一種弱病毒防治矮牽牛病毒病的方法
2023-10-19 12:50:52
專利名稱：一種弱病毒防治矮牽牛病毒病的方法
技術領域：
本發明涉及植物病毒的防治技術領域，尤其涉及一種弱病毒防治矮牽牛病毒病的方法。
背景技術：
矮牽牛(Pe加"/a/^^/^)原產南美，屬茄科碧冬茄屬植物，是一種廣泛用於盆栽、花壇的 草本植物。因其花期長，花色品種多而深受人們的喜愛，在美化環境上有很高的觀賞價值。 但因病毒的嚴重危害，症狀感病植株出現葉斑駁症，形成花葉，顏色有深有淺，常伴有葉巻 曲，生長勢減弱，花畸形，變小等，使其觀賞價值大大降低。據調查表明，種子繁殖的發病 率為20 30%，無性繁殖的發病率可高達卯％左右。自然侵染矮牽牛的病毒以黃瓜花葉病毒 (CMV)為主。
植物病毒是侵染蔬菜花卉藥材和大田作物的細胞內致病的微生物，因為其按照寄主的細 胞系統進行基本的代謝和複製侵染過程，因些其不能像細菌和真菌等病原微生物那樣通過藥 物治療達到根除效果。迄今，對植物病毒進行控制仍然沒有"特效藥"，控制的主要方法是預
防其侵染。實踐證明預先接種弱病毒株能夠幹擾其後侵梁的強病毒株的危害，降低其影響，
達到抗病增產和改善作物品質的作用。以黃瓜花葉病毒(CMV)為例，該病毒能夠侵染1000 多種植物，可經75種蚜蟲傳播，也是目前世界範圍內寄主植物最多、分布最廣、危害嚴重的 植物病毒之一。預防病毒傳播媒介昆蟲和獲得無病毒繁殖材料並不是在任何情況下均能夠有 效實施。用弱病毒株進行預防接種的方法是行之有效的方法之一。但是，預防接種的方法大 都採用浸根、噴槍和摩擦接種法，在接種弱病毒前必須進行種子消毒和苗床防治蚜蟲、白粉 蝨，嚴防幼苗在接種弱病毒前被強病毒感染，具有費時、使用方法繁瑣、效率低等缺點，故 不利於產業化，無法滿足現代農業的需求。
發明內容
本發明要解決上述現有技術的缺陷，提供一種弱病毒防治矮牽牛病毒病的方法。
本發明目的通過以下技術方案來實現這種弱病毒防治矮牽牛病毒病的方法，按如下步 驟進行
1)、培養基的配製，包括基本培養基和組培各階段培養基的各組分與每升所含重量為-
(1) 基本培養基基本培養基採用MS培養基，其中，蔗糖或白糖20 30g/L，瓊脂7 9g/L， pH5.6 6.0;
(2) 無菌播種培養基1/2MS;
(3) 誘導培養基1/3MS+BA1.0 3.0mg/L和NAA0.1 0.5mg/L;
5(4) 增殖培養基1/2MS+BA0.1 1.0mg/L和NAA 0.05 0.5mg/L;
(5) 壯苗培養基MS+BA0.1 0.5mg/L和NAA0.01 0.1mg/L;
(6) 生根培養基1/2MS+NAA0.01 0.1mg/L;
2)、矮牽牛莖尖脫毒培養
(1) 外植體的選取與滅菌取矮牽牛的種子，經滅菌處理後接種在無菌播種培養基上，
在培養條件下培養30 45天後，從種子培養成高約5 7cm的實生苗，無需滅菌直接作為莖 尖脫毒培養用的外植體；或取溫室盆栽的性狀純正、生長健壯的矮牽牛植株上的幼芽，經滅 菌處理後作為莖尖脫毒培養用的外植體；
(2) 莖尖脫毒培養將無菌播種培養的實生苗的頂芽或滅菌處理後的溫室盆栽的幼芽在 無菌條件下，在40倍的雙筒解剖鏡下，摘出0.15 0.3mm大小的帶1 2個葉原基的莖尖， 接種在誘導培養基上，在培養條件下培養30 45天後，從莖尖誘導形成幼芽或叢生芽；
(3) 增殖培養將誘導形成的幼芽或叢生芽切成單芽接到增殖培養基上，在培養條件下 培養30 45天增殖出叢生芽；根據對幼苗數量的需求，每隔30 45天按同樣方法進行幼苗 再增殖培養；
