一種檢測和鑑別蚊媒體內瘧原蟲子孢子的方法
2023-11-11 04:10:37 4
專利名稱：一種檢測和鑑別蚊媒體內瘧原蟲子孢子的方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測和鑑別蚊媒體內瘧原蟲子孢子的方法。
背景技術：
瘧疾是嚴重危害人類健康的蟲媒傳染病，每年3-5億人發病，至少100萬人死於瘧疾。世界衛生組織(WHO)已將瘧疾和愛滋病、結核病一起，列為全球三大公共衛生問題。引起瘧疾的人體瘧原蟲有4種，分別是間日瘧原蟲、惡性瘧原蟲、三日瘧原蟲和卵形瘧原蟲。按蚊是瘧疾唯一的傳播媒介，媒介控制措施對全球控制和消除瘧疾目標的實現具有重要意義(Greenwood, B. Μ. Control to elimination amplications for malaria research [J].Trends Parasitol,2008,24 (10) :449-454 ；WHO Study Group.Malaria vector control and personal protection [J]. World Health Organ Tech Rep Ser, 2006,936 :1-6 。有效的媒介控制措施很大程度上依賴於準確的媒介調查。對傳瘧媒介的密度、種群分布、生態習性、季節消長及其按蚊子孢子感染等情況的調查不僅是制訂和實施綜合媒介控制措施所必需的科學依據，同時也為瘧疾流行態勢的分析和有效瘧疾防治策略的制訂提供必要的參考信息(Beier，J. C.，J. Keating, J. I. Githure，et al. Integrated vector management for malaria control [J]. Malar J, 2008, 7(1) :S4)。按岐子孢子感染率是評價某種按蚊傳播瘧疾能力的直接指標，也是評價瘧疾控制效果和進行瘧疾監測的重要內容。傳統的蚊體內瘧原蟲檢測方法是採用顯微解剖方式，觀察蚊胃卵囊和蚊唾液腺子孢子情況。按蚊解剖和卵囊/子孢子檢測不僅需要新鮮的按蚊樣本，而且需要熟練的專業實驗操作技術。我國主要為間日瘧流行，目前我國大多數間日瘧流行區的瘧疾發病率不高，按蚊子孢子陽性率往往低於1/1000，採用傳統的按蚊解剖方式檢測卵囊/子孢子費時、費力，已經不適合用於現場媒介調查。同時，由於這種傳統技術不能鑑別瘧原蟲種，在間日瘧/惡性瘧混合流行區其檢測結果為瘧疾防治提供的信息有限。免疫學方法檢測穩定性較差，假陽性偏高等缺點，限制了其在現場媒介調查中推廣應用(Lochouarn， L.D. Fontenille. ELISA detection of malaria sporozoites :false_positive results in Anopheles gambiae s.1.associated with bovinebloodmeals[J]. Trans R Soc Trop Med Hyg，1999,93(1) :101-102)。目前已有採用敏感性和特異性較高的巢式PCR技術檢測蚊體內瘧原蟲的報導，但由於該技術需要進行兩輪PCR反應，操作繁瑣，不適合高通量檢測 (Li，F.，C.NiuB. Ye. Nestedpolymerase chain reaction in detection of Plasmodium vivax sporozoites inmosquitoes [J]. Chin Med J (Engl)，2001，114 (6) :654-657)。為此， 現場媒介監測迫切需要開發敏感、特異、簡便快速的蚊體內瘧原蟲檢測和鑑別技術。螢光定量PCR技術是一種先進的核酸定量檢測技術，其通過在PCR反應體系中加入螢光基團， 利用螢光信號積累實時監測整個PCR進程，既能進行定性分析又能進行定量檢測。與常規 PCR相比，螢光定量PCR具有敏感性和特異性更高、不需進行凝膠電泳分析、操作簡便、快速高效等特點。