溶於複雜混合物中的不同分子靶的分離和/或分析設備的製作方法

2023-11-11 19:25:12

專利名稱：溶於複雜混合物中的不同分子靶的分離和/或分析設備的製作方法
溶於複雜混合物中的不同分子靶的分離和/或分析設備本發明涉及分離和/或分析溶於複雜混合物中的不同分子靶、特別是核酸或蛋白質分子靶的設備。本發明特別涉及分離或分析分子靶的設備，其中包括由生物聚合物探針構成的晶片或陣列。這樣設備用於分離和/或檢測溶於複雜溶液中的多種分子靶。根據本發明的第一個實施方式，設備包括a.微型柱陣列，其包括放置在同一平面上的N個行和P個列的微型柱，每個微型柱包括一種固定的分子探針型，根據本發明的一個實施方式，通過探針/靶特異連接，能保留在複雜混合物中存在的特異分子靶，b.平行於所述微型柱陣列平面並在其上面的平面內的第一毛細管網，所述的第一毛細管網能將接到所述設備中的複雜混合物循環到如在a中定義的陣列的每個微型柱中，c.平行於該微型柱陣列平面並在其下面的平面內的第二毛細管網，所述的第二毛細管網能將洗脫後的分子靶循環到一個或多個檢測器中，由此回收它們和/或對它們進行分析，d.如果必要，用於回收和/或分析不同的分子靶的檢測器，優選質譜儀。本發明還涉及分離和/或檢測溶於複雜溶液中的多種分子靶的設備，所述的設備包括a.毛細管網，它能使加入所述設備的複雜混合物循環，b.兩組置於毛細管網兩側的電極-官能化電極組，其中這些電極接入由點組成的探針，每種探針通過探針/靶的特異連接能保留在該複雜混合物存在的特異分子靶，-非官能化電極組。本發明還涉及這樣一種設備尤其在分離和/或分析生物試樣中含有的DNA或RNA 分子中的用途。人們知道可採用質譜法分析測定大分子的質量，例如DNA、RNA或蛋白質的質量。 如果採用這種方法分析伴隨有分子分解，還可以測定它們的序列。不過，對於具有不同尺寸和序列的分子混合物，採用這種技術就變得很困難，甚至不可能鑑別這些不同的分子。可採用其它方法替代質譜進行檢測。因此，表面等離子體共振(SPR)能夠測定用具有自由電子金屬(例如金或鉬等) 製成的小厚度(xnm)薄片表面上小距離QOOnm以下)內的累計物質密度。事實上，在該金屬薄片的其中一個面上反射波隨在另一面附近物質的密度和量成比例地改變。然而，確實不可能區分引起反射波改變的不同類分子。此外，採用這種方法，檢測在生物-晶片上固定靶的靈敏度目前低於使用標記分子螢光所達到的靈敏度。在該金屬表面上探針存在本身因遠離金屬靶而降低其檢測靈敏度。動力學測量靶/探針相互作用時，在該表面附近存在的自由靶分子使這種測量走樣。一般而言，由於效能的緣故，採用SI^R方法檢測需要使用比螢光或放射性標記法多的材料量。因此，採用sra檢測還與一些實驗不相容，特別在診斷領域更是如此。另外，可以求助於測量在不同分子狀態之間存在的阻抗變化。
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具有一定序列的單鏈DNA分子的阻抗與相應的雙鏈配對複合體的不同。這種性質用於評估DNA晶片上的雜交比例，因此可評估在生物-晶片上生成的探針-靶複合體數 (ref.)。一般而言，這些阻抗變化可以用於研究分子間的相互作用，例如配體固定在其受體上，但也可以用於研究DNA或蛋白質與藥物、離子等之間的相互作用。不過，對於這些生物晶片，這種檢測方法受到下述因素制約1)難以製造2000個點以上的高密度晶片。事實上，由於製造這些阻抗晶片所使用的電極尺寸和連接物幾何結構，點數一超過800個，雜交面積就變得非常大。然而大的雜交面積要求應該布滿很大雜交面積的試樣體積，因此需要大量的生物材料，以便達到這種檢測的最小濃度。這與例如對於這些診斷可使用材料不多的實驗有矛盾。2)所研究分子的構象變化(探針和/或靶)會造成測量結果的假改變，導致不能解釋測量的阻抗變化。例如，由於分子內序列或雜交而產生的DNA變形與雜交所引起阻抗的變化為相同的數量級。在現有技術中採用場效應電晶體作為電流放大器，測量與DNA分子雜交相關的阻抗變化(ref.)。把探針接到電晶體柵極。這些靶固定後，它們改變了柵極阻抗，這樣引起在 (電晶體輸入)電源與電晶體輸出漏極之間的電流改變。但是，還沒有描述過這類檢測器的任何網狀結構。使用場效應電晶體作為電流放大器這個事實制約了為證明與雜交相關阻抗變化而可使用的交流電流頻率，自此制約了檢測器的靈敏度(ref.)。此外在上述說明中，這種柵極控制了電晶體中電流通過，其中植入這些探針消除了使用如電極的電晶體不同端子來控制靶運動，由此引導雜交集中在靶與探針層面上的可能。由生物聚合物探針組成的陣列(DNA晶片、蛋白質晶片等)能夠定性和定量地分離在混合物中存在的生物聚合物，這在理論上是可行的，不管其數量、序列和複雜性。但是，例如核酸網絡不能絕對精確地計算雜交分子數。此外，採用實際可用的技術，檢測生物晶片上的生物聚合物(微-陣列)是間接的，因此需要一個對它們進行標記的步驟(螢光、放射性等)。如果在生物聚合物中放射性標記殘留物和冷殘留物加入效率幾乎相同時，這與使用螢光標記物不同(Martinez等人，((Nucl. Acids. Res.》2003，31，第18頁；Hoen等人， ((Nucleic Acids Res.》，2003年3月1日，31 (5)，第20頁)。合成加入螢光標記物CY3和 CY5的DNA分子時尤其會遇到這些標記問題。由該後一類標記得到的立體阻塞物還可能嚴重地改變反應(通常的雜交、抗體-抗原反應、靶-配體反應等)的動力學和化學計算量平衡。採用放射性同位素可克服這些立體阻塞物問題；不過，這些放射性同位素牽涉到放射性廢物的管理。另外，採用放射性方法標記分子的檢測技術，即實質上放射性的磷成像類檢測技術(Bertucci F 等人，《Hum Mol Genet.》，1999 年 9 月，8 (9)，第 1715-22 頁；Erratum in, 《Hum Mol Genet. )) 1999年10月，8 (11)，第21 頁)，與不同類型的螢光檢測掃描儀，對於達到進行測量的檢測閾值和再現性，在晶片上待雜交生物材料量方面有一些限制。事實上， 不可能使用含有低細胞數(約1000個細胞)的試樣通過細胞檢測以某些拷貝數存在的分子，然而，這些細胞數量卻與通常的臨床取樣情況相對應。使用經典DNA晶片的另一種選擇在於使用沿整個毛細管長度呈環狀排列的探針使該毛細管內官能化，每個環是由對一種基因特異的探針型構成的。較小的毛細管直徑 (約100 μ m)能夠在理論上減少可分析試樣的體積，因此例如使用較低的標記生物材料量
4就能夠達到螢光法可檢測的濃度。然而，與降低反應體積相同，在探針環中每個進行雜交靶的濃度依賴於整個毛細管的體積。探針數增加得越大，毛細管的長度就應該越長，達到檢測濃度需要的材料量(例如待分析試樣)就越大(毛細管的體積與其長度成正比)。使用毛細管時，與試樣標記相關的這些問題依然相同。另外，使用大量不同探針生產官能化的毛細管是棘手的，費用也高。最後，一般而言在該技術狀況中描述的DNA或蛋白質晶片是單次使用，這樣使每個實驗點的使用成本非常高。這種使用的獨特性大大制約了這些技術在為診斷所作的臨床研究和試驗方面的普及。本發明提供一種設備，它能夠分離和/或分析在複雜混合物中存在的特異分子靶，特別是生物聚合物分子靶，例如RNA、DNA或蛋白質分子。本發明的設備在大量實驗中是可重複使用的，還能夠測量約微微微摩爾(10_18)，甚至ζ印to摩爾(10_21)的產物濃度。 使用有限細胞數，例如約千個，甚至百個細胞，這些極限能夠通過細胞鑑定單拷貝存在的分子。另外，根據本發明的某些實施方式，該設備能夠進行對比分析，因此能夠同時分析多個試樣。根據本發明的另一個實施方式，該設備能夠通過探針直接測量例如保留在所述陣列每個微型柱中或在陣列雜交點中的核酸或蛋白質序列。因此，本發明的一個方面涉及分離和/或分析溶於複雜混合物中的幾種分子靶的設備，所述的設備包括a.微型柱陣列，包括放置在同一平面上的N個行和P個列的微型柱，每個微型柱包括固定的分子型探針，它能通過探針/靶特異連接保留在複雜混合物中存在的特異分子靶，b.在平行於所述微型柱陣列平面並位於其上面的平面中的第一毛細管網，所述的第一毛細管網能將加到所述設備的複雜混合物循環到如在a中定義的陣列的每個微型柱中，c.在平行於該微型柱陣列平面並位於其下面的平面中的第二毛細管網，所述的第二毛細管網能將洗脫後的分子靶循環到一個或多個檢測器中，因此能回收它們和/或對它們進行分析，d.如果必要，檢測器，它能回收和/或分析不同的分子靶，優選質譜儀。如果必要，電極系統能夠操作、替換在這些網中的靶。術語「毛細管」應該理解是允許循環流體，直徑小於1毫米，優選地1-100 μ m的任
何合適管道。在本發明的意義上，「分離複雜混合物中的分子靶」應該理解是這種操作，它能夠獲得富含初始複雜混合物中存在的特異分子或分子靶的不同體積的溶液。這裡「富含」應該理解是在分離後所得到的溶液中至少50%，優選80%，還更優選至少90%的分子是這些分子靶。「分析分子靶」應該理解這種操作在於鑑定在待分析複雜混合物中存在的分子靶 (測定)和/或確定這種分子靶的相對或絕對量(定量分析)。術語「複雜混合物」在本發明的意義上應該理解是含有大量不同結構分子的溶液， 特別地是含有100種以上具有不同結構分子的混合物。更優選地，本發明的設備用於分離和/或分析特別在生物源試樣中含有的生物學分子(或生物分子)。