(4) 壯苗培養將增殖出的叢生芽接種到壯苗培養基上，在培養條件下培養20 30天 後，幼苗株高生長達2 5釐米；
(5) 生根培養將培養的壯苗切成單株接種在生根培養基中進行生根培養，在培養條件
下培養20 30天後，幼苗長高成約5 7cm、苗基部長出5 10根細根；
(6) 移栽在隔離溫室中，將生根組培苗移栽於基質中，培育1 2個月至成苗。
(7) 定植在隔離溫室中，將移栽苗定植在溫室盆缽中，培育3 5個月至植株開花。 3)、病毒ELISA檢測
將常規溫室中發生的矮牽牛病毒，經擴增、克隆和原核表達所獲得的相關病毒外殼蛋白， 注射小鼠或家兔免疫並製備成病毒特異性抗血清後，對移栽苗和開花植株進行病毒ELISA檢
4)、弱病毒的接種 '
將黃瓜花葉病毒的弱病毒株通過常規汁液摩擦方法接種到步驟3)檢測為無病毒的矮牽 牛植株上。
5)、弱病毒植株的組培繁殖
(1) 外植體的選取與滅菌取步驟4)檢測為弱病毒的矮牽牛植株上的幼芽，經滅菌處 理後作為組培繁殖用的外植體；
(2) 誘導培養將滅菌處理後的幼芽接種在誘導培養基上，在培養條件下培養30 45天後，誘導形成叢生芽；
(3) 增殖培養將誘導形成的叢生芽切成單芽接到增殖培養基上，在培養條件下培養 30 45天增殖出叢生芽；根據對幼苗數量的需求，每隔30 45天按同樣方法進行幼苗再增 殖培養；
(4) 壯苗培養將增殖出的叢生芽接種到壯苗培養基上，在培養條件下培養20 30天 後，幼苗株高生長達2 5釐米；
(5) 生根培養將培養的壯苗切成單株接種在生根培養基中進行生根培養，在培養條件 下培養20 30天後，幼苗長高成約5 7cm、苗基部長出5 10根細根；
(6) 移栽將生根組培苗移栽於基質中，培育1 2個月至成苗。
(7) 定植將移栽苗定植在盆缽中，培育3 5個月至植株開花。 所述的弱病毒防治矮牽牛病毒病的方法，所述的培養基，包括基本培養基和組培各階段
培養基的各組分與每升所含重量為-
(1) 基本培養基基本培養基採用MS培養基，其中，瓊脂8g/L， pH5.8;
(2) 無菌播種培養基1/2MS+白糖20g/L;
(3) 誘導培養基1/3MS+BA1.0mg/L和NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L;
(4) 增殖培養基1/2MS+BA0.5mg/L和NAA0.1mg/L+白糖30g/L;
(5) 壯苗培養基MS+BA0.25mg/L和NAA0.05mg/L+白糖30g/L;
(6) 生根培養基1/2MS+NAA0.05mg/L+白糖20g/L。 所述的弱病毒防治矮牽牛病毒病的方法，所述的無菌播種培養時種子的滅菌處理是經
75%酒精浸泡0.5 1.0分鐘，再用0.1%升汞溶液滅菌20 30分鐘，最後用無菌水衝洗3 5 次。
所述的弱病毒防治矮牽牛病毒病的方法，所述的溫室盆栽植株幼芽的滅菌處理是經75% 酒精浸泡0.5 1.0分鐘，再用0.1%升汞溶液滅菌10 15分鐘，最後用無菌水衝洗3 5次。
所述的弱病毒防治矮牽牛病毒病的方法，所述的各組培階段的培養條件是，培養溫度為 25±2°C，光照光強為2200 2500Lx，光照時間為14h/d。
所述的弱病毒防治矮牽牛病毒病的方法，所述的移栽基質由泥炭珍珠巖蛭石按體積 比2: 1: l配製而成。
所述的弱病毒防治矮牽牛病毒病的方法，所述的弱病毒為黃瓜花葉病毒的弱病毒株N14、 黃瓜花葉病毒的衛星RNA生防製劑S52。
本發明的有益效果是
