可逆光致變色膽素蛋白的製備方法
2023-11-01 03:45:37 4
專利名稱：可逆光致變色膽素蛋白的製備方法
技術領域：
本發明屬於生物技術中色素蛋白質材料領域，具體涉及一種可逆光致變色膽素蛋白的製備方法。
膽素蛋白具有廣泛的應用前景。目前製備膽素蛋白的方法之一是從藻或植物中提取。另一種方法是應用有機溶劑，從藻類提取PCB，再利用光敏色素類膽素蛋白自身的裂合酶活性，與PCB進行重組而獲得可逆光致變色的光敏色素類膽素蛋白(Lamparter，T.，Mittmann，F.，Gartner，W.，etal.，Characterization of recombinant phytochrome from thecyanobacterium synechocystis.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1997，94，11792-11797)。這種方法由於必須利用有機溶劑和去汙劑，因此在食品、化妝品、醫藥領域的應用受到限制。
發明內容
本發明的目的在於提供一種能克服上述缺陷的可逆光致變色膽素蛋白的製備方法，該方法不使用有機溶劑和去汙劑，而可在體外重組製備可逆光致變色膽素蛋白。
為實現上述發明目的一種可逆光致變色膽素蛋白的製備方法，其步驟為(1)應用基因工程方法表達光敏色素類脫輔基蛋白；(2)將步驟(1)得到的脫輔基蛋白與PC、α-PC或β-PC混合，按如下反應條件反應反應溫度20～45℃， pH值7.0～8.5；反應所需的輔助因子①二價錳離子、鎂離子或鈣離子中的一種或幾種，其總濃度為0.1～5mmol/L，和②巰基乙醇、二硫蘇糖醇、還原型穀胱甘肽或其它巰基化合物中的一種或幾種，其總濃度為0.1～10mmol/L。
上述步驟(2)還可以包括PcE/F，將其與脫輔基蛋白與PC、α-PC、或β-PC混合，所述PcE/F的製備方法為(1)採用基因工程方法，分別將pcE和pcF克隆於表達載體中，將此表達載體分別轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產PcE與PcF；(2)將PcE與PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
在現有的可逆光致變色膽素蛋白光敏色素製備方法中，由於使用PCB這種膽色素小分子，所以需要使用有機溶劑和去汙劑。本發明方法通過基因工程表達光敏色素類膽素蛋白的脫輔基蛋白、相應的催化PCB從PC或α-PC裂解開的PC裂合酶，然後應用此裂合酶催化PCB從PC或α-PC裂解，同時生成的PCB與膽素蛋白的脫輔基蛋白體外重組，從而製備光敏色素類的可逆光致變色膽素蛋白。或利用克隆表達的光敏色素類脫輔基蛋白自身的裂合酶作用直接從PC奪取PCB，製備可逆光致變色膽素蛋白。在此新方法中，不涉及使用任何有機溶劑。總之，本發明使用PC而不是PCB作反應物，應用克隆表達的PC裂合酶或光敏色素類脫輔基蛋白本身催化PC中的PCB轉移，並與光敏色素類脫輔基蛋白重組，從而生成可逆光致變色的膽素蛋白。本發明方法中，整個反應過程不涉及使用有機溶劑和去汙劑，只使用蛋白質與水溶液。因此，此種可逆光致變色膽素蛋白製備方法更適合應用於食品、保健與醫藥功能領域中。
可以應用吸收光譜檢測以上方法製備的可逆光致變色膽素蛋白(見說明書附圖
)。
對於本專利所得到的光敏色素類可逆光致變色膽素蛋白，當用650nm光輻射時，表現為700nm吸收增強；當用700nm光輻射時，表現為650nm吸收增強，即可逆光致變色範圍650700nm。本發明方法中，整個反應過程不涉及使用有機溶劑和去汙劑，只使用蛋白質與水溶液，是一種環境友好的綠色生產工藝。因此，此種可逆光致變色膽素蛋白製備方法更適合應用於食品、保健與醫藥功能領域中。
實施例1(1)將GenBank中編號為AB028873的aphA克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產AphA。如此生產的AphA具有6個組氨酸構成的親和標記，因此，這裡可以應用與該親和標記匹配的金屬離子螯合親和層析柱分離提純AphA。
(2)將步驟(1)得到的脫輔基蛋白AphA與PC混合，按如下反應條件反應反應溫度37℃，pH值7.5；反應所需的輔助因子①5mmol/L的鎂離子，②5mmol/L的巰基乙醇。
反應得到光敏色素類可逆光致變色膽素蛋白AphA。
實施例2(1)將GenBank中編號為AB028873的aphA克隆於Novagen公司的表達載體pGEMEX中，將此重組表達載體轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產AphA。
(2)將步驟(1)得到的脫輔基蛋白AphA與PC混合，按如下反應條件反應反應溫度37℃，pH值7.5；反應所需的輔助因子①5mmol/L的鎂離子，②5mmol/L的巰基乙醇。
反應得到光敏色素類可逆光致變色膽素蛋白AphA。
實施例3(1)將GenBank中編號為D64001的cphl克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產Cphl。如此生產的Cphl具有6個組氨酸構成的親和標記，因此，這裡可以應用與該親和標記匹配的金屬離子螯合親和層析柱分離提純Cphl。