目前該技術已廣泛應用於生物學及醫學研究，並且在多種疾病的臨床檢驗診斷中推廣應用(歐陽松應，楊冬，歐陽紅生，等.實時螢光定量PCR技術及其應用[J]. 生命的化學，2004，M(I) :74-76)。在瘧疾研究和應用方面，國內外學者利用該技術在瘧疾病人診斷、抗瘧藥療效考核、瘧疾疫苗效果評價等方面進行了一些探索，均取得了較好的效果(Swan, H.，L Sloan，A. Muyombwe, et al. Evaluation of a real-time polymerase chain reaction assay for the diagnosisof malaria in patients from Thai land [J]. Am J Trop Med Hyg，2005，73 (5) :850-854 ；Rougemont, Μ. , Μ. Van Saanen，R. Sahli，et al. Detection of fourP1asmodium species in blood from humans by 18S rRNA gene subunit-based andspecies-specific real-time PCR assays[J]. J Clin Microbiol, 2004,42(12) :5636-5643 ；Andrews, L. ， R. F. Andersen, D. Webster, et al. Quantitative real-timepolymerase chain reaction for malaria diagnosis and its use in malaria vaccineclinical trials [J]. Am J Trop Med Hyg，2005，73(1) :191-198 ；Witney, A. A., D. L. Doolan, R.M.Anthony，et al. Determining liver stage parasite burden by real time quantitative PCR as a method for evaluating pre-erythrocytic malaria vaccine efficacy [J]. Mol Biochem Parasitol, 2001,118 (2) :233-245.)。目前國外已有釆用螢光定量PCR技術檢測蚊體內惡性瘧原蟲的報導，其缺點是不能進行蟲種鑑別(Bell， Α.S.L. C.Ranford-Cartwright. A real-time PCR assay forquantifying Plasmodium falciparum infections in the mosquito vector[J]. IntJ Parasitol,2004,34(7) 795-802) ；Bass 等(Bass, C. , D. Nikou, A. M. Blagborough,et al. PCR-based detection of Plasmodium in Anopheles mosquitoes :a comparison of a new high-throughput assay with existing methods [J]. Malar J, 2008, 7 :177)建立了 Taqman 探針螢光定量 PCR 技術用於檢測蚊體內瘧原蟲，並進行蟲種鑑別，但由於Taqman探針成本高，並不適合大樣本檢測和現場應用。目前尚沒有採用成本較低、操作簡便的基於STOR Green I染料法螢光定量 PCR技術檢測並鑑別四種蚊體內瘧原蟲子孢子的報導。
發明內容