更具體地，可能涉及從生物組織或液體中採集的試樣，例如血液、血漿、腦脊髓液、 尿或唾液。可以從動物(特別地哺乳動物，優選人)採集試樣。特別可以從健康個體或患有病理學疾病的患者採集試樣。該病理學疾病具體可以是癌症、神經變性病理學、感染病理學，特別是病毒、細菌或寄生蟲感染病理學疾病。這種試樣還可以含有組織提取物或細胞提取物，其來自真核細胞或原核細胞、細菌、蕈類或酵母，特別是培養物中的細胞或從外部環境採集的細胞。還可以從植物中採集獲得這種試樣。還可能涉及從農產品加工產品中進行抽取，特別是從烹飪食品中進行採集，或從穀粒、水果或糧食中進行採集。這種設備因此可以用於各種用途，特別是用於藥物診斷或農產品加工質量控制， 或任何生物學分析，特別用於生態學、考古學或犯罪學領域。本發明設備的每個微型柱包括任何形狀的室，例如管狀室，其直徑優選地是 2-1000 μ m,優選地 20-100 μ m,長度 2-2000 μ m,優選地 40-200 μ m。每個室通過第一端與第一毛細管網的毛細管連接，通過其相反端與第二毛細管網的毛細管連接，因而可能讓在毛細管網中循環的流體通過整個室。所述設備通常由置於同一平面中多個室的N個行和P個列的陣列構成。這些室相對於該平面可以有任何的傾斜度，但是由於實際的原因這些室優選地平行或垂直於該陣列平面。由於堵塞的原因，這些室的兩行中的一行可以呈梅花形放置。特別地，在製造本發明設備時在合適材料表面的厚度內可以鑿出或模塑這些室， 於是構成該陣列的平面，所述材料例如是玻璃、矽、塑料、Kapton、碳、金或任何其它材料。本發明設備的微型柱陣列因此由大量的室構成，例如1至1百萬個室，優選地 100-100000個室，因此能分離和/或分析在同一試樣中會含有的如此之多的特異分子靶。所述分子探針放置並固定在每個室中，優選地，根據探針的具體特性放置並固定在每個室中，於是構成每個都能夠保留特異分子靶的色譜微型柱。在本發明的意義上，術語「固定」表示當循環流通過有這些分子探針的微型柱時， 特別是在電場、磁場存在下，或在預先注入該設備毛細管網中的循環流的存在下，這些探針保持在這些室中。該設備因此由微型柱陣列組成，其中每個微型柱包括大量(例如IO6-IOltl)具有同樣特性的探針，這些探針被固定，並能在適當條件下特異地與相應分子靶連接。下文用術語 「分子探針」表示這些探針。探針與所述複雜混合物中含有靶的連接的術語「特異連接」，表示該探針與特定靶連接，但與其它分子連接不多，更特別地與該複雜混合物中存在的其它靶連接不多。優選的探針-靶對，特別是與互補序列雜交的核酸，例如用特定的寡核苷酸探針雜交信使RNA、DNA或cDNA分子，由抗體或其的功能片段組成的探針專門識別抗原，或任何的受體-配體對，反之亦然。本技術領域的技術人員能將所述的設備用於分離和/或分析任何類型的分子，當它們結合成為特異識別的實體時，該實體含有分子探針，所述靶分子於是能特異地與在支持物上固定的所述分子探針連接。例如藉助與一種不能從所述室出來的單元的強相互作用可以達到將探針固定在每個室中。這種偶聯方式例如是這些探針固定在該室內壁上，特別是通過共價鍵或任何其它的強相互作用將這些探針固定在該室內壁上。
或者，這些分子探針可以固定在微粒上，該微粒結構是使得它們不可能從其室中逃逸(Huang 等人，《分析化學》(Anal. Chem. ),2002 年，74(14)，第 3362-3371 頁；Ugolin 等人，FR 0015398，2000年，11月)。所述微粒的平均直徑例如是大於每個微型柱進口或出口毛細管的直徑。如果這些微粒能經受或提供磁吸引力，並且如果所述室的一部分壁能另外提供或經受磁吸引力，則通過這些微粒與該室的一部分內壁的磁相互作用或許可以將這些微粒保留在該室中。在一個特別的實施方式中，所述分子探針在每個室中被固定在凝膠上，因此妨礙所述的分子探針遷移到所述微型柱外。例如通過與構成凝膠的分子的強相互作用或共價鍵保留所述分子探針。在一個優選的實施方式中，每個室填滿了凝膠，而所述分子探針與一些微粒聯接， 該微粒直徑大於凝膠網絡結構尺寸，因此允許將這些微粒固定在所述微型柱中，由此固定聯接所述的分子探針。可以採用任何合適方法將這些分子探針與這些微粒或與所述室內壁聯接。作為例子，特別可以列舉在同生物素聯接的分子探針與用抗生物素蛋白官能化的珠之間的生物素-抗生物素蛋白型的非共價聯接，例如以「dynal」銷售的這些產品(Dynal全世界經銷商， 版權1996，Dynal AS-技術手冊第二版)。一般而言，就這些色譜柱所描述的所有聯接、化學鍵合、強相互作用類型可能都適
I=I O特別地，可以將所述探針直接固定在裝在每個微型柱中的凝膠聚合物上。在另一個實施方式中，特別地，在所述探針是核酸的情況下，為了使該探針與微粒共價聯接，可能的是合成一種非均相聚合物polyX/探針，例如聚-吡咯/核酸。事實上，在 5'端或3'端與吡咯連接的這些核酸分子探針具有與游離吡咯分子聚合的特性，於是生成一種非均相聚合物，因此，這些尺寸足夠大的非均相聚合物可以起到上述微粒的作用。另外一種選擇是使用在5 『端和/或3 『端與橋聯劑連接的核酸探針，例如補骨脂素。探針序列可以呈下述形式補骨脂素5' (Yl)Xn (Y2) 3'。)(r!代表嚴格意義的探針，而 Yl和Y2是如此選擇的序列，以致這些探針能夠被連接，彼此無須通過互補性來制約。作為實例，這些聚合探針可以由5' (T)mXn(A)m3'補骨脂素等摩爾混合物組成，其中m = 5。在紫外輻射作用下，這些探針聚合成大分子(聚5' (T)mXn(T)m3補骨脂素3' (A)m(X)η(A) m5'等)，它可以保留在每個室中。所有上述的相互作用類型也可能都適合探針直接固定在所述室壁上的情況。特別地，通常利用的相互作用也可能適合固定核酸探針的DNA晶片或固定多肽探針的蛋白質晶片(賴氨酸/核酸靜電相互作用、矽烷固定、吡咯在其室表面上的聚合作用、補骨脂素固定等)，如同在珠或室壁上原位合成方法。同樣可考慮使用尼龍或硝基纖維素將這些探針不可逆地固定在微粒或所述室壁上(這時微粒或壁是用這些材料製成的)。這種固定可以是直接的，或藉助橋接進行固定，例如在尼龍微粒與分子探針之間的補骨脂素橋。在一個特別的實施方式中，同源可考慮使用孔直徑足夠小的孔過濾器(例如，直徑小於過濾微粒的直徑)將與微粒聯接的分子探針機械保留在該室中。這樣一些過濾器 (特氟隆過濾器等)目前使用和銷售。分子探針在其支持物上固定應該強到足以耐受在操作所述靶時所施加的不同處
7理與承受所採用的任選電場。本發明的設備包括一個或兩個毛細管網，它們與能夠控制待分析靶的洗脫和/或遷移的電極連接，採用將所述探針固定在生物晶片支持物上的所述任何化學方法都可以將這些探針固定在所述電極上。在用ITO(或任何其它透明合金、ΑΤΟ、ZNO、FT0)製成的電極的情況下，可以實現具有親水基團探針的直接沉積，例如Ρ03-(參見ref.)，如這些核酸便是這種情況。需要採用封裝方法將沒有接受探針植入的電極部分分開。例如，可以使用一種聚吡咯薄膜。在吡咯溶液的存在下，將這些植入的電極置於電壓下時，製造出這種薄膜。這種吡咯在電流作用下自發地聚合，並離析出電極的自由部分。在植入探針後，這些電極還可以用不會被所述靶雜交的單一寡核苷酸(PolyA例子)進行飽和。本發明渉及在用ITO製成的電極上通過盲接吸附固定核酸聚合物的方法。所述設備包括兩個毛細管網時，允許待分析混合物循環通過所有的微型柱。相應的所述靶特異地保留在每個微型柱上。然後洗脫該靶，即從與其特異結合的分子探針上洗脫它們，然後遷移到一個或多個檢測器，同時到達在微型柱出口的毛細管網。考慮到大量的微型柱，很容易理解到為了順序分析靶，可能有利的是在N*P微型柱陣列的情況下，在每個微型柱中或在例如一行一行地排列的至少不同的微型柱組中，能夠分別控制洗脫和/或遷移所述的靶，如作為優選實例所描述的。按照本技術領域的技術人員已知的對於二氧化矽採用酸腐蝕技術，或對於塑料採用雷射加工方法，在諸如二氧化矽、塑料(像有機玻璃)之類的材料中，例如鑿出或模塑出這些毛細管網。在一個優選的實施方式中，在合適材料板的厚度內鑿出每個毛細管網。所述設備這時包括微型柱陣列和兩塊已鑿出這些毛細管網的板，這些毛細管網粘接在陣列的每個面上(Kuo等人，《化分析學》，2003，75 (10)，第2224-2230頁；Kuo等人，《化分析學》，2003， 75 ⑶，第 1861-1867 頁)。在一個特別的實施方式中，如上所述的本發明設備的特徵在於，它包括一些工具， 在陣列的一個或多個特定微型柱中，這些工具能夠控制分子靶洗脫和/或在洗脫後將它們保留在這些微型柱中。「洗脫」應該理解是消除在所述靶與所述探針之間已建立的所述特異連接的操作。在本發明的意義上，「在特定的微型柱中控制洗脫和/或靶遷移」應該理解是，該設備能夠選擇一些微型柱，其中的靶會被洗脫或遷移到所述檢測器中，而其它的靶沒有被洗脫或仍保留在所述微型柱中，儘管或許有液流通過所述的微型柱。如果使用同樣的分析設備時，這時有可能分別分析從每個微型柱或微型柱組洗脫的靶，按照這種實施方式的設備尤其能夠限制所採用檢測器的數量。