(2)將步驟(1)得到的脫輔基蛋白Cphl與PC混合，按如下反應條件反應反應溫度37℃，pH值7.5；反應所需的輔助因子①5mmol/L的鎂離子，②5mmol/L的巰基乙醇。
反應得到光敏色素類可逆光致變色膽素蛋白Cphl。
實施例4(1)用PCR擴增GenBank中編號為AB028873的aphA之N端缺失25個胺基酸，C端缺失445胺基酸的AphA片段(簡稱AphA-N25-C445)，將AphA-N25-C445克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產AphA-N25-C445。
(2)將步驟(1)得到的脫輔基蛋白AphA-N25-C445與PC混合，按如下反應條件反應反應溫度37℃，pH值7.5；反應所需的輔助因子①5mmol/L的鎂離子，②5mmol/L的巰基乙醇。
反應得到光敏色素類可逆光致變色膽素蛋白AphA-N25-C445。
實施例5(1)將GenBank中編號為AB028873的aphA克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產AphA。
(2)將步驟(1)得到的脫輔基蛋白AphA與PC混合，按如下反應條件反應反應溫度37℃，pH值7.5；反應所需的輔助因子①0.1mmol/L的鎂離子，②0.1mmol/L的巰基乙醇。
反應得到光敏色素類可逆光致變色膽素蛋白AphA。
實施例6(1)將GenBank中編號為AB028873的aphA克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產AphA。
(2)將步驟(1)得到的脫輔基蛋白AphA與PC混合，按如下反應條件反應反應溫度37℃，pH值7.5；反應所需的輔助因子①3mmol/L的鈣離子，②5mmol/L的還原型穀胱甘肽。
反應得到光敏色素類可逆光致變色膽素蛋白AphA。
實施例7(1)將GenBank中編號為AB028873的aphA克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產AphA。
(2)將步驟(1)得到的脫輔基蛋白AphA與PC混合，按如下反應條件反應反應溫度37℃，pH值7.5；反應所需的輔助因子①5mmol/L的鎂離子，②10mmol/L的巰基乙醇。
反應得到光敏色素類可逆光致變色膽素蛋白AphA。
實施例8(1)分別將GenBank中編號為AF506031的pcE、pcF克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體分別轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產PcE與PcF。如此生產的pcE與pcF具有6個組氨酸構成的親和標記，因此，這裡可以應用與該親和標記匹配的金屬離子螯合親和層析柱分離提純PcE與PcF。
(2)將PcE與PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
(3)將GenBank中編號為AB028873的aphA基因克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產光敏色素類脫輔基蛋白AphA。如此生產的AphA具有6個組氨酸構成的親和標記，因此，這裡可以應用與該親和標記匹配的金屬離子螯合親和層析柱分離提純AphA。
(4)將步驟(2)得到的PcE/F、步驟(3)得到的脫輔基蛋白與PC混合，按如下反應條件反應反應溫度37℃，pH值7.5；反應所需的輔助因子①3mmol/L的二價錳離子，②5mmol/L的巰基乙醇。
反應得到光敏色素類可逆光致變色膽素蛋白AphA。
實施例9(1)分別將GenBank中編號為AF506031的pcE、pcF克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體分別轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產PcE與PcF。
(2)將PcE與PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
(3)將GenBank中編號為AB028873的aphA克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產AphA。
(4)將步驟(2)得到的PcE/F、步驟(3)得到的脫輔基蛋白AphA與α-PC混合，按如下反應條件反應反應溫度37℃，pH值8.0；反應所需的輔助因子①3mmol/L的二價錳離子，②5mmol/L的巰基乙醇。
反應得到光敏色素類可逆光致變色膽素蛋白AphA。
實施例10(1)分別將GenBank中編號為AF506031的pcE、pcF克隆於Stratagene公司的表達載體pGEMEX中，將此重組表達載體分別轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產PcE與PcF。
(2)將PcE與PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