7(1) 利用植物組織培養技術進行接種弱病毒植株的組培繁殖，繁殖的組培苗100%攜帶 弱病毒，並可連續地繁殖下去，作為生產用種，省去以往每年生產前都需進行免疫接種，成 倍地提高了工作效率。
(2) 弱病毒保護的矮牽牛其花葉病毒和類似病症的發病率低於3%，植株健壯、花大色 豔，品質明顯提高。
具體實施例方式
通過以下實施例對本發明作進一步的詳細說明，但本發明的內容並不局限於此。 實施例1:
這種弱病毒防治矮牽牛病毒病的方法，按如下步驟進行
1)、培養基的配製，包括基本培養基和組培各階段培養基的各組分與每升所含重量為
(1) 基本培養基基本培養基採用MS培養基，其中，瓊脂8g/L， pH5.8;
(2) 無菌播種培養基1/2MS+白糖20g/L;
(3) 誘導培養基1/3MS+BA1.0mg/L和NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L;
(4) 增殖培養基1/2MS+BA0.5mg/L和NAA0.1mg/L+白糖30g/L;
(5) 壯苗培養基MS+BA0.25mg/L和NAA 0.05mg/L+白糖30g/L;
(6) 生根培養基1/2MS+NAA0.05mg/L +白糖20g/L。 2)、矮牽牛莖尖脫毒培養-
(1) 外植體的選取與滅菌取矮牽牛的種子，經滅菌處理後接種在無菌播種培養基上， 在培養條件下培養30 45天後，從種子培養成高約5 7cm的實生苗，無需滅菌直接作為莖 尖脫毒培養用的外植體；
(2) 莖尖脫毒培養將無菌播種培養的實生苗的頂芽或滅菌處理後的溫室盆栽的幼芽在 無菌條件下，在40倍的雙筒解剖鏡下，摘出0.15 0.3mm大小的帶1~2個葉原基的莖尖， 接種在誘導培養基上，在培養條件下培養30 45天後，從莖尖誘導形成幼芽或叢生芽；
(3) 增殖培養將誘導形成的幼芽或叢生芽切成單芽接到增殖培養基上，在培養條件下 培養30 45天增殖出叢生芽；根據對幼苗數量的需求，每隔30 45天按同樣方法進行幼苗 再增殖培養；
(4) 壯苗培養將增殖出的叢生芽接種到壯苗培養基上，在培養條件下培養20 30天 後，幼苗株高生長達2 5釐米；
(5) 生根培養將培養的壯苗切成單株接種在生根培養基中進行生根培養，在培養條件
下培養20 30天後，幼苗長高成約5 7cm、苗基部長出5 10根細根；
(6) 移栽在隔離溫室中，將生根組培苗移栽於基質中，培育1 2個月至成苗。
8(7)定植在隔離溫室中，將移栽苗定植在溫室盆缽中，培育3 5個月至植株開花。 3)、病毒ELISA檢測-
將常規溫室中發生的矮牽牛病毒，經擴增、克隆和原核表達所獲得的相關病毒外殼蛋白， 注射小鼠或家兔免疫並製備成病毒特異性抗血清後，對移栽苗和開花植株進行病毒ELISA檢
4)、弱病毒的接種
將黃瓜花葉病毒的弱病毒株通過常規汁液摩擦方法接種到步驟3)檢測為無病毒的矮牽 牛植株上。
5)、弱病毒植株的組培繁殖-
(1) 外植體的選取與滅菌取步驟4)檢測為弱病毒的矮牽牛植株上的幼芽，經滅菌處 理後作為組培繁殖用的外植體；
(2) 誘導培養將滅菌處理後的幼芽接種在誘導培養基上，在培養條件下培養30 45 天后，誘導形成叢生芽；
(3) 增殖培養將誘導形成的叢生芽切成單芽接到增殖培養基上，在培養條件下培養 30 45天增殖出叢生芽；根據對幼苗數量的需求，每隔30 45天按同樣方法進行幼苗再增 殖培養；
(4) 壯苗培養將增殖出的叢生芽接種到壯苗培養基上，在培養條件下培養20 30天 後，幼苗株高生長達2 5釐米；