在一個特別的實施方式中，當所述分子靶是帶電荷的分子，例如核酸時，有可能通過施加電場控制這些靶的洗脫和/或遷移，例如使用與每個微型柱接觸並在每個微型柱出口排列的電極組。在每個室中的這些電極可以是彼此獨立的(室與室多路傳送)或是由電極組組成的，因此每一組室形成每個電位單元。因此，在一個特別的實施方式中，本發明的設備包括第一電極，即室或中間電極， 放置在與每個微型柱接觸，優選地在微型柱的中間，以及第二電極，即遠側電極，放置在每個微型柱的出口，因此能控制將保留在一個或多個特定微型柱中的分子靶洗脫和/或將它們遷移到所述檢測器或洗脫後將它們保留在這些微型柱中。設置這些室電極以便在洗脫後通過電相互作用將一些帶電分子保留在該微型柱中，然後允許它們選擇性遷移。這些室是管狀時，例如安排所述分子與室的側壁接觸。如果所述設備能洗脫和/或將分子靶分別遷移到檢測器，所述設備可以包括一個合適的毛細管網，它尤其能把在微型柱出口的分子靶會聚到有限數量的檢測器中，甚至單個檢測器中。另外，在一個優選的實施方式中，本發明的設備特徵在於通達微型柱進口的第一毛細管網和通達微型柱出口的第二毛細管網，所述第一毛細管網包括加入複雜混合物的第一橫向毛細管，以下稱之上橫向管道，其直徑優選地是2-1000 μ m，其與通達所述陣列微型柱的所有毛細管連接，所述第二毛細管網包括將所述微型柱與所有毛細管連接的一個或多個橫向毛細管，其稱之下橫向管道，直徑優選地是2-1000 μ m，該下橫管道與一個或多個檢測器連接。所述下和上橫向管道每個優選地與電極連接，因此在待分析複雜混合物加入點與所述檢測器之間能施加一個電位差，由此還能夠保證帶電分子在整個設備中遷移，特別是能夠通過電泳保證在待分析複雜混合物含有的核酸在整個設備中遷移。在一個特別優選的實施方式中，本發明設備的特徵在於所述微型柱陣列包括安排在同一平面內的N個行和P個列的微型柱，其特徵還在於它包括一些工具，它們能夠控制保留在特定行微型柱上的分子靶的洗脫和/或將它們遷移到所述檢測器和/或在洗脫後將它們保留在所述微型柱上，其特徵還在於選擇第二毛細管網的每個毛細管長度，以使在微型柱出口與下橫向管道之間的距離因第二毛細管網的毛細管之間的不同而不同，優選地從連接一行第一微型柱的毛細管到連接該行最後微型柱的毛細管是遞增或遞減的，結果對於同一行的每個微型柱，分子靶通過微型柱出口到達檢測器的時間都是不同的。作為實例，為了達到來自同一行每個微型柱的靶的不同遷移時間，將每個微型柱與下橫向管道連接的毛細管網可以包括P個平行毛細管，每個毛細管可將所述陣列中同一行的P個微型柱與下橫向管道連接起來，並與不同的所述下橫向管道形成角度90°。為了進一步延遲標記，在室的最後行與橫向管道之間的這些毛細管部分沿著非線性路逕行走。能夠通過不同靶的遷移時間鑑定所述靶來自的微型柱，因此能夠採用在微型柱中的分子探針鑑定上述靶。由此選擇毛細管的直徑和其中使用的任意凝膠密度，從而並不從大小標準方面辨別這些遷移分子，而遷移時間只是取決於達到的途徑。然而，任選地可以選擇凝膠密度，以便通過毛細管電泳進行色譜分離。分子遷移時，採用適當的凝膠可使具有不同尺寸的分子有不同延遲，或使諸如在同一探針上被雜交的具有小的序列多形態的分子有不同延遲。優選地，下橫向管道以及具有不同距離第二毛細管網的不同部分都裝滿凝膠。因此，靶快速遷移直到第二毛細管網的毛細管不同部分，在此進行色譜分離。為了控制所述設備微型柱每行的靶的洗脫和/或遷移，同一行的所有P個微型柱都可以與同一電極連接，本發明的設備因此包括N個行電極(室行電極)，優選地在微型柱中間的行電極，和第二組與行電極平行的電極(遠側的行電極)，同時在同一行的微型柱出口將P個毛細管連接起來。
於是得到一種室或中間行電極網一種微型柱陣列行電極。除了在每個室中允許靶的毫微-操作外，這些電極可以催化探針固定，例如與吡咯連接的探針，在電場作用下其固定在每個電極中。第二組遠側的行電極，即室行電極的鏡面電極，安排在微型柱陣列的室的出口。所述行電極對確定了 N*P微型柱陣列的電位單位。所述電極對能夠向微型柱的每行施加所期望的電位。根據所述設備的一個優選實施方式，第一和第二毛細管網位於平行於微型柱陣列平面的平面中，優選地它們分別在由該微型柱陣列構成的平面之上和之下，而第一毛細管網，稱之上毛細管網，包括N個平行的毛細管，每個毛細管將上橫向管道與該陣列同一行的 P個微型柱連接起來，而第二毛細管網，稱之下毛細管網，包括P個平行毛細管，每個毛細管將該陣列同一列的N個微型柱與下橫向管道連接起來，在上下兩個毛細管網之間形成的角度不是0，優選地是90°。因此，通過微型柱陣列的每行P個室將上毛細管網的每個毛細管與該下毛細管網的所有這些毛細管連接起來。反之亦然，通過微型柱陣列的每列N個室將下毛細管網的每個毛細管與該上毛細管網的所有毛細管連接起來。在一個特別的實施方式中，其中包括N*P微型柱的這樣一種陣列，與上橫向管道相反的上毛細管網的毛細管末端，優選地與該微型柱陣列行的第P個和最後一個微型柱最後連接而中止，以及下橫向管道相反的下毛細管網的毛細管末端，優選地與該微型柱陣列微型柱的列的第N個和最後一個室最後連接而中止。在另一個實施方式中，讓與橫向管道相反的下毛細管網的毛細管末端與第二橫向毛細管(副下橫向管道)連接，這個管道能在通過所述微型柱陣列的兩個下、上毛細管網之間確立流，這樣能夠加速和更精確地控制在下毛細管網中遷移。事實上，如果主下橫向管道裝滿一種凝膠以使微毛細管電泳達到這個水平，這時總有可能在上橫向管道與副下橫向管道之間建立封閉循環流。一般而言，這些毛細管網可以裝填凝膠，例如聚丙烯醯胺或任何其它凝膠，這種凝膠能夠調節這些流，分子遷移時還能夠控制它們擴散，特別是毛細管電泳使用的液體凝膠。在裝有N*P微型柱陣列的設備的一個特別實施方式中，上和下橫向管道裝有有或沒有螺紋的活塞，因此能夠控制所述流通過的微型柱的行數。往後移動時，該活塞使所述陣列的微型柱行越來越多。在製作有槽的空心活塞時，可能任選地使微型柱的行逐行移動。在一個特別的實施方式中，在無流動的雜交期間進行靶循環，同時在上、下橫向管道的這些電極與相繼的行電極之間建立交變電場。這個電場能夠有規律地使這些未雜交靶混合，以使雜交溶液均勻。此外，通過調節電場力有可能控制雜交的特異性(Cluzel P， 1996，《科學》(Science)，Vol. 2071 (5250)，第 792-794 頁)。一個使用疊置雙毛細管網的較簡單的替代辦法是使用單個毛細管網和行電極對組，構成本發明的設備。所述設備這時呈由點組成的探針陣列形式(相應於一個雜交單位)，其中每個點由分子型探針構成，例如核酸聚合物型，其序列對於一種基因是特異性的(蛋白質應涉及抗體型或特異配體)。將該陣列點的每個行放在金或ITO(或任何其它合適的金屬或合金) 表面上，同時規定了電極的範圍，這時整個陣列由對應於行數η的η個電極構成，每個行電極包括植入探針的P個點(參見圖7)。在絕緣材料，例如玻璃、kapton、氧化鋁等上通過薄
10層鏤蝕這些電極(參見示意圖)。製作第一組電極的鏡面第二組電極，但是這次該電極不用接入探針，這些電極是所述的非官能化的。兩組電極與P個平行毛細管網彼此相對放置，結果有一個電極組在上面，另一個電極組在下面(圖8和9)。第一官能化電極組具有植入由點組成的探針的電極， 每種探針存在於所述複雜混合物中時，通過探針/靶特異連接能保留特異性的分子靶。第二電極組具有非官能化的電極。在一個特別的實施例中，所述官能化電極組位於所述毛細管網上面，而所述非官能化電極組位於所述毛細管網下面。每個毛細管與該官能化電極組的η個電極和該非官能化電極組的η個電極垂直(圖9、10、11)。該構造如此實現，以致η 個官能化電極的第一點是在該毛細管網的第一毛細管中，η個官能化電極的第二點是在該毛細管網的第二毛細管中，依此類推(圖11)。電極對是由在該毛細管網上面接入由點組成的探針的電極和在該毛細管網下面的非官能化電極相對而成的。這些電極的厚度可以非常小，能夠採用SI^R進行檢測。在毛細管網的每個末端，這些毛細管會聚到一個圓形容器。該容器包括在與該官能化電極組相同的平面內的電極(容器電極)(圖11)。在一個特別的實施例中，這個電極是圓的。在一個特別的實施例中，這個電極處在每個容器頂部的中心。 所述官能化電極組(植入探針的電極)是由兩個補充連接電極完成的第一彎曲電極位於第一容器電極與第一官能化電極之間，第二彎曲電極位於第二容器電極與最後的官能化電極之間。該連接電極是彎曲的，其曲率如此確定，以致於該連接電極與該容器中心(容器電極)之間的距離在任何電極點都是相同的。第一補充連接電極位於第一容器電極與第一官能化電極之間，第二補充連接電極位於第二容器電極與最後官能化電極之間，結果在該連接電極與該容器電極之間的最短距離在任何電極點都是相同的。上面對本發明的設備作了描述，該設備包括所述網構成單元的雙毛細管網，該單元例如是毛細管、電極、檢測器等，這種描述可適用於製作包括單一網的設備，前提是其與具有單一網的這個設備運行相容，如果需要這個結構還可改動。類似地，對待分析分子和使用的探針以及它們的製備、使用和檢測方式所作的描述都可適用於製作包括單一網的設備，前提是其與具有單一網的這個設備運行相容，如果需要這個結構還可改動。包括唯一一個毛細管網的設備運行原理是利用活性雜交(ha)，並可描述如下1)把待分析試樣(圖1 接到第一容器中。