一種檢測臨床常見病原微生物的基因晶片的製作方法

2023-11-01 05:01:47

專利名稱：：一種檢測臨床常見病原微生物的基因晶片的製作方法
技術領域：
：本發明涉及生物檢測
技術領域：
，具體涉及一種用於檢測臨床常見病原微生物的基因晶片。
背景技術：
：感染性疾病一直以來都是臨床最常見的致病因素之一，也是長期困擾臨床疾病診斷和治療的難題。除了日益增長的HIV、B肝等各類病毒感染的患者外，臨床目前最為多見的仍是各種常見細菌和真菌引起的感染疾病。隨著全球老齡化現狀突現，人口流動性增加，病原微生物的流行度和傳播度加大，引起感染性疾病呈現多發和複合感染的趨勢。由於病原體本身的變異以及曾經消失或控制的病原體死灰復燃，臨床感染性疾病越來越複雜，如結核，曾經控制並仍在常規防疫，但每年仍有新增病例10000萬，死亡約300萬人，可見感染性疾病的控制不容忽視。目前臨床上，針對引起感染的病原微生物，多採用培養和生化鑑定等方法。這些方法耗時長、操作危險性高，從一定程度上制約了臨床診斷和治療的效果。因此研究一套針對微生物準確高效的檢測系統，不僅可以減輕臨床醫務工作者的辛苦和危險，同時也能為病人的早期診斷治療起到及時有效的輔助診斷作用。隨著PCR技術的成熟和普及，PCR-RFLP、PCR-SSCP、螢光定量PCR、RT_PCR等分子診斷技術相繼應用到微生物檢測上。(MuldrewKL.Moleculardiagnos-ticsofinfectiousdiseases.[J]CurrOpinPediatr.2009，21(1):102_11)。病原微生物一直是臨床工作中鑑定和診斷的重要環節，隨著感染性疾病的增多和病情嚴重程度的加劇，通過分離培養的方法鑑定病原微生物已經無法滿足臨床的需求。基因晶片技術是上世紀90年代誕生的一項綜合技術。它集合分子生物學和計算機學等多項學科技術於一體，通過將分子探針固定在載體上對目的基因進行快速有效的檢測，不僅能保證結果的準確性，檢測效率也顯_!ι^。ΚοζειΙ·(KozalMJ,ShahN,ShenN,YangR,etal.ExtensivepolymorphismsobservedinHIV-IcladeBproteasegeneusinghigh—densityoligonucleotidearrays.[J]NatMed.1996.2(7):753_9)首次在臨床中應用基因晶片對HIV21蛋白酶基因多態性進行研究取得成功後，Kato-MaedaM等(Kato-MaedaΜ,RheeJT,GingerasTRetal.ComparinggenomeswithinthespeciesMycobacteriumtuberculosis.[J]GenomeRes.2001.11(4)547-54)利用基因晶片技術對分支桿菌菌種和結核分支桿菌耐利福平基因rpoB突變。結果表明基因晶片不僅可以用於測序，而且還可以通過聚類分析等統計學手段直接鑑定分枝桿菌菌種，於是基因晶片技術被正引入微生物鑑定診斷。UchidaK石if究小組(UchidaK，YayamaT，KokuboY，etal.Directdetectionofpathogensinosteoarticularinfectionsbypolymerasechainreactionamplificationandmicroarrayhybridization.[J]OrthopSci.2009，14(5):471_83)禾口JSrvinenAK石if究小組(JarvinenAK,LaaksoS，PiiparinenP，AittakorpiA，etal.RapididentificationofbacterialpathogensusingaPCRandmicroarraybasedassay.[J]BMCMicrobiol.2009,9161-177.)在前人的基礎上也通過進一步優化條件和選擇菌種，針對臨床不同感染現狀研製出各種組合的基因晶片。