來自小麥的核酸分子、轉基因植物細胞和植物及其在生產改性澱粉中的應用的製作方法

2023-12-10 04:07:16 4

專利名稱：來自小麥的核酸分子、轉基因植物細胞和植物及其在生產改性澱粉中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及編碼來自小麥的R1-蛋白質的核酸分子及其衍生物和部分、所述的R1-蛋白質、用於生產所述R1-蛋白質的方法、包括所述核酸分子的轉基因植物細胞和植物、包括所述核酸分子的轉基因植物細胞和植物以及可獲自所述轉基因植物細胞和植物的改性澱粉。
多糖澱粉構成了植物中最重要的貯存物質之一。澱粉廣泛用於生產食品並且還在生產工業化產品中作為再生原料起重要作用。為了在許多不同技術領域中應用澱粉，需要各種任選地改性的澱粉以便滿足加工工業的不同需求。
儘管澱粉由化學上均一的基本成分，即葡萄糖組成，但是它不構成均勻原料。它是複雜的分子混合物，所述分子在其萄糖鏈的聚合度和支化度方面存在差異直鏈澱粉型澱粉是由α-1，4-糖苷支鏈葡萄糖分子組成的基本上非支化聚合物，而支鏈澱粉型澱粉是支化葡萄糖鏈的混合物，它另外包括α-1，6-糖苷互連鍵。
澱粉的分子結構主要依賴於其支化度、直鏈澱粉/支鏈澱粉比例、平均鏈長、鏈長分布和磷酸化程度，從而進一步決定澱粉及其水溶液的功能特性。澱粉及其水溶液的重要功能特性分別是例如溶解性、退減趨勢、成膜能力、粘度、糊化(粘合和膠連)特性和抗冷性。另外，澱粉顆粒的大小還可能決定澱粉對特殊應用的適合性。
由於澱粉通常通過化學和/或物理修飾得到改變以便滿足工業的要求，所以對提供改性澱粉存在巨大的需求，這種改性澱粉將會使含有改性澱粉的植物細胞或植物部位更適合於工業化加工，例如生產食品或工藝產品。因此，需要避免進行耗時而昂貴的化學和/或物理修飾並提供可合成更接近地滿足澱粉加工工業要求的澱粉的植物。
例如，通過傳統的育種和/或產生突變株製備產生改性產物的改良植物的常規方法局限於應用同源基因且並不總是令人滿意的。特別在小麥中，因小麥的多倍性(四或六倍性)而難以通過傳統育種製備穩定的突變株。然而，近來通過育種方法(Nakamura等，Mol.Gen.Geent.248(1995)，253-259)獲得了產生蠟質型澱粉(不含直鏈澱粉的澱粉)的小麥突變株。
進一步的可供選擇的方法是製備包括適合於改變植物澱粉機理的核酸分子以合成改性澱粉的轉基因植物。這類植物通過重組分子生物學技術並引入幹擾澱粉代謝的同源和/或異源核酸分子(例如編碼區、調節元件、內含子)來生產。然而，應用重組分子生物學技術需要直接或間接(例如共抑制、反義技術、蛋白質或核酶的生成)參與澱粉代謝或澱粉生物合成(即澱粉的合成、改性和/或降解)的適宜核酸的有效性。
大量基因參與澱粉代謝。因此，已經將編碼例如分支酶、脫支酶、異澱粉酶、澱粉合成酶、ADP-葡萄糖-焦磷酸化酶的大量基因用於改變植物中的澱粉代謝。
尤其就澱粉磷酸化程度而言R1蛋白質參與澱粉代謝且因此適合於改變澱粉的合成。特別地，R1-蛋白質和編碼來源於下列許多植物物種的R1-蛋白質的基因是公知的即來自WO 97/11188-A1和Lorberth等(Nature Biotechnology 16(1998)，473-477)的馬鈴薯；來自WO 98/27212-A1的玉米；來自Sakaki等、EMBL資料庫登記寄存號C71741(1997-09-19)的稻米；和來自WO 99/53072-A1的鼠耳芥屬、姜、蘚類、香蒲(寬葉香蒲)和大豆。
然而，小麥植物中存在R1-蛋白質並未得到證實，相應的核酸分子也未得到鑑定。此外，編碼R1-蛋白質的已知核酸分子並不總是令人滿意的或並不總是適合於小麥植物的遺傳工程或體內誘變以便改變小麥澱粉的生物合成和/或代謝。
因此，有待由本發明解決的問題是提供編碼來源於小麥的R1-蛋白質的核酸分子和改變植物中，尤其是小麥植物中澱粉代謝以便提供一種改性澱粉的方法，這種改性澱粉就物理和/或化學特性而言不同於天然合成的澱粉，尤其是小麥澱粉，它表現出改善的特徵，特別是應用於食品和/或非食品工業。
這些問題由如權利要求中所述的本發明的實施方案解決。
因此，本發明涉及編碼包括按照Seq.ID No.2和Seq.ID No.9的胺基酸序列的R1蛋白質的核酸分子或按照質粒pTa R1-11(DSM號12810)和質粒RS26-88(DSM號13511)的cDNA插入片段的其衍生物或其部分。所述本發明的R1-蛋白質參與澱粉的代謝並且就磷酸化程度而言直接或間接參與小麥澱粉的生物合成。
在本發明的含義內，有關本發明R1-蛋白質(多肽、胺基酸序列)的術語「衍生物」包括來源於Seq.ID No.2的多肽，它包括約至少60-79個胺基酸基、優選至少80個胺基酸基、更優選至少90個胺基酸基、特別是至少100個且最優選約101-111個胺基酸基，這些胺基酸基選自下列組成的胺基酸基的組1E、2V、3V、5G、6L、7G、8E、9T、10L、11V、12G、13A、14Y、15P、16G、17R、18A、20S、21F、23C、24K、25K、27D、28L、30S、31P、34L、35G、36Y、37P、38S、39K、40P、41I、42G、43L、44F、45I、48S、49I、50I、51F、52R、53S、54D、55S、56N、57G、58E、59D、60L、6 1E、62G、63Y、64A、65G、66A、67G、68L、69Y、70D、71S、72V、73P、74M、75D、77E、80V、81V、83D、84Y、87D、88P、89L、90I、92D、95F、96R、99I、100L、101S、103I、104A、105R、106A、107G、108H、109A、110I、111E、112E、113L、114Y、115G、116S、117P、118Q、119D、121E、122G、123V、124V、126D、127G、128K、129I、130Y、131V、132V、133Q和134T；且所述多肽包括至少1個、優選2個且更優選3個選自如Seq.ID No.2所述的胺基酸基中76V、93S和97N組成的組的胺基酸基(下文由單個字母碼表示)。
在本發明的含義內，有關本發明R1-蛋白質(多肽、胺基酸序列)的術語「部分」包括由本發明R1-蛋白質或其衍生物的約至少10-19個、優選至少20個、更優選至少40個、特別是至少80個且最優選約100-140個胺基酸基組成的多肽或寡肽。