本發明的目的就是針對上述缺陷，提供了一種檢測和鑑別蚊媒體內瘧原蟲子孢子的方法，包括以下步驟1)設計一對引物，為18S-qF 5' -ATAACGAACGAGATCTTAACCT-3』18S-qR 5' -ATCGTTCCTCTAAGAAGCTTTA-3『；2)提取媒介按蚊體內瘧原蟲子孢子基因組DNA ；3)通過螢光定量PCR反應對蚊媒體內瘧原蟲基因組DNA進行擴增；4)將擴增產物熔解後得到熔解曲線，並與陽性對照和陰性對照進行比對。所述步驟2)的DNA提取方法包括以下步驟a)將蚊媒體頭胸部置於1. 5ml離心管中；b)力Π50μ 1 IXPBS於步驟a)所述的離心管中，用玻璃研磨棒研磨5_10min，再加入 100 μ 1 Buffer ATL ；c)加20 μ 1蛋白酶K於步驟b)所述的離心管中，56°C，搖動3小時；d)加200 μ 1 Buffer Al於步驟c)所述的離心管中，振動15s，70°C放置10分鐘；
e)加200 μ 1無水乙醇於步驟d)所述的離心管中，振動15s，得到混合液；f)將步驟e)所述的處理後的混合液置於QIAamp離心純化柱中離心，8000rpm，1 分鐘，將純化柱去除過濾液後置於一回收管中；g)在上述步驟f)處理後的純化柱中加入500 μ 1 Buffer AW1，並離心，8000rpm，1 分鐘，將純化柱去除過濾液後置於另一回收管中；h)在上述步驟g)處理後的純化柱中加入500 μ 1 Buffer Aff2,並離心，14000rpm, 3分鐘，將柱子去除過濾液後置於再一回收管中，繼續離心，14000rpm, 1分鐘；i)將上述步驟h)處理後的純化柱去除過濾液後置於離心管中，加入30 μ 1 BufferAE,室溫靜置5分鐘，再離心，8000rpm，1分鐘；j)將上述步驟i)處理後的柱子中加入30ul雙蒸水，室溫靜置5分鐘，SOOOrpm，離心1分鐘，得到模板DNA並於-20°C保存。所述步驟幻的螢光定量PCR反應體系包括有15ul 2X螢光定量PCR預混液； 1. 2ul濃度為5uM的引物18S_qF，1. 2ul濃度為5uM的引物18S_qR，1 μ 1上述步驟j)得到的模板DNA和11. 6ul雙蒸水。所述步驟3)的螢光定量PCR反應過程為95°C預變性10min，95°C變性15s，60°C退火加延伸lmin，共持續45個循環。所述步驟4)的陽性對照為含有4種瘧原蟲目的片段的質粒DNA標準品，陰性對照為陰性按蚊DNA，陰性按蚊提取方法如權利要求2所述。本發明的另一個目的是提供了上述檢測和鑑別蚊媒體內瘧原蟲子孢子的方法在蚊媒體內瘧原蟲子孢子定量檢測中的應用。所述應用包括以下步驟A)構建分別含有4種瘧原蟲目的片段的質粒DNA標準品，質粒中所含目的片段序列分別為惡性瘧原蟲標準質粒如序列1所示，間日瘧原蟲標準質粒如序列2所示，三日瘧原蟲標準質粒如序列3所示，卵形瘧原蟲標準質粒如序列4所示；B)依步驟A)所述的質粒DNA標準品序列建立蚊媒體內瘧原蟲子孢子DNA定量曲線.
一入 ，C)以步驟B)建立的定量曲線為標準曲線進行定量檢測。本發明的有益效果為所提供的檢測和鑑別蚊媒體內瘧原蟲子孢子的方法及其應用不僅對蚊媒體內瘧原蟲進行定量檢測，還可以依據構建的四種人體瘧原蟲質粒DNA標準品進行定性鑑定，如圖2所示，提高了此類檢測鑑定技術的敏感性和特異性，並且相比於現有的技術更加簡便快速，成本低廉，更適合評價瘧疾控制效果及進行瘧疾監測。
圖1為四種人體瘧原蟲18S rDNA基因序列對比。圖2為四種人體瘧原蟲熔解曲線分析結果。其中，Pf為惡性瘧原蟲；Pv為間日瘧原蟲；Rii為三日瘧原蟲；Po為卵形瘧原蟲，括號內為GenBank登錄號，NTC為陰性對照(即陰性按蚊DNA熔解曲線)。圖3為螢光定量PCR標準曲線。
具體實施例方式以下結合附圖詳細說明本發明具體實施方式