DirkM.Leinberger等(DirkΜ.Leinberger,UlrikeSchumacher,IngoB.Autenriethetal.DevelopmentofaDNAMicroarrayforDetectionandldentificationofFungalPathogensInvolvedinInvasiveMycoses.[J]CLIN.MICROBIOL.，2005，43(10):4943_4953)人對於各種真菌也建立了穩定而高效的基因晶片鑑定方法。目前國內的微生物檢測晶片多停留在科研水平，探針也多較單一或僅涉及16SrRNA基因局部，尚不能完全滿足準確檢測目的微生物的要求(薛建亞，翁心華等，細菌16SrRNA基因晶片的構建及其在細菌鑑定中的應用，第二軍醫大學學報，2007，28(8):919-921)。
發明內容本發明的目的在於提供一種用於檢測臨床常見病原微生物的基因晶片。本發明針對臨床常見的病原微生物金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯桿菌、銅綠假單胞菌、白色假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌，從PUBMED在線資料庫檢索上述微生物的16SrRNA基因和ITS基因序列，通過DNAMAN5.2.2(LynnonBiosoft,USA)和NCBIBLAST軟體(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進行比對，找到它們的保守區域和高變區域，然後應用PrimerPremier5.O(PREMIERBiosoftInternational,CA)在這些保守區域中設計引物，高變區中設計探針。經過反覆試驗篩選和驗證，得到了一組擴增效能好的引物以及一系列雜交特異性高準確度好的探針。基於此，本發明提供一種用於檢測臨床常見微生物的基因晶片，其包括固定在固相載體上的檢測探針A、B、C、D、E和F。其中，探針A用於檢測金黃色葡萄球菌，其選自以下序列中的一種或幾種CAAAAGTAAAAGACGGTCTTGCTGT，ATCGTAAAACTCTGTTATTA,ACCGTGGAGGGTCATTGGAAAC,AGTGCTAAGTGTTAGGGGGT，以及AACCTTTTAGGAGCTAGCC；其中，探針B用於檢測銅綠假單胞菌，其選自以下序列中的一種或幾種CGGACCTCACGCTATCAGATGA,CAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTT,CCAAAACTACTGAGCTAGAG,GGATCCTTGAGATCATAGTG,CTAATCCCATAAAACCGATCGTAGT,以及GCAAGGGGGACGGTTACCAC；其中，探針C用於檢測肺炎克雷伯桿菌，其選自以下序列中的一種或幾種GTCGAGCGGTAGCACAGAGAGCTT,CTCTCGGGTGACGAGCGGC,ACAATGGCATATACAAAGAG,GACCTCATAAAGTATGTCGTAGT,CTGGCAGGCTAGAGTCTTGT,以及GGTCTGTCAAGTCGGATGT；其中，探針D用於檢測白色假絲酵母菌，其選自以下序列中的一種或幾種GCTTGCGGCGGTAACGTCCACCA,CCCACCGCCAAAGCAAG,CCCGCCTTACCACTACCGTCTTT,以及CGTTACCGCCGCAAGCAA；其中，探針E用於檢測熱帶假絲酵母菌，其選自以下序列中的一種或幾種GGGAGCAATCCTACCGCCAGAG,ATTTACAGTCAAACTTGATTTA,TAAGCGACTTAGGTTTATC,以及GGCCACCACAATTTATTTCA；其中，探針F用於檢測光滑假絲酵母菌，其選自以下序列中的一種或幾種TTTCTTTTAGTAGAAAACAACT,CAGTATGTGGGACACGAGCGC,GCTCGTTTGCGCGAGCGGCGGG，以及GGAGGGATATGTGAGTGTTTTGTGC。