本發明進一步涉及核酸分子，該核酸分子包括來源於Seq.IDNo.1和Seq.ID No.9的核酸分子或其衍生物或其部分；質粒pTa R1-11(DSM號12810)的672 bp EcoR I/Kpn I插入片段或其衍生物或其部分；特別是Seq.ID No.1的編碼區(核苷酸1-449)或其衍生物或其部分；尤其是質粒pTa R1-11(DSM號12810)插入片段的編碼區；和質粒RS26-88(DSM號13511)的編碼區或其衍生物或其部分。
在本發明的含義內，有關本發明核酸分子(核苷酸序列或多核苷酸)的術語「衍生物」包括多核苷酸，它包括約至少150-209個核苷酸、優選至少210個核苷酸、更優選至少240個核苷酸、特別是至少270個核苷酸且最優選約280-294個核苷酸，這些核苷酸選自下列組成的核苷酸的組(a)如Seq.ID No.1所述的1C、3G、4A、6G、7T、8G、9G、10T、12A、15G、16G、18C、19T、20T、21G、22G、24G、25A、27A、28C、30C、31T、33G、34T、36G、37G、38A、39G、40C、42T、43A、44T、45C、46C、48G、49G、51C、52G、53T、54G、55C、58T、59G、60A、61G、63T、64T、67T、69T；70G、72A、73A、75A、76A、77A、79A、81G、82A、84C、85T、88A、89C、90T、91C、92T、93C、94C、97A、100T、103T、105G、106G、107T、108T、109A、110C、111C、112C、114A、115G、116C、117A、118A、120C、121C、123A、124T、126G、127G、129C、130T、132T、133T、134C、135A、136T、137A、138A、144T、145C、147A、148T、149C、150A、151T、152C、153T、154T、155C、156C、157G、159T、160C、162G、163A、165T、166C、168A、169A、171G、172G、174G、175A、177G、178A、181T、182G、183G、184A、185A、186G、187G、188T、189T、190A、192G、193C、195G、196G、198G、199C、201G、202G、205T、207T、208A、210G、211A、213A、214G、215T、216G、217T、219C、220C、222A、223T、224G、225G、226A、227T、228G、230G、231G、232A、234G、235A、238A、240G、241T、242T、243G、244T、245A、247T、249G、250A、252T、253A、256C、259C、261G、262A、263C、264C、265C、268T、270A、271T、276G、277A、281T、285T、286T、287C、288C、289G、295C、296A、297A、298T、299C、300C、301T、303T、304C、306A、308C、309A、310T、312G、313C、315C、316G、318G、319C、320T、321G、322G、324G、325A、327G、328C、330A、331T、332C、333G、334A、335G、336G、337A、338G、339C、340T、342T、343A、344T、345G、346G、348T、349C、351C、352C、354C、355A、357G、358A、361T、363G、364A、365G、366G、367G、369G、370T、371A、372G、373T、374G、375A、377G、378G、379A、380T、381G、382G、384A、385A、387A、388T、390T、391A、393G、394T、396G、397T、399C、400A、401G、402A、403C、404A、406A、407C、408C、409A、410A、411A、412G、413A、414T、415G、416T和419T；且(b)所述的多核苷酸包括約至少15-19個核苷酸、優選至少20個核苷酸、更優選至少25個核苷酸、特別是至少27個核苷酸且最優選約30-32個核苷酸，這些核苷酸選自下列核苷酸組成的組如Seq.ID No.1所述的17A、23A、50C、56C、65C、68G、71T、104G、113T、143G、159C、161A、167T、191C、203G、206G、218C、221T、229T、233A、248C、251C、257G、269C、272C、279T、280C、290G、326C、341C、347G、350A、353A、359T、383G、392C和405T。
清楚地表明不應將序列成分的編號(一方面是核酸序列而另一方面是胺基酸序列)理解為固定或限定的定義。該編號僅提供了與術語相關的序列成分彼此的位置的信息並因此是一種參考。
此外，有關編碼本發明R1-蛋白質的核酸分子的術語「衍生物」包括通過添加、缺失、插入或重組一個或多個核苷酸而不同於Seq.IDNo.1和/或Seq.ID No.9且滿足如上述(b)中給出的定義的核酸分子。
另外，有關編碼本發明R1-蛋白質的核酸分子的術語「衍生物」包括本發明核酸分子的互補或反向互補多核苷酸或其部分。此外，有關編碼本發明R1-蛋白質的核酸分子的術語「衍生物」包括與本發明核酸分子雜交的多核苷酸或其部分，它滿足如上述(b)中給出的定義。
為了本發明的目的，術語「雜交」指的是在常規雜交條件下、優選在如例如Sambrook等(Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)所述的嚴格條件下的雜交。
「特異性雜交」尤其優選指的是下列條件雜交緩衝液2×SSC；10×Denhardt溶液(Ficoll 400+PEG+BSA；比例為1∶1∶1)；0.1％ SDS；5mM EDTA；50mM Na2HPO4；250μg/ml青魚精子DNA；50μg/ml tRNA；或0.25M磷酸鈉緩衝液(pH7.2)；1 mM EDTA；7％ SDS；雜交溫度T＝55-68℃；洗滌緩衝液0.2×SSC；0.1％ SDS；和洗滌溫度T＝40-68℃。
與本發明核酸分子或與適合於本發明使用的核酸分子雜交的分子還包括本發明核酸分子或適合於本發明使用的核酸分子的部分、衍生物和等位基因變體。
在本發明的上下文中，術語「衍生物」指的是這些分子的序列在一個或多個位置上不同於本發明或適合於本發明使用的核酸分子的序列且與這些序列表現出高度的同源性。同源性指的是序列同一性至少為60％、優選在70％以上、且尤其優選在85％以上、特別是在90％以上且特別優選在95％以上。已經通過一種或多種缺失、取代、插入(添加)或重組引起了相對於本發明核酸分子或相對於適合於本發明使用的核酸分子的偏差。
