg gtg cag atc cag gtc tat cag1248Thr Thr Ala Asp Asp Asn Gln Pro Ser Val Gln Ile Gln Val Tyr Gln400 405 410 415ggg gag cgt gag atc gcc gcg cac aac aag ttg ctc ggg tcc ttc gag1296Gly Glu Arg Glu Ile Ala Ala His Asn Lys Leu Leu Gly Ser Phe Glu420 425 430ctg acc ggc atc ccg ccg gcg ccg cgg ggg att ccg cag atc gag gtc1344Leu Thr Gly Ile Pro Pro Ala Pro Arg Gly Ile Pro Gln Ile Glu Val435 440 445act ttc gac atc gac gcc aac ggc att gtg cac gtc acc gcc aag gac1392Thr Phe Asp Ile Asp Ala Asn Gly Ile Val His Val Thr Ala Lys Asp450 455 460aag ggc acc ggc aag gag aac acg atc cga atc cag gaa ggc tcg ggc1440Lys Gly Thr Gly Lys Glu Asn Thr Ile Arg Ile Gln Glu Gly Ser Gly465 470 475
ctg tcc aag gaa gac att gac cgc atg atc aag gac gcc gaa gcg cac1488Leu Ser Lys Glu Asp Ile Asp Arg Met Ile Lys Asp Ala Glu Ala His480 485 490 495gcc gag gag gat cgc aag cgt cgc gag gag gcc gat gtt cgt aat caa1536Ala Glu Glu Asp Arg Lys Arg Arg Glu Glu Ala Asp Val Arg Asn Gln500 505 510gcc gag aca ttg gtc tac cag acg gag aag ttc gtc aaa gaa cag cgt1584Ala Glu Thr Leu Val Tyr Gln Thr Glu Lys Phe Val Lys Glu Gln Arg515 520 525gag gcc gag ggt ggt tcg aag gta cct gaa gac acg ctg aac aag gtt1632Glu Ala Glu Gly Gly Ser Lys Val Pro Glu Asp Thr Leu Asn Lys Val530 535 540gat gcc gcg gtg gcg gaa gcg aag gcg gca ctt ggc gga tcg gat att1680Asp Ala Ala Val Ala Glu Ala Lys Ala Ala Leu Gly Gly Ser Asp Ile545 550 555tcg gcc atc aag tcg gcg atg gag aag ctg ggc cag gag tcg cag gct1728Ser Ala Ile Lys Ser Ala Met Glu Lys Leu Gly Gln Glu Ser Gln Ala560 565 570 575ctg ggg caa gcg atc tac gaa gca gct cag gct gcg tca cag gcc act1776Leu Gly Gln Ala Ile Tyr Glu Ala Ala Gln Ala Ala Ser Gln Ala Thr580 585 590ggc gct gcc cac ccc ggc ggc gag ccg ggc ggt gcc cac ccc ggc tcg1824Gly Ala Ala His Pro Gly Gly Glu Pro Gly Gly Ala His Pro Gly Ser595 600 605gct gat gac gtt gtg gac gcg gag gtg gtc gac gac ggc cgg gag gcc1872Ala Asp Asp Val Val Asp Ala Glu Val Val Asp Asp Gly Arg Glu Ala610 615 620aag ggt ggc gga ggg agt ggt ggc gga ggg agc ggt ggc gga ggg agt1920Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser625 630 635ggc cac aca cgg agg cag gga aca tca cca tcc aag tgt cca tac ctc1968Gly His Thr Arg Arg Gln Gly Thr Ser Pro Ser Lys Cys Pro Tyr Leu640 645 650 655aat ttc ttt cag ctc ttg gtg ctg gct ggt ctt tct cac ttc tgt tca2016Asn Phe Phe Gln Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Ser His Phe Cys Ser660 665 670ggt gtt atc cac gtg acc aag gaa gtg aaa gaa gtg gca acg ctg tcc2064
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Ala Val Ile Thr Thr Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ala Gln Arg Gln Ala115 120 125Thr Lys Asp Ala Gly Gln Ile Ala Gly Leu Asn Val Leu Arg Ile Val130 135 140Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala Tyr Gly Leu Asp Lys Gly Glu145 150 155 160Lys Glu Gln Arg Ile Leu Val Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp165 170 175Val Ser Leu Leu Glu Ile Gly Glu Gly Val Val Glu Val Arg Ala Thr180 185 190Ser Gly Asp Asn His Leu Gly Gly Asp Asp Trp Asp Gln Arg Val Val195 200 205Asp Trp Leu Val Asp Lys Phe Lys Gly Thr Ser Gly Ile Asp Leu Thr210 215 220Lys Asp Lys Met Ala Met Gln Arg Leu Arg Glu Ala Ala Glu Lys Ala225 230 235 240Lys Ile Glu Leu Ser Ser Ser Gln Ser Thr Ser Ile Asn Leu Pro Tyr245 250 255Ile Thr Val Asp Ala Asp Lys Asn Pro Leu Phe Leu Asp Glu Gln Leu260 265 270Thr Arg Ala Glu Phe Gln Arg Ile Thr Gln Asp Leu Leu Asp Arg Thr275 280 285Arg Lys Pro Phe Gln Ser Val Ile Ala Asp Thr Gly Ile Ser Val Ser290 295 300
