鮮地黃中分離梓醇的方法
2023-10-31 22:01:37
專利名稱：：鮮地黃中分離梓醇的方法
技術領域：
：本發明涉及一種分離梓醇的方法，尤其涉及一種由鮮地黃中分離梓醇的方法。技術背景地黃是一種常用大宗中藥材，需求量約20000噸/年，出口約1000噸/年。由於藥效的差異，其可作為不同的藥材入藥，是典型的經過加工炮製而藥性發生改變的藥材；其分為鮮地黃、生地黃及熟地黃。鮮地黃清熱生津，涼血止血，用於熱病傷陰，舌絳煩渴；生地黃清熱涼血，養陰生津，用於舌絳煩渴，陰虛內熱；熟地黃滋陰補血，益精填髓，用於肝腎陰虛，血虛萎黃。梓醇屬環烯醚萜葡萄糖苷類，現代藥理實驗證明，梓醇具有抗癌、神經保護、降血糖、緩瀉、利尿、消炎、解痙等作用，是地黃的有效成分之一,是2005版《中國藥典》生地黃的質量控制指標，梓醇在鮮地黃中含量最高(約1%),加工成生地黃後梓醇量大幅下降，炮製成熟地黃後梓醇幾乎全部降解。對於梓醇的分離和製取，已有的報導多集中在從地黃中溶出梓醇程度方面，包括所用溶劑，提取時間，提取方法等因素，如李更生等[1將地黃切碎，用水加熱回流lh,再用正丁醇提取，回收正丁醇後用甲醇溶解供試；都恆青等w將地黃切成小塊，以甲醇回流提取lh;王宏潔等[3]將鮮地黃冷凍乾燥後研成粉末(過40目篩)，以甲醇超聲提取20min;邊寶林等"]和郝武常等[5]均將地黃乾燥後粉碎，過80目篩，以甲醇室溫浸提2h;汪程遠等[61將地黃切成小塊，以水浸、超聲提取多次；羅燕燕等7]將地黃切成小塊，以20%乙醇浸泡15min，勻漿，勻漿液不時振搖，浸泡2h;趙新峰等[8]用剪刀將地黃樣品剪碎，以乙醇加熱回流0.5h。羅燕燕等w考察了提取溶媒和浸出時間的影響，分別以甲醇、水、15%乙醇、20%乙醇、30%乙醇和50%乙醇提取1、2、4、6、8、26h，高效液相色譜法測定梓醇含量。確定以20%乙醇浸提2h為最佳。張玲等[9〕以雙波長薄層掃描法考察了地黃的提取工藝，比較了水提lh、2h、3h、4h、5h和95X乙醇提取2h、4h的梓醇含量，確定以水提取lh-2h梓醇含量最高。劉明等[1°]以梓醇為檢測指標，採用高效液相色譜法，以4因素2水平正交試驗設計考察了提取溶媒、提取方法、提取次數和溶媒用量等因素的影響，確定最佳工藝條件為用3倍量甲醇回流提取2次，回流時間為2h。李計萍等叫考察了水、甲醇以及10%、20%、50%、70%和95%乙醇作為溶媒，發現甲醇、20%乙醇和50%乙醇提取液中梓醇含量相差不大；同一地黃樣品，分別以回流lh、超聲lh、浸lh的方法處理，梓醇含量沒有明顯區別；同一樣品超聲處理IO、20、30、40、60min，梓醇含量也沒有明顯差異。宋子榮等^以HPLC為含量測定方法，採用重複-正交實驗法，以乙醇濃度、溶劑量、提取時間和提取次數4個因素，每個因素選取3個水平進行實驗，最好確定以60%乙醇8倍量，回流提取2次，每次1.5h為梓醇的較佳提取條件張漢忠[13等採用正交試驗優選地黃醇浸提取工藝，以醇浸膏得率為考察指標，梓醇定性作參考，確定最佳提取工藝。確定地黃醇浸提取工藝用4倍量60%乙醇，提取3次，每次6d為最佳提取工藝。目前製備小量(毫克級或克級)高純度(含量高於9890的方法多為實驗室方法(如用常規植化分離手段——陰陽離子樹脂等，低壓層析等技術)，步驟繁瑣，製備量小，或使用製備型高效液相色譜儀，但成本高，費時費力，製備量小，均不適宜工業規模化生產，如汪程遠等[14]用天然澄清劑與非極性大孔吸附樹脂聯合應用分離生地黃中的梓醇。王慧森等採用反覆矽膠柱層析色譜分離得到梓醇，步驟為地黃藥材粉碎、乙醇浸泡、濃縮、D101大孔吸附樹脂、矽膠柱層析等。李更生等[15]採低壓柱層析法分離得到梓醇，但需反覆富集且為毫克級。