此外，同源性指的是在所述核酸分子與由它們編碼的蛋白質之間存在功能和/或結構等價性。與本發明核酸分子或與適合於本發明使用的核酸分子同源且構成這些分子的衍生物的核酸分子通常是構成發揮相同、事實上相同或相似生物學功能的修飾的這些分子的變化形式。它們可以是例如來自其它植物物種的序列這樣的天然出現的變化形式或突變，這些突變可能已經天然發生或已經通過定向誘變被引入。這些變化形式可以進一步是合成的序列。等位基因變體可以是天然出現的變體或者是合成的變體或通過重組DNA技術產生的變體。
有關編碼本發明R1-蛋白質的核酸分子的術語「部分」包括由本發明編碼R1-蛋白質的核酸分子或其衍生物的約至少30-99個、優選至少100個、更優選至少200個、特別是至少300個且最優選至少400個核苷酸組成的多核苷酸或寡核苷酸。術語「部分」並不限於長至足以編碼如上所述R1-蛋白質功能活性部分的核酸分子的部分。
在本發明的一個優選的實施方案中，本發明的術語「衍生物」和/或「部分」分別包括如上所定義的多核苷酸、多肽或寡肽，它們分別顯示出來源於小麥的R1-基因(即編碼R1-蛋白質的核酸分子)、R1-蛋白質的功能和/或結構等價性。術語「功能和/或結構等價性」指的是本發明分子各自相同、等價或相似的功能、尤其是生物學功能。然而，術語「部分」並不限於足以編碼所述蛋白質中的功能活性部分的所述核酸分子的部分。
由本發明核酸分子編碼的R1-蛋白質可以顯示出某些常規特徵例如酶活性、分子量、免疫反應性、構象、凝膠電泳中的遷移率、層析特徵、沉降係數、溶解性、光譜特性、穩定性、酶活性的最佳pH和/或最佳溫度等。
本發明的核酸分子可以分離自例如天然來源、可以由遺傳工程或分子生物學方法(例如PCR)製備或可以通過化學合成方法生產。本發明的核酸分子優選是DNA或RNA分子，例如cDNA或基因組DNA分子。任選地，本發明的核酸分子包括一種或多種間插序列(內含子)。
在另一個優選的實施方案中，本發明的核酸分子包括一種或多種確保在原核細胞和/或真核細胞中、優選在植物細胞中RNA分子的轉錄和合成的調節元件。
本發明的核酸分子適合於改變細胞、優選植物細胞中澱粉的生物合成/代謝，這種改變通過下列方式實現有義表達本發明的核酸分子、反義表達本發明的核酸分子、表達合適的核酶、共抑制或體內誘變。
因此，本發明也涉及允許在改變R1-蛋白質表達水平的細胞或植物細胞中翻譯或非翻譯性mRNA分子合成(有義或反義作用、共抑制作用或核酶)的本發明的核酸分子、特別是DNA分子的應用。
一般來說，本發明核酸分子的應用適合於任何植物物種。然而，優選單子葉植物和雙子葉植物，特別是農作物植物且最優選貯存澱粉的植物，例如黑麥、大麥、燕麥、小麥、小米、西米、稻米、玉米、豌豆、皺皮種青豌豆、木薯、馬鈴薯、番茄、油菜、大豆、大麻、亞麻、向日葵、豇豆、竹芋、三葉草、麥草或苜蓿，特別是是馬鈴薯、玉米、稻米或小麥植物。
共抑制方法對本領域技術人員來說是眾所周知的(Jorgensen，Trends Biotechnol.8(1990)，340-344；Niebel等，Curr.Top.Microbiol.Immunol.197(1995)，91-103；Flavell等，Curr.Top.Microbiol.Immunol.197(1995)，43-56；Palaqui Vaucheret，Plant.Mol.Biol.29(1995)，149-159；Vaucheret等，Mol.Gen.Genet.248(1995)，311-317；和de Borne等，Mol.Gen.Genet.243(1994)，613-621)。
在另一個實施方案中，本發明涉及編碼顯示出特異性裂解本發明DNA分子轉錄物的核酶活性的RNA分子的DNA分子。核酶是能夠裂解RNA分子和特異性靶序列的具有催化活性的RNA分子。通過重組DNA技術能夠測定相對於本發明核酸分子的核酶的特異性。為了製備編碼特異性裂解本發明DNA分子轉錄物的核酶的DNA分子，例如使編碼核酶催化結構域的DNA序列(DNA分子)的兩側與本發明的DNA序列連接。編碼所述催化結構域的核酸序列是例如SCMo病毒的衛星DNA的催化結構域(Davies等，Virology 177(1990)，216-224)或TobR病毒的衛星DNA的催化結構域(Steinecke等，EMBO J.11(1992)，1525-1530；Haseloff和Gerlach，Nature 334(1988)，585-591)。位於所述催化結構域側翼的DNA序列優選是用作靶物的本發明的DNA分子或其部分。核酶表達的一般原理和方法描述在EP-B1 0 321 201中。核酶在植物細胞中的表達進一步描述在Feyter等的Mol.Gen.Genet.250(1996)，329-338中。
通過「體內誘變」的方法也可以降低本發明R1-蛋白質在植物細胞中的活性。因此，將雜種RNA/DNA寡核苷酸(嵌合體)引入細胞(Kipp等，Poster Session at the 5th International Congress of PlantMolecular Biology，1997年9月21-27日，Singapore；Dixon和Arntzen，關於「Metabolic Engineering in Transgenic Plants」的會議報告，Keystone Symposia，Copper Mountain，CO，USA，TIBTECH 15(1997)，441-447；WO 95/15972-A1；Kren等，Hepatology25(1997)，1462-1468；Cole-Strauss等，Science 273(1996)，1386-1389)。
因此，本發明的另一個目的是提供一種通過體內誘變獲得的顯示出本發明R1-蛋白質的改變活性的植物、優選小麥植物。
此外，本發明涉及一種適合於遺傳工程的包括本發明的核酸分子(例如DNA和/或RNA)的載體，尤其是質粒、粘粒、病毒、噬菌體等；特別是適合於細菌和/或植物的遺傳工程的載體。術語「載體」指的是本領域技術人員所公知的允許將單鏈或雙鏈核酸分子靶向轉入宿主細胞的載體，例如DNA或RNA病毒或病毒片段；在有或沒有調節元件存在的情況下適合於將核酸分子轉入細胞的質粒；例如在基因槍方法中使用的金屬顆粒；還有可以通過化學和/或物理方法直接引入細胞的核酸分子。