。本發明所使用的DNA提取試劑盒為QINGEN公司生產，編號為51304 ；DNA提取步驟中所用的Buffer ATL、蛋白酶!((proteinase K)、Buffer Al、無水乙醇、QIAamp離心純化柱 (QIAamp Mini spin column)、2ml 回收管、Buffer AffUB uffer AE 禾口 Buffer AW2 均為上述 DNA提取試劑盒中自帶；所用的1XPBS、雙蒸水(ddH20)為實驗室常規配製方法；螢光定量 PCR反應中所用的2X螢光定量PCR預混液由ABI公司生產，編號為4367659 ；所用PCR儀為ABI PRISM 7000螢光定量PCR儀，由美國應用生物系統公司生產；所用玻璃研磨棒由江蘇省血吸蟲病防治研究所定製並提供。本發明中的熔解曲線分析由ABI PRISM 7000螢光定量PCR儀自動完成，定量檢測中，測定結果經ABI PRISM 7000SDS軟體處理後根據標準曲線計算出檢測樣本中瘧原蟲 DNA拷貝數。實施例1 1、設計引物根據4種人體瘧原蟲18S小亞單位核糖體rDNA的序列特徵，在種特異性區域兩側的屬特異性區域設計了一對引物，序列比對見圖1。引物序列如下18S-qF :5，ATAACGAACGAGATCTTAACCT-3，18S-qR :5，-ATCGTTCCTCTAAGAAGCTTTA-3，。2、提取按蚊瘧原蟲基因組DNA a)將按蚊頭胸部置於1. 5ml離心管中；b)力Π 50 μ 1 IXPBS於步驟a)所述的離心管中，用玻璃研磨棒研磨5_10min，再加入 100 μ 1 Buffer ATL ；c)加20 μ 1蛋白酶K於步驟b)所述的離心管中，56°C，搖動3小時；d)加200 μ IBuffer Al於步驟c)所述的離心管中，振動15s，70°C放置10分鐘；e)加200 μ 1無水乙醇於步驟d)所述的離心管中，振動15s，得到混合液；f)將步驟e)所述的處理後的混合液置於QIAamp離心純化柱中離心，8000rpm，1 分鐘，將純化柱去除過濾液後置於一回收管中；g)在上述步驟f)處理後的純化柱中加入500 μ 1 Buffer AW1，並離心，8000rpm，1 分鐘，將純化柱去除過濾液後置於另一回收管中；h)在上述步驟g)處理後的純化柱中加入500 μ 1 Buffer Aff2,並離心，14000rpm, 3分鐘，將柱子去除過濾液後置於再一回收管中，繼續離心，14000rpm, 1分鐘；i)將上述步驟h)處理後的純化柱去除過濾液後置於離心管中，加入30 μ 1 Buffer AE,室溫靜置5分鐘，再離心，8000rpm，1分鐘；j)將上述步驟i)處理後的柱子中加入30ul雙蒸水，室溫靜置5分鐘，SOOOrpm，離心1分鐘，得到模板DNA並於-20°C保存。3、配製實時螢光定量PCR反應體系分別將15ul 2 X 螢光定量PCR預混液(Power SYBR Green PCR Master Mix(2X)), 1. 2ul濃度為5uM的引物18S-qF, 1. 2ul濃度為5uM引物18S_qR，1 μ 1模板DNA和11. 6ul 雙蒸水(ddH20)加入螢光定量PCR專用反應管中，並混勻。
4、進行實時螢光定量PCR反應將PCR反應管置於ABI PRISM 7000螢光定量PCR儀中，並設定如下反應條件 95°C預變性IOmin ；95°C變性15s，60°C退火加延伸lmin，共持續45個循環；擴增結束後儀器自動進行熔解曲線分析。5、檢測結果判斷結合擴增曲線和熔解曲線對檢測結果進行分析和判讀。a.定性檢測分別設立陽性對照和陰性對照，檢測樣本出現擴增曲線並具有特異性的熔解曲線即判為陽性，否則判為陰性；通過比較樣本與陽性對照的熔解溫度進行瘧原蟲種鑑別。如圖2所示，4種人體瘧原蟲擴增產物的熔解溫度(Melting Temperature,Tm)分別約為三日瘧71.0°C，惡性瘧72. 7°C，卵形瘧73.9°C，間日瘧75.9°C;其中，較為常見的惡性瘧和間日瘧的Tm值相差3°C;陰性對照中引物二聚體的Tm值約為68. 0°C，易於同特異性擴增產物相區分。b.定量檢測採用質粒DNA作為標準品製作標準曲線。如圖3所示，測定結果經ABI PRISM 7000SDS軟體處理後，模板濃度與可檢測的螢光信號的循環數(CT值)之間呈負相關關係，相關係數r為-0. 99，根據標準曲線計算出檢測樣本中瘧原蟲DNA拷貝數。
權利要求