經檢索，目前尚無廠家或單位提供公斤級純度高於98%的梓醇報導。參考文獻-[I]李更生，劉長河，王慧森，等.不同產地的地黃中梓醇含量比較[J].中草藥，2002,33(2):126.[2]都恆青，李趙曦，劉根成，等.地黃的質量研究[J].中國中藥雜誌，1992,17(6):327.[3]王宏潔，邊寶林，楊健，等.地黃中梓醇變化條件的探討[J].中國中藥雜誌，1997,22(7):概[4]邊寶林，楊健，王宏潔，等.不同乾燥條件對鮮地黃中梓醇含量的影響[J].中國中藥雜誌，1996,21(6):346.[5]郝武常，朱宇紅，朱志峰.炮製對地黃中梓醇含量的影響[J].中國中藥雜誌，1997,22(6):345.[6]汪程遠，張浩，孟莉，等.HPLC測定地黃及其製劑中梓醇的含量[J].華西藥學雜誌，2003,18(2):134.[7]羅燕燕，張紹青，索建政，等.高效液相色譜法測定地黃中梓醇的含量[J].中國藥學雜誌，1994,29(1):38.[8]趙新峰，孫毓慶.毛細管區帶電泳法測定地黃中梓醇的含量[J].藥物分析雜誌，2002，22(6):471.[9]張玲，徐新剛，時延增，等.地黃提取工藝研究[J].中草藥，1998，29(5):308[10]劉明，李更生.鮮地黃中梓醇提取工藝[J].時珍國醫國藥，2000,11(4):301[II]李計萍，馬華，王躍生，等.鮮地黃與幹地黃中梓醇、糖類成分含量的比較[J].中國藥學雜誌，2001,36(5):300.[12]宋子榮，譚梓駿，陳西松，白海波.地黃提取工藝的優化，中國實驗方劑學雜誌[J]，2006,12:8.[13]張漢忠，張漢貞，鄔陽.正交試驗優選地黃醇浸提取工藝[J].中國醫院藥學雜誌，2001，21(11):678.[14]汪程遠，張浩，張承平，孟莉.生地黃中環烯醚萜類的純化分離工藝[J].醫藥導報，2003,22(10):707.[15]李更生，王慧森，都恆青，等.液相層析法分離製備地黃降血糖成分梓醇[J].中醫研究，1997,10(3):24。
發明內容針對現有技術的不足，本發明要解決的問題是提供一種大量分離製備梓醇的方法，本發明方法步驟工藝簡捷，設備簡單，環保節能，適合工業化規模生產。本發明所述鮮地黃中分離梓醇的方法，由如下步驟實現(1)取鮮地黃，棄去黴爛部位，洗淨，切成厚度為lmm2cra的切片；(2)立即將鮮地黃切片加熱至40"C100X:,保溫lmin120min;或直接用水蒸氣熱處理lmin120min;然後以3000rpm8000rpm轉速勻漿5min20min;或者，立即將鮮地黃切片與其等重量的40'C1001C的熱水混合，共同以3000rpra8000rpm轉速勻槳5min20min;(3)常規過濾勻漿液，去除未破碎的鮮地黃組織及不溶性雜質，得含梓醇的樣液；(4)取大孔吸附樹脂溼法裝柱，對含梓醇的樣液進行大孔吸附樹脂分離，上樣液的重量與大孔吸附樹脂體積比例為10g/L10kg/L;先以水洗脫，以molish反應結合TLC檢査，至molish反應陰性，同時梓醇出現為止，更換洗脫溶劑為乙醇或甲醇，繼續洗脫至無梓醇檢出止，將收集的各份洗脫液分別以TLC檢測，觀察梓醇所在的部位，合併含梓醇的洗脫液，揮髮結晶或者旋蒸得梓醇粗品；(5)取梓醇粗品以其體積量13倍的95%乙醇溶解，減壓過濾，除去不溶的雜質得樣液，然後取柱層析用矽膠溼法裝柱，溼法上樣，氯仿-甲醇=9:2洗脫，以梓醇標準品對照，TLC檢測，合併收集的含梓醇的組分，揮幹溶劑，得純度為98%以上梓醇；或者，取梓醇粗品加入以其體積量12倍的4(TC60'C熱甲醇，待完全溶解後滴入氯仿至剛出現晶體止，置20小時以上，減壓抽濾，產物60X:乾燥，重複此步2~5遍得梓醇純品。