(5) 生根培養將培養的壯苗切成單株接種在生根培養基中進行生根培養，在培養條件
下培養20 30天後，幼苗長高成約5 7cm、苗基部長出5 10根細根；
(6) 移栽將生根組培苗移栽於基質中，培育1 2個月至成苗。
(7) 定植將移栽苗定植在盆缽中，培育3 5個月至植株開花。
所述的弱病毒防治矮牽牛病毒病的方法，其特徵在於所述的無菌播種培養時種子的滅
菌處理是經75%酒精浸泡1.0分鐘，再用0.1%升汞溶液滅菌20分鐘，最後用無菌水衝洗3 5次。
所述的弱病毒防治矮牽牛病毒病的方法，其特徵在於，所述的各組培階段的培養條件是， 培養溫度為25士2t:，光照光強為2200 2500Lx，光照時間為14h/d。
所述的弱病毒防治矮牽牛病毒病的方法，其特徵在於所述的移栽基質由泥炭珍珠巖 蛭石按體積比2: 1: l配製而成。
所述的弱病毒防治矮牽牛病毒病的方法，其特徵在於所述的弱病毒為黃瓜花葉病毒的
弱病毒株N14、黃瓜花葉病毒的衛星RNA生防製劑S52。本例中，其基本培養基的瓊脂7g/L， pH5.6;無菌播種培養基1/2MS+白糖20g/L;誘導 培養基1/3MS+BA1.0mg/L和NAA O.lmg/L+庶糖30g/L;增殖培養基1/2MS+BA O.lmg /L和NAA 0.05mg/L+白糖30g/L;壯苗培養基MS+ BA O.lmg /L和NAA 0.01mg/L+白糖 30g/L;生根培養基1/2MS+NAA0.01mg/L+白糖20g/L。
取溫室盆栽的性狀純正、生長健壯的矮牽牛植株上的幼芽，經75%酒精浸泡0.5分鐘， 再用0.1%升汞水溶液浸泡10分鐘，最後用無菌水衝洗3 5次進行滅菌處理，作為莖尖脫毒 培養用外植體的材料。
其餘步驟，條件均同於實施例l。
實施例3:
本例中，其基本培養基的瓊脂9g/L， pH6.0;無菌播種培養基1/2MS+白糖20g/L;誘導 培養基U3MS+BA3.0mg/L和NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L;增殖培養基1/2MS+BA1.0mg /L和NAA0.5mg/L+白糖30g/L;壯苗培養基MS+BA0.5mg /L和NAA O.lmg/L+白糖30g/L; 生根培養基1/2MS+NAA0.1mg/L+白糖20g/L。
取矮牽牛的種子，經75°/。酒精浸泡1.0分鐘，再用0.1%升汞水溶液浸泡30分鐘，最後 用無菌水衝洗3 5次進行滅菌處理，作為莖尖脫毒培養用外植體的材料。
其餘步驟，條件均同於實施例l。
實施例4:
本例中，其基本培養基的蔗糖或白糖20 30g/L，瓊脂7 9g/L， pH5.6 6.0;無菌播種 培養基1/2MS;誘導培養基1/3MS+BA 1.0 3.0mg/L和NAA 0.1 0.5mg/L;增殖培養基 1/2MS+BA0.1 1.0mg/L和NAA0.05 0.5mg/L;壯苗培養基MS+BA0.1 0.5mg/L禾口 NAA0.01 0.1mg/L;生根培養基1/2MS+NAA0.01 0.1mg/L。
取矮牽牛的種子，經75%酒精浸泡0.5 1.0分鐘，再用0.1%升汞水溶液浸泡20 30分 鍾，最後用無菌水衝洗3 5次進行滅菌處理，作為莖尖脫毒培養用外植體的材料。或取溫室 盆栽的性狀純正、生長健壯的矮牽牛植株上的幼芽，經75%酒精浸泡0.5 1.0分鐘，再用0.1% 升汞水溶液浸泡10 15分鐘，最後用無菌水衝洗3 5次進行滅菌處理，作為莖尖脫毒培養 用外植體的材料。
其餘步驟，條件均同於實施例l。