上述基因晶片，其還可包括固定在固相載體上的陽性對照探針X，探針X為下述探針中的一種或兩種CGTAGGTGGCAAGCGTTATC,GAATTGACGGGGACCCGCACAAGC。上述的基因晶片，其還可包括陰性對照點，該陰性對照點為探針稀釋液，不含有任何雜交探針。本發明基因晶片的固相載體可以是任何不影響核酸雜交，且可穩定連接雜交探針的載體，例如硝酸纖維素膜或尼龍膜等。進一步，本發明還提供一種含有上述基因晶片的檢測試劑盒。該試劑盒還可進一步含有下述引物中的一種或多種srr-rlAGAGTTTGATCCTGGCTCAG,srr-dgGACTACCAGGGTATCTAATCC,srr-raCGTAGGTGGCAAGCGTTATC,srr-pgTGTGCGGGTCCCCGTCAATT,srr-gdGAATTGACGGGGACCCGCACAAGC,srr-akTACGGCTACCTTGTTACGACTT,ITSlTCCGTAGGTGAACCTGCGG,ITS4TCCTCCGCTTATTGATATG。本發明基因晶片優選在固相載體上連接上述全部探針，這樣在檢測時可以提供更為準確的結果；優選，在所述試劑盒中的引物包括上述全部srr系列引物和ITS引物。當然，本領域技術人員應當理解這不是必須的。本發明基因晶片可以分為檢測系統和監控系統兩個部分。檢測系統包括上述6種檢測探針，可由全部29個檢測探針組成，每種探針可以平行重複點樣2個或多個。監控系統包括①陰性對照，為探針稀釋液(去離子純水)可布控在點陣的四周，正常反應下該點無信號。若顯色過程中該點顯色，表明探針稀釋液有汙染或點樣過程有汙染。②陽性對照，為設計的針對細菌的通用探針(即陽性探針)，可布控在矩陣中間，共2X2個點。正常反應下為待見物中有細菌則該點顯色，若無信號可能是待檢物中無細菌或實驗失敗。③平行對照，為每條檢測探針平行點樣2次，即每條探針顯色點為2個，每種微生物根據探針的不同，檢測點從816個不等。若平行點顯色效果均一，說明實驗操作過程控制良好，探針結合能力好，具有可重複性，若平行點顯色效果不等，表明探針結合能力不穩定或實驗操作過程控制欠佳。本發明提供的基因晶片和試劑盒具有如下優點①探針設計合理，能在42°C進行穩定的雜交；②晶片系統包括監控和檢測兩個體系，可同時檢測6種臨床常見的病原微生物，在檢測同時具備監測功能，對過程和結果起到控制作用；③srr系列通用引物所擴增得到的產物結合起來基本涵蓋16SrRNA基因全長，包含的信息多；④srr系列通用引物能擴增所有細菌的16SrRNA基因，並且能夠按照需求進行組合，或者在同一反應中進行多重PCR反應；⑤擴增得到的產物均具有較高的特異性，長度適中，能滿足不同實驗的需求。因此，該組通用引物適用於各種關於細菌16SrRNA基因的研究。試驗表明，本發明晶片可快速檢測6種臨床常見病原微生物，適用於臨床常規檢測、急重症快速檢測和突發傳染疾病篩查。本發明為臨床感染的快速診斷提供了技術支持，也為未來臨床微生物檢測基因晶片的應用普及奠定了基礎。圖1顯示的是本發明基因晶片點樣矩陣，圖中〇陰性對照；·陽性對照』①金黃色葡萄球菌探針；②肺炎克雷伯桿菌探針；③銅綠假單胞菌探針；④熱帶假絲酵母菌探針；⑤白色假絲酵母菌探針；⑥光滑假絲酵母菌探針；Θ其它探針(不穩定的檢測探針)。具體實施例方式以下結合實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬於本發明的範圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例1基因晶片的製備本例以尼龍膜為固相載體，說明本發明基因晶片的製備方法。(1)以帶正電荷的尼龍膜為載體將帶正電荷的尼龍膜製備成4X2cm2大小，置於室溫乾燥環境下，備用。