上述鮮地黃中分離梓醇的方法中步驟(1)所述鮮地黃優選在切片前削皮，儘量除去鮮地黃中部白色和淺黃色菊花芯以外的部分(見圖1)。上述鮮地黃中分離梓醇的方法中步驟(2)所述方法優選在無氧條件下進行，其中加熱溫度優選70。C100"C，保溫30min90min;勻漿轉速優選500O卬m6000rpm。上述鮮地黃中分離梓醇的方法中步驟(3)所述勻漿液若顏色較深，可加入其重量O.1%10%的活性碳吸附勻漿液，使溶液顏色變淺。上述鮮地黃中分離梓醇的方法中步驟(4)所述大孔吸附樹脂優選是HPD-600、HPD~500、HPD-300、HPD-100型號中的一種或者幾種等量混合；相對應樹脂型號如D101樹脂等系列'。上述鮮地黃中分離梓醇的方法中步驟(4)所述分離樣品後的大孔吸附樹脂優選用體積百分比濃度為20%以上的有機溶劑洗脫再生。其中所述有機溶劑優選是乙醇或甲醇。由於大孔吸附樹脂需反覆使用，故大孔吸附樹脂需要後處理以進行下一批次的分離，大孔吸附樹脂再生所需洗脫的溶劑為含量大於10%的乙醇、甲醇等相似有機溶劑。本工藝利用索氏提取器原理，可使溶劑循環使用，反覆流洗樹脂，節約了溶劑，減輕了工作量。具體裝置見圖2，右圖為整體構造圖，左圖為局部。上述鮮地黃中分離梓醇的方法中步驟(4)所述洗脫溶劑乙醇或甲醇優選是體積百分比濃度為20%以上的乙醇或甲醇。上述鮮地黃中分離梓醇的方法中步驟(4)或(5)所述TLC檢測採用薄層層析矽膠G，氯仿甲醇-l:l展開，茴香醛硫酸顯色。上述鮮地黃中分離梓醇的方法中步驟(5)所述柱層析用矽膠優選是60目~100目的矽膠。本發明在國家自然科學基金(基金號30270101)資助下完成，因鮮地黃細胞中存在e-葡萄糖苷酶，本發明方法的關鍵技術在於對分解梓醇的酶進行滅活從而保證鮮地黃中本身含有的梓醇不被破壞進，進而進行後續分離，而從生地黃和熟地黃中提取梓醇，因其本身梓醇含量低，致使製備成本高。本發明方法可以極大限度的將梓醇和地黃中糖類部分(佔鮮重的13%以上，是梓醇含量的十多倍，)分離從而為高純梓醇的製備掃除障礙，本發明方法製備髙純(含量大於98%)梓醇能力可達100kg/年，有望中試放大進行工業化生產，年生產能力達10噸，生產過程節能環保，生產成本大幅下降，可以為科研，新藥開發，保健品研發提供原料保證。圖1:鮮地黃橫切片圖，示鮮地黃中部白色和淺黃色菊花芯。圖2:大孔吸附樹脂用有機溶劑洗脫再生裝置圖，其中右圖為整體構造圖，左圖為局部。具體實施方式實施例1:1)鮮地黃破碎勻漿取鮮地黃，棄去黴爛部位，洗淨，削皮(除去鮮地黃中部白色和淺黃色菊花芯以外的部分)，切成厚度為lmra2cm的切片；在無氧條件下，立即將鮮地黃切片加熱至8(TC100'C，保溫70min80min;或直接用水蒸氣熱處理60min80min;然後以6000rpm轉速勻槳10min;或者，立即將鮮地黃切片與其等重量的IOO'C的熱水混合，共同以5000rpm轉速勻漿20min;常規過濾勻漿液，去除未破碎的鮮地黃組織及不溶性雜質，得含梓醇的樣液。2)大孔吸附樹脂分離取大孔吸附樹脂HPD-100約5kg溼法裝柱，柱體積約5000mL。上樣液1000ml，先以水洗脫，以molish反應結合TLC檢査，至molish反應陰性，同時梓醇出現為止，更換洗脫溶劑為20%乙醇，繼續洗脫至無梓醇檢出止。將收集的各份洗脫液分別以TLC檢測(薄層層析矽膠G，氯仿甲醇=1:1展開，茴香醛硫酸顯色)，以梓醇標準品為對照，觀察梓醇所在的部位，合併含梓醇的洗脫液，揮髮結晶或者旋蒸得梓醇粗品；將對含梓醇的樣液分離完畢的大孔吸附樹脂以95%乙醇洗脫，使樹脂再生。