液質聯用快速測定魚肝臟中河魨毒素含量的方法與流程

2023-11-12 05:12:22 1

本發明涉及一種液質聯用快速測定魚肝臟中河魨毒素含量的方法，屬於色譜檢測
技術領域：
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背景技術：
：TTX(河魨毒素)是發現最早而毒性極大的小分子海洋毒素，毒性為氰化鈉的1000倍。毒性作用主要表現為選擇性地阻遏神經和肌肉的鈉離子通道，抑制鈉離子通過神經細胞膜，先後麻痺感覺和運動神經，嚴重的腦幹麻痺導致呼吸衰竭；中毒潛伏期短，致死率高達60％。TTX為無色稜柱狀晶體，可溶於弱酸的水溶液。溶液pH值影響其穩定性，pH值7時易分解；溫度高於220℃時炭化。TTX的測定方法主要有酶聯免疫法、生物檢測法(小鼠法)、電化學法(毛細管電泳法)、色譜法(液相色譜、液相色譜-質譜、氣相色譜-質譜聯用)等。但小鼠法測定的準確度會因小鼠個體差異而變化；酶聯免疫法成本較高，氣相色譜-質譜與液相色譜-螢光法需將TTX經鹼解衍生後再檢測，衍生效率以及源自樣品的螢光物質會干擾檢測結果，且步驟複雜、費時。而液相色譜-質譜聯用，前處理淨化需達到質譜進樣要求，提取溶液一般採用三氯乙酸、乙酸等水溶液，淨化樣品採用過C18小柱、離子交換柱等以及超濾等手段，但所得提取液仍因存在嚴重的基質效應而影響方法靈敏度。技術實現要素：針對現有技術中的基質效應問題，本發明所要解決的技術問題是：提供一種液質聯用快速測定魚肝臟中河魨毒素含量的方法。為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案是：本發明提供的液質聯用快速測定魚肝臟中河魨毒素含量的方法，包括下列步驟：(一)樣品預處理(1)活河魨魚冷凍處死，去皮，取其肝臟部分經均質制樣機充分粉碎，取其粉碎後肝臟樣品50g，加入15-20g的高嶺土，繼續用均質制樣機粉碎，均質粉碎10-15min，然後放入-40℃冰箱中冷凍1-2h；冷凍結束後稱取試樣(1.00±0.01)g於50mL聚丙烯離心管中，準確加入5mL30％乙醇水溶液和5mL1.0％乙酸甲醇溶液，均質30-50s，細胞破碎儀在60℃超聲提取25min，8000r/min離心5min，轉移上清液至另一潔淨離心管中；殘渣用3mL30％乙醇水溶液和3mL1％乙酸甲醇溶液重複提取1次，合併上清液並於4℃10000r/min離心5min，取2.0mL上清液加入5.0mL正己烷，渦旋30s後4℃下10000r/min離心5min，棄正己烷層，重複脫脂1次，所得清液待淨化；(2)取1.0mL脫脂後的上清液過Carbon-GCB石墨化碳黑SPE固相萃取小柱，控制流速2mL/min，棄去流出液；再取1mL上清液以2mL/min流速通過小柱，流出液過0.22μm聚四氟乙烯-尼龍複合膜，收集於進樣小瓶，供HPLC-MS/MS測定；(二)色譜-質譜條件色譜條件色譜柱：Zic-Hilic(100mm×2.1mmi.d.，3.5μm)；流動相A為0.1％甲酸水溶液(含5mmol/L甲酸銨)；流動相B為95％乙腈(含5mmol/L甲酸銨的0.1％甲酸水溶液)。洗脫程序為：0-5.3min，從20％線性遞增到95％；5.3-7min，從95％線性遞減至20％；7.01-12min，平衡5min；進樣量：10μL；流速0.35mL/min；柱溫：30℃。表1TTX的液相色譜梯度洗脫條件時間(min)流速(μL/min)A相(％)B相(％)0.035020805.33509557.03509557.01350208012.03502080質譜條件離子源及掃描方式：ESI+；檢測模式：MRM；碰撞氣流量：12L/min；氣簾氣流量：10L/min；TTX的質譜定性、定量離子對分別為320.2/162.1和320.2/302.2，相應碰撞能分別為32V和47V；質譜峰保留時間在6.32附近，駐留時間和電噴霧電壓分別為200ms和5000V，離子源溫度為600℃，各質譜參數見表2。表2TTX保留時間、定性定量離子對、去簇電壓和碰撞能量*定量離子對。本發明的有益效果：本發明針對魚肝臟樣品中的基質效應問題，結合河魨毒素的化學特點，在前處理時加入高嶺土，並採用低溫冷凍的方式，最大程度的將毒素分離出來。同時60℃酸解，細胞破碎儀超聲提取，Carbon-GCBSPE淨化後，樣品直接進樣分析，處理過程簡捷、低耗。方法準確，操作方便、重現性好，可滿足目前對魚肝中河魨毒素快速檢測的技術要求。本發明中樣品經1％乙酸甲醇在60℃下細胞破碎儀超聲提取，Carbon-GCBSPE小柱淨化後，直接進樣分析，節省了濃縮時間。與現有技術中0.2％乙酸水溶液提取、其它SPE淨化以及超濾等方法相比，該方法操作簡單、準確度高、成本低、省時高效，改進了基質效應問題，且具有靈敏度高、重現性好、結果可靠的優點，滿足目前快速檢測河魨魚肝中TTX含量的技術要求。附圖說明下面結合附圖對本發明的具體實施方式作進一步詳細的說明。圖1是陽性河魨魚肝臟樣品中TTX總離子流圖。圖2是空白紅鰭東方魨肝臟樣品的總離子流圖。圖3是加標10μg/kg紅鰭東方魨肝臟樣品的總離子流圖。