(2)設計引物和探針首先從PUBMED在線資料庫檢索金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯桿菌、銅綠假單胞菌、白色假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌和熱帶假絲酵母菌的16SrRNA基因和ITS基因序列，通過DNAMAN5.2.2(LynnonBiosoft，USA)和NCBIBLAST軟體(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進行比對，找到它們的保守區域和高變區域，然後應用PrimerPremier5.O(PREMIERBiosoftInternational，CA)在這些保守區域中設計引物，高變區中設計探針。經過反覆試驗篩選和驗證，得到了一組擴增效能好的引物(表1和表2)以及一系列雜交特異性高準確度好的探針(表3)，在合成探針時在探針的5』端加載IOT長臂後固定於載體上。本例中的srr系列引物為針對細菌16SrRNA基因的引物系列。三對引物相互重疊，很好的涵蓋了16SrRNA基因的全長，為設計探針提供了更大的選擇範圍。同時所設計的引物獲得片段長度為400SOObp左右，不僅長度適中，更可通過選擇進行組合，完成雜交、測序等反應。Srr系列引物可在同一反應條件下完成PCR擴增反應，所得到的混合產物能很好的滿足雜交的需要，為晶片雜交節省了時間並降低了成本。通過srr系列引物獲得16SrRNA基因的全部序列，彌補了過去微生物檢測晶片目的片段小，涵蓋信息少的不足，實得晶片包含的信息量更大，檢測效率更高，準確性更好。(3)晶片點陣布控每張晶片為4X2cm2的帶正電荷的尼龍膜，晶片包含66條探針(圖1)。晶片包含監控系統和檢測系統(圖1)。監控系統包括3個部分①陰性對照，為探針稀釋液(去離子純水)布控在點陣的四周，正常反應下該點無信號。若顯色過程中該點顯色，表明探針稀釋液有汙染或點樣過程有汙染。②陽性對照，為設計的針對細菌的通用探針，布控在矩陣中間，共2X2個點。正常反應下為待見物中有細菌則該點顯色，若無信號可能是待檢物中無細菌或實驗失敗。③平行對照，為每條檢測探針平行點樣2次，即每條探針顯色點為2個，每種微生物根據探針的不同，檢測點從816個不等。若平行點顯色效果均一，說明實驗操作過程控制良好，探針結合能力好，具有可重複性，若平行點顯色效果不等，表明探針結合能力不穩定或實驗操作過程控制欠佳。檢測系統由針對6種病原微生物的29探針點樣組成，每條探針均採用去離子純水稀釋為25μM工作液，平行點樣2次即每條探針均有2個點顯示。所有探針根據檢測的微生物集合排布。當點樣點經過顯色後顯示藍紫色點，表明待檢樣本中含有該探針檢測的微生物。多條探針同時顯色必須以顯色探針較多的一種微生物為主要報告對象。(4)監控系統與檢測系統的點陣布控監控系統與檢測系統的點陣布控在同一區域同時完成。採用手工點樣點印於帶正電荷的尼龍膜上，紫外燈下交聯8分鐘後4°C保存備用，若需長時間保存則存於-20°C。表1srr系列通用引物序列1tableseeoriginaldocumentpage91該組srr系列通用引物序列尚未公布；2以Staphylococcusaureussubsp.aureusJH9(NC_009487)16SrRNA基因序列(1562bp)為參考·表2ITS通用引物序列1tableseeoriginaldocumentpage9表3檢測6種病原微生物的寡核苷酸探針tableseeoriginaldocumentpage9tableseeoriginaldocumentpage10實施例2病原微牛物的檢測(1)提取細菌DNA採用CTAB/NaCl法分別提取金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、肺炎克雷伯桿菌(ATCC700603)、銅綠假單胞菌(ATCC27853)、白色假絲酵母菌(ATCC64548)、光滑假絲酵母菌(ATCC900030)和熱帶假絲酵母菌(CCTCCAY92045)的病原微生物DNA作為模板。(2)目的DNA擴增採用表1和2的4對引物進行PCR反應，擴增得到目的DNA。