Glu Ile Asp His Val Val Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Met Pro Ala305 310 315 320Val Thr Asp Leu Val Lys Glu Leu Thr Gly Gly Lys Glu Pro Asn Lys325 330 335Gly Val Asn Pro Asp Glu Val Val Ala Val Gly Ala Ala Leu Gln Ala340 345 350Gly Val Leu Lys Gly Glu Val Lys Asp Val Leu Leu Leu Asp Val Thr355 360 365Pro Leu Ser Leu Gly Ile Glu Thr Lys Gly Gly Val Met Thr Arg Leu370 375 380Ile Glu Arg Asn Thr Thr Ile Pro Thr Lys Arg Ser Glu Thr Phe Thr385 390 395 400Thr Ala Asp Asp Asn Gln Pro Ser Val Gln Ile Gln Val Tyr Gln Gly405 410 415Glu Arg Glu Ile Ala Ala His Asn Lys Leu Leu Gly Ser Phe Glu Leu420 425 430Thr Gly Ile Pro Pro Ala Pro Arg Gly Ile Pro Gln Ile Glu Val Thr435 440 445Phe Asp Ile Asp Ala Asn Gly Ile Val His Val Thr Ala Lys Asp Lys450 455 460Gly Thr Gly Lys Glu Asn Thr Ile Arg Ile Gln Glu Gly Ser Gly Leu465 470 475 480Ser Lys Glu Asp Ile Asp Arg Met Ile Lys Asp Ala Glu Ala His Ala485 490 495Glu Glu Asp Arg Lys Arg Arg Glu Glu Ala Asp Val Arg Asn Gln Ala
500 505 510Glu Thr Leu Val Tyr Gln Thr Glu Lys Phe Val Lys Glu Gln Arg Glu515 520 525Ala Glu Gly Gly Ser Lys Val Pro Glu Asp Thr Leu Asn Lys Val Asp530 535 540Ala Ala Val Ala Glu Ala Lys Ala Ala Leu Gly Gly Ser Asp Ile Ser545 550 555 560Ala Ile Lys Ser Ala Met Glu Lys Leu Gly Gln Glu Ser Gln Ala Leu565 570 575Gly Gln Ala Ile Tyr Glu Ala Ala Gln Ala Ala Ser Gln Ala Thr Gly580 585 590Ala Ala His Pro Gly Gly Glu Pro Gly Gly Ala His Pro Gly Ser Ala595 600 605Asp Asp Val Val Asp Ala Glu Val Val Asp Asp Gly Arg Glu Ala Lys610 615 620Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly625 630 635 640His Thr Arg Arg Gln Gly Thr Ser Pro Ser Lys Cys Pro Tyr Leu Asn645 650 655Phe Phe Gln Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Ser His Phe Cys Ser Gly660 665 670Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys675 680 685Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp690 695 700
Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn705 710 715 720Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn725 730 735Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr740 745 750Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His755 760 765Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser770 775 780Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys785 790 795 800Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn805 810 815Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu820 825 830Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr835 840 845Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn850 855 860Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn865 870 875 880Leu Leu Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly Ile Phe885 890 895
Val Ile Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg Glu Arg900 905 910Arg Arg Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val915 920 925210321145212DNA213人工序列(Artificial)220