3)矽膠柱層析取梓醇粗品約20g以95%乙醇50ml溶解，減壓過濾，除去不溶的雜質。取100g柱層析用矽膠(60-100目)拌樣。取柱層析用矽膠2.0kg，溼法裝柱溼法上樣，氯仿-甲醇=9:2洗脫。以梓醇標準品對照，TLC檢測，合併含梓醇的組分，揮幹溶劑，得純度為98%以上梓醇。或者4)重結晶取梓醇粗品加入以其體積量1.5倍的50r6(TC熱甲醇,待完全溶解後滴入氯仿至剛出現晶體止，置20小時以上，減壓抽濾，產物601C乾燥，重複此步3遍得梓醇純品。鮮地黃中梓醇提取分步收率見下表:tableseeoriginaldocumentpage8實施例2:0鮮地黃破碎勻漿取鮮地黃，棄去黴爛部位，洗淨，削皮(除去鮮地黃中部白色和淺黃色菊花芯以外的部分)，切成厚度為lmm2cm的切片；立即將鮮地黃切片加熱至4(TC5(TC，保溫100min120min;或直接用水蒸氣熱處理90min;然後以5000rpm轉速勻漿15min;或者，立即將鮮地黃切片與其等重量的60'C的熱水混合，共同以5000rpm轉速勻漿20min;常規過濾勻漿液，去除未破碎的鮮地黃組織及不溶性雜質，得含梓醇的樣液。2)大孔吸附樹脂分離取大孔吸附樹脂HPD-100約5kg溼法裝柱，柱體積約5000mL。上樣液1000ral，先以水洗脫，以molish反應結合TLC檢査，至molish反應陰性，同時梓醇出現為止，更換洗脫溶劑為30%乙醇，繼續洗脫至無梓醇檢出止。將收集的各份洗脫液分別以TLC檢測(薄層層析矽膠G,氯仿甲醇=1:1展開，茴香醛硫酸顯色)，以梓醇標準品為對照，觀察梓醇所在的部位，合併含梓醇的洗脫液，揮髮結晶或者旋蒸得梓醇粗品；將對含梓醇的樣液分離完畢的大孔吸附樹脂以95%乙醇洗脫，使樹脂再生。3)矽膠柱層析取梓醇粗品約20g以95%乙醇50ml溶解，減壓過濾，除去不溶的雜質。取100g柱層析用矽膠(60"100目)拌樣。取柱層析用矽膠2.Okg，溼法裝柱溼法上樣，氯仿-甲醇=9:2洗脫。以梓醇標準品對照，TLC檢測，合併含梓醇的組分，揮幹溶劑，得純度為98%以上梓醇。或者4)重結晶取梓醇粗品加入以其體積量1倍的40r熱甲醇，待完全溶解後滴入氯仿至剛出現晶體止，置20小時以上，減壓抽濾，產物601C乾燥，重複此步5遍得梓醇純品。實施例3:1)鮮地黃破碎勻漿取鮮地黃，棄去黴爛部位，洗淨，削皮(除去鮮地黃中部白色和淺黃色菊花芯以外的部分)，切成厚度為lram2cm的切片；立即將鮮地黃切片加熱至100'C，保溫20min;或直接用水蒸氣熱處理30min;然後以8000rpm轉速勻漿5min;或者，立即將鮮地黃切片與其等重量的8(TC的熱水混合，共同以6000rpm轉速勻漿20min;常規過濾勻漿液，去除未破碎的鮮地黃組織及不溶性雜質，得含梓醇的樣液。2)大孔吸附樹脂分離取大孔吸附樹脂HPD-IOO約5kg溼法裝柱，柱體積約5000mL。上樣液1000ml，先以水洗脫，以molish反應結合TLC檢査，至molish反應陰性，同時梓醇出現為止，更換洗脫溶劑為30%乙醇，繼續洗脫至無梓醇檢出止。將收集的各份洗脫液分別以TLC檢測(薄層層析矽膠G，氯仿甲醇-l:l展開，茴香醛硫酸顯色)，以梓醇標準品為對照，觀察梓醇所在的部位，合併含梓醇的洗脫液，揮髮結晶或者旋蒸得梓醇粗品；將對含梓醇的樣液分離完畢的大孔吸附樹脂以95%乙醇洗脫，使樹脂再生。3)矽膠柱層析取梓醇粗品約20g以95%乙醇50ml溶解，減壓過濾，除去不溶的雜質。取100g柱層析用矽膠(60-100目)拌樣。取柱層析用矽膠2.Okg，溼法裝柱溼法上樣，氯仿-甲醇=9:2洗脫。以梓醇標準品對照，TLC檢測，合併含梓醇的組分，揮幹溶劑，得純度為98%以上梓醇。