在另一個實施方案中本發明涉及一種通過本發明的核酸分子或載體轉化和/或重組操作的轉基因宿主細胞，特別是一種轉基因的原核細胞或真核細胞且更優選一種轉基因的細菌或植物細胞。本發明的轉基因宿主細胞、尤其是轉基因的細菌或植物細胞含有一種或多種本發明的核酸分子，將它們穩定地整合入所述細胞的基因組，分別優選不在同源基因組的基因座上、不在基因組內天然出現的基因的位置上。可以通過DNA印跡、RNA印跡和/或蛋白質印跡分析鑑定本發明的轉基因細胞。
另外，本發明涉及來源於本發明轉基因宿主細胞和/或其含有本發明核酸分子或載體的後代的轉基因細胞。
由於提供了本發明的核酸分子和/或載體，通過重組DNA技術可製備包括本發明核酸分子和/或載體的轉基因植物細胞或植物，特別是單子葉植物或雙子葉植物細胞或植物，優選農作物植物細胞或植物，特別是選自下列組成的組的植物細胞或植物馬鈴薯、玉米、燕麥、黑麥、大麥、小麥、豌豆、稻米、小米、皺皮種青豌豆、木薯、西米、番茄、油菜、大豆、大麻、亞麻、向日葵、豇豆、竹芋、三葉草、麥草、苜蓿或木薯。
本發明的轉基因植物細胞或植物合成了就結構和/或物理和/或化學特性而言不同於在野生型(未轉化)植物中合成的澱粉的改性澱粉。通過遺傳工程和/或分子生物學方法將本發明的載體和/或核酸分子引入植物細胞、優選與確保在所述植物細胞中的轉錄和/或翻譯的一種或多種調節元件連接。任選地，隨後將所得的轉基因植物細胞再生成完整植物。
因此，本發明涉及一種包括本發明的核酸分子和/或載體的轉基因植物細胞，特別是單子葉植物或雙子葉植物細胞，優選馬鈴薯、玉米、燕麥、黑麥、大麥、小麥、豌豆、稻米、小米、皺皮種青豌豆、木薯、西米、番茄、油菜、大豆、大麻、亞麻、向日葵、豇豆、竹芋、三葉草、麥草、苜蓿或木薯的細胞，特別是馬鈴薯、小麥、玉米或稻米的細胞。
本發明還涉及一種轉基因宿主細胞、優選植物細胞的製備方法，該方法包括將本發明的核酸分子和/或載體引入屬於原核細胞或真核細胞的宿主細胞的基因組、優選引入植物細胞的基因組的步驟。優選所述的細胞含有與確保在所述細胞中的轉錄和/或翻譯的一種或多種調節元件連接的核酸分子。合適的調節元件優選相對於本發明核酸分子而言是同源或異源的。
在另一個實施方案中，本發明涉及一種轉基因植物細胞，其中存在的(同源的或任選地，異源的)本發明的核酸分子直接或間接導致本發明R1-蛋白質的表達或另一方面直接或間接導致抑制編碼R1-蛋白質的一種或多種內源性基因的表達。優選所述的轉基因植物細胞包括選自下列核酸分子組成的組的核酸分子(a)轉錄成導致本發明R1-蛋白質表達的有義RNA的本發明的核酸分子、優選DNA分子；(b)轉錄成導致編碼R1-蛋白質的一種或多種內源性基因表達減少(抑制)的反義RNA的本發明的核酸分子、優選DNA分子；(c)轉錄成導致編碼R1-蛋白質的一種或多種內源性基因表達減少(抑制)的共抑制RNA(有義RNA)的本發明的核酸分子、優選DNA分子；(d)轉錄成特異性裂解編碼R1-蛋白質的一種或多種內源性基因轉錄物的核酶的本發明的核酸分子、優選DNA分子；(e)通過體內誘變引入的修飾編碼R1-蛋白質的一種或多種內源性基因的本發明的核酸分子；由此改變了所述細胞中的澱粉代謝/生物合成。
如果通過反義作用改變了澱粉在植物中的代謝，那麼本發明的DNA分子在反義方向上與一種或多種確保植物細胞中轉錄和/或翻譯的調節元件連接，任選地，它包括一種或多種所表達的多核苷酸的相應基因組序列的內含子。反義RNA應具有最少約15-25個核苷酸、優選至少約50-100個核苷酸且最優選至少約200-1000個核苷酸。
在另一個實施方案中，通過一種包括本發明核酸分子的核酶使轉基因植物細胞中的R1-蛋白質的量得到減少。為了在本發明的轉基因植物細胞中表達所述的核酶分子，使編碼所述核酶的DNA分子與確保轉錄和/或翻譯的一種或多種調節元件連接。
通過本領域技術人員眾所周知的方法可以將所述的轉基因植物細胞再生成完整植物。可通過再生本發明的轉基因植物細胞獲得的包括本發明的轉基因植物細胞的轉基因植物和所述轉基因植物的製備方法也是本發明的主題。
本發明的轉基因植物是一種單子葉植物或雙子葉植物，優選農作物植物，特別是黑麥、大麥、燕麥、稻米、小麥、小米、西米、玉米、豌豆、皺皮種青豌豆、木薯、馬鈴薯、番茄、木薯、油菜、大豆、大麻、亞麻、向日葵、豇豆、白三葉草、麥草、苜蓿或竹芋植物，特別是玉米、小麥、稻米或馬鈴薯植物。
此外，本發明涉及本發明植物的繁殖材料、種子、器官和部位。
本發明還涉及一種用於生產澱粉的方法，該方法包括將本發明的轉基因植物細胞、植物和/或植物部位引入澱粉的生產/提取工藝中的步驟。
本發明進一步涉及一種用於生產改性澱粉的方法，該方法包括將本發明的澱粉引入澱粉的化學和/或物理修飾/處理的工藝中的步驟。
從植物、植物細胞或其部位中提取澱粉的工藝在本領域中是眾所周知的。例如，這類工藝描述在Eckhoff等的Cereal Chem.73(1996)，54-57中。例如通過「溼磨法」來提取玉米澱粉。用於從各種植物中提取澱粉的其它方法描述在下列文獻中例如StarchChemistry andTechnology(編輯Whistler，BeMiller和Paschall(1994)第2版，Academic Press Inc.London LTD；ISBN 0-12-746270-8；第XII章，417-468頁；Watson，S.A.Corn and Sorghum StarchesProduction，第XIII章，469-479頁；Corbishley和MillerTapioca，Arrowroot and Sago StarchesProduction；第XIV章，479-490頁；MitchPotato StarchProduction and Uses；第XV章，491-506頁；Knight和OlsonWheat StarchProduction，Modification and Uses；第XVI章，507-528頁；Rohwer和KlemRiceStarchProduction and Uses)。用於從植物材料中提取澱粉的方法中常用的設備是分離器、潷析器、水力旋流器和例如噴霧乾燥器或噴射乾燥器這樣不同種類的用於乾燥澱粉的機器。