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221misc_feature222(1)..(27)223重組pcDNA3.1(+)-hsp70質粒引物
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221misc_feature222(1)..(30)223hsp70-linker-B7-1引物4006ggtggttcga aggtacctga agacacgctg 30210721176212DNA213人工序列(Artificial)220
221misc_feature222(1)..(76)223hsp70-linker-B7-1引物4007actccctccg ccaccgctcc ctccgccacc actccctccg ccacccttgg cctcccggcc 60gtcgtcgacc acctcc 76210821153212DNA213人工序列(Artificial)220
221misc_feature222(1)..(53)223hsp70-linker-B7-1220
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221misc_feature222(1)..(39)223hsp70-linker-B7-1引物4009gacactctag attatacagg gcgtacactt tcccttctc 392101021127212DNA213人工序列(Artificial)220
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221misc_feature222(1)..(27)223重組pcDNA3.1(+)hsp70/B7-1質粒鑑定引物
40011tctagattat acagggcgta cactttc 27210122111875212DNA213結核桿菌(H37Rv)株40012atggctcgtg cggtcgggat cgacctcggg accaccaact ccgtcgtctc ggttctggaa 60ggtggcgacc cggtcgtcgt cgccaactcc gagggctcca ggaccacccc gtcaattgtc120gcgttcgccc gcaacggtga ggtgctggtc ggccagcccg ccaagaacca ggcagtgacc180aacgtcgatc gcaccgtgcg ctcggtcaag cgacacatgg gcagcgactg gtccatagag240attgacggca agaaatacac cgcgccggag atcagcgccc gcattctgat gaagctgaag300cgcgacgccg aggcctacct cggtgaggac attaccgacg cggttatcac gacgcccgcc360tacttcaatg acgcccagcg tcaggccacc aaggacgccg gccagatcgc cggcctcaac420gtgctgcgga tcgtcaacga gccgaccgcg gccgcgctgg cctacggcct cgacaagggc480gagaaggagc agcgaatcct ggtcttcgac ttgggtggtg gcactttcga cgtttccctg540ctggagatcg gcgagggtgt ggttgaggtc cgtgccactt cgggtgacaa ccacctcggc600ggcgacgact gggaccagcg ggtcgtcgat tggctggtgg acaagttcaa gggcaccagc660ggcatcgatc tgaccaagga caagatggcg atgcagcggc tgcgggaagc cgccgagaag720gcaaagatcg agctgagttc gagtcagtcc acctcgatca acctgcccta catcaccgtc780gacgccgaca agaacccgtt gttcttagac gagcagctga cccgcgcgga gttccaacgg840atcactcagg acctgctgga ccgcactcgc aagccgttcc agtcggtgat cgctgacacc900ggcatttcgg tgtcggagat cgatcacgtt gtgctcgtgg gtggttcgac ccggatgccc960gcggtgaccg atctggtcaa ggaactcacc ggcggcaagg aacccaacaa gggcgtcaac 1020cccgatgagg ttgtcgcggt gggagccgct ctgcaggccg gcgtcctcaa gggcgaggtg 1080aaagacgttc tgctgcttga tgttaccccg ctgagcctgg gtatcgagac caagggcggg 1140
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1.含有SEQ ID NO.1序列的核苷酸。
2.由SEQ ID NO.1核苷酸序列所編碼的胺基酸序列，其具有SEQ ID NO.2的序列。
3.含有SEQ ID NO.1的核苷酸序列的表達載體。
4.根據權利要求3所述的表達載體，其特徵在於所述載體為質粒載體。
5.根據權利要求4所述的表達載體，其特徵在於所述質粒載體為pcDNA3.1(+)。
6.含有權利要求3所述的表達載體的宿主細胞。
7.含有SEQ ID NO.3的接頭序列。
8.一種嵌合型DNA疫苗，包含如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的全長開放讀碼框架，或其保守性變異體。
9.根據權利要求8所述的嵌合型DNA疫苗，其特徵在於它進一步包含一表達載體。
10.根據權利要求9所述的嵌合型DNA疫苗，其特徵在於所述表達載體為質粒載體。
11.根據權利要求10所述的嵌合型DNA疫苗，其特徵在於所述質粒載體為pcDNA3.1(+)。
12.一種藥物組合物，含有權利要求9所述的嵌合型DNA疫苗以及藥學上可接受的載體和賦形劑。
13.一種藥物組合物，含有包含SEQ ID NO.2的蛋白質以及藥學上可接受的載體和賦形劑。
14.權利要求9所述嵌合型DNA疫苗在製備預防和治療結核病藥物中的應用。
15.權利要求9所述嵌合型DNA疫苗在製備免疫治療藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及用於預防結核病和免疫治療的嵌合型DNA疫苗，包含如SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的全長開放讀碼框架，或其保守性變異體，SEQ ID NO.1中包含了分支桿菌hsp70基因與人B7－1基因，該兩個基因之間通過設計一接頭序列將二者連接。本發明的疫苗可用於結核桿菌所致的結核病；或者在體外真核細胞中表達相應的蛋白質，用作預防和治療結核病。也可作為一種免疫增進劑，用於相應的病毒性疾病以及腫瘤的免疫治療。
文檔編號A61K48/00GK1562362SQ20041000178
公開日2005年1月12日 申請日期2004年2月5日 優先權日2003年3月6日
發明者鍾森, 丁惠忠, 史小玲, 鍾林 申請人:鍾森, 丁惠忠, 史小玲, 鍾林