(3)將GenBank中編號為AB028873的aphA克隆於Stratagene公司的表達載體pGEMEX中，將此重組表達載體轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產AphA。
(4)將步驟(2)得到的PcE/F、步驟(3)得到的脫輔基蛋白AphA與PC混合，按如下反應條件反應反應溫度37℃，pH值7.5；反應所需的輔助因子①3mmol/L的二價錳離子，②5mmol/L的巰基乙醇。
反應得到光敏色素類可逆光致變色膽素蛋白AphA。
實施例11(1)分別將GenBank中編號為AF506031的pcE、pcF克隆於Stratagene公司的表達載體pGEMEX中，將此重組表達載體分別轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產PcE與PcF。
(2)將PcE與PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
(3)將GenBank中編號為AB028873的aphA克隆於Stratagene公司的表達載體pGEMEX中，將此重組表達載體轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產AphA。
(4)將步驟(2)得到的PcE/F、步驟(3)得到的脫輔基蛋白AphA與β-PC混合，按如下反應條件反應反應溫度37℃，pH值8.0；反應所需的輔助因子①3mmol/L的二價錳離子，②5mmol/L的巰基乙醇。
反應得到光敏色素類可逆光致變色膽素蛋白AphA。
實施例12(1)分別將GenBank中編號為AF178757的pcE、pcF克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體分別轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產PcE與PcF。如此生產的pcE與pcF具有6個組氨酸構成的親和標記，因此，這裡可以應用與該親和標記匹配的金屬離子螯合親和層析柱分離提純PcE與PcF。
(2)將PcE與PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
(3)將GenBank中編號為AB028873的aphA克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產AphA。如此生產的AphA具有6個組氨酸構成的親和標記，因此，這裡可以應用與該親和標記匹配的金屬離子螯合親和層析柱分離提純AphA。
(4)將步驟(2)得到的PcE/F、步驟(3)得到的脫輔基蛋白AphA與β-PC混合，按如下反應條件反應反應溫度37℃，pH值7.5；反應所需的輔助因子①3mmol/L的二價錳離子，②5mmol/L的巰基乙醇。
反應得到光敏色素類可逆光致變色膽素蛋白AphA。
實施例13(1)分別將GenBank中編號為AF506031的pcE、pcF克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體分別轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產PcE與PcF。
(2)將PcE與PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
(3)用PCR擴增GenBank中編號為AB028873的aphA之N端缺失25個胺基酸的AphA片段(簡稱AphA-N25)，將AphA-N25克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產AphA-N25。如此生產的AphA具有6個組氨酸構成的親和標記，因此，這裡可以應用與該親和標記匹配的金屬離子螯合親和層析柱分離提純AphA-N25。
(4)將步驟(2)得到的PcE/F、步驟(3)得到的脫輔基蛋白AphA-N25與PC混合，按如下反應條件反應反應溫度37℃，pH值7.5；反應所需的輔助因子①3mmol/L的二價錳離子，②5mmol/L的巰基乙醇。
反應得到光敏色素類可逆光致變色膽素蛋白AphA-N25。
實施例14(1)分別將GenBank中編號為AF506031的pcE、pcF克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體分別轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產PcE與PcF。
(2)將PcE與PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
(3)用PCR擴增GenBank中編號為AB028873的aphA之C端缺失445個胺基酸的AphA片段(簡稱AphA-C445)，將AphA-C445克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產AphA-C445。如此生產的AphA-C445具有6個組氨酸構成的親和標記，因此，這裡可以應用與該親和標記匹配的金屬離子螯合親和層析柱分離提純AphA-C445。
(4)將步驟(2)得到的PcE/F、步驟(3)得到的脫輔基蛋白AphA-C445與PC混合，按如下反應條件反應反應溫度37℃，pH值7.5；反應所需的輔助因子①3mmol/L的二價錳離子，②5mmol/L的巰基乙醇。