這些分析的分子是核酸時，在第一連接電極(正)與第一容器電極(負)之間施加一個電位。在分析蛋白質時，這個電位可以交替地顛倒。本說明書下面涉及這些核酸的作用。這些待分析分子以等摩爾方式遷移到每個毛細管中，並濃縮在所述連接電極上。2)然後，切斷容器電極與連接電極之間的電位，而在第一官能化電極⑴與連接電極(_)之間施加一個電位。這時，每個毛細管的這些分子遷移到第一官能化電極，在這裡第一電極點的互補靶(通過毛細管的點)可能被雜交(這種電場加速其雜交)。在每個點的濃度是最大的(它只是取決於毛細管的數量，不再取決於管道化總體積)。3)為了將這些靶限制在點內，可以把第二行電極(非官能化的)調到負電位；達到一種電荷分布(-+_)，其中+電荷的中心在每個毛細管的第一點上。為了改善這種雜交作用，這些電位可以是不連續的。無電位的時間間隔相應於松馳時間，在這個時間裡這些靶可以無限制地進行雜交。為了增加待分析靶的混合，有利於少量存在靶的雜交，在松馳時間裡，在所述毛細管網上面和下面的第一電極對之間可以建立間斷的交變電位(這還改善雜交的特異性)。一旦這些靶在點的第一行水平進行雜交，第一行就會去除這些電位。連接電極位置記為0，接入探針的第一、第二和第三官能化電極的位置分別記為1、2和3時，施加的電位順序可以如此描述4)第二官能化電極處於正電位，電荷的分布是(0_、1+、2+)(任選地，第三電極處在負電位)，電荷分布(0-、1+、2+、3_)；5)第一官能化電極處於負電位，電荷分布是(0-、1-、2+)，任選地(0-、1-、2+、3_)；6)連接電極處於0，電荷分布(1_、2+)，任選地(1-、2+、1_)；7)在官能化電極2與非官能化電極2之間的間斷交變電位。在點的第一行中所有非雜交探針會遷移到點的第二行中。全部的遷移、松馳、混合順序(點4-6)逐步應用於使在分析試樣中有互補靶的所有行的所有點雜交。一旦到達第二容器，已遷移到不同毛細管中的這些靶再進行混合。這時有可能按照一種實施方案沿著另一方向達到這些電位順序，以便沿著相反方向通過這個毛細管網。靶在兩個容器之間來回通過這些毛細管能夠提高該設備的檢測穩定性。根據前面就具有雙毛細管網的設備所描述的，使用具有唯一一個毛細管網的設備對這些雜交靶進行量化，可考慮有多個檢測可能性。關於SPR ·可以直接就這種官能化電極網對這些靶進行量化。為了能進行sra測量(參見用SI^R檢測章節說明)，在官能化電極網的每行電極背後安裝呈三稜體狀的稜鏡。·為了減少檢測本底噪聲和解決靈敏度的問題，可以對所述非官能化電極組進行 SI^R測量，其中與每個電極毛細管相反的這個面同三稜鏡聯接(參見spr章)。在這個檢測方法中，該官能化電極組可以與一種結構聯接，或每個點被小室分隔開並限定其範圍(圖 13)。每個室是一個小槽，其底是由官能化電極構成的，並且它是在非官能化電極對面朝著該毛細管敞開的(在毛細管網的毛細管一側敞開的室)。這些室間隔避免了其中一個靶在官能化電極與非官能化電極之間遷移過程中一個點靶與另個點靶混合。在使用有側邊和單個毛細管網的敞開室的情況下，有可能使橫向管道適合於毛細管系統和遷移延遲系統(參見如有關具有雙毛細管網設備的下毛細管網所描述的章節)。 在使用單個毛細管網的情況下，有可能取消第二容器，用毛細管系統的橫向管道和遷移延遲系統取代該容器(圖14)。因此，具有兩個疊置毛細管網的這個系統的所述同樣檢測類型也可應用於簡化系統。在這種構型中，第一連接電極是如此彎曲的，以致在連接電極與容器中心之間的距離在該電極任何點處都是相同的，還在於第二連接電極不是彎曲的。雜交時，這個電極用於確定這些探針不可越過的電邊界，然後在檢測步驟，這個電極應能夠藉助由靶電極和連接電極所確定的電位將這些靶引向該延遲系統。如果所述電極相對於橫向管道有一個凸角，則延遲效果被放大。關於螢光-如果所述靶用一種螢光標記物進行標記，則有可能用掃描儀在所述官能化電極組上直接讀出這些雜交的靶。同樣地，可以採用螢光與SPR(用SPR的損耗波激發螢光分
12子)的聯用方法。-所述靶沒有標記時，使用靶或複合物的螢光配體時可以評價探針/靶複合物比率。對於DNA晶片，列舉吖啶類，特別是吖啶橙，它是一種帶正電荷DNA的插入子 (intercalant)。吖啶橙能夠有區別地標記單或雙DNA，通過由這些電極系統產生的電場的作用消除其游離分子。藉助能夠控制所有帶電荷分子的電極組，可以在雜交或絡合反應過程中進行所有的測量。這個方法，可以估計組成該點的探針分子數和已雜交的靶數；這兩種測量能夠確定靶在溶液中的真實濃度。為了避免來自電極的幹擾螢光，使用ITO類的合金可以製作全部的連接物，這些合金在可見光區是透明的(氧化銦和氧化錫或任何其它等效合金等)。這些合金是非常親電子的，它們嚴格能耐受在化學離析章中所描述的化學離析方法。在一種本發明設備的特定結構中，這些探針可以放在該官能化電極組的這些電極之間(圖7)。在使用雙毛細管網的情況下，本發明的設備包括一個或多個分開收集所述分子靶和/或分開分析所述分子靶的合適檢測器，下面稱之這個或這些檢測器。在一些優選的實施方式中，將所述檢測器與下橫向管道的出口相連，而下橫向管道連接第二毛細管網的毛細管。在本文下面詳細地描述了一種設備，它包括檢測器和連接第二毛細管網所有毛細管的下橫向管道。當然，其它的變化也是可考慮的，特別地，可以使用多個檢測器，將每個檢測器與下橫向管道的出口相連，而下橫向管道連接第二毛細管網的一部分毛細管。在第二毛細管網的出口可以裝配所有的檢測系統，特別是能夠區分諸如來自不同試樣的分子靶的所述分子靶所使用的標記類型。作為實例，如果這些靶可用螢光標記，特別是在用螢光探針標記後，可以使用分光光度計進行這種檢測，該分光光度計能夠激發或獲得標記分子螢光或研究分子的固有螢光。為此，在一個特定的實施方式中，可能的是在下橫向管道出口添加一種在石英晶體或任何其它透明材料中鑿成的毛細管，該透明材料能夠激發和獲得這種螢光(例如塑料)。這種螢光通過該石英毛細管時被激發而可閱讀。研究分子的自然螢光可以用於這種檢測。同樣地，在紅外光譜法和喇曼光譜法中可以使用NaCl或KCl晶體進行研究。或者，如果一些靶是用順磁標記物標記的，則可利用順磁或電子共振進行這些靶的檢測和量化。採用Sra進行檢測時，遠側或內行電極是由厚度幾十μπι的金(或具有自由電子的其它金屬)箔構成。每個遠側電極的外面(與管道相反)是與三稜鏡(玻璃、石英、塑料或任何其他可以適合於該SI^R的透明材料)的三個面拼接的。該三稜鏡是由一種三面體構成的，其三個矩形面中的一個矩形面是與遠側行電極的外面聯接的，三面體的長度相應於該電極的長度(圖15)。在靶雜交後，在所述微管道迴路中進行漂洗與除去所有未雜化的靶，而雜化靶保留在每個室中或每個點中，以便簡化概念。給該系統施加電壓，以便在每行電極對中，分別在官能化和非官能化電極概念中，中間電極的電位是正的，而遠側電極的電位是負的。我們在描述時把官能化電極比作中間電極，而把非官能化電極比作遠側電極。對於這些蛋白質、 抗體或分子受體晶片，這些電位隨研究分子的電荷而改變。把能解開探針-靶複合體的離液劑加到該介質中。將這些探針與靶分開，但依然因中間電極的負電荷而保留在每個室或點中(圖16)。在第一電極對中的電位顛倒過來，例如遠側電極的電位是正的，而中間電極的電位是負的。依賴於電極對的室或點每行的靶，遷移到該毛細管網中，進入與毛細管網垂直的遠側電極中(兩個疊置網系統中的下毛細管網)，例如每個室或點的這些探針再處於不同的毛細管中。本發明還涉及一種sra分析方法，該方法包括-靶在電極上雜交，-用離液劑去雜交，-通過電位保持靶，-顛倒電位使這些靶遷移到非官能化電極上，-測量非官能化電極上的SPR。讓光在遠側電極的外面上反射通過放在每個電極上的這些三稜鏡進行sra測量。 通過觀測所測量的sra信號隨著時間而改變的速度，有可能估算離解常數。將交變電流施加在一對行電極之間時，有可能測量探針/靶的結合常數和離解常數。在這種特定的情況下，這些實驗中不使用變性劑，從而電場誘發的局部濃度變化能夠實現探針和靶的這些結合和離解。 施加在電極上的電流可能干擾sra信號。為了減少這種幹擾，在行電極對之間施加的電場可以是間斷的。這時只在電場中斷階段進行sra測量。我們可以講採用sra脈衝與電場頻率聯用測量，有可能通過分析sra信號隨著行電極對之間電場中斷時間而變化的速度測定分子的擴散係數。每對行電極都重複進行同樣的操作。由於金屬表面沒有官能化，這些靶可以與該金屬直接接觸，這樣於是增加了檢測的靈敏度。此外，該電場能夠將這些靶最大地集中於該金屬表面，這樣也提高了檢測靈敏度。由於SI^R檢測取決於質量，所以待檢測分子越重，這種檢測就越有效。因此增加分子量能夠降低檢測限。使用這些用重同位素置換的靶原子能夠增加分子量，於是能夠降低檢測限。在相應於使用單毛細管網的可替換辦法的情況下，可能的是採用直接電檢測法直接測量固定在靶上的分子阻抗。除了通過電場控制探針和靶的作用外，植入這些晶片中的電極系統還能夠直接測量固定在靶上的分子阻抗。為了達到高的點密度，在低於20cm2表面上為IO3-IO6,生產一種交叉電極系統。該系統由位於在探針點的陣列下面和上面兩個不同平面中的兩個疊置電極組組成。所述非官能化電極組的方向垂直於所述官能化電極組的方向(圖17)。例如在官能化電極與非官能化組的電極上平面投射的每個交點將這些點植插在該官能化電極組。探針聯接取決於電極的性質和探針分子的性質(參見探針植入和電極絕緣章)。在DNA分子的範圍內，為了降低因DNA彎曲和分子內雜交而產生的測量偽差， 可考慮的是最大地限制分子構象，這些偽差會引起與雜交相同數量級的阻抗變化。一種限制DNA的辦法是採用分子梳理將其吸收在電極上。在該電極上這些拉長分子不再可能發生它們自身的彎曲或雜交，相反地，它們還保持在溶液中與互補序列雜交的能力。另一種解決辦法是在所述官能化電極組與所述非官能化電極組之間繃緊所述探針分子，同時通過這些末端將該分子固定在電極上。使用探針寡核苷酸，在5'和3'兩個末端被官能化。在5' 端選擇的官能化不同於在3'端選擇的官能化。兩類官能化具有不同的激活和/或催化作