試驗例
1)、對照材料以種子實生苗培育的植株、扦插繁殖培育的植株和脫毒組培苗培育的植
株為材料；
102) 、處理材料以實施例1或實施例2或實施例3或實施例4獲得的攜帶弱病毒的組培 苗培育的植株為材料。
3) 、性狀觀察
觀察對照材料、處理材料的植株發病率、病毒危害症狀等。
4) 、病毒ELISA檢測
分別將常規溫室中發生的矮牽牛病毒或弱病毒，經擴增、克隆和原核表達所獲得的相關 病毒外殼蛋白，注射小鼠或家兔免疫並製備成病毒特異性抗血清後，對對照材料、處理材料
的植株進行病毒ELISA檢測。
5) 、試驗結果
接種弱病毒的植株通過組培繁殖獲得的組培苗100%攜帶弱病毒，弱病毒保護的矮牽牛其 花葉病毒和類似病症的發病率低於3%，非弱病毒保護的種子實生苗培育的植株、扦插繁殖培 育的植株和脫毒組培苗培育的植株的花葉病毒和類似病症的發病率為30 80%，弱病毒保護 的矮牽牛植株健壯、花大色豔，品質比種子實生苗培育的植株、扦插繁殖培育的植株和脫毒 組培苗培育的植株明顯提高。
除上述實施例外，本發明還可以有其他實施方式。凡採用等同替換或等效變換形成的技 術方案，均落在本發明要求的保護範圍。
1權利要求
1、一種弱病毒防治矮牽牛病毒病的方法，其特徵在於該方法按以下步驟進行1)、培養基的配製，包括基本培養基和組培各階段培養基的各組分與每升所含重量為(1)基本培養基基本培養基採用MS培養基，其中，蔗糖或白糖20～30g/L，瓊脂7～9g/L，pH5.6～6.0；(2)無菌播種培養基1/2MS；(3)誘導培養基1/3MS+BA1.0～3.0mg/L和NAA0.1～0.5mg/L；(4)增殖培養基1/2MS+BA0.1～1.0mg/L和NAA0.05～0.5mg/L；(5)壯苗培養基MS+BA0.1～0.5mg/L和NAA0.01～0.1mg/L；(6)生根培養基1/2MS+NAA0.01～0.1mg/L；2)、矮牽牛莖尖脫毒培養(1)外植體的選取與滅菌取矮牽牛的種子，經滅菌處理後接種在無菌播種培養基上，在培養條件下培養30～45天後，從種子培養成高5～7cm的實生苗，無需滅菌直接作為莖尖脫毒培養用的外植體；或取溫室盆栽的性狀純正、生長健壯的矮牽牛植株上的幼芽，經滅菌處理後作為莖尖脫毒培養用的外植體；(2)莖尖脫毒培養將無菌播種培養的實生苗的頂芽或滅菌處理後的溫室盆栽的幼芽在無菌條件下，在40倍的雙筒解剖鏡下，摘出0.15～0.3mm大小的帶1～2個葉原基的莖尖，接種在誘導培養基上，在培養條件下培養30～45天後，從莖尖誘導形成幼芽或叢生芽；(3)增殖培養將誘導形成的幼芽或叢生芽切成單芽接到增殖培養基上，在培養條件下培養30～45天增殖出叢生芽；根據對幼苗數量的需求，每隔30～45天按同樣方法進行幼苗再增殖培養；(4)壯苗培養將增殖出的叢生芽接種到壯苗培養基上，在培養條件下培養20～30天後，幼苗株高生長達2～5釐米；(5)生根培養將培養的壯苗切成單株接種在生根培養基中進行生根培養，在培養條件下培養20～30天後，幼苗長高成5～7cm、苗基部長出5～10根細根；(6)移栽在隔離溫室中，將生根組培苗移栽於基質中，培育1～2個月至成苗；(7)定植在隔離溫室中，將移栽苗定植在溫室盆缽中，培育3～5個月至植株開花；3)、病毒ELISA檢測將常規溫室中發生的矮牽牛病毒，經擴增、克隆和原核表達所獲得的相關病毒外殼蛋白，注射小鼠或家兔免疫並製備成病毒特異性抗血清後，對移栽苗和開花植株進行病毒ELISA檢測；4)、弱病毒的接種將黃瓜花葉病毒的弱病毒株通過常規汁液摩擦方法接種到步