具體實施方式實施例1本實施例提供的液質聯用快速測定魚肝臟中河魨毒素含量的方法，包括下列步驟：(一)樣品預處理(1)活河魨魚冷凍處死，去皮，取其肝臟部分經均質制樣機充分粉碎，取其粉碎後肝臟樣品50g，加入15-20g的高嶺土，繼續用均質制樣機粉碎，均質粉碎10-15min，然後放入-40℃冰箱中冷凍1-2h；冷凍結束後稱取試樣(1.00±0.01)g於50mL聚丙烯離心管中，準確加入5mL30％乙醇水溶液和5mL1.0％乙酸甲醇溶液，均質30-50s，細胞破碎儀在60℃超聲提取25min，8000r/min離心5min，轉移上清液至另一潔淨離心管中；殘渣用3mL30％乙醇水溶液和3mL1％乙酸甲醇溶液重複提取1次，合併上清液並於4℃10000r/min離心5min，取2.0mL上清液加入5.0mL正己烷，渦旋30s後4℃下10000r/min離心5min，棄正己烷層，重複脫脂1次，所得清液待淨化；(2)取1.0mL脫脂後的上清液過Carbon-GCB石墨化碳黑SPE固相萃取小柱，控制流速2mL/min，棄去流出液；再取1mL上清液以2mL/min流速通過小柱，流出液過0.22μm聚四氟乙烯-尼龍複合膜，收集於進樣小瓶，供HPLC-MS/MS測定；(二)色譜-質譜條件色譜條件色譜柱：Zic-Hilic(100mm×2.1mmi.d.，3.5μm)；流動相A為0.1％甲酸水溶液(含5mmol/L甲酸銨)；流動相B為95％乙腈(含5mmol/L甲酸銨的0.1％甲酸水溶液)。洗脫程序為：0-5.3min，從20％線性遞增到95％；5.3-7min，從95％線性遞減至20％；7.01-12min，平衡5min；進樣量：10μL；流速0.35mL/min；柱溫：30℃。表1TTX的液相色譜梯度洗脫條件時間(min)流速(μL/min)A相(％)B相(％)0.035020805.33509557.03509557.01350208012.03502080質譜條件離子源及掃描方式：ESI+；檢測模式：MRM；碰撞氣流量：12L/min；氣簾氣流量：10L/min；TTX的質譜定性、定量離子對分別為320.2/162.1和320.2/302.2，相應碰撞能分別為32V和47V；質譜峰保留時間在6.32min附近，駐留時間和電噴霧電壓分別為200ms和5000V，離子源溫度為600℃，各質譜參數見表2。表2TTX保留時間、定性定量離子對、去簇電壓和碰撞能量*定量離子對。如圖1，是陽性河魨魚肝臟樣品中TTX總離子流圖。實施例2線性範圍與檢出限稱取試樣(1.00±0.01)g於50mL聚丙烯離心管中，加入適量河魨毒素標準溶液，加標水平分別為0、10、20、50、100、200μg/kg，放置0.5h後按照實施例1方法，得到0、10、20、50、100、200μg/kg的基質加標溶液；以TTX標準物質的峰面積為縱坐標，基質加標溶液濃度(μg/kg)為橫坐標，繪出標準曲線，外標法定量。結果顯示，TTX在10～200μg/kg範圍內呈良好線性，回歸方程為Y＝2.34e+003X，r2＝0.9994。等量稱取河魨魚肝臟樣品(1.00±0.01)g，加適量標準溶液，使TTX的濃度水平為5.0、10、20、30μg/kg，每水平3個平行樣，按實施例1方法進行HPLC-MS/MS分析。結果表明，添加水平為5.0μg/kg時提取液中TTX的定量離子信噪比均大於3；添加水平為10.0μg/kg時，TTX定量離子的S/N均大於10。以目標化合物的響應值信噪比≥3時對應的濃度作檢出限，信噪比大於10作定量下限，得到本方法中河魨毒素的檢出限和定量下限分別為5.0μg/kg和10.0μg/kg。圖2-3為紅鰭東方魨肝空白基質及加標樣品譜圖。實施例3回收率與精密度稱取經測定不含TTX的養殖陰性紅鰭東方魨肝臟樣品(1.00±0.01)g於50mL聚丙烯離心管，分成3組，每組6個，加適量標準溶液，使樣品中TTX的濃度分別為10、15、30、50、100、200μg/kg，按實施例1方法用HPLC-MS/MS分析。基質加標校準曲線外標法定量，回收率與精密度數據見表3。用空白基質作回收率實驗，結果如下：表3回收率與精密度數據添加水平/(μg.kg-1)回收率％1088.6-93.61590.6-96.33095.8-98.35095.2-99.510097.6-102.320098.3-103.8實施例4實際樣品的檢測應用本方法對20份河魨魚肝臟樣品進行檢測，檢出陽性樣品6份，其TTX含量在41.5～520.7μg/kg之間。以上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，並非是對本發明作其它形式的限制，任何熟悉本專業的技術人員可能利用上述揭示的技術內容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發明技術方案內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬於本發明技術方案的保護範圍。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp