一種芽孢桿菌及其菌劑和製備方法與應用的製作方法

2023-11-01 04:08:32 2

專利名稱：一種芽孢桿菌及其菌劑和製備方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於微生物技術領域，具體涉及一種芽孢桿菌及其菌劑和製備方法與應用。
背景技術：
植物寄生線蟲是植物的主要病原物之一，每年造成約1000億美元的損失。其在全世界廣泛分布，寄主範圍廣泛，它能使細菌和真菌更易於侵染植物，是誘發植物病害的重要原因之一。菸草根結線蟲是兩種嚴重危害菸草的病害，隨著菸草生產的發展，連作面積的增加，危害日趨嚴重，線蟲病害是許多國家菸草生產的主要限制因素之一，在我國各大煙區造成了嚴重危害，僅根結線蟲病在雲南省的年發病面積達2 3萬公頃，病株造成菸葉減 產30%-50%。菸草線蟲病害的防治目前多採用化學防治、輪作及抗病品種，但效果均不太理想，且存在諸多弊端。如目前使用的化學殺線蟲劑多為劇毒或高毒、高殘留農藥，對土壤微生物、植物、水源和大氣層帶來嚴重汙染或破壞，同時線蟲抗藥性問題也日益突出，而且藥物在植物體內殘留會間接對人類造成危害。因此急需開發對環境友好，對人畜無毒的防治線蟲病害的微生物製劑。植物寄生線蟲生防細菌的研究是利用植株上附生的拮抗細菌來防治植物病蟲害的有效途徑，也是最近幾年興起的新的研究熱點，而篩選高效和活性穩定的拮抗菌株則是保證生物防治獲得成功的先決條件。目前主要研究的生防細菌有植物根圍促生細菌(PGPR)、穿刺巴氏桿菌 iPas teuria pene trans )、假單胞桿菌 iPseudomonas spp.)、蘇雲金芽孢桿菌{Bacillus thuringiensis)0這些植物內生細菌能夠定殖在植物組織間，生存環境穩定，不易受到外界環境的影響，且對人畜無毒害，對環境友好，是重要的植物病害生防細菌資源。但是據可查資料，源於植物內生的解澱粉芽孢桿菌及其製劑的製備和利用該製劑對植物根結線蟲進行防治的研究一直未見報導。

發明內容
本發明第一目的在於提供一種芽孢桿菌，第二目的在於提供一種以所述芽孢桿菌作為活性成分的菌劑，第三目的在於提供所述以芽孢桿菌作為活性成分的菌劑製備方法，第四目的在於提供所述菌劑在製備毒殺植物根結線蟲藥物中的應用。本發明第一目的是這樣實現的，所述的芽孢桿菌為解澱粉芽孢桿菌OfeciJAz1Samyloliquefaciens ) WY11,保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏日2012年10月11日，保藏編號CGMCC No. 6663。所述解澱粉芽孢桿菌屬於真細菌界，後壁菌門，桿菌綱，芽孢桿菌目，芽孢桿菌科，芽孢桿菌屬。—解澱粉芽孢桿菌WYll的獲得與鑑定(I)解澱粉芽孢桿菌WYl I的獲得與鑑定
本發明所述的解澱粉芽孢桿菌，是從菸草葉片中分離得到。菸草樣品採自雲南省玉溪市研和鎮，採集長勢良好無病煙株旺長期葉片，洗淨後隨即稱取葉片0. 4g，在70%酒精中振蕩浸泡lmin，再用有效氯含量1%的次氯酸鈉溶液振蕩浸泡Imin後，用無菌水衝洗4次。消毒後的組織與滅菌鋼珠一併放入2ml滅菌離心管，加入600ul無菌水，用QIAGEN高通量組織研磨器研磨3min，頻率為30r/s。研磨後的母液採用梯度稀釋法稀釋後塗布平板，各單操作分別重複四次，在28°C下黑暗培養48h。挑取單菌落，重新於平板上劃線純化保存，其中長勢旺盛者，定名為WYll菌株。所用培養基配方酵母浸出汁3.0g，牛肉浸膏l.Og，大豆蛋白腖5.0g，NaCl 5. Og,瓊脂 17. Og,蒸餾水 IOOOmL, pH :7. O。對上述分離的菌株WY11，通過生物學特性觀察，進行進一步的形態鑑定，方法如下
觀察菌落的形態、大小、凹凸度、邊緣，革蘭氏染色，生理生化特徵測試具體方法參照《常見細菌系統鑑定手冊》。該菌16S rDNA序列擴增引物採用F27/R1492，擴增產物委託上
海英駿生物技術有限公司進行序列測定。以上實驗結果記錄如下
A、形態特徵菌體形狀為杆狀，菌體平均大小為0. 5^1. 5umXl. 6^2. 5um，革蘭氏染色為陽性。內生芽孢，無鞭毛。B、培養特徵在NA培養基上菌落呈白色，褶皺凸起，邊緣不整齊。C、生理生化特性好氧生長，葡萄糖發酵陽性，澱粉水解試驗陽性，明膠液化試驗陽性，V. P試驗陽性，接觸酶反應陽性，甲基紅反應陽性，硝酸鹽還原試驗陽性，檸檬酸鹽利用陽性。表I菌株WYll的生理生化特徵
生化特徵 |WY11菌株D一葡萄糖 ；D一甘露糖 T
澱粉水解T酪氨酸水解 ^
明膠水解_+_V-P反應十
接觸酶T甲基紅T
硝酸還原_+_2% NaCl+
￥ 酸鹽利用 I+|5%NaCl1~
注「 + 」表示陽性反應，表示陰性反應。D、菌株的穩定性該菌生長溫度範圍在12 48°C，最適宜生長溫度為28 34°C，生長pH值在6. 5 8，最適宜pH值為7。E、16S rDNA序列分析對該菌株進行16S rDNA序列測定，GenBank註冊號JQ936682. 1，WYll菌株16S rDNA序列與假單胞菌屬的菌株相似性達到99%。通過序列比對和生理生化特性將WYll菌株鑑定為解澱粉芽孢桿菌{Bacillus amyloliquefaciens\本發明所述的WYll菌株其16S rDNA序列見GenBank: JQ936682. I。(2)解澱粉芽抱桿菌 CfeciJJw1S amyloli quefaci ens ) WY11 的保藏
通過上述鑑定結果，確認菌株WYll為解澱粉芽孢杆MiBacillus的一個株系,命名為WY11,於2012年10月11日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱06110，地址為北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編100080)，其保藏編號為CGMCC No. 6663。本發明第二目的是這樣實現的，以所述解澱粉芽孢杆mBacillusamyloli quefaci ens ) WYl I經斜面培養、種子培養、發酵並添加活性劑後製成的菌劑。
本發明第三目的是這樣實現的，包括斜面培養、種子培養、發酵、液體菌劑製備、固體菌劑製備步驟，具體包括
A、斜面培養將解澱粉芽抱桿菌CfeciBy1Samyloli quefaci ens ) WY11接種到斜面培養基上，在溫度為28 30°C下培養48h，得斜面菌種；
B、種子培養將斜面菌種接種到液體培養基中，在溫度為28 34°C下培養18 24h，得液體發酵種子；
C、發酵將液體發酵種子按培養基體積3 5%的量接種入發酵罐，在28 34°C下培養36 48h，攪拌速度為120 150印111，通氣量5 10%，得到解澱粉芽孢桿菌1￥11發酵液；
D、液體菌劑製備在發酵液中添加0.16^0. 6%的活性劑充分混勻，得到目標液體菌劑； E、固體菌劑製備在目標液體菌劑中加入吸附劑吸附經風乾至水分含量重量比小於13%得到目標固體菌劑。本發明第四目的是這樣實現的，所述菌劑在製備毒殺植物根結線蟲藥物中的應用。除非另有說明外，本發明中所採用的百分數均為體積百分數。本發明所述解澱粉芽孢桿菌和以所述解澱粉芽孢桿菌為活性成分的製劑可應用於植物根結線蟲的防治，具有以下優點
I、本發明所述解澱粉芽孢桿菌iBacillus amyloli quefaci ens ) WYll是一種高效生防細菌，以所述解澱粉芽孢桿菌(AaciVAz1S amyloli quefaci ens ) WY11為活性成分的製劑對植物根結線蟲具有顯著的毒殺作用，其液體製劑100倍稀釋液對根結線蟲的毒殺死亡率為
100% o2、本發明所述以解澱粉芽孢桿菌amyloli quefaci ens ) WY11為活性成分的製劑的製備方法簡單易行，合理有效，成本低廉，有利於該製劑的工業化生產和應用普及。3、本發明所述的解澱粉芽孢桿菌amyloli quefaci ens ) WY11及以解澱粉芽孢桿菌iBacillus為活性成分的製劑對人畜無毒,並且具有很強的環境適應性和環境友好性。


圖I為本發明工藝流程圖。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明作進一步的說明，但不以任何方式對本發明加以限制，基於本發明教導所作的任何變換或改進，均落入本發明的保護範圍。本發明所述的芽孢桿菌為解澱粉芽孢桿菌iBaci Ilus amyloli quefaci ens ) W Y11,保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏日2012年10月11日，保藏編號CGMCC No. 6663。所述解澱粉芽孢桿菌屬於真細菌界，後壁菌門，桿菌綱，芽孢桿菌目，芽孢桿菌科，芽孢桿菌屬。本發明所述的芽孢桿菌為活性成分的菌劑，是以所述解澱粉芽孢桿菌amyloli quefaci ens ) WYl I經斜面培養、種子培養、發酵並添加活性劑後製成的菌劑。
所述的菌劑包括固體菌劑和液體菌劑。本發明所述的芽孢桿菌為活性成分的菌劑的製備方法，包括斜面培養、種子培養、發酵、液體菌劑製備、固體菌劑製備步驟，具體包括
A、斜面培養將解澱粉芽抱桿菌Uiacillusamyloli quefaci ens ) WYll接種到斜面培養基上，在溫度為28 30°C下培養48h，得斜面菌種；
B、種子培養將斜面菌種接種到液體培養基中，在溫度為28 34°C下培養18 24h，得液體發酵種子；
C、發酵將液體發酵種子按培養基體積3 5%的量接種入發酵罐，在28 34°C下培養36 48h，攪拌速度為120 150印111，通氣量5 10%，得到解澱粉芽孢桿菌1￥11發酵液；
D、液體菌劑製備在發酵液中添加0.16^0. 6%的活性劑充分混勻，得到目標液體菌劑；
E、固體菌劑製備在目標液體菌劑中加入吸附劑吸附經風乾至水分含量重量比小於13%得到目標固體菌劑。所述的斜面培養步驟中斜面培養基為營養瓊脂培養基。所述的種子培養步驟中液體培養基為體積百分比牛肉浸膏2 4%、蛋白腖0. 4^0. 6%、氯化鈉 0. 4^0. 6%，其餘為水，pH 值為 6. 5^8. O。所述的發酵步驟中培養基為重量體積比豆餅粉廣2%、可溶性澱粉廣2%、牛肉浸膏
0.5 0. 8%、NaCNO3O. 02 0. 04%、CaCO3O. I 0. 3%,其餘為水。所述的活性劑為體積比0. 05、. 2%腐植酸鈉、0. OrO. 1%殼聚糖或0. 0. 3%幾丁質中的一種或幾種。所述的固體菌劑製備步驟中吸附劑為硅藻土、草炭或活性炭的一種或幾種。本發明所述的芽孢桿菌為活性成分的菌劑的應用為所述菌劑在製備毒殺植物根結線蟲藥物中的應用。解澱粉芽孢桿菌菌劑製備
a.斜面培養培養基為營養瓊脂培養基，28 30°C保溫培養48 h。b.搖瓶種子培養將解澱粉芽孢桿菌WYll斜面菌種接種到配方(體積百分比)為牛肉膏3%、蛋白腖0. 5%、氯化鈉0. 5%、其餘為自來水、pH 6. 5-8. 0的搖瓶培養液中，在28 —34°C溫度、搖瓶轉速為150rpm的條件下培養18 — 24h，獲得液體發酵種子。c.液體發酵工藝將發酵種子接種到裝有液體培養基配方(g/L):豆餅粉10-20、可溶性澱粉10-20、牛肉浸膏5-8、NaCN03 0 . 2-0 . 4, CaCO3 1-3，發酵溫度28 34°C、接種量3 5%，發酵罐攪拌速度120 150 rpm，通氣量5 10%，發酵時間為36 48h的條件下得到解澱粉芽孢桿菌發酵液；上述接種量和通氣量的百分比為體積百分比。d.液體製劑製備液體發酵後，發酵液中添加0. 05-0. 2%腐植酸鈉，0. 01-0. 1%殼聚糖和0. 1-0. 3%幾丁質而製成解澱粉芽孢桿菌WYll液體製劑。液體製劑中的腐植酸鈉可以促進植物的生長，殼聚糖和幾丁質有利於促進植物根際微生物菌群的繁殖，提高植物本身的抗性。e.固體製劑製備上述液體製劑中添加等比例的草炭、硅藻土，然後進行風乾，至水分含量小於13% (w/w)即成解澱粉芽孢桿菌WYll固體製劑。本發明的解澱粉芽孢桿菌菌劑作為微生物農藥毒殺植物根結線蟲。本發明的優點在於1.本發明所用菌種為芽孢桿菌，芽孢耐高溫和乾燥等不利環境條件，利於菌劑的加工、運輸和儲存。2.發酵周期短，製備成本低，節約能源。3.具有良好的毒殺植物根結線蟲功能，改善植物根微生態環境，促進植物生長。下面通過實施例加以說明
實施例I
——以解澱粉芽孢桿菌WYll為活性成分的製劑的製備
A、斜面培養將解澱粉芽孢桿菌iBaci Ilus amyloli quefaci ens ) WYll接種到瓊脂培養基上，在30°C下培養48h，獲得斜面菌種。B、種子培養將上述斜面菌種接入種子培養液中，30°C下培養24h，搖瓶轉速為150rpm，得到液體發酵種子。種子培養液成分牛肉浸膏3%，、蛋白腖0. 5%、氯化鈉0. 5%，其 餘為水，pH值為7。C、液體發酵培養按5%的接種量，將上述液體發酵種子接種到裝有液體發酵體系的發酵罐中，在32°C下培養48h，攪拌速度為150rpm，通氣量8%，得到解澱粉芽孢桿菌WYll發酵液，發酵懸浮液的活菌含量為I. 3X IO9個/ml。發酵培養基成分豆餅粉I. 5%、可溶性澱粉 I. 5%、牛肉浸膏 0. 7%, NaCNO3O. 03%、CaCO3O. 2%，其餘為水。D、製劑製備取上述解澱粉芽孢桿菌(ifeciBys amyIoIiquefaciens、WiW添說體積比0. 05、. 2%腐植酸鈉、0. OrO. 1%殼聚糖和0. ro. 3%幾丁質充分混勻，製成液體製劑。實施例2
——以解澱粉芽孢桿菌WYll為活性成分的製劑的製備
與實施例I基本相同，不同之處在於A、斜面培養的溫度為28°C。B、種子培養的溫度為28°C，時間為18h，搖瓶轉速為120rpm。種子培養液pH值為6. 5。C、液體發酵培養按3%接種，溫度為28°C，時間為36h，攪拌速度為120rpm，通氣量5%。發酵培養基成分為豆餅粉1%、可溶性澱粉 1%、牛肉浸膏 0. 5%, NaCNO3O. 02%、CaCO3O. 1%。實施例3
——以解澱粉芽孢桿菌WYll為活性成分的製劑的製備
與實施例I基本相同，不同之處在於A、斜面培養的溫度為28°C。B、種子培養的溫度為34°C，時間為18h，搖瓶轉速為130rpm。種子培養液pH值為8。C、液體發酵培養按4%接種，溫度為34°C，時間為40h，攪拌速度為130rpm，通氣量10%。發酵培養基成分為豆餅粉2%、可溶性澱粉 2%、牛肉浸膏 0. 8%、NaCNO3O. 04%、CaCO3O. 3%。實施例4
——以解澱粉芽孢桿菌WYll為活性成分的製劑的製備
與實施例2基本相同，不同之處在於將實施例2中的液體製劑進一步混入草炭I份，風乾至含水率為12%，製成固體製劑。實施例5
——以解澱粉芽孢桿菌WYll為活性成分的製劑的製備
與實施例2基本相同，不同之處在於將實施例2中的液體製劑進一步混入硅藻土 I份，風乾至含水率為9%，製成固體製劑。實施例6
——以解澱粉芽孢桿菌WYll為活性成分的液體製劑對植物根結線蟲的毒殺實驗以解澱粉芽孢桿菌WYll為活性成分的液體製劑的製備同實施例2。根結線蟲的分離採用貝曼漏鬥法進行，獲得根結線蟲的二齡幼蟲。將分離的根結線蟲添加到解澱粉芽孢桿菌液體製劑的100倍稀釋液中，以等量的水為對照，室溫放置Ih觀測線蟲存活和死亡數量，結果見表2。結果表明，在對照中，根結線蟲二齡幼蟲的死亡率是
4.41%，而解澱粉芽孢桿菌液體製劑的100倍稀釋液的處理根結線蟲二齡幼蟲的死亡率達到了 100%，由此可見，以解澱粉芽孢桿菌WYll為活性成分的液體製劑對根結線蟲二齡幼蟲具有強烈的毒殺效果。表2解澱粉芽孢桿菌液體製劑對根結線蟲的毒殺效果
權利要求