多重PCR反應液由IOXbufTer(Biostar)，10μmol/L的各條引物，10mmol/LdNTPs(羅氏公司)，2UTaqDNA聚合酶(Biostar)，Biotin-11-dUTP(Fermentas)和無菌水組成。PCR反應條件為50μ1體系(多重PCR)Taqbuffer(IOX)5μ1dNTPs(IOmM)0.8μ1srr-rl1.5μ1srr-dg1.5μ1srr-ra1.5μ1srr-pg1.5μ1srr-gd1.5μ1srr-ak1.5μ1Taq(2U/μ1)1μ1dUTP0·2μ1ddH2031μ1DNA3μ125μ1體系(ITS):Taqbuffer(10Χ)2.5μ1dNTPs(IOmM)0.4μ1ITSl1μ1ITS41μ1Taq(2U/μ1)0.5μ1dUTP0.1μ1ddH2016.5μ1DNA3μ1具體擴增條件為95°C5min,940C45s，X45s，ν35cycles720Clmin30s,-72°CIOmin.注擴增srr引物時，X為46°C；擴增ITS引物時，X為60°C(3)PCR產物96°C變性10分鐘，_20°C驟冷。(4)將實施例1中固定好探針的尼龍膜置於5ml雜交液中42°C預雜交2小時，封閉膜晶片表面非特異性結合位點，將已變性的PCR產物與預熱的雜交液110混勻，加入反應容器中42°C雜交6小時。(5)雜交完成後，室溫(25°C)下以2XSSC-0.1%SDS溶液洗滌，5minX2次；0.5XSSC-0.1%SDS溶液洗滌，15minX1次；Bufferl-3%Tween20溶液[10%IMTri.Cl(PH7.5),2%5MNaCl,5%IMMgCl2]洗滌，5minXl次；封閉液(60%CASERN,1%PVP,20%0.5MEDTA，剩餘體積用PBS補足)37°C孵育30min；封閉液-0.1%AP-avidin,37"C孵育30min；Bufferl-3%Tween20溶液洗滌，15minX1次；Buffer3溶液[10%IMTri·Cl(PH9.5),2%5MNaCl,2%IMMgCl2]洗滌，4minXl次；BufTer3_5%NBT/BCIP避光至顯色。(6)結果判讀按照上述步驟15，分別對金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯桿菌、銅綠假單胞菌、白色假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌和熱帶假絲酵母菌進行檢測，結果表明，陰性對照均未顯色，陽性對照均顯示為藍紫色點，針對每個菌種進行檢測時，僅該菌種的相應得檢測點出現藍紫色點(該菌種的相應得檢測點均顯示)。針對所設計探針的特異性還進行了非檢測菌雜交，分別用備檢的6種病原微生物交互檢測，並用大腸桿菌、奇異變形桿菌和鮑曼不動桿菌作為目的菌，利用所設計的晶片進行雜交檢測。檢測結果顯示，非晶片探針指向的微生物作為模板雜交後，晶片上未見藍紫色顯色陽性點，由此可見晶片特異性良好。實施例3病原微牛物的檢測本例按照實施例2的方法，對6株經培養生化鑑定為金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯桿菌、銅綠假單胞菌、白色假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌臨床分離(武漢大學中南醫院檢驗科，湖北武漢)病原微生物進行檢測。結果表明，檢測結果與培養和生化鑑定結果完全一致。