1.一種檢測和鑑別蚊媒體內瘧原蟲子孢子的方法，其特徵在於，包括以下步驟1)設計一對引物，為18S-qF :5』 -ATAACGAACGAGATCTTAACCT-3』18S-qR :5，ATCGTTCCTCTAAGAAGCTTTA-3，；2)提取媒介按蚊體內瘧原蟲子孢子基因組DNA;3)通過螢光定量PCR反應對蚊媒體內瘧原蟲基因組DNA進行擴增；4)將擴增產物熔解後得到熔解曲線，並與陽性對照和陰性對照進行比對。
2.如權利要求1所述的鑑定方法，其特徵在於，所述步驟幻的DNA提取方法包括以下步驟a)將蚊媒體頭胸部置於1.5ml離心管中；b)加50μ1IXPBS於步驟a)所述的離心管中，用玻璃研磨棒研磨5-lOmin，再加入 100 μ 1 Buffer ATL ；c)加20μ 1蛋白酶K於步驟b)所述的離心管中，56°C，搖動3小時；d)加200μ 1 Buffer Al於步驟c)所述的離心管中，振動15s，70°C放置10分鐘；e)加200μ 1無水乙醇於步驟d)所述的離心管中，振動15s，得到混合液；f)將步驟e)所述的處理後的混合液置於QIAamp離心純化柱中離心，8000rpm，1分鐘， 將純化柱去除過濾液後置於一回收管中；g)在上述步驟f)處理後的純化柱中加入500μ 1 Buffer AW1，並離心，8000rpm，1分鐘，將純化柱去除過濾液後置於另一回收管中；h)在上述步驟g)處理後的純化柱中加入500μ 1 Buffer Aff2,並離心，14000rpm, 3分鐘，將柱子去除過濾液後置於再一回收管中，繼續離心，14000rpm, 1分鐘；i)將上述步驟h)處理後的純化柱去除過濾液後置於離心管中，加入30μ1 BufferAE, 室溫靜置5分鐘，再離心，8000rpm，1分鐘；j)將上述步驟i)處理後的柱子中加入30ul雙蒸水，室溫靜置5分鐘，SOOOrpm，離心1 分鐘，得到模板DNA並於-20°C保存。
3.如權利要求2所述的鑑定方法，其特徵在於，所述步驟3)的螢光定量PCR反應體系包括有15ul 2 X螢光定量PCR預混液；1. 2ul濃度為5uM的引物18S_qF，1. 2ul濃度為5uM 的引物18S_qR，1 μ 1上述步驟j)得到的模板DNA和11. 6ul雙蒸水。
4.如權利要求3所述的鑑定方法，其特徵在於，所述步驟3)的螢光定量PCR反應過程為95°C預變性10min，95°C變性15s，60°C退火加延伸lmin，共持續45個循環。
5.如權利要求4所述的鑑定方法，其特徵在於，所述步驟4)的陽性對照為含有4種瘧原蟲目的片段的質粒DNA標準品，陰性對照為陰性按蚊DNA，陰性按蚊提取方法如權利要求 2所述。
6.一種如權利要求5所述的鑑定方法在蚊媒體內瘧原蟲子孢子定量檢測中的應用。
7.如權利要求6所述的應用，其特徵在於，所述應用包括以下步驟A)構建分別含有4種瘧原蟲目的片段的質粒DNA標準品，質粒中所含目的片段序列分別為惡性瘧原蟲標準質粒如序列1所示，間日瘧原蟲標準質粒如序列2所示，三日瘧原蟲標準質粒如序列3所示，卵形瘧原蟲標準質粒如序列4所示；B)依步驟A)所述的質粒DNA標準品序列建立蚊媒體內瘧原蟲子孢子DNA定量曲線；C)以步驟B)建立的定量曲線為標準曲線進行定量檢測。
全文摘要
本發明公開了一種檢測和鑑別蚊媒體內瘧原蟲子孢子的方法，包括以下步驟1)設計一對引物；2)提取媒介按蚊體內瘧原蟲子孢子基因組DNA；3)通過螢光定量PCR反應對蚊媒體內瘧原蟲基因組DNA進行擴增；4)將擴增產物熔解後得到熔解曲線，並與陽性對照和陰性對照進行比對。本發明的有益效果為所提供的檢測和鑑別蚊媒體內瘧原蟲子孢子的方法及其應用不僅對蚊媒體內瘧原蟲進行定量檢測，還可以依據構建的四種人體瘧原蟲質粒DNA標準品進行定性鑑定，如圖2所示，提高了此類檢測鑑定技術的敏感性和特異性，並且相比於現有的技術更加簡便快速，成本低廉，更適合評價瘧疾控制效果及進行瘧疾監測。
文檔編號C12Q1/68GK102154460SQ20111000297
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月10日 優先權日2011年1月10日
發明者劉耀寶, 周華雲, 曹俊, 高琪 申請人:江蘇省血吸蟲病防治研究所