1.一種芽孢桿菌，其特徵在於所述的芽孢桿菌為解澱粉芽孢桿菌OfeciJAz1Samyloliquefaciens ) WY11,保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏日2012年10月11日，保藏編號=CGMCC No. 6663 ;所述解澱粉芽孢桿菌屬於真細菌界，後壁菌門，桿菌綱，芽孢桿菌目，芽孢桿菌科，芽孢桿菌屬。
2.—種權利要求I所述的芽孢桿菌為活性成分的菌劑，其特徵在於是以所述解澱粉芽孢桿菌iBaci Ilus amyloli quefaci ens ) WYll經斜面培養、種子培養、發酵並添加活性劑後製成的菌劑。
3.根據權利要求2所述的芽孢桿菌為活性成分的菌劑，其特徵在於所述的菌劑包括固 體菌劑和液體菌劑。
4.一種權利要求2所述的芽孢桿菌為活性成分的菌劑的製備方法，其特徵在於包括斜面培養、種子培養、發酵、液體菌劑製備、固體菌劑製備步驟，具體包括 A、斜面培養將解澱粉芽抱桿菌Uiacillusamyloli quefaci ens ) WYll接種到斜面培養基上，在溫度為28 30°C下培養48h，得斜面菌種； B、種子培養將斜面菌種接種到液體培養基中，在溫度為28 34°C下培養18 24h，得液體發酵種子； C、發酵將液體發酵種子按培養基體積3 5%的量接種入發酵罐，在28 34°C下培養36 48h，攪拌速度為120 150印111，通氣量5 10%，得到解澱粉芽孢桿菌1￥11發酵液； D、液體菌劑製備在發酵液中添加O.16^0. 6%的活性劑充分混勻，得到目標液體菌劑； E、固體菌劑製備在目標液體菌劑中加入吸附劑吸附經風乾至水分含量重量比小於13%得到目標固體菌劑。
5.根據權利要求4所述的芽孢桿菌為活性成分的菌劑的製備方法，其特徵在於所述的A步驟中斜面培養基為營養瓊脂培養基。
6.根據權利要求4所述的芽孢桿菌為活性成分的菌劑的製備方法，其特徵在於所述的B步驟中液體培養基為體積百分比牛肉浸膏2 4%、蛋白腖O. 4^0. 6%、氯化鈉O. 4^0. 6%，其餘為水，pH值為6. 5 8. O。
7.根據權利要求4所述的芽孢桿菌為活性成分的菌劑的製備方法，其特徵在於所述的C步驟中培養基為重量體積比豆餅粉f 2%、可溶性澱粉f 2%、牛肉浸膏O. 5^0. 8%、NaNO3O. 02 O. 04%、CaCO3 O. Γθ. 3%，其餘為水。
8.根據權利要求2或4所述的芽孢桿菌為活性成分的菌劑的製備方法，其特徵在於所述的活性劑為體積比O. 05、. 2%腐植酸鈉、O. ΟΓΟ. 1%殼聚糖或O. Γ0. 3%幾丁質中的一種或幾種。
9.根據權利要求4所述的芽孢桿菌為活性成分的菌劑的製備方法，其特徵在於所述的E步驟中吸附劑為硅藻土、草炭或活性炭的一種或幾種。
10.一種權利要求2或3所述的芽孢桿菌為活性成分的菌劑的應用，其特徵在於所述菌劑在製備毒殺植物根結線蟲藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種芽孢桿菌，所述的芽孢桿菌為解澱粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)WY11，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏日2012年10月11日，保藏編號CGMCC No.6663；所述芽孢桿菌為活性成分的菌劑，是以所述解澱粉芽孢桿菌經斜面培養、種子培養、發酵並添加活性劑後製成的菌劑；所述芽孢桿菌為活性成分的菌劑的製備方法，包括斜面培養、種子培養、發酵、液體菌劑製備、固體菌劑製備步驟；所述芽孢桿菌為活性成分的菌劑在製備毒殺植物根結線蟲藥物中的應用。本發明所述解澱粉芽孢桿菌和菌劑對植物根結線蟲均有顯著的毒殺作用，使用方便，對人畜無毒害作用，同時還能調節植物微生物生態區系，促進植物生長。
文檔編號C12N1/20GK102952768SQ201210435610
公開日2013年3月6日 申請日期2012年11月5日 優先權日2012年11月5日
發明者夏振遠, 汪安雲, 吳玉萍, 莫笑晗, 雷麗萍 申請人:雲南省菸草農業科學研究院