本發明還涉及可獲自本發明的轉基因植物細胞、植物和/或植物部位、優選獲自小麥的改性澱粉。本發明的轉基因細胞或植物合成了就磷酸化程度而言不同於可獲自未轉化植物的澱粉的改性澱粉。在本發明一個特定的實施方案中，本發明的澱粉顯示出比可獲自相應未轉化細胞或植物的澱粉增加的磷酸酯含量。增加的磷酸酯含量(磷酸一酯含量)指的是澱粉的硫酸酯含量比可獲自相應未轉化植物的澱粉的磷酸酯含量至少增加約10-30％、更優選至少增加30％、甚至更優選至少增加50％、且特別優選增加100％以上到約1000-5000％。一般來說，百分比值指的是例如按照Lim等在Cereal Chem.(1994)71，448中所述的方法測定的小麥澱粉的葡糖-6-磷酸(glu-6-P)含量約為0.3nmol glu-6-P/mg澱粉。因此，本發明的小麥澱粉包括至少0.4nmol/mg澱粉的葡糖-6-磷酸含量、更優選至少0.8nmol/mg澱粉的葡糖-6-磷酸含量、特別是至少1.0nmol/mg澱粉的葡糖-6-磷酸含量、尤其是至少約1.5nmol/mg澱粉的葡糖-6-磷酸含量且最優選至少3.0nmol/mg澱粉的葡糖-6-磷酸含量。
在本發明的另一個實施方案中，本發明的澱粉顯示出的降低的磷酸酯含量(磷酸一酯含量)為可獲自相應未轉化植物的澱粉的磷酸酯含量至少約5-20％、優選至少約21-50％、甚至更優選約為51-95％。因此，本發明的小麥澱粉顯示出的葡糖-6-磷酸含量低於0.2nmol/mg澱粉、優選低於0.1nmol/mg澱粉、更優選低於0.05nmol/mg澱粉、特別是低於0.02nmol/mg澱粉、尤其是低於0.01nmol/mg澱粉且最優選低於0.001nmol/mg澱粉。
本發明的另一個目的是提供一種用於製備本發明R1-蛋白質或其衍生物或其部分的方法，該方法包括在允許表達所述R1-蛋白質或其衍生物或其部分的條件下培養本發明的轉基因宿主細胞並從所述細胞和/或所述細胞的培養基中分離所述R1-蛋白質或其衍生物或其部分的步驟。
此外，本發明涉及由通過用於生產本發明的R1-蛋白質或其衍生物或其部分的方法可獲得的本發明的核酸分子編碼的R1-蛋白質(R1-多肽)或其衍生物或其部分，優選來源於小麥的R1-蛋白質或其衍生物或其部分，尤其是按照Seq.ID No.2和Seq.ID No.10的R1-蛋白質或其衍生物或其部分。
在本發明中，術語「確保轉錄和/或翻譯的調節元件」優選具有諸如啟動子、增強子、終止子等這樣使細胞中的轉錄啟動和/或終止的核酸分子(例如DNA和/或RNA)的含義。術語「確保轉錄和/或翻譯的調節元件」還可以包括導致植物和/或植物細胞中受時間和/或區域(胚乳、根、塊莖、葉、莖、種子、果實、質外體、液泡、細胞溶膠、質體、線粒體、溶酶體)限制的轉錄或可化學誘導的核酸分子。
為了在植物細胞中表達本發明的核酸分子，可以使用任意活性啟動子。所述的啟動子相對於所轉化的植物細胞而言可以是同源或異源的，例如用於組成型表達的花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子(Odell等，Nature 313(1985)，810-812；Mitsuhara等，Plant andCell Physiology 37(1996)，49-59)或WO 94/01571-A1中描述的啟動子構建體。合適的還有導致由例如就植物特定組織或部位而言有限表達這樣的內源性和/或外源性因素(例如WO 93/07279-A1)確定/誘導的受區域和/或時間限制的表達的啟動子(Stockhaus等，EMBO J.8(1989)，2245-2251)。優選在所轉化植物中貯存澱粉的部位內具有活性的啟動子。例如玉米、小麥和稻米穀粒或種子和馬鈴薯塊莖等這樣優選的植物部位用於表達本發明的核酸分子。為了轉化馬鈴薯，可以使用塊莖特異性B33-啟動子(Rocha-Sosa等，EMBO J.8(1989)，23-29)。除啟動子外，啟動轉錄的DNA區還可以含有諸如所謂增強子-元件這樣確保轉錄進一步增加的DNA序列。為了在植物細胞且特別是在小麥細胞中進行表達，可以使用下列啟動子35S啟動子(Odell等，上文；Mitsuhara等，上文)；遍在蛋白質啟動子(US 5,614,399，Christensen等，Plant Mol.Biol.18(1992)，675-689；Takimoto等，Plant Mol.Biol.26(1994)，1007-1012；Corne jo等，PlantMol.Biol.23(1993)，567-581；Toki等，Plant Phys.100(1992)，1503-1507)；谷蛋白啟動子(Leisy等，Plant Mol.Biol.14(1990)，41-50；Zheng等，Plant J.4(1993)，357-366；Kononowicz等，JointAnnual Meeting of The American Society of Plant Physiologistsand The Canadian Society of Plant Physiologists，Minneapolis，Minnesota，USA，1993年7月1日-8月4日；Plant Physiol.102(增刊)(1993)166；Zhao等，Annual Meeting of The AmericanSociety of Plant Physiologists，Pittsburgh，Pennsylvania，USA，1992年8月1-5日；Plant Physiol.99(增刊1)(1992)，85；Yoshihara等，FEBS Lett.383(1996)，213-218)；肌動蛋白啟動子(McElroy等，Plant Cell 2(1990)，163-171)；cab-6啟動子(Plant and Cell Physiology 35(1994)，773-778)；RTBV啟動子(Yin等，Plant J.12(1997)，1179-1188)；CVMV啟動子(Verdaguer等，Plant Mol.Biol.31(1996)，1129-1139)；rab 16B啟動子(Plant Physiol.112(1996)，483-491)；psbD-C操縱子的啟動子(To等，Plant and Cell Physiology 37(1996)，660-666)；Tpi啟動子(Snowden等，Plant Mol.Biol.31(1996)，689-692)；Osgrpl啟動子(Xu等，Plant Mol.Biol.28(1995)，455-471)；Ltp2啟動子(Kalla等，Plant J.6(1994)，849-860)，ADH1啟動子(Kyozuka等，Mol.Gen.Genet.228(1991)，40-48)和LHCP啟動子(EMBO J.10(1991)，1803-1808)。
此外，術語「調節元件」還包括適合於終止轉錄和/或將聚腺苷酸尾添加到轉錄的核酸分子上的終止信號。終止信號的實例是包括來自土壤桿菌屬的胭脂氨酸合酶基因(NOS基因)或章魚氨酸合酶基因(Gielen等，EMBO J.8(1989)，23-29)的聚腺苷酸化信號的3』-非翻譯區、來自大豆的貯存蛋白基因的3』-非翻譯區或核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶的小亞單位(ssRUBISCO)。任選地，術語「調節元件」包括例如確保本發明核酸分子在特定的組織(例如胚乳、葉、莖、塊莖、分生組織、果實、根、種子)或細胞區室(例如細胞溶膠、質外體、質體、線粒體、液泡、溶酶體)中的轉錄和/或翻譯的特異性定位的核酸分子。任選地，術語「調節元件」還包括例如確保本發明核酸分子受時間限制轉錄和/或翻譯的核酸分子。此外，「調節元件」可以任選地以化學方式被觸發。
一般使用確保所述核酸分子穩定整合入植物基因組的克隆載體將本發明的核酸分子、優選DNA或RNA分子引入植物細胞。為了將核酸分子引入高等植物，可應用大量含有大腸桿菌複製信號和例如pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184這樣用於篩選轉化細菌細胞的標記基因的克隆載體。通過使用一種或多種限制性內切核酸酶可以將本發明的核酸分子整合入載體的適當限制位點上。將獲得的質粒用於轉化例如大腸桿菌細胞。在合適的培養基中培養轉化的細胞且隨後收集並裂解，通過標準方法回收質粒DNA且一般通過限制酶切和/或序列分析來對其進行分析。在每一種操作後，可以將所述質粒DNA切割並將獲得的DNA片段與其它DNA序列連接。為了將DNA引入植物宿主細胞，可應用大量轉化方法和技術例如，通過使用根癌土壤桿菌或毛根土壤桿菌的T-DNA轉化；原生質體融合；DNA注射；DNA電穿孔；和通過膜滲透(PEG)或通過生物(biolistic)方法和其它方法引入DNA。如果欲由轉基因植物細胞再生完整植物，那麼應含有選擇標記基因。如果使用Ti-或Ri-質粒，例如為了轉化植物細胞，那麼應將Ti-或Ri-質粒T-DNA的至少右側邊緣、優選其右側和左側邊緣與欲引入所述植物細胞作為側翼區的多核苷酸連接。如果將土壤桿菌屬用於轉化，那麼應將欲引入的DNA克隆到中間載體或二元載體中。由於序列與T-DNA的序列同源，所以可以通過同源重組將中間載體整合入土壤桿菌屬的Ti-或Ri-質粒。所述的中間載體還含有轉移T-DNA必不可少的vir-區。因為中間載體不能在土壤桿菌屬中複製，所以輔助質粒可以將中間載體轉移到土壤桿菌屬中(接合作用)。二元載體可以在大腸桿菌和在土壤桿菌屬中複製。它們含有選擇標記基因和位於右側和左側T-DNA邊緣區側翼的接頭或多接頭。可以將它們直接轉化入土壤桿菌屬(Hoslters等，Mol.Gen.Genet.163(1978)，181-187)。用於轉化土壤桿菌屬的質粒進一步包括一種選擇標記基因，例如允許選擇轉化的細菌的NPTII基因。該質粒可以包括例如對壯觀黴素(Svab等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87(1990)，8526-8530；Sval等，Plant Mol.Biol.14(1990)，197-206)、鏈黴素(Jones等，Mol.Gen.Genet.91(1987)，86-91；Svab等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87(1990)，8526-8530；Svab等，Plant Mol.Biol.14(1990)，197-206)、膦絲菌素(De Block等，EMBO J.6(1987)，2513-2518)、草甘膦(Thompson等，EMBO J.6(1987)，2519-2523；Thompson等，Weed Sci.35(1987)，19-23(增刊))或潮黴素(Waldron等，Plant Mol.Biol.5(1985)，103-108)產生抗性的其它選擇標記基因。土壤桿菌屬宿主細胞應含有攜帶vir-區的質粒。vir-區對將T-DNA轉移到植物細胞中是必不可少的。可以含有附加的T-DNA。將所轉化的土壤桿菌屬進一步用於轉化植物細胞。
T-DNA在轉化植物細胞中的應用描述在下列文獻中EP-A-120516；HoekemaThe Binary Plant Vector System OffsetdrukkerijKanters B.V.，Alblasserdam(1985)，第V章；Fraley等，Crit.Rev.Plant.Sci.，4，1-46和An等，EMBO J.4(1985)，277-287。二元載體是商購的，例如pBIN19(Clontech Laboratories，Inc.，USA)。
為了將DNA轉移到植物細胞中，可以將植物的外植體與根癌土壤桿菌或毛根土壤桿菌一起共培育。可以在允許選擇轉化細胞的合適的培養基(例如含有抗生素或殺生物劑等)中從感染的植物材料(例如葉片、莖節、根，還有原生質體或懸浮液培育的植物細胞)再生完整植物。對獲得的植物篩選存在的引入的DNA。為通過使用例如生物(biolistic)方法或通過轉化原生質體而引入外源DNA的其它可能性對本領域技術人員來說是公知的(例如，Willmitzer，L.，1993Transgenic plantsBiotechnology，A Multi-VolumeComprehensive Treatise(H.J.Rehm，G.Reed，A.Pühler，P.Stadler編輯)，Vol.2，627-659，VCH Weinheim-New York-Basel-Cambridge)。
通過根癌土壤桿菌由Ti-質粒-載體系統轉化雙子葉植物是一種完全確立的方法。還可以將土壤桿菌屬用於轉化單子葉植物(Chan等，Plant Mol.Biol.22(1993)，491-506；Hiei等，Plant J.6(1994)，271-282)。
用於轉化單子葉植物的可供選擇的方法有例如，通過生物(biolistic)手段轉化；原生質體轉化；部分通透細胞的電穿孔；通過玻璃纖維引入DNA。各種參考文獻涉及玉米的轉化(WO 95/06128-A1；EP-A-0 513 849；EP-A-0 465 875)。EP-A-292 435中描述了如何由無粘液的脆粒玉米愈傷組織作為原料獲得能育植物的方法。Shillito等(Bio/Technology 7(1989)，581)以產生能夠再生成完整植物的分化原生質體的愈傷組織懸浮液培養物作為原料。
就轉化小麥而言，可以應用各種方法例如土壤桿菌屬介導的基因轉移(Hiei等，Plant J.6(1994)，271-282；Hiei等，PlantMol.Biol.35(1997)，205-218；Park等，J.Plant.Biol.38(1995)，365-371)；原生質體轉化(數據見Gene transfer to plants，I.Potrykus，G.Spangenberg(編輯)，Springer-Verlag BerlinHeidelberg，1995，66-75頁；Datta等，Plant Mol.Biol.20(1992)，619-629；Sadasivam等，Plant Cell Rep.(1994)，394-396)；生物(biolistic)手段(Li等，Plant Cell Rep.12(1993)，250-255；Cao等，，Plant Cell Rep.11(1992)，586-591；Christou，Plant Mol.Biol.81997，197-203)；和電穿孔(Xu等Gene transferto plants，I.Potrykus，G.Spangenberg(編輯)，Springer-VerlagBerlin Heidelberg(1995)，201-208)。
一旦將引入的DNA整合入植物細胞的基因組，則它通常被穩定地整合併保留在原始轉化的細胞的後代基因組內。轉化的細胞通常含有一種選擇標記基因，它允許在有某些糖類、胺基酸、殺生物劑或例如卡那黴素、G 428、博來黴素、潮黴素或膦絲菌素這樣的抗生素存在的情況下選擇轉化體。因此，各選擇標記基因允許對照缺乏引入的DNA的細胞選擇轉化的細胞。
在選擇後，在正常條件下培養所轉化的細胞且使它生長成完整植物(McCormick等，Plant Cell Reports 5(1986)，81-84)。可以將所得的植物與具有相同轉化的遺傳性或不同遺傳性的植物雜交育種。所得的個體或雜交體具有相應的表型特性。應使兩代或多代生長以便確保無論哪一種表型特徵均穩定且可轉化。此外，應採集種子以便確保相應的表型或其它特性保留下來。
可獲自植物細胞、可獲自本發明的植物或可通過本發明方法獲得的改性澱粉適合於大量工業化應用。基本上，可以將澱粉再劃分成兩個主要領域。一個領域包括澱粉的水解產物，另一個是所謂的天然澱粉。水解主要包括通過酶或化學方法獲得的葡萄糖或葡聚糖組分。可以將它們用於進一步的工藝，諸如發酵和化學修飾。目前基本上使用澱粉葡糖苷酶以酶促方式進行澱粉的水解。通過使用較少量的水解用酶可以降低成本，這是因為澱粉的結構發生了改變，例如穀粒的表面積增加、因支化較少而導致可消化性改善或空間結構改變，其限制了所用酶進入。可以將所謂天然澱粉的應用再劃分成下列領域(a)製備食品的應用澱粉是傳統的各種食品的添加劑，其中它主要用於粘合水性添加劑的目的或使粘度增加或膠凝增加。重要的特徵性特性是流動性和吸著性、溶脹溫度和糊化溫度、粘度和增稠性、澱粉的溶解性、透明度和糊結構、耐熱性、抗剪強度和耐酸性、退減趨勢、成膜能力、冷凍/融化阻力、可消化性以及與例如無機或有機離子形成複合物的能力。
(b)製備非食品的應用另一個主要應用領域是可以將澱粉用作各種生產過程中的輔助劑或用作工藝產品的添加劑。澱粉用作輔助劑的主要應用領域首先是造紙業和紙板工業。在該領域中，澱粉主要用於固定(保持固態)、用於上膠填料和細顆粒、作為固化物質並用於脫水。此外，應用有關勁度、硬度、固定性、手感、光澤、平滑性、撕裂強度以及表面積的澱粉的有利特性。
在紙的生產過程中，可以在4個應用領域即表面、塗布、團塊和噴霧之間進行區分。
對有關澱粉表面處理的要求主要是高度的亮度、相應的粘度、高粘度穩定性、良好的成膜性以及形成較少的灰塵。當用於塗布固體內含物時，相應的粘度、高粘合能力和高色素親合性起重要作用。作為團塊的添加劑快速、均勻、無損耗分散、高機械穩定性和在紙漿中完全的保留性具有重要性。當將澱粉用於噴霧時，相應的固體含量、高粘度和高粘合能力也是重要的。一個主要的應用領域例如是在粘合劑工業中，其中將澱粉的應用領域再劃分成4個領域用作純澱粉膠、用於用特殊化學物質製備的澱粉膠、將澱粉用作合成樹脂和聚合物分散體的添加劑以及將澱粉用作合成粘合劑的補充劑。將全部基於澱粉的粘合劑的90％用於生產波面紙板、紙囊和紙袋、紙和鋁的複合材料、信封用盒和膠水、郵票等。
澱粉作為輔助劑和添加劑的另一個可能的應用是用於織物護理產品的生產過程中。在紡織工業中，可以在下列4個應用領域中進行區分將澱粉用作膠粘劑，即作為熨平和強化用於防止編織過程中主動張力和用於增加編織過程中耐磨性的去毛刺特性的輔助劑；作為主要在變質預處理後織物改善，諸如漂白、染色等的試劑；作為用於防止染料擴散的染料漿生產過程中的增稠劑；和作為用於縫線用纏繞劑的添加劑。
此外，可以將澱粉用作建築材料的添加劑。一個實例是生產石膏板，其中薄石膏粉中混合的澱粉與水成膏狀、在石膏板表面擴散且由此使紙板與所述石膏板粘合。其它應用領域是將澱粉與石膏粉和礦物纖維混合。在預拌混凝土中，可以將澱粉用於使上漿過程減速。
此外，澱粉有利地用於生產暫時防止土壤顆粒受到人為地層移動中水的影響的土壤穩定化工具。根據現有技術的知識，可以將由澱粉和聚合物乳液組成的組合產品看作與迄今為止所用產品具有相同的減侵蝕和減結殼作用；然而，它們相當低廉。
另一個應用領域是澱粉在用於改變這些製品的特殊特性的植物保護劑中的應用。例如，將澱粉用於改善植物防護劑和肥料的溼潤性；用於活性組分的定量釋放；用於將液體、揮發性和/或有氣味的活性成分轉化成微晶、穩定、可變形的物質；用於混合不相容的組成；和因分解較緩慢而用於延長作用期限。
還可以將澱粉用於藥物、醫療和化妝品工業領域。在製藥工業中，可以將澱粉用作片劑的粘合劑或用於稀釋膠囊中的粘合劑。此外，澱粉適合用作片劑的崩解劑，這是因為在吞咽時它吸收液體並在短時後它溶脹到使活性成分釋放。它也是一種達到時間延遲型釋放活性成分的適宜助劑(阻滯作用)。由於性質上的原因，藥用流動劑型(flowance)和撒粉是其它的應用領域。在化妝品領域中，例如，將澱粉用作諸如香料和水楊酸這樣的粉末添加劑的載體。澱粉相對廣泛的應用領域是牙膏。
將澱粉用作煤和煤磚的添加劑也是合適的。通過添加澱粉，煤可以定量地成塊和/或團成高質量的煤磚，由此防止了煤磚的過早崩解。燒煤含有4-6％的添加澱粉、0.1-0.5％的熱量煤。此外，澱粉適合用作粘合劑，因為向煤和煤磚中添加它可以明顯減少毒性物質的散發。
此外，可以將澱粉用作加工礦石和煤泥中的絮凝劑。
另一個應用領域是將澱粉用作澆鑄中加工物料的添加劑。就各種澆鑄工藝而言，需要由混有粘合劑的砂子生產的芯。目前，最常用的粘合劑是混有改性澱粉，大部分是溶脹澱粉的膨潤土。
添加澱粉的目的在於增加流阻和改善粘合強度。此外，溶脹澱粉可以滿足生產工藝的其它先決條件，諸如在冷水中的分散性、再水化程度、在砂子中良好的混溶性和高度結合水的能力。