14用。例如在5'端選擇具有化學或光激活作用的官能Hs、NH2，在3'端選擇具有電催化的吡咯官能。在官能化電極組與非官能化電極組之間的距離如此選擇，以致這些分子被繃緊， 不能改變特定的彎曲或進行分子內雜交。一種替代辦法是使所述探針的5'末端官能化， 使其接在官能化的電極上，還在於在3' (3'附著位點)端添加一個短序列(10-20個鹼基對)。選擇特異性的附著3'位點的序列，以便它不與這些靶雜交。將在附著3'位點的互補序列接在對面的非官能化電極上。藉助化學鍵通過其5'末端將這些探針與所述官能化電極組聯接起來，藉助在附著位點與接在電極上的互補序列之間形成的10-20對鹼基複合體，通過3'末端將這些探針與所述非官能化電極聯接起來。這些探針於是在這兩個電極之間被繃緊，這樣降低了分子內雜交和彎曲。帶有這些植入的探針的電極晶片，通過靶簡單擴散到每個點中可以被動地雜交， 例如對這些實際生物-晶片進行的雜交。然而，優選的是按照上述方法的活性雜交。為此目的，一個毛細管網和兩個與前面章節所描述的類似容器，放置在官能化與非官能化電極組之間。把兩個容器電極以及兩個連接電極接到官能化電極組(參見示意圖)中。一旦該晶片被雜交，根據每個點的阻抗變化就能夠測定固定靶的量。官能化電極與非官能電極的投射(在上平面中)之間的交點是唯一的，相應於唯一一個點。對由非官能化電極和官能化電極構成的任何可能電極對相繼地施加電位差和電流時，可測量點與點的阻抗。兩組疊置電極之間垂直設置，在理論上能夠進行這種測量。然而，使用交流電或不連續電流與一個電極連接多個點這個事實，會帶來幹擾電容問題，這些問題會干擾這種測量。事實上，這使得正確地測量電流和電壓變得很困難，甚至變得不可能，從而也難以確定每個點的阻抗。為了解決這個問題，需要加進能夠確定點與點的電壓和電流的斷路器。 為了製作與生物晶片尺寸相容的斷路器，在同一平面中用電極格子代替所述官能化電極組(或所述非官能化電極組)，該格子由絕緣的第一組電極(水平的)，和與第一組電極垂直的第二組電極(垂直的)組成。格子的網孔限定了空間範圍，或按照格子尺寸安排側邊 10-500μπι的小電極(點電極)。在每個格子網孔中放置一個或兩個場效應電晶體，以致該電晶體的柵極與該格子網孔側邊的水平電極連接，電晶體的輸入端子(電源)與該格子網孔側邊的垂直電極連接，而電晶體的輸出端子(漏極)與點電極連接。簡言之，我們得到一個格子，其由水平和垂直電極確定的網孔被小的點電極佔據。 使用一個或兩個場效應電晶體將這些點電極與格子網孔四個側邊中的兩個側邊連接起來 (圖17、18)。將這些分子探針接到每個點電極中。這些非官能化電極組放置在每個「點電極」列對面，並且平行於官能化格子的垂直電極。這個非官能化電極組的每個電極是與其本體連接的。這個非官能化電極組可以用與其本體連接的單個板代替。在用不連續電流測量阻抗的情況下(這種電流總是沿著同一方向流動)，使用「點電極」的單個電晶體對於發揮斷路器的作用是必不可少的。把這些水平電極置於電壓下時， 所有這些電晶體的柵極都供電，這樣切斷了所有這些電晶體輸入與輸出之間的電流，這些點電極因此被隔開了。切斷唯一一個水平電極中的電流時，在對單個垂直電極施加電流與不連續電場時，只是在兩個電極交點處的電晶體讓電流在其輸入與輸出之間通過。讓單個點處於電壓下時，可以使用其它的點測量在點電極中的阻抗變化而沒有幹擾。在採用交變電流測量阻抗的情況下(電流沿著兩個方向流動)，不管電流的方向， 都應該給點電極供電。因此需要在該格子網孔放置兩個場效應電晶體，它們具有相反的特徵，即電晶體柵極的電壓是零或負的時，讓所述電流對於第一電晶體沿著一個方向，對於第二電晶體沿著另一個方向在輸入與輸出之間通過。不管電流通過的方向怎樣，都給點電極供電。有利的是添加能讓電流沿著兩個方向在輸入與輸出之間通過的電晶體，例如「nmos」 或「pmos」類型的電晶體，但這些電晶體有附加端子，因此需要通過格子網孔進行這種水平電極的連接，這樣制約了小型化。可能的是進行螢光和阻抗的混合檢測或只是螢光的檢測(這時只使用這些電極按照前面活性雜交(ha)的說明進行雜交)。為了不妨礙這些探針或靶發射的螢光，所有的電路和電極都可以用例如ITO的透明合金製成。在用螢光檢測這些核酸的情況下，用發色團標記靶的一種替代變化包括使用這些核酸的螢光插入物。吖啶是良好的候選者，特別是吖啶橙，它與單鏈DNA分子或DNA/DNA復體結合時具有發出不同螢光的特性。此外，吖啶橙帶正電，這樣能夠使它在電場中移動。通過用吖啶標記並測量發射的螢光可以測定在每個點的探針密度，同時施加不同的電場能夠除去未與DNA探針結合的吖啶分子。施加電場的順序與ha章所描述的類似，但可以將電場的方向適合於希望被移動的分子電荷。一旦把這些靶加到所述晶片上，相對於DNA/DNA複合物生成的螢光測量，通過將它與探針螢光比較能夠測定每類靶的濃度。這種方法能夠實現動態測量雜交，還能夠測量這些靶與這些探針之間的離解常數(kd)和結合常數(ka)。可以將靶的kd和ka測量結果與天然序列所得到的測量結果進行比較，這樣就有可能證明多形性。更一般而言，進行混合測量時，例如使用一種插入物和靶螢光標記與發色團，或測量阻抗和插入物等等時，有可能證明這種探針與這種靶不配對。特別地，在本發明設備中使用的檢測器是一種質譜儀。該質譜儀能夠同時為使用者檢測靶分子數和這些分子的性質(分子量和在某些條件下它們的化學式)。所述設備例如可以包括與質譜儀的離子化電噴(ElectroSpray Ionisation, ESI)連接的下橫向管道 (Kebarle等人，《分析化學》，1993，65 (22)，第972-986頁)。優選地，該下橫向管道通過壓電或熱小管與檢測器連接，該小管允許有規律的注入電噴(ElectroSpray)中。ESI的所有這些改進都是可調節的，例如微噴霧(microESI)、毫微噴霧(nanoESI)、微微噴霧(pico ESI) (Smith 等，T. Matsuo 等人編輯，1995 年，John Wiley and son ；Baffinslane>Chischester> West Sussex, UK,第 41-74 頁；Emmett 等人，《J. AM Soc. Mass Spectrom)), 1994 年，5，第 605-613頁；Valaskovic等人，《分析化學》，1995年，67 (20)，第3802-3805頁)。其它類型的檢測器，例如在直角加速的飛行時間裡四極子分析儀(aoTOF或QT0F) (Chernushevich 等人，第43屆MS和Allied Topics的ASMS會議會議錄，1995年，亞特蘭大，喬治亞州； Sanzone, G,《Rev. SCi. Instrum)), 1970年，41 (5)，第741頁)，是可用於本發明設備中的。這些分子離子的質量和電荷數據與分子離子數能夠推導出特異性地保留在一定微型柱中的每類分子靶性質與數量。特別地通過靶的特異性標記和在採用MS/MS方法獲得譜的期間分子分解，可以推導出在每個微型柱中特異性地與探針連接的分子的化學式 (Chernushevich等人，第43屆MS和Allied Topics的ASMS會議會議錄，1995年，亞特蘭大，喬治亞州)。在一個特定的實施方式中，還可能考慮同時安裝兩套能進行螢光分析和電噴的石英毛細管，採用質譜法實現雙螢光檢測。同樣地，可以協同安裝多個不同類型的檢測器或分析儀。根據本發明設備的一個特別實施方式，可能的是平行分析不同試樣的不同轉錄組。在該設備的一個特別實施方式中，該設備包括包括轉錄組的代表，集合的核酸為特徵的核酸[固定在這些室中或微粒上]。關於「轉錄組的代表」，應該理解包括固定在該室中的核酸，其具有相同或互補的序列，或在嚴格條件下特異性地與信使RNA雜交，該信使RNA是一定細胞或全體細胞的基因組核酸序列轉錄產物，並且對於所述的細胞或前提細胞，其比例是與在特定條件下所得到轉錄產物的比例相當的。下面的實施例中描述了轉錄組的代表性核酸的製備方法。優選地，轉錄組的代表集合核酸被固定在微粒上，而採用適當的方法將所述的微粒固定在微型柱中。採用具體地在下面實施例3描述的方法，所述設備能夠平行地分析不同的轉錄組。本發明特別地涉及含有固定了轉錄組的代表、集合核酸的這樣這些微粒。本發明還涉及按照實施例3中確定的標準選擇的一組核酸分子。在每個微型柱中含有轉錄組的集合代表性核酸的微型柱晶片，特別地可以使用這組核酸分子。