驟3)檢測為無病毒的矮牽牛植株上；5)、弱病毒植株的組培繁殖(1)外植體的選取與滅菌取步驟4)檢測為弱病毒的矮牽牛植株上的幼芽，經滅菌處理後作為組培繁殖用的外植體；(2)誘導培養將滅菌處理後的幼芽接種在誘導培養基上，在培養條件下培養30～45天後，誘導形成叢生芽；(3)增殖培養將誘導形成的叢生芽切成單芽接到增殖培養基上，在培養條件下培養30～45天增殖出叢生芽；根據對幼苗數量的需求，每隔30～45天按同樣方法進行幼苗再增殖培養；(4)壯苗培養將增殖出的叢生芽接種到壯苗培養基上，在培養條件下培養20～30天後，幼苗株高生長達2～5釐米；(5)生根培養將培養的壯苗切成單株接種在生根培養基中進行生根培養，在培養條件下培養20～30天後，幼苗長高成約5～7cm、苗基部長出5～10根細根；(6)移栽將生根組培苗移栽於基質中，培育1～2個月至成苗；(7)定植將移栽苗定植在盆缽中，培育3～5個月至植株開花。
2、 根據權利要求1所述的弱病毒防治矮牽牛病毒病的方法，其特徵在於所述的培養基，包括基本培養基和組培各階段培養基的各組分與每升所含重量為(1) 基本培養基基本培養基採用MS培養基，其中，瓊脂8g/L， pH5.8;(2) 無菌播種培養基1/2MS+白糖20g/L;(3) 誘導培養基1/3MS+ BA l.Omg/L和NAA0.2mg/L +蔗糖30g/L;(4) 增殖培養基1/2MS+BA 0.5mg/L和NAA0.1mg/L+白糖30g/L;(5) 壯苗培養基MS+BA0.25mg/L和NAA0.05mg/L+白糖30g/L;(6) 生根培養基1/2MS+NAA0.05mg/L+白糖20g/L。
3、 根據權利要求1所述的弱病毒防治矮牽牛病毒病的方法，其特徵在於所述的無菌播 種培養時種子的滅菌處理是經75%酒精浸泡0.5 1.0分鐘，再用0.1%升汞溶液滅菌20 30 分鐘，最後用無菌水衝洗3 5次。
4、 根據權利要求l所述的弱病毒防治矮牽牛病毒病的方法，其特徵在於所述的溫室盆 栽植株幼芽的滅菌處理是經75%酒精浸泡0.5 1.0分鐘，再用0.1%升汞溶液滅菌10 15分 鍾，最後用無菌水衝洗3 5次。
5、 根據權利要求1所述的弱病毒防治矮牽牛病毒病的方法，其特徵在於，所述的各組培 階段的培養條件是，培養溫度為25士2。C，光照光強為2200 2500Lx，光照時間為14h/d。
6、 根據權利要求1所述的弱病毒防治矮牽牛病毒病的方法，其特徵在於所述的移栽基質由泥炭珍珠巖蛭石按體積比l: 2: 2配製而成。
7、 根據權利要求1所述的弱病毒防治矮牽牛病毒病的方法，其特徵在於所述的弱病毒為黃瓜花葉病毒的弱病毒株N14、黃瓜花葉病毒的衛星RNA生防製劑S52。
全文摘要
本發明涉及一種弱病毒防治矮牽牛病毒病的方法，按如下步驟進行1)培養基的配製；2)矮牽牛莖尖脫毒培養；3)病毒ELISA檢測4)弱病毒的接種；5)弱病毒植株的組培繁殖。本發明的有益效果是利用植物組織培養技術進行接種弱病毒植株的組培繁殖，繁殖的組培苗100％攜帶弱病毒，並可連續地繁殖下去，作為生產用種，省去以往每年生產前都需進行免疫接種，成倍地提高了工作效率。弱病毒保護的矮牽牛其花葉病毒和類似病症的發病率低於3％，植株健壯、花大色豔，品質明顯提高。
文檔編號A01N63/02GK101496527SQ200910096468
公開日2009年8月5日 申請日期2009年3月9日 優先權日2009年3月9日
發明者呂永平, 剛 徐, 汪一婷, 牟豪傑, 陳劍平 申請人:浙江省農業科學院