或者4)重結晶取梓醇粗品加入以其體積量1倍的60C熱甲醇，待完全溶解後滴入氯仿至剛出現晶體止，置20小時以上，減壓抽濾，產物60"C乾燥，重複此步4遍得梓醇純品。權利要求1.一種鮮地黃中分離梓醇的方法，由如下步驟實現(1)取鮮地黃，棄去黴爛部位，洗淨，切成厚度為1mm～2cm的切片；(2)立即將鮮地黃切片加熱至40℃～100℃，保溫1min～120min；或直接用水蒸氣熱處理1min～120min；然後以3000rpm～8000rpm轉速勻漿5min～20min；或者，立即將鮮地黃切片與其等重量的40℃～100℃的熱水混合，共同以3000rpm～8000rpm轉速勻漿5min～20min；(3)常規過濾勻漿液，去除未破碎的鮮地黃組織及不溶性雜質，得含梓醇的樣液；(4)取大孔吸附樹脂溼法裝柱，對含梓醇的樣液進行大孔吸附樹脂分離，上樣液的重量與大孔吸附樹脂體積比例為10g/L～10kg/L；先以水洗脫，以molish反應結合TLC檢查，至molish反應陰性，同時梓醇出現為止，更換洗脫溶劑為乙醇或甲醇，繼續洗脫至無梓醇檢出止，將收集的各份洗脫液分別以TLC檢測，觀察梓醇所在的部位，合併含梓醇的洗脫液，揮髮結晶或者旋蒸得梓醇粗品；(5)取梓醇粗品以其體積量1～3倍的95％乙醇溶解，減壓過濾，除去不溶的雜質得樣液，然後取柱層析用矽膠溼法裝柱，溼法上樣，氯仿-甲醇＝9∶2洗脫，以梓醇標準品對照，TLC檢測，合併收集的含梓醇的組分，揮幹溶劑，得純度為98％以上梓醇；或者，取梓醇粗品加入以其體積量1～2倍的40℃～60℃熱甲醇，待完全溶解後滴入氯仿至剛出現晶體止，置20小時以上，減壓抽濾，產物60℃乾燥，重複此步2～5遍得梓醇純品。2.如權利要求1所述鮮地黃中分離梓醇的方法，其特徵是步驟(l)所述鮮地黃在切片前削皮，除去鮮地黃中部白色和淺黃色菊花芯以外的部分。3.如權利要求1所述鮮地黃中分離梓醇的方法，其特徵是步驟(2)所述方法在無氧條件下進行。4.如權利要求1所述鮮地黃中分離梓醇的方法，其特徵是步驟(3)所述勻漿液若顏色較深，加入其重量0.01%10%的活性碳吸附勻漿液，使溶液顏色變淺。5.如權利要求1所述鮮地黃中分離梓醇的方法，其特徵是步驟(4)所述大孔吸附樹脂是HPD-600、HPD-500、HPD-300、HPD-100型號或者相對應型號中的一種或者幾種等量混合。6.如權利要求1所述鮮地黃中分離梓醇的方法，其特徵是步驟(4)所述分離樣品後的大孔吸附樹脂用體積百分比濃度為20%以上的有機溶劑洗脫再生。7.如權利要求6所述鮮地黃中分離梓醇的方法，其特徵是所述有機溶劑是乙醇或甲醇。8.如權利要求1所述鮮地黃中分離梓醇的方法，其特徵是步驟(4)所述洗脫溶劑乙醇或甲醇是體積百分比濃度為20%以上的乙醇或甲醇。9.如權利要求1所述鮮地黃中分離梓醇的方法，其特徵是步驟(4)或(5)所述TLC檢測採用薄層層析矽膠G，氯仿甲醇-l:l展開，茴香醛硫酸顯色。10.如權利要求1所述鮮地黃中分離梓醇的方法，其特徵是步驟(5)所述柱層析用矽膠是60目300目的矽膠。全文摘要本發明公開了一種鮮地黃中分離梓醇的方法，由鮮地黃破碎勻漿得含梓醇的樣液；大孔吸附樹脂分離；矽膠柱層析或重結晶步驟實現。本發明方法可以極大限度的將梓醇和地黃中糖類部分分離從而為高純梓醇的製備掃除障礙，本發明方法製備高純梓醇能力可達100kg/年，且生產過程節能環保，生產成本低，可以為科研，新藥開發，保健品研發提供原料保證。文檔編號C07H17/04GK101265282SQ20081001600公開日2008年9月17日申請日期2008年5月5日優先權日2008年5月5日發明者劉彥飛,溫學森,宇趙申請人:山東大學