權利要求一種檢測臨床常見病原微生物的基因晶片，其包括固定在固相載體上的檢測探針A、B、C、D、E和F其中，探針A用於檢測金黃色葡萄球菌，其選自以下序列中的一種或幾種CAAAAGTAAAAGACGGTCTTGCTGT，ATCGTAAAACTCTGTTATTA，ACCGTGGAGGGTCATTGGAAAC，AGTGCTAAGTGTTAGGGGGT，以及AACCTTTTAGGAGCTAGCC；其中，探針B用於檢測銅綠假單胞菌，其選自以下序列中的一種或幾種CGGACCTCACGCTATCAGATGA，CAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTT，CCAAAACTACTGAGCTAGAG，GGATCCTTGAGATCATAGTG，CTAATCCCATAAAACCGATCGTAGT，以及GCAAGGGGGACGGTTACCAC；其中，探針C用於檢測肺炎克雷伯桿菌，其選自以下序列中的一種或幾種GTCGAGCGGTAGCACAGAGAGCTT，CTCTCGGGTGACGAGCGGC，ACAATGGCATATACAAAGAG，GACCTCATAAAGTATGTCGTAGT，CTGGCAGGCTAGAGTCTTGT，以及GGTCTGTCAAGTCGGATGT；其中，探針D用於檢測白色假絲酵母菌，其選自以下序列中的一種或幾種GCTTGCGGCGGTAACGTCCACCA，CCCACCGCCAAAGCAAG，CCCGCCTTACCACTACCGTCTTT，以及CGTTACCGCCGCAAGCAA；其中，探針E用於檢測熱帶假絲酵母菌，其選自以下序列中的一種或幾種GGGAGCAATCCTACCGCCAGAG，ATTTACAGTCAAACTTGATTTA，TAAGCGACTTAGGTTTATC，以及GGCCACCACAATTTATTTCA；其中，探針F用於檢測光滑假絲酵母菌，其選自以下序列中的一種或幾種TTTCTTTTAGTAGAAAACAACT，CAGTATGTGGGACACGAGCGC，GCTCGTTTGCGCGAGCGGCGGG，以及GGAGGGATATGTGAGTGTTTTGTGC。2.如權利要求1所述的基因晶片，其還包括固定在固相載體上的陽性對照探針X，探針X為下述探針中的一種或兩種CGTAGGTGGCAAGCGTTATC，GAATTGACGGGGACCCGCACAAGC。3.如權利要求1或2所述的基因晶片，其還包括陰性對照點，該陰性對照點上不含有任何雜交探針。4.如權利要求1或2所述的基因晶片，其特徵在於，所述固相載體為硝酸纖維素膜或尼龍膜。5.含有權利要求14任一項所述基因晶片的檢測試劑盒。6.如權利要求5所述的檢測試劑盒，其還包括下述引物中的一種或多種srr-■rlAGAGTTTGATCCTGGCTCAG，srr--dgGACTACCAGGGTATCTAATCC，srr-raCGTAGGTGGCAAGCGTTATC，srr-PgTGTGCGGGTCCCCGTCAATT，srr--gdGAATTGACGGGGACCCGCACAAGC，srr-akTACGGCTACCTTGTTACGACTT，ITS1TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4TCCTCCGCTTATTGATATG。全文摘要本發明公開了一種檢測臨床常見病原微生物的基因晶片。該基因晶片包括固定在固相載體上的特異檢測探針，這些探針是針對金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯桿菌、銅綠假單胞菌、白色假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌以及熱帶假絲酵母菌的16SrRNA基因和ITS基因序列進行設計並經過反覆試驗篩選和驗證得到的，其具有良好的雜交特異性準確性。本發明還公開了包括上述基因晶片和一組通用引物的檢測試劑盒。本發明晶片檢測全過程操作簡單、省時，成本較低，適用於臨床常見病原微生物的篩查、急重症患者的早期快速診斷以及突發感染事件病原的診斷，該晶片有助於臨床快速診斷感染原，對臨床疾患起到早發現、早診斷的作用。文檔編號C12Q1/14GK101831505SQ20101018717公開日2010年9月15日申請日期2010年5月21日優先權日2010年5月21日發明者劉松梅,周新,塗建成,胡一敏,謝焱,鄧冠華,鄭璇,鄭芳申請人:武漢大學