一種氯羥吡啶膠體金層析檢測試紙條或卡的製作方法

2023-11-01 07:59:32 3

專利名稱：一種氯羥吡啶膠體金層析檢測試紙條或卡的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種快速檢測微量氯羥吡啶的器具，特別是涉及一種飼料和動物源性食品中氯羥吡啶殘留分析的膠體金層析檢測試紙條或卡。
背景技術：
氯羥吡啶(CLOP)，商品名為克球酚，化學名為3，5-二氯-2，6-二甲基-4-羥基吡啶，是一種預防畜、兔球蟲病的飼料藥物添加劑，長期使用或不按規定用藥會造成氯羥吡啶在動物體內和組織中殘留，具有一定的致畸性和胚胎毒性。現在，歐盟、美國、加拿大、日本以及中國、中國臺灣都規定了各種動物組織中氯羥吡啶殘留最高限量標準。我國規定了氯羥吡啶在雞肉中的殘留限量為O. 01mg/kgo組織中氯羥吡啶的檢測方法主要採用氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)和氣譜/質譜聯用法(GC/MS)等。氣相色譜相對麻煩，高效液相色譜法具有簡便快速、靈敏的特點，成為分析雞肉組織中氯羥吡啶殘留的主要方法。我國規定了氯羥吡啶在雞肉中的殘留限量為O. 01mg/kg,而相應標準的檢測限為O. 05mg/kg，無法滿足檢測要求。同時，在樣品處理過程中，需先經葡聚糖凝膠陰離子交換柱去除幹擾雜質，再過鹼性氧化鋁SPE柱，不僅過程繁瑣，而且降低了的回收率。理化分析法靈敏度高，結果準確，但是樣品需經一系列複雜的處理淨化，繁瑣費時，所需儀器設備價格昂貴，而且只有特定的專業技術人員才能操作，不能進行現場檢測，時效性差，難以推廣。酶聯免疫吸附法(ELISA)法以競爭性酶聯免疫反應為檢測原理，反應顯色後用酶標儀測定吸光值(OD)值進行結果判定。縮短了檢測時間，可以對殘留藥物進行定性定量檢測。但ELISA方法需要配套的酶標儀和配套試劑，操作過程仍較複雜，而且國內現處在研發階段，進口國外產品價格昂貴，因而ELISA方法的應用受到了較大限制。

發明內容
本發明的目的是研製出特異、敏感、快速、簡便的氯羥吡啶殘留膠體金層析檢測試紙條和試紙卡。一種氯羥吡啶膠體金層析檢測試紙條或卡，包括襯板和在襯板上依次銜接的樣品墊、金標結合墊、硝酸纖維素膜、玻璃吸水墊，所述金標結合墊為吸附有膠體金標記的抗氯羥吡啶單克隆抗體或多克隆抗體玻璃纖維棉，在所述硝酸纖維素膜上有用氯羥吡啶-載體蛋白偶聯物印製的隱形檢測線，用山羊抗小鼠IgG印製的隱形對照線。所述的氯羥吡啶膠體金層析檢測試紙條或卡，所述的隱形檢測線和隱形對照線平行排列組合為「 11 」。所述的試紙條或卡，所述金標物結合墊為將1: 100 1: 500稀釋(體積比)的膠體金標記抗體吸附於玻璃纖維棉中，4°c低溫真空乾燥，製備CLOP金標物結合墊。所述的試紙條或卡，所述膠體金標記抗體製備方法為將稀釋後的膠體金和單克隆抗體或多克隆抗體按照不同的濃度倍比，選擇膠體金顯色紅色的最小稀釋濃度作為膠體金標記抗體的最佳量，用於膠體金標記抗體的製備。所述的試紙條或卡，所述單克隆抗體或多克隆抗體的製備方法為Al、氯羥吡啶半抗原的改造親核取代反應引入酯鍵，然後在鹼、酸的作用下，合成含有羧基的氯羥吡啶半抗原；A2、CL0P-2C-載體蛋白人工抗原的合成採用活潑酯法合成CLOP人工免疫原，稱取75mg CLOP半抗原溶解於3mL N, N-二甲基甲醯胺中，加入二環己基碳二亞胺35mg和N-羥基琥珀醯亞胺18mg，在室溫下磁力攪拌反應過夜12h，此液為A ;稱取20mgBSA溶於2mL0. 01mol/L pH 7. 4的磷酸鹽緩衝液溶液中，此液為B ;將反應液B置於磁力攪拌器上，4°C下將反應液A緩慢滴加到反應液B中，攪拌反應過夜。次日將反應液置於經過預處理的透析袋內，在PBS中攪拌透析7天，得到偶聯產物CL0P-2C-BSA，分裝上清液，凍存於_20°C冰箱中，備用；A3、氯羥吡啶單克隆抗體和多克隆抗體的獲得用CL0P-2C-BSA免疫6周雌性BALB/C小鼠5隻，劑量為50ii g/0. 2mL/只，背部皮下分點注射。採用細胞融合技術無菌取脾臟製備脾細胞，在聚乙二醇-1500作用下與NStl骨髓瘤細胞進行融合；用間接ELISA法和阻斷ELISA法進行陽性孔篩選，選擇強陽性、抑制率高、細胞生長旺盛的孔進行有限稀釋克隆化，擴大培養、凍存並鑑定，獲得一株雜交瘤細胞株；之後採用體內誘生腹水法製備CLOPmAb ；多抗製備用CL0P-2C-BSA載體蛋白結合抗原免疫紐西蘭白兔，免疫劑量為50 y g 100 y g/次，背部皮下分多點注射；首免，用合成的人工抗原與等量弗氏完全佐劑乳化；加強免疫，用合成的人工抗原與等量弗氏不完全佐劑乳化，連續免疫4 5次，每次間隔4 8周，最後一次免疫後10 15天，以ELISA法測其定效價達到IO5以上時，採血並分離收集高免血清。以飽和硫酸銨鹽析法提取IgG抗體，_20°C凍存備用。本發明的膠體金層析檢測試紙條和試紙卡具有下列各項優點①特異性強，敏感性高。該膠體金層析檢測試紙條和試紙卡以膠體金標記高親和力的單克隆抗體(mAb)或多克隆抗體(pAb)為基礎製備而成，金標抗體中金顆粒與抗體分子之間無共價鍵形成，二者通過異性電荷間的範德華力相結合，膠體金標記對單克隆抗體或多克隆抗體的特異性和親和力影響很小，且具有較高的標記率。因此，試紙條和試紙卡具有較強的特異性和較高的敏感性，檢出最低限量可達到Ippb lOppb。②簡便、快速、時效性強。使用膠體金層析檢測試紙條和試紙卡，無需任何其它試劑和儀器，可現場操作，只要將試紙條插入被檢樣品或將待檢樣品滴加在試紙卡上10 20秒鐘，在10分鐘內即可判定檢測結果。③結果顯示形象、直觀、準確。膠體金層析檢測試紙條和試紙卡均以顯示棕紅色線「 I 」和「 I I 」作為檢測結果陽性和陰性標記，即在包被膜上顯示一條棕紅色線「 I 」時，表示在被檢樣品中含有被檢物，顯示兩條棕紅色線「 I I 」時，表示在被檢樣品中不含被檢物。結果判定形象、直觀、準確，簡單明了，不易出現假陽性和假陰性等人為誤判。④節省費用，適用範圍廣，便於推廣。使用膠體金層析檢測試紙條和試紙卡，比用儀器分析和進口 ELISA試劑盒的費用大幅下降。另外，試紙條和試紙卡的適用範圍廣，可滿足不同層次人員需要，包括專業檢驗，海關檢疫，衛生檢疫，質量監測，加工企業和養殖場戶等，便於推廣應用，具有廣闊的市場前景和明顯的經濟、社會效益。


圖1、氯羥吡啶膠體金層析檢測試紙條結構示意圖。圖2、氯羥吡啶膠體金層析檢測試紙條俯視結構示意圖。圖3、為本發明的氯羥吡啶半抗原改造的技術路線圖。圖4、為氯羥吡啶的紅外質譜圖。圖5、為氯羥吡啶改造後的半抗原紅外質譜圖。
具體實施例方式一種適用於氯羥吡啶殘留檢測的膠體金層析檢測試紙條和試紙卡，它包括檢測試紙條或試紙卡、用於檢測的試劑，其中試劑包括樣品稀釋液，樣品提取液。要製成氯羥吡啶 膠體金層析檢測試紙條和試紙卡，首先需要對氯羥吡啶半抗原進行改造，製備氯羥吡啶偶聯載體蛋白，用於製備相應的檢測線和抗體；而且需要製備氯羥吡啶金標抗體，用於製備相應的金標抗體纖維棉。本發明還包括動物可食性組織如肝臟、肌肉、飼料樣品預處理方法，將待檢動物組織或飼料樣研磨搗碎後經乙腈完全提取，烘乾後加入適量樣品稀釋液即可用於本膠體金層析檢測試紙條和試紙卡檢測；尿樣無需研磨搗碎直接按一定比例添加乙腈和稀釋液進行檢測。本發明的膠體金層析檢測試紙條和試紙卡，樣品處理簡單，適合於大量樣品的快速檢測和篩選，具有高特異性、高靈敏度、高精確率等特點，最低檢測限O. 5μ g/mL。以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。實施例1、氯羥吡啶抗原、抗體的製備1.1氯羥吡啶半抗原的改造與鑑定親核取代反應引入酯鍵(-C00-基團)，然後在鹼、酸的作用下，合成含有羧基的氯羥吡啶半抗原。取5mmoL CL0P，溶於15ml O. 5mol/L NaOH溶液中，待完全溶解後，減壓蒸餾除去水分，常溫下水洗生成物、抽慮、乾燥後，用20mL DMF溶解，滴加O. 56mL溴乙酸乙酯，60°C恆溫反應3h，冷卻至室溫，向反應液中加入150mL蒸餾水，放入4°C冰箱中冷卻過夜，抽濾一水洗—抽濾得到含有酯鍵的CLOP衍生物。然後加入20mL蒸餾水，加熱至85°C，滴加Imol/LNaOH溶液使固體全部溶解，冷卻至室溫，再滴加lmol/LHCI使溶液pH值在4左右，4°C冷卻過夜，抽濾、重結晶、乾燥得到含有羧基的氯羥吡啶半抗原(CL0P-2C)，合成路線見圖3。紅外(IR)鑑定取CL0P-2C 2mg,加入乾燥KBr約200mg，置於瑪瑙乳缽中，在紅外燈照射下研磨、混勻，裝入壓片模具，8t壓力下lOmin，製得厚度Imm的透明KBr樣品片，上機測試，測試結果見圖4、圖5。圖4中氯羥吡啶分子上的羥基(-0H)、吡啶環骨架在3249. 2133cm_\l561. 3671CHT1處分別有明顯的吸收；而與之相比較，圖5中吡啶環骨架吸收峰仍然存在(1556. 8925CHT1)，但3249. 2133cm—1處吸收峰消失，說明吡啶環上的-OH消失；同時在1738. 4146CHT1處出現了羰基(-C = O)吸收峰，3442. 9772cm_1處出現峰形寬而鈍的吸收峰(由羧基中的-OH產生)，判斷生成物中帶有羧基官能團，氯羥吡啶半抗原合成成功。1.2CL0P-2C-載體蛋白(BSA)人工抗原的合成
採用活潑酯法合成CLOP人工免疫原稱取75mg CLOP半抗原(CL0P-2C)溶解於3mLN，N-二甲基甲醯胺(DMF)中，加入二環己基碳二亞胺(DCC) 35mg和N-羥基琥珀醯亞胺(NHS) 18mg,在室溫下磁力攪拌反應過夜12h，此液為A ;稱取20mgBSA溶於2mL 0. 01mol/LpH 7. 4的磷酸鹽緩衝液(PBS)溶液中，此液為B。將反應液B置於磁力攪拌器上，4°C下將反應液A緩慢滴加到反應液B中，攪拌反應過夜。次日將反應液置於經過預處理的透析袋內，在PBS中攪拌透析7天，得到偶聯產物CL0P-2C-BSA，分裝上清液，凍存於_20°C冰箱中，備用。1. 3氯羥吡啶單克隆抗體(CLOP mAb)和多克隆抗體(CLOPpAb)的獲得用CL0P-2C-BSA免疫6周雌性BALB/C小鼠5隻，劑量為50 u g/0. 2mL/只，背部皮下分點注射。採用細胞融合技術無菌取脾臟製備脾細胞，在聚乙二醇(PEG)-1500作用下與NStl骨髓瘤細胞進行融合；用間接ELISA法和阻斷ELISA法進行陽性孔篩選，選擇強陽性、抑制率高、細胞生長旺盛的孔進行有限稀釋克隆化，擴大培養、凍存並鑑定，獲得一株雜交瘤細胞株。之後採用體內誘生腹水法製備CLOP mAb。獲得的腹水用飽和硫酸銨鹽析法純化。計算該單抗親和力常數。 多抗製備用CL0P-2C-BSA載體蛋白結合抗原免疫紐西蘭白兔，免疫劑量為50 y g 100 y g/次，背部皮下分多點注射。首免，用合成的人工抗原與等量弗氏完全佐劑(FCA)乳化；加強免疫，用合成的人工抗原與等量弗氏不完全佐劑(FIA)乳化，連續免疫4 5次，每次間隔4 8周，最後一次免疫後10 15天，以ELISA法測其定效價達到IO5以上時，採血並分離收集高免血清。以飽和硫酸銨鹽析法提取IgG抗體，_20°C凍存備用。實施例2、CLOP膠體金免疫試紙條和試紙卡的製備2.1膠體金層析檢測試紙條和試紙卡檢測反應原理當膠體金層析檢測試紙條或試紙卡測試端加入待測樣品溶液後，待測溶液通過虹吸作用帶動待測物及金標物結合墊中的金標抗體一起向包被膜擴散，並最終滲入手柄端吸水濾紙。在擴散過程中，待測物可與金標抗體相結合，進而封閉金標抗體上待測物的抗原結合點，阻止金標抗體與包被膜上偶聯載體蛋白抗原的檢測線結合，檢測線不能顯色，而羊或兔抗小鼠IgG (或羊抗兔IgG)抗體則可與金標抗體結合，形成一條棕紅色對照線「 I 」，為陽性表示。反之樣品溶液中無待測物則不能阻止金標抗體與包被膜上偶聯載體蛋白抗原的檢測線結合，顯示棕紅色檢測線「 I 」，同樣羊抗或兔抗小鼠IgG (或羊抗兔IgG)抗體也與金標抗體結合，顯示棕紅色對照線「 I 」，這樣形成兩條棕紅色線「 I I 」，為陰性表示。如果包被膜上沒有棕紅色線顯示，則表明試紙條已失效。2. 2氯羥吡啶膠體金免疫試紙條和試紙卡的製備(I)待標氯輕卩比唳mAb或pAb與膠體金溶液的預處理將待標氯輕卩比唳mAb或pAb溶液IOOOOrpm離心30mmin，除去雜質；用0. lmol/L K2CO3溶液調節膠體金溶液的pH值至8. 2。(2)待標氯輕卩比唳mAb或pAb與膠體金最佳標記濃度的確定確定氯輕卩比唳mAb與膠體金最適標記濃度取酶標板9孔，每孔25 u I ddw鋪底，第一孔加入400 u g/25 u L的CLOP mAb，之後進行倍比至第八孔，第九孔為空白對照；用0. lmol/L K2CO3調節膠體金溶液pH 8. 2，加入到酶標板中，每孔125 y L，混勻，靜置IOmin後，加入0.1mLlO% NaCl溶液25 y L，混勻，靜置Ih ;對照孔與CLOP mAb量不足以穩定金溶膠的各孔呈現由紅變藍的聚沉現象，而CLOP mAb量達到或超過最低穩定量的各管仍保持紅色不變，選擇其中含CLOP mAb量最低孔第7孔的量，為ImL膠體金所需的CLOP mAb的量，該孔的CLOP mAb的量為12. 5 μ g，在此基礎上增加10% (體積比)即為待標CLOPmAb的實際用量，待標的量為13. 75 μ go(3)膠體金與氯羥吡啶IgG抗體的結合按照上述第7孔的結果，分別取ImL膠體金和對應量的氯輕卩比唳mAb 13. 75 μ g,攪拌下混合,靜置反應lOmin, IOOOOrpm離心30min,棄上清，沉澱物稀釋後加入含I %的(體積比)BSA的硼酸鈉溶液(硼酸鈉濃度為10%，質量體積比)，BSA作為穩定劑，4°C保存備用。將1: 100 1: 500稀釋(體積比)的膠體金標記抗體(單克隆抗體或多克隆抗體)吸附於精製玻璃纖維棉中，4°C低溫真空乾燥，製備CLOP金標物結合墊。參考1和圖2，襯板I用硬質塑膠條製成。樣品墊2用玻璃纖維棉製成。金標 物結合墊3為吸附有膠體金標記的抗氯羥吡啶單克隆抗體或多克隆抗體玻璃纖維棉。包被膜4本實施例採用硝酸纖維素膜。隱形檢測線5用CLOP-載體蛋白偶聯物在包被膜上印製成「I」。隱形對照線6用山羊抗小鼠免疫球蛋白(GaM IgG)溶液在包被膜上印製成「 I 」，兩條線平行排列組合為「 I I 」。手柄端的吸水墊7用吸水濾紙製成。覆蓋在樣品墊2和金標物結合墊3上面的樣品端白色保護膜8-1，手柄端保護膜8-2覆蓋在吸水墊7上面的手柄端其它顏色保護膜(如黃色)。標識線9為測試樣品的帶箭頭標示線，即在樣品墊2與金標物結合墊3交界處對應的白色保護膜偏向樣品墊一側約O. 5cm處印製的標示線，在標示線右側保護膜上印有箭頭及max字樣。也可以根據需要製成試紙卡。實施例3、本發明氯羥吡啶膠體金免疫試紙條和試紙卡的性能3.1本發明氯羥吡啶膠體金免疫試紙條和試紙卡的靈敏度試驗將氯羥吡啶母液(lmg/mL)濃度分別稀釋為0、2· 0、4· 0、8· O、16. 0、32· O μ g/L和64 μ g/L的CLOP標準品加到CLOP-試紙條和試紙卡(CLOP-Strip)的樣品墊上，靜置反應10分鐘，用讀條儀讀取T線掃描面積光密度的相對光密度值(G/DX A-ROD (pixel)，式中G為graph表不圖表，D為density表不光密度，A為area表不掃描面積，DXA為掃描面積的光密度，ROD為relative optical density表示相對光密度值，pixel為不同距離像速),以不同濃度標準品與空白標準品相對光密度值的百分率(G/DXA-R0D(pixel)% )為縱坐標，以不同標準品濃度的常用對數值為橫坐標，在半對數坐標紙上繪製檢測試紙的標準曲線，推導回歸方程，進行相關回歸分析。根據檢測試紙的顯色結果，取G/DXA-R0DXpiXel% =80%為機讀敏感度，取G/DXA-ROD (pixel) %= 50%為目測敏感度，確定CAP-Strip的檢測限。檢測試紙的機讀檢測限為0. 5μ g/L，根據肉眼觀察進行判斷，目測檢測限為5. 0μ g/L。3. 2本發明氯羥吡啶膠體金免疫試紙條和試紙卡的特異性試驗以交叉反應率為指標判定該試紙的特異性。將與CLOP結構相似，功能相近的抗生素類藥物或非抗抗生素類藥物作物類似物來檢測該試紙的特異性。目測結果顯示，檢測試紙與山羊抗小鼠IgG的結合反應特異性很強；與CL0P-2C的交叉反應為4. 0μ g/L，這是因為CLOP、CL0P-2C具有相同的抗原表位；與其他抗球蟲藥和抗生素類藥物無交叉反應性。表I氯羥吡啶膠體金免疫試紙與氯羥吡啶類似化合物的交叉反應
權利要求
1.一種氯羥吡啶膠體金層析檢測試紙條或卡，包括襯板和在襯板上依次銜接的樣品墊、金標結合墊、硝酸纖維素膜、玻璃吸水墊，其特徵在於所述金標結合墊為吸附有膠體金標記的抗氯羥吡啶單克隆抗體或多克隆抗體玻璃纖維棉，在所述硝酸纖維素膜上有用氯羥吡啶-載體蛋白偶聯物印製的隱形檢測線，用山羊抗小鼠IgG印製的隱形對照線。
2.根據權利要求1所述的氯羥吡啶膠體金層析檢測試紙條或卡，其特徵在於，所述的隱形檢測線和隱形對照線平行排列組合為「 11 」。
3.根據權利要求1所述的試紙條或卡，其特徵在於，所述金標物結合墊為將1: 100 1: 500稀釋(體積比)的膠體金標記抗體吸附於玻璃纖維棉中，4°C低溫真空乾燥，製備CLOP金標物結合墊。
4.根據權利要求3所述的試紙條或卡，其特徵在於，所述膠體金標記抗體製備方法為將稀釋後的膠體金和單克隆抗體或多克隆抗體按照不同的濃度倍比，選擇膠體金顯色紅色的最小稀釋濃度作為膠體金標記抗體的最佳量，用於膠體金標記抗體的製備。
5.根據權利要求4所述的試紙條或卡，其特徵在於，所述單克隆抗體或多克隆抗體的製備方法為 Al、氯羥吡啶半抗原的改造親核取代反應引入酯鍵，然後在鹼、酸的作用下，合成含有羧基的氯羥吡啶半抗原； A2、CL0P-2C-載體蛋白人工抗原的合成採用活潑酯法合成CLOP人工免疫原，稱取75mg CLOP半抗原溶解於3mL N,N-二甲基甲醯胺中，加入二環己基碳二亞胺35mg和N-輕基琥珀醯亞胺18mg，在室溫下磁力攪拌反應過夜12h，此液為A ;稱取20mgBSA溶於2mLO.01mol/L pH 7. 4的磷酸鹽緩衝液溶液中，此液為B ;將反應液B置於磁力攪拌器上，4°C下將反應液A緩慢滴加到反應液B中,攪拌反應過夜。次日將反應液置於經過預處理的透析袋內，在PBS中攪拌透析7天，得到偶聯產物CL0P-2C-BSA，分裝上清液，凍存於_20°C冰箱中，備用； A3、氯羥吡啶單克隆抗體和多克隆抗體的獲得用CL0P-2C-BSA免疫6周雌性BALB/C小鼠5隻，劑量為50μ g/0. 2mL/只，背部皮下分點注射。採用細胞融合技術無菌取脾臟製備脾細胞，在聚乙二醇-1500作用下與NSO骨髓瘤細胞進行融合；用間接ELISA法和阻斷ELISA法進行陽性孔篩選，選擇強陽性、抑制率高、細胞生長旺盛的孔進行有限稀釋克隆化，擴大培養、凍存並鑑定，獲得一株雜交瘤細胞株；之後採用體內誘生腹水法製備CLOP mAb ； 多抗製備用CL0P-2C-BSA載體蛋白結合抗原免疫紐西蘭白兔，免疫劑量為50yg ，100 μ g/次，背部皮下分多點注射；首免，用合成的人工抗原與等量弗氏完全佐劑乳化；力口強免疫，用合成的人工抗原與等量弗氏不完全佐劑乳化，連續免疫4 5次，每次間隔4 8周，最後一次免疫後10 15天，以ELISA法測其定效價達到105以上時，採血並分離收集高免血清。以飽和硫酸銨鹽析法提取IgG抗體，-20°C凍存備用。
全文摘要
本發明公開了一種氯羥吡啶膠體金層析檢測試紙條或卡，包括襯板和在襯板上依次銜接的樣品墊、金標結合墊、硝酸纖維素膜、玻璃吸水墊，所述金標結合墊為吸附有膠體金標記的抗氯羥吡啶單克隆抗體或多克隆抗體玻璃纖維棉，在所述硝酸纖維素膜上有用氯羥吡啶-載體蛋白偶聯物印製的隱形檢測線，用山羊抗小鼠IgG印製的隱形對照線。本發明的膠體金層析檢測試紙條和試紙卡具有下列各項優點①特異性強，敏感性高。②簡便、快速、時效性強。③結果顯示形象、直觀、準確。④節省費用，適用範圍廣，便於推廣。
文檔編號G01N33/543GK103018440SQ201210507849
公開日2013年4月3日 申請日期2012年11月23日 優先權日2012年11月23日
發明者張海棠, 範國英, 王自良, 姜金慶, 王淑雲, 楊雪峰, 丁涵, 李藝 申請人:河南科技學院