在另一個實施方式中，本發明設備的特徵在於這些分子探針是肽或多肽，優選地連接所述抗原的抗體或片段。本發明自然地涉及所述設備在生物試樣，特別是細胞提取物的特異RNA和/或DNA 分子的檢測和/或定量分析中的用途，應選擇與生物試樣中的RNA或DNA進行特異性地雜交的那些分子探針。例如根據在實施例4中描述的方法，使用尤其能夠對比分析至少兩種生物試樣中的特異RNA和/或DNA分子的這樣一種設備。根據基因選擇適當方式的多種探針，例如根據外顯子選擇特異探針時，探針量化能夠提供基因拼接形式的特異信號。本發明還涉及溶於複雜混合物中的分子靶的分離和分析方法，所述的方法包括a.把含有待分離分子靶的複雜混合物加到例如上述本發明的設備中，b.在能將靶特異性連接在微型柱的探針上的適當條件下，讓該複雜混合物循環通過該設備微型柱的陣列，c.洗脫特異性保留在微型柱探針上的靶，d.將從微型柱洗脫的靶循環到檢測器，e.使用檢測器回收和/或分析每種靶。在一個特定的實施方式中，本發明涉及比較分析在兩種生物試樣中含有的至少兩種特異DNA或RNA分子群體的方法，所述的方法包括a.標記來自第一試樣的DNA或RNA分子，例如用重同位素標記，以便將在第一試樣中含有的標記DNA或RNA分子的質量與在第二試樣中含有的具有同樣結構、但沒有標記的 DNA或RNA分子的質量區分開；b.將兩種待比較DNA或RNA群體等摩爾混合；c.把該等摩爾混合物加到本發明的適當設備中，該設備包括由質譜儀構成的檢測器；d.在能將靶特異連接在微型柱探針上的適當條件下，讓該等摩爾混合物循環通過該設備微型柱的陣列；
e.洗脫特異性保留在微型柱探針上的靶，f.將從微型柱洗脫的靶循環到檢測器，g.使用質譜儀檢測和/或定量分析每種靶。在這個方法的一種特定實施方式中，選擇使用的設備特別地由如前面描述的行電極對構成，因此能夠控制在微型柱的每行中洗脫和/或洗脫靶的遷移。在這種情況下，該方法的優選實施方式包括下述步驟a.把含有待分離DNA和/或RNA分子的複雜混合物加到本發明的適當微型柱設備中，b.在能將靶特異性連接在微型柱探針上的適當條件下，優選地在封閉的迴路中， 讓所述複雜混合物循環通過該設備微型柱的陣列；c.如果必要，在開放迴路中，讓洗液循環通過該微型柱陣列，這樣能夠除去未雜交或未特異性雜交的分子，d.在微型柱行電極對之間施加電位差，室電極為正的，而遠側的電極為負的，在橫向管道電極對之間施加電位差，下橫向管道為負的，而上橫向管道為正的，使得在步驟e變性後DNA或RNA分子保留在每個微型柱，e.在能使探針/靶複合物變性的條件下，讓變性溶液循環通過微型柱陣列的一個或多個行，因此洗脫DNA或RNA分子， f.將施加在該陣列微型柱行的行電極對上的電位差顛倒或取消，g.將所述陣列行的微型柱中的變性靶循環到檢測器，h.使用檢測器回收和/或分析每種靶。通過採用電場，上述方法的優選替代辦法能夠實現僅僅分子靶的變性和遷移步驟。這樣一種方法的特徵在於它包括a.把含有待分離DNA和/或RNA分子的複雜混合物加到本發明的適當微型柱設備中，b.在能將靶特異性連接在微型柱探針上的適當條件下，優選地在封閉的迴路中， 如果必要，如上述在橫向管道電極與相繼的行電極之間的交變電場作用下，讓複雜混合物循環通過所述設備的微型柱陣列，c.如果必要，在開放的迴路中，讓能除去未雜交或未特異性地雜交分子的洗滌溶液循環通過所述微型柱陣列，d.下橫向管道與第一容器連接，該容器裝有變性溶液，其含有的負離子能在電場中遷移，上橫向管道與第二容器連接，該容器裝有變性溶液，其含有同樣的負離子，e.在下和上橫向管道與遠側的行電極上施加負電位，而在室行電極上施加正電位，結果所述溶液中的負離子遷移到帶正電荷的微型柱中，並使分子靶變性，這些如此變性的分子靶因遠側行電極的負電位而被固定在這些微型柱中。f.在橫向管道電極對之間施加電位差，在上橫向管道為負的，而在第二下橫向管道為正的，g.將施加在所述陣列微型柱行的行電極對上的電位差顛倒或取消，以便通過電泳能夠將該陣列行的微型柱中的變性靶遷移到檢測器，h.使用所述檢測器回收和/或分析每種靶。
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本發明還涉及一種方法，其中包括a.本發明設備的構造，其中每個微型柱裝有轉錄組代表的成比例的RNA或DNA靶，b.加入固定在該陣列每個微型柱中的RNA或DNA靶的特異互補探針化學計算量混合物，一種靶的每種特異探針的分子量與其它探針是不相同的，因此在質譜儀中彼此是可鑑定的，c.在能將探針特異性連接在這些靶上的適當條件下，而靶固定在這些微型柱上， 讓探針混合物循環通過該設備微型柱的陣列中，d.洗脫微型柱上固定的特異保留的探針，e.讓從微型柱洗脫的探針遷移到由質譜儀構成的檢測器，f.使用質譜儀分析每種探針。替代上述方法時，能夠使用由特異探針組成的探針組，一個靶的每個特異探針大小與其它探針是不相同的，和/或每個特異探針用特異螢光標記物進行標記，在探針的毛細管電泳後採用合適的分光光度法進行這種檢測。本發明還涉及複雜混合物中分子靶的分離和定量分析方法，所述方法包括a.把含有待分離分子靶的複雜混合物加到本發明的設備中，該設備一方面包括一個能循環複雜混合物的毛細管網，另一方面包括根據上面描述的兩個電極組，b.在所述設備的電極之間施加電位，以便所述靶能夠從毛細管網末端遷移到其它毛細管網末端，並且探針能夠雜交這些與其互補的靶，c.原位分析或回收，接著使用檢測器分析探針中的每個雜交靶。本發明的實施例和圖都說明了這種方法的實施。本發明還涉及分析轉錄組的方法，該方法包括使用a.磁微粒組，在微粒上固定了待分析轉錄組的代表性靶的集合，以及b.探針的不同類型組，其中化學計算量混合物的所述探針組中每種探針型與靶型是特異性的和互補的。本發明涉及一種如此定義的方法，其特徵在於化學計算量混合物中所述探針組中的每種探針型對於靶型是特異性的和互補的。本發明還涉及如上所述的方法，其特徵在於通過其分子量毫無歧義地可鑑定在所述混合物中存在的每種探針型，將下述三個標準結合可達到其鑑定經驗式、尺寸和用重原子的任選標記。本發明還涉及一種如上所述的方法，其特徵在於通過其尺寸與螢光標記物毫無歧義地確定在該混合物中存在的每種探針型。如此描述的轉錄組分析方法可以轉用於分析蛋白質組或分析患者的一種或多種基因的缺失或增加。在這些其它分析中，這些探針還可確定所研究靶的代表的存在，並且與其它探針型相比，可毫無歧義地鑑定在該探針組中的每種探針型。下面的實施例能夠說明本發明設備的某些優選實施方式，更易於理解它們的用途，然而這些實施例還不限制本發明的保護範圍。


圖IA是在合適的材料中模塑微型柱的N個行和P個列的陣列(1)俯視圖。
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圖IB表示通過中間行電極和遠側行電極02)連接的微型柱一行。圖2表示所述設備的示意圖，它包括微型柱陣列O)、上毛細管網(3)，它與有活塞 (6)的上橫向管道(31)連接，下毛細管網G)，它與下橫向管道Gl)和與檢測器(5)連接。 該設備還包括副橫向管道(7)，便於在雜交和/或洗滌步驟時循環這些流。圖3是下橫向管道的連接詳圖，它包括下管道電極G2)、壓電 (pietzo-electrique)管(43)、ElectroSpray 器(44)和檢測器。圖4表示使用有活塞的設備，在帶負電荷分子靶變性步驟時電極的極性。金屬活塞(6)蓋的電極帶負電荷。把變性溶液加在上橫向管道(31)的自由端，這些箭頭表示該流的循環方向。這些電極在微型柱水平是正的(+)，而在微型柱出口是負的(_)。圖5表示在第一行分子靶遷移步驟時電極的極性。消除了在第一行電極中的電位差。下橫向管道裝滿凝膠。該設備還包括副橫向管道(7)。圖6說明在使用裝有在電場中能遷移的離液劑的變性緩衝液容器(8)的設備內， 帶電荷分子靶的變性步驟。圖7說明了官能化與植入探針的電極組實例。在薄玻璃板上鏤蝕用金或用ITO製成的電極。按照在這些電極上或在這些電極之間的情況進行探針沉積(點或雜交單元)。在這種方法中，將描述在這些電極上唯一應用沉積物。圖8說明行電極對的裝配。將兩個相對的鏤蝕電極薄板排列起來可得到這些行電極對。其中一個薄板已官能化，另一個薄板沒有官能化。圖9說明插在兩組官能化和非官能化電極之間的毛細管網。圖10說明官能化電極，它用連接彎曲電極和容器電極完成。圖11說明在毛細管網周圍裝配兩組官能化和非官能化電極。圖12說明施加到電極的電荷順序，以便使一個電極的這些靶相繼遷移到另一個電極的這些靶，因此由一個點遷移到另一個點。圖13說明有由這些官能化電極構成的底板的半敞開室。它們向該毛細管網的這些毛細管敞開。這些室避免了因擴散而使靶分散。圖14說明只有一個毛細管網的設備的方案。除去第二容器，有利於橫向管道和延遲系統。第二連接電極(V)是直線的。它用於規定帶電荷靶不可越過靜電的範圍。電極 (V)相對於橫向管道(W)是凸起的時，這種延遲效果被增強。第二連接電極能夠選擇性地將這些探針移動到該橫向管道中。圖15說明了一種原位SI3R檢測的設備。把三稜鏡與未官能化的電極連接起來。圖16說明了採用SI3R檢測未官能化電極的原理。1)通過電場把去雜交靶保持在適當位置。2)這些靶藉助電場遷移到未官能化的電極。3)進行 SI3R 檢測。4)為改進檢測可以交替切斷電流。
圖17說明了一種兩組交叉疊置電極的設備，以實現測量阻抗。圖18說明了一種代替該官能化電極組的格子，以測量間斷電流的阻抗。圖19說明了一種代替該官能化電極組的格子，以測量交流電流的阻抗。
實施例1.檢測在生物試樣中含有的DNA或RNA分子的設備實施例。1.A微型柱陣列微型柱陣列(1)是由直徑50 μ m、長度100 μ m的微型柱的N個行和P個列構成的， 沿著玻璃、矽或塑料類材料的厚度鑿出或模塑這些微型柱(圖1A)。這些室垂直於該晶片的主平面。每個室裝滿聚丙烯醯胺凝膠，所述特異性分子探針固定在微粒上，其微粒直徑大於凝膠網格。用一個公用電極將該微型柱陣列每行的這些室連接起來，形成一個室的行電極 01)。這個電極是由處在室中間的金薄層構成的，因此將每個室分成兩個半室。第二組電極，中間行電極的鏡面，放置在該微型柱陣列的室出口處，設置遠側的行電極0幻。每個遠側的行電極平行於中間的行電極，形成行電極對(圖1B)。這些電極對在室的每個行高度施加期望的電位。這些遠側電極是以與中間電極同樣方式製成的。1.B層疊置的毛細管網通過兩個管道將每個室與分別位於室平面上與下的層疊置毛細管網連接起來 (參見圖2)上毛細管網由N個平行的毛細管(上毛細管)(3)構成，下毛細管網由P個平行的毛細管(下毛細管)(4)構成，當然N/P排列可以在兩層毛細管之間顛倒。上毛細管網的相同毛細管與所述微型柱陣列的行的P個室連接，而下毛細管網的相同毛細管則分別與該微型柱陣列的列的N個室連接。這些連接都是用上述連接管道實現的，例如上和下兩個毛細管網的方向應該是垂直的。因此，通過該微型柱陣列的P個室的行，將上毛細管網的每個毛細管與下毛細管網的所有毛細管連接起來。相互地，通過該微型柱陣列的N個室的列， 將下毛細管網的每個毛細管與上毛細管網的所有毛細管連接起來。這些毛細管的直徑是1-100 μ m。上毛細管網的所有毛細管通到直徑2-1000 μ m 的橫向毛細管(31)(上橫向管道)中。該上橫向管道因此連接了上毛細管網的所有毛細管，它垂直於上毛細管網的方向。與橫向管道相反的上毛細管網的毛細管末端，在與該微型柱陣列室的行的第P個和最後室最後連接時中斷。下毛細管網的所有毛細管通到直徑為 2-1000 μ m的橫向毛細管Gl)(下橫向管道)中。該下橫向管道因此連接了下毛細管網的所有毛細管。所述下毛細管網的毛細管如此設置，以致在室列的第一室的連接處與下橫向管道之間的行程是不同毛細管的不同長度。下毛細管網的這部分毛細管稱之延遲。這種延遲讓下橫向管道與下毛細管網不構成90°角度。根據選擇的角度，這些延遲在這些連續的下毛細管之間是增加或減少的。將與橫向管道相反的下毛細管網的毛細管末端與第二橫向毛細管(7)(第二下橫向管道)連接，因此能夠在兩個上與下毛細管網之間建立通過所述室陣列的流。主下橫向管道填滿毛細管電泳的液體凝膠，以便在這個水平進行毛細管電泳，這時可能的是在上橫向管道與第二下橫向管道之間建立一種閉合環狀流(圖2)。在上和下橫向管道中安置一些電極。上橫向管道裝有螺紋或無螺紋的活塞(6)，它可能允許選擇所述流通過室的行數。
21向外推移時，該活塞移動的越多，微型柱陣列室的行越多。1.C檢測器使用質譜儀(5)檢測在下橫向管道出口的分子。下橫向管道是與質譜儀(圖3)的電離電噴(ESI) (44)鄰接的。它通過壓電小管 (43)或熱小管與檢測器連接，該管允許有規律注入電噴中。2.無活塞設備的實施例2該實施例說明本發明設備的另一個實施方式，該方式適合於分離和分析在生物試樣中含有的核酸分子，還能使保留在這些微型柱上的分子靶變性，並且只是通過施加電場使它們遷移到檢測器中。所述微型柱陣列和毛細管網與實施例1基本相同，只是有如下差別該設備在上橫向管道中沒有活塞。另一方面，該下橫向管道和上橫向管道與裝有氫氧化銨(NH4OH)鹽的變性緩衝液容器連接起來。3.實施例3，製備裝有轉錄組代表性核酸集合的微型柱及其分析轉錄組的用途。本發明設備的每個微型柱，例如像實施例1或2所描述的微型柱，包括其上固定了待分析轉錄組的代表性核酸集合的支持物或微粒(DNA、RNA或寡核苷酸等等)。為了避免大尺寸polyA(多聚腺嘌呤)尾的存在，使用引物，例如5' (T)19X3'，其中X可以是A、C或G，進行待分析信使RNA試樣的逆轉錄。因此使用在polyA尾後遇到的與A不同的第一核苷酸開始進行這種逆轉錄。為了得到固定在支持物或微粒上的基因組的代表性cDNA試樣，將上述的這些引物預先固定在所述的支持物或所述的微粒上，再進行這種逆轉錄。在這種支持物上逆轉錄後可以聯接逆轉錄產物。使用在5'端生物素化的引物5' (T)19X3'時(還可能利用這些微粒與靶之間的化學絡合作用)，通過生物素-抗生物素蛋白偶聯可以保證這種聯接。本發明涉及一種分離和/或檢測溶於複雜混合物中的多個分子靶的設備，所述的設備包括在其上固定待分析轉錄組的代表性靶集合的磁微粒組和探針組。化學計算量混合物的探針組中的每種探針型對於靶型是特效的和互補的。把含有基因組的代表性cDNA集合的這些微粒或支持物再放到本發明設備的微型柱。於是得到微型柱晶片，按照下述方法，它的每個微型柱都能夠分析一個轉錄組採用該設備要使用探針組，其中組成該混合物的每類探針對於固定在這些微型柱上的這些類靶中的一類靶和唯一一類靶是特效的和互補的，從而這些探針形成化學計算量混合物。因此，所述混合物中存在的每種探針型可毫無歧義地用其分子量鑑別。將三個準則結合起來可獲得這種分子量的特異性經驗式、尺寸和用重原子標記可能性。這三個準則結合起來能夠產生極大量的探針。對於等於M的DNA的聚合物尺寸，例如M = n+m+1+j，有可能得到大量的經驗式(AnCmT而)，它等於(n+m+l+j)/(n ！ *m ！ *1 ！ *j ！)。特別對於保留在所述支持物或微粒上的靶分子，這些互補探針都被雜交；涉及分離步驟。一旦該系統已漂洗和這些未雜交探針被除去，可控地使在支持物或微粒上的這些雜交探針分子變性。這時可能對在含有這些固定靶的支持物或微粒上的每類雜交探針分子進行定量分析。為了減少非特異雜交，在小核苷酸聚合物(X)Ii的存在下使這些序列雜交，式中X代表A、T、G或C，N為3-7個核苷酸，生成η個核苷酸的所有可能序列。這種方法也可以應用於蛋白質組研究領域中的蛋白質。將待研究蛋白質混合物固定在支持物或微粒上。這些靶是由抗體或任何其它特異配體組成的，每種探針型的分子量允許毫無歧義地進行鑑定。為了消除具有相同分子量的不同探針型間的不確定性，這些探針可以與改變該探針分子量的惰性分子聯接。為了再提高這種檢測的鑑別能力，在注到質譜儀之前進行毛細管色譜分離。這種毛細管色譜法能夠按照其大小分離這些探針。可用壓電小管將質譜儀與毛細管電泳聯接起來。前面實施方式的另一種選擇是使用螢光標記物區分這些探針。毫無歧義地採用其大小和螢光標記物定義每類探針。例如將五種不同的螢光標記物與其大小分為20-200鹼基的探針結合時，這兩個標準結合能夠達到複雜度約千位。當然，通過增加這些探針的許可大小範圍和使用螢光標記物的數量，有可能擴大探針混合物的複雜性。使用一組其上固定待分析轉錄組的代表性靶集合的磁微粒和一組如上所述的化學計算量探針時，可以直接在溶液中使用而不採用這種方法。這些磁微粒用於分離這些雜交探針。事實上，採用由單純磁鐵產生的磁場分離這些雜交微粒。一旦這種系統被漂洗和這些未雜交探針被除去，就可控地使這些雜交探針去雜交，採用上述方法中的一種方法分析洗脫物就能夠確定分析轉錄組的組成。這種方法代替了經典的DNA晶片，尤其在研究轉錄組和CGH(比較基因組雜交)時更如此。4.實施例4 使用如實施例1描述的微型柱晶片分析RNA試樣。實施例1中描述的設備能夠分析核酸分子混合物。可以使用細胞RNA單一提取物， 但也可以使用兩種不同的提取物進行這種分析。為了採用質譜法檢測分析兩種不同的RNA提取物，合適的是將兩種群體中的至少一個mRNA群體標記。採用加入重同位素的逆轉錄進行這種標記。這些重同位素選自018、 017、N15、C13、H2或任何其它可以採用普通形式質量區分的重同位素。將這些重同位素加到參與合成核酸的核苷酸中。第二種待分析mRNA群體反轉錄成cDNA而沒有加入重原子，或加入與第一群體不同的重原子。為了避免與可能分解產物的任何混雜，可用重原子標記這些引物5' (T)19X3'， 其中X可以取值A、G或C，而這些重原子不同於在採用質譜儀檢測的情況下該分子餘下部分任選使用的重原子。採用螢光檢測時，使用發色團標記這些引物。在過早的時間內突然停止這種逆轉錄，因此所有的cDNA的延長時間是相同的，以縮小尺寸比例的更易鑑定的分子量得到cDNA分子。這種方法還可以用於製備通常DNA晶片使用的cDNA靶。一旦得到兩種cDNA群體，將它們等摩爾混合起來(還可能的是處理mRNA/cDNA 不均勻混合物)。將這種混合物加到在每個微型柱中多次循環的閉合迴路中(參見圖2)。 在它們通過這些微型柱期間，這些靶與互補探針進行雜交。在閉合迴路內循環在每次通過微型柱後能夠使這種混合物均化。在進入管內的阻抗例如能夠調節雜交溶液的溫度，而且在雜交循環過程中還能夠發生這些熱變化，這樣可以控制雜交特異性。任選地，一種超聲室由於將這些靶cDNA破碎成更小尺寸的分子而能夠使待雜交分子尺寸均勻，由寡核苷酸
23(20-100pb)構成的探針事實上有利於等效尺寸靶的雜化。一旦實現雜化，該迴路是開放的，並且大量用除去非雜交或非特異雜交分子的溶液漂洗(洗滌步驟)。該系統這時與質譜儀的電噴器聯接起來，在該陣列微型柱的行電極對之間建立起電位差，在中間處為正電位，而在遠側為負電位。同樣地，在橫向管道的電極處建立起電位差，在上橫向管道為負電位，而在下橫向管道為正電位。由於電極的極性，這些雜交分子保持在每個雜交室中。設置所述活塞使得只能通過該陣列微型柱的第一行的微型柱在上和下兩個網之間進行這種循環(圖4)。由阻抗控制溫度的變性溶液(例如位於上橫向管道)這時以層流方式注入，並擴散通過最靠近下橫向管道的第一行的微型柱，該活塞阻止進入微型柱的其它行。所述變性劑使這些探針-靶配合物變性，所述電場阻止靶擴散到室之外。在抉擇時也可考慮這種熱變性。在提高每個微型柱中緩衝液溫度時，產生了在固定探針與該靶之間形成的複合體變性，靶重新進入溶液，而探針依然固定在該陣列上。第一行電極對之間的電場然後反轉或簡單截斷，保持橫向管道電極對之間的電位差(圖幻。第一行每個微型柱的靶這時通過下毛細管網的相應毛細管，通過電泳使這些探針輸送或遷移通過這些毛細管，直到下橫向管道。不同微型柱的靶隨著下毛細管網的毛細管各自延遲而以不同的時間到達下橫向管道。事實上，對於分析而言，這些不同的靶以不同的時間到達與下橫向管道聯接的檢測器(ElectroSpray)毛細管。為了不使來自不同微型柱的靶之間混合，一般而言需要以非常緩慢的層流方式進行。使用微型柱的多種探針能夠確定基因片段的任何形式。5.實施例5 使用如實施例2所描述的微型柱晶片分析RNA試樣。在下面的方法中，為了使靶變性和讓它們遷移到質譜儀中，不需要讓任何流體在毛細管中循環。在這個方法中，將使用實施例2描述的設備。採用的雜交和漂洗步驟與實施例4 中描述的相同。在雜交和漂洗後，讓上橫向管道與裝有能遷移到緩衝液電場中的離液劑 (chaotrope)的緩衝液容器相連，下橫向管道與裝有同樣緩衝液的第二容器連接。上和下橫向管道的電極以及遠側的行電極保持在負電位，而相對的中間的行電極保持在正電位。離子和離液劑遷移、陽極和陰極、緩衝劑的PH以及電位差都會引起探針-靶生物聚合物的複合物的變性(圖6)。這些探針由於與該陣列強鍵合而依然固定在其陣列上，帶負電荷的自由靶也依然在帶正電荷的中間行電極中。一旦探針/靶複合物變性，橫向管道電極之間設置電位差，對於上橫向管道的電位為負的，而對於下橫向管道的電位為正的，中間電極的電位保持在正的，而遠側的保持在負的，因此這些靶被限制在每個微型柱的靜電室中，於是停止了任何遷移。這時，相繼逐行地使該微型柱陣列行電極之間的電位差置零，因此電泳會引起在下毛細管網的毛細管中的每個行的靶相繼遷移。這些靶按照其毛細管各自途徑的距離遷移直到下橫向管道。在下橫向管道出口，進行這種分析。6.實施例6 在每個微型柱中分離與離析的生物聚合物的微序列化本發明的方法允許在所述質譜儀中分離和分析核酸或蛋白質靶的序列化。所述微序列化是在核酸序列中進行隨機分裂，然後採用質譜儀鑑定這些得到的產物。這些隨機分裂可以是化學的、物理的、機械的或酶的。例如，通過由微型柱中固定酶組成的酶混合物的作用可以得到這些酶切物，這個微型柱例如放置在檢測毛細管與下橫向管道之間。這些生物聚合物穿過這個微型柱時，它們部分被降解。能夠由分析降解產物推導出這種序列。這些酶例如是核酸的核酸內切酶或蛋白質的肽鏈內切酶，例如它們能夠在這些生物聚合物中得到隨機酶切物。使用核酸的核酸外切酶或蛋白質的肽鏈外切酶有可能部分消化。分析這些反應產物能夠得到特異性地保留在每個微型柱中的生物聚合物序列。使用酸、鹼或任何其它化學產品時，謹慎化學降解生物聚合物可產生的化學分裂。例如使用能使這些生物聚合物分裂的超聲波、微波或或微-頻率達到這些機械降解。最後，通過電子流或通過與生物聚合物相互作用的重原子轟擊可以達到物理分解。所有這些處理能夠按照可以預言的組合，通過例如核酸的磷酸酯鍵和蛋白質的肽鍵斷裂使這種生物聚合物打碎。進行這些處理只是在統計上誘發每個分子隨機分裂。為了測定生物聚合物序列，必需在它們的至少一個末端有標記物。對所得到的含有這種標記物的分解物的所有離子的研究能夠確定這種序列。在生物聚合物中末端標記物以天然狀態存在，或者它是採用人工方法加入的。例如，mRNA的3'末端系統地含有polyA尾。這個polyA尾可以作為末端標記物使用例如5' (T)19X3'之類的引物通過逆轉錄得到其cDNA，其中X可以是A、 C或G。於是使用在polyA尾後遇到的與A不同的第一核苷酸開始這種逆轉錄。為了避免有任選分解產物的任何散亂性，使用與所述分子其餘部分任選使用的重原子不同的重原子標記這些5' (T)19X3'引物。由於知道標記物的嚴格質量，所以應很容易推導出分裂產物， 在該序列中殘留物順序。在蛋白質的情況下，使用化合物，例如苯基異硫氰酸酯、1-氟_2， 4- 二硝基苯或densyle氯，標記N端的末端能夠測定序列。還可能在每個末端對生物聚合物進行雙標記，以增加該方法的分辨能力。在配合物的情況下，這些MSMS方法能夠在第二步選擇待分析分子離子，例如像在多嵌合體蛋白質的情況下。最後，有可能直接通過分析連續分解的產物，例如允許這種分析採用MSMS方法，測定生物聚合物的序列，例如對於蛋白質，藉助N端和C端的末端測定這些序列末端的標記物。7.分析多肽混合物時使用微型柱晶片以類似於實施例1或2所描述的方式生產這些設備。所述陣列每個微型柱裝有多肽類的特異性抗體。這些抗體對自然或變性蛋白質是特異性的。這些抗體直接固定在室壁上或保留在每個室中的微粒上。例如對於核酸，應可能使用與吡咯分子結合的抗體。就核酸所描述的與吡咯結合的這些探針全部應用方法都可應用於與吡咯結合的抗體。使用微型柱網制出一個封閉迴路時，使細胞的多肽提取物絡合。這樣在每個微型柱中能生成抗原/抗體特異性複合物。為了洗脫保留在每個微型柱中的多肽，需要使用只是根據蛋白質大小能使它們遷移的緩衝液。這些緩衝液還能夠破壞這種抗原/抗體複合物。為此，列舉 SDS(十二烷基硫酸鈉)鹼緩衝液，它們能夠使所有的蛋白質向正極遷移，而不管其等電點。附圖標記說明說明書附圖中標記的定義如下A =彎曲的連接電極(例如有用ITO製成的透明電極的玻璃薄板)B =官能化行電極(例如有用ITO製成的透明電極的玻璃薄板)C =容器電極(例如有用ITO製成的透明電極的玻璃薄板)D =既沒有底層也沒有頂層的毛細管(例如在kapton中鑿孔)中間平面
E =沒有頂層而有底層的毛細管(例如在kapton中鑿孔)中間平面F =既沒有底層也沒有頂層的容器(例如在kapton中鑿孔)中間平面G =非官能化行電極(例如有用ITO製成的透明電極的玻璃薄板)H=非雜交靶I =官能化電極J=非官能化電極K =探針點雜交單位L=三稜鏡M=柵極的水平電極N=電源的垂直電極0=點電極P =柵極Q =電源R =漏極T =既沒有底也沒有底層的室S=電流循環方向U =有延遲的毛細管網V=用於分析的行電極W=副橫向管道
權利要求
1.分離和/或檢測溶於複雜混合物中的多種分子靶的設備，所述的設備包括a.磁微粒組，其上固定了待分析轉錄組的代表性靶集合，以及b.探針組。
2.根據前述權利要求所述的設備，其特徵在於在使用所述的靶時，形成化學計算量混合物的所述探針組中每種探針型對於靶類型是特異性的、互補的。
3.根據前述權利要求所述的設備，其特徵在於通過分子量可毫無歧義地鑑定所述混合物中存在的每種探針型，將下述三個標準結合可達到其鑑定經驗式、尺寸和用重原子的任選標記。
4.根據前述權利要求所述的設備，其特徵在於通過其尺寸和螢光標記物可毫無歧義地確定在混合物中存在的每種探針型。
5.分析轉錄組的方法，該方法包括使用a.磁微粒組，在其微粒上固定了待分析轉錄組的代表性靶集合，以及b.不同類型的探針組，其中在該探針組中每種探針型對於與所述靶的靶型是特異性的和互補的以生成化學計量混合物。
6.根據前述權利要求所述的方法，其特徵在於形成化學計量混合物的所述探針組的每種探針型對於靶型是特異性的、互補的。
7.根據前述權利要求所述的方法，其特徵在於通過分子量可毫無歧義地鑑定在所述混合物中存在的每種探針型，將下述三個標準結合可達到其鑑定經驗式、尺寸和用重原子的任選標記。
8.根據前述權利要求所述的方法，其特徵在於通過其尺寸和螢光標記物可毫無歧義地確定在所述混合物中存在的每種探針型。
全文摘要
本發明涉及分離和/或分析溶於複雜混合物中的一些靶分子的設備，其特徵在於其包括a)微型柱陣列，其中每個微型柱(2)包括固定的分子探針，其通過特定探針/靶連接能保留在該複雜混合物中含有的特異分子靶，b)第一毛細管網(3)，將加到本發明設備的複雜混合物循環到在a)定義的陣列的每個微型柱中，c)第二毛細管網(4)，在洗脫後將保留在所述微型柱上的分子靶循環到進行其回收和/或分析的檢測器(5)中，以及d)如果必要，用於回收和/或分析不同的分子靶的檢測器(5)，優選為質譜儀形式。
文檔編號G01N33/543GK102225325SQ20111015353
公開日2011年10月26日 申請日期2004年8月27日 優先權日2003年9月24日
發明者卡特琳·奧裡, 尼古拉斯·烏戈林, 熱羅姆·勒博, 西爾維·舍維拉爾 申請人:原子能委員會