反應得到光敏色素類可逆光致變色膽素蛋白AphA-C445。
實施例15(1)分別將GenBank中編號為AF506031的pcE、pcF克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體分別轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產PcE與PcF。
(2)將PcE與PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
(3)用PCR擴增GenBank中編號為AB028873的aphA之C端缺失275個胺基酸的AphA片段(簡稱AphA-C275)，將AphA-C275克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產AphA-C275。如此生產的AphA-C275具有6個組氨酸構成的親和標記，因此，這裡可以應用與該親和標記匹配的金屬離子螯合親和層析柱分離提純AphA-C275。
(4)將步驟(2)得到的PcE/F、步驟(3)得到的脫輔基蛋白AphA-C275與PC混合，按如下反應條件反應反應溫度37℃，pH值7.5；反應所需的輔助因子①3mmol/L的二價錳離子，②5mmol/L的巰基乙醇。
反應得到光敏色素類可逆光致變色膽素蛋白AphA-C275。
實施例16(1)分別將GenBank中編號為AF178757的pcE、pcF克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體分別轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產PcE與PcF。
(2)將PcE與PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
(3)將GenBank中編號為AB028873的aphA克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產AphA。
(4)將步驟(2)得到的PcE/F、步驟(3)得到的脫輔基蛋白AphA與PC混合，按如下反應條件反應反應溫度20℃，pH值7.5；反應所需的輔助因子①3mmol/L的二價錳離子，②5mmol/L的巰基乙醇。
反應得到光敏色素類可逆光致變色膽素蛋白AphA。
實施例17(1)分別將GenBank中編號為AF178757的pcE、pcF克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體分別轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產PcE與PcF。
(2)將PcE與PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
(3)將GenBank中編號為AB028873的aphA克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產AphA。
(4)將步驟(2)得到的PcE/F、步驟(3)得到的脫輔基蛋白AphA與PC混合，按如下反應條件反應反應溫度45℃，pH值7.5；反應所需的輔助因子①3mmol/L的二價錳離子，②5mmol/L的巰基乙醇。
反應得到光敏色素類可逆光致變色膽素蛋白AphA。
實施例18(1)分別將GenBank中編號為AF178757的pcE、pcF克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體分別轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產PcE與PcF。
(2)將PcE與PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
(3)將GenBank中編號為AB028873的aphA克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產AphA。
(4)將步驟(2)得到的PcE/F、步驟(3)得到的脫輔基蛋白AphA與PC混合，按如下反應條件反應反應溫度35℃，pH值7.0；反應所需的輔助因子①3mmol/L的二價錳離子，②5mmol/L的巰基乙醇。
反應得到光敏色素類可逆光致變色膽素蛋白AphA。
實施例19(1)分別將GenBank中編號為AF178757的pcE、pcF克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體分別轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產PcE與PcF。
(2)將PcE與PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
(3)將GenBank中編號為AB028873的aphA克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產AphA。
(4)將步驟(2)得到的PcE/F、步驟(3)得到的脫輔基蛋白AphA與PC混合，按如下反應條件反應反應溫度37℃，pH值8.5；反應所需的輔助因子①3mmol/L的二價錳離子，②5mmol/L的巰基乙醇。
反應得到光敏色素類可逆光致變色膽素蛋白AphA。
實施例20(1)分別將GenBank中編號為AF178757的pcE、pcF克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體分別轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產PcE與PcF。
(2)將PcE與PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
(3)將GenBank中編號為AB028873的aphA克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產AphA。
(4)將步驟(2)得到的PcE/F、步驟(3)得到的脫輔基蛋白AphA與PC混合，按如下反應條件反應反應溫度37℃，pH值7.5；反應所需的輔助因子①5mmol/L的鎂離子，②5mmol/L的巰基乙醇。
反應得到光敏色素類可逆光致變色膽素蛋白AphA。
實施例21(1)分別將GenBank中編號為AF178757的pcE、pcF克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體分別轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產PcE與PcF。
(2)將PcE與PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
(3)將GenBank中編號為AB028873的aphA克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產AphA。
(4)將步驟(2)得到的PcE/F、步驟(3)得到的脫輔基蛋白AphA與PC混合，按如下反應條件反應反應溫度37℃，pH值7.5；反應所需的輔助因子①5mmol/L的二價鈣離子，②5mmol/L的巰基乙醇。
反應得到光敏色素類可逆光致變色膽素蛋白AphA。
實施例22(1)分別將GenBank中編號為AF178757的pcE、pcF克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體分別轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產PcE與PcF。
(2)將PcE與PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
(3)將GenBank中編號為AB028873的aphA克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產AphA。
(4)將步驟(2)得到的PcE/F、步驟(3)得到的脫輔基蛋白AphA與PC混合，按如下反應條件反應反應溫度37℃，pH值7.5；反應所需的輔助因子①0.1mmol/L的二價錳離子，②0.1mmol/L的巰基乙醇。
反應得到光敏色素類可逆光致變色膽素蛋白AphA。
實施例23(1)分別將GenBank中編號為AF178757的pcE、pcF克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體分別轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產PcE與PcF。
(2)將PcE與PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
(3)將GenBank中編號為AB028873的aphA克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產AphA。
(4)將步驟(2)得到的PcE/F、步驟(3)得到的脫輔基蛋白AphA與PC混合，按如下反應條件反應反應溫度37℃，pH值7.5；反應所需的輔助因子①5mmol/L的二價錳離子，②10mmol/L的巰基乙醇。
反應得到光敏色素類可逆光致變色膽素蛋白AphA。
實施例24(1)分別將GenBank中編號為AF178757的pcE、pcF克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體分別轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產PcE與PcF。
(2)將PcE與PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
(3)將GenBank中編號為AB028873的aphA克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產AphA。
(4)將步驟(2)得到的PcE/F、步驟(3)得到的脫輔基蛋白AphA與PC混合，按如下反應條件反應反應溫度37℃，pH值7.5；反應所需的輔助因子①5mmol/L的鎂離子，②5mmol/L的二硫蘇糖醇。
反應得到光敏色素類可逆光致變色膽素蛋白AphA。
實施例25(1)分別將GenBank中編號為AF178757的pcE、pcF克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體分別轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產PcE與PcF。
(2)將PcE與PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
(3)將GenBank中編號為AB028873的aphA克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產AphA。
(4)將步驟(2)得到的PcE/F、步驟(3)得到的脫輔基蛋白AphA與PC混合，按如下反應條件反應反應溫度37℃，pH值7.5；反應所需的輔助因子①5mmol/L的鎂離子，②5mmol/L的還原型穀胱甘肽。
反應得到光敏色素類可逆光致變色膽素蛋白AphA。
實施例26(1)分別將GenBank中編號為AF178757的pcE、pcF克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體分別轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產PcE與PcF。如此生產的pcE與pcF具有6個組氨酸構成的親和標記，因此，這裡可以應用與該親和標記匹配的金屬離子螯合親和層析柱分離提純PcE與PcF。
(2)將PcE與PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
(3)將GenBank中編號為D64001的cphl克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，將此重組表達載體轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產Cphl。如此生產的Cphl具有6個組氨酸構成的親和標記，因此，這裡可以應用與該親和標記匹配的金屬離子螯合親和層析柱分離提純Cphl。
(4)將步驟(2)得到的PcE/F、步驟(3)得到的脫輔基蛋白Cphl與PC混合，按如下反應條件反應反應溫度37℃，pH值7.5；反應所需的輔助因子①5mmol/L的鎂離子，②5mmol/L的巰基乙醇。
反應得到光敏色素類可逆光致變色膽素蛋白Cphl。
在上述實施例中，當反應條件為溫度為35℃～40℃，pH值7.5～8時技術效果更好。
上述製備方法適用於採用各種pcE、pcF和光敏色素基因來製備光敏色素類可逆光致變色膽素蛋白，但涉及到微生物菌種公開的問題，本發明只選用了GenBank中已公開的微生物為例對本發明方法加以說明，本領域的一般技術人員可以根據上述公開的內容採用其它原料實施本發明。
權利要求
1.一種可逆光致變色膽素蛋白的製備方法，其步驟為(1)應用基因工程方法表達光敏色素類脫輔基蛋白；(2)將步驟(1)得到的脫輔基蛋白與PC、α-PC或β-PC混合，按如下反應條件反應即可反應溫度20～45℃，pH值7.0～8.5；反應所需的輔助因子①二價錳離子、鎂離子或鈣離子中的一種或幾種，其總濃度為0.1～5mmol/L，和②巰基乙醇、二硫蘇糖醇、還原型穀胱甘肽或其它巰基化合物中的一種或幾種，其總濃度為0.1～10mmol/L。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於上述步驟(2)還可以包括PcE/F，將其與脫輔基蛋白與PC、α-PC、或β-PC混合，所述PcE/F的製備方法為(1)採用基因工程方法，分別將pcE和pcF克隆於表達載體中，將此表達載體分別轉入大腸桿菌，從而得到相應的大腸桿菌工程菌，應用此工程菌生產PcE與PcF；(2)將PcE與PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於在應用基因工程方法表達時，光敏色素類脫輔基蛋白的N端1～25個胺基酸和C端第314胺基酸以後的胺基酸可以進行分子設計。
4.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於其反應條件為溫度為35℃～40℃，pH值7.5～8。
5.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於其反應條件為溫度為35℃～40℃，pH值7.5～8。
全文摘要
本發明公開了一種可逆光致變色膽素蛋白的製備方法，通過基因工程表達光敏色素類可逆光致變色膽素蛋白的脫輔基蛋白、相應的催化藻藍膽素從藻藍蛋白裂解的藻藍蛋白裂合酶，然後應用此裂合酶或光敏色素類脫輔基蛋白催化藻藍膽素從藻藍蛋白及其亞基轉移，並同時與膽素蛋白脫輔基蛋白體外重組，從而製備可逆光致變色膽素蛋白。本專利發明的方法中，整個反應過程不涉及使用有機溶劑和去汙劑，只使用蛋白質與水溶液，是一種環境友好的綠色生產工藝。因此，此可逆光致變色膽素蛋白的製備方法更適合應用於食品、保健與醫藥功能領域中。
文檔編號C07K14/405GK1443849SQ0311891
公開日2003年9月24日 申請日期2003年4月11日 優先權日2003年4月11日
發明者趙開弘, 冉勇, 董依然 申請人:華中科技大學