在橡膠工業中，可以將澱粉用於改善工藝和光學質量。由於這一原因就要求改善表面光澤、手感和外觀。為了這一目的，在冷硫化前將澱粉分散在橡膠物質的粘性塗膠表面上。還可以將澱粉用於改善橡膠的可印性。
改性澱粉的另一個應用領域是生產皮革替代物。
在塑料市場上，正在湧現出下列應用領域將來源於澱粉的產物整合入加工過程(澱粉僅是填料，在合成聚合物與澱粉之間不存在直接粘合)或另一方面將來源於澱粉的產物整合入聚合物的產生過程中(澱粉和聚合物形成穩定的粘合)。
澱粉用作純填料不能與諸如滑石這樣的其它物質競爭。當特殊的澱粉特性變得有效且終產品的特性分布由此明顯改變時，上述情況可以改變。一個實例是將澱粉產品用於加工諸如聚乙烯這樣的熱塑性材料。因此，通過共表達將澱粉和合成聚合物按1∶1的比例混合而形成母煉膠，由此可以通過使用成粒的聚乙烯的常規技術生產不同產品。聚乙烯薄膜中澱粉的整合可以使物質在空心體中的透性增加、水蒸汽滲透性改善、抗靜電性能改善、防結塊性能改善和使用含水染料的可印性改善。
另一種可能性是澱粉在聚氨酯泡沫塑料中的應用。由於澱粉衍生物的採用且由於加工技術的最優化，所以能夠對合成聚合物與澱粉羥基之間的反應進行特定控制。結果是因應用了澱粉而使聚氨酯薄膜具有了下列特性分布熱膨脹係數降低；收縮性能降低；壓力/張力性能改善；水蒸汽滲透性增加而吸水性沒有改變；可燃性和裂化密度降低；沒有易燃部分溢出；不含滷化物且老化減少。目前仍然存在的缺陷在於壓力和衝擊強度降低。
薄膜產品的研發不再是唯一的選擇。還可以產生諸如罐、盤子和碗這樣具有50％以上澱粉含量的固體塑料產品。此外，澱粉/聚合物混合物提供了它們極易於生物降解的優點。
此外，由於它們比澱粉極強的結合水的能力，所以接枝聚合物已經獲得了極大的重要性。這些產品是含有澱粉和按照自由基鏈機理接枝上的合成單體的側鏈晶格的產品。目前可獲得的澱粉接枝聚合物的特徵在於改善的粘合和保留能力高達1000g水/g澱粉的高粘度。主要將這些超級吸收劑用於衛生保健領域，例如應用在諸如尿布和床單這樣的產品中以及應用在例如種子顆粒這樣的農業領域中。生物材料的寄存按照布達佩斯條約的要求將如本發明所述的下列質粒寄存在德國的Braunschweig的Deutsche Sammlung für Mikroorganismen undZellkulturen(DSMZ)質粒pTaR1-11指的是1999年5月20日寄存的寄存號DSM No.12810。
質粒RS26-88指的是2000年5月24日寄存的寄存號DSM No.13511。
下列實施例僅用來解釋本發明而不以任何方式來限定本發明。實施例1來自普通小麥L.，cv Florida的編碼R1-蛋白質的cDN的製備為了鑑定和分離編碼來源於小麥的R1-蛋白質的cDNA，通過使用λzap II載體(λZAP II-cDNA合成試劑盒，Stratagene GmbH，Heidelberg，Germany)、按照製造商的方案由21日齡小麥植物潁果(「含澱粉」-胚乳)聚腺苷酸化RNA製備小麥cDNA文庫。該cDNA文庫的原始滴度約為1.26×106pfu/ml。
使用寡核苷酸R1A和R1B作為對含有編碼來源於玉米的R1-蛋白質的cDNA的質粒pBinAR Hyg(DSM 9505)DNA插入片段進行PCR(聚合酶鏈反應)擴增的引物來篩選cDNA文庫。所述的質粒例如可按照WO98/27212的實施例14所述獲得。因此，特別將WO 98/27212-A1的公開內容引入本文作為參考。
在對載體pBluescript進行Xba I/Asp 718限制內切核酸酶消化後，通過瓊脂糖凝膠電泳和標準方案純化cDNA片段。
作為用於對所述玉米cDNA片段進行PCR擴增的模板，使用約10pg的上述分離的玉米cDNA片段。
PCR緩衝液含有1.5mM MgCl2、20mM Tris-HCL(pH 8.4)、50mM KCl、0.8mM dNTP混合物、1μM引物R1A、1μM引物R1B和2.5個單位的Taq聚合酶。
R1A5』TATTGGAAGCTCGAGTTGAAC 3』(Seq.ID No.3)R1B5』TTGAGCTGTCTAATAGATGCA 3』(Seq.ID No.4)按照下列方案在TrioblockPCR-熱循環儀(Biometra，Germany)中進行PCR循環以便擴增編碼來源於玉米的R1-蛋白質的cDNA片段95℃下4分鐘；96℃下1分鐘；62℃下45秒；72℃下1分15秒；共30個循環；和72℃下5分鐘。
隨後，按照製造商的方案(Boehringer Mannheim，DIG系統用戶指南)將獲得的片段進行隨機引導的毛地黃毒苷(digoxygenin)標記。
將1924bp的擴增和標記的cDNA片段進一步用作篩選上述製備的來源於小麥的cDNA文庫的異源探針。
按照標準方案篩選約3.5×105噬菌體。
在55℃下的5×SSC、3％阻斷液(Blocking)(BoehringerMannheim)、0.2％ SDS、0.1％月桂基肌氨酸鈉和50μg/ml青魚精子DNA中預雜交後，將該濾膜與1ng/ml毛地黃毒苷(digoxygenin)標記的(隨機引導的DNA標記試劑盒)r1-蛋白質探針(1924 bp的玉米Xbal/Asp718 cDNA片段)雜交過夜。在室溫下將該濾膜用2×SSC、1％ SDS洗滌2次、共5分鐘；在55℃下用1×SSC、0.5％ SDS洗滌2次、共10分鐘；並在55℃下用0.5×SSC、0.2％ SDS洗滌2次、共10分鐘。
重新篩選並純化陽性克隆。按照製造商的方案(Stratagene，Heidelberg)通過體內切除分離質粒(pBluescript SK Phagemide)。在通過限制分析對所述克隆進行特徵記述後，進一步分析最長的cDNA插入片段。實施例2pTaR1-11的cDNA插入片段的序列分析按照雙脫氧核苷酸方法(Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA74(1977)，5463-5467)分析所分離的克隆pTaR1-11的cDNA插入片段的核苷酸序列。
克隆pTaR1-11含有672bp的插入片段，該片段代表編碼按照Seq.ID No.2的來源於小麥的R1-蛋白質的按照Seq.ID No.1的部分cDNA。
Seq.ID No.1的多核苷酸的相應胺基酸序列在Seq.ID No.2中給出。實施例3來自普通小麥L.cv Florida的編碼R1-蛋白質的cDNA的分離和序列鑑定為了鑑定和分離編碼來自小麥的R1-蛋白質的cDNA，從來自小麥的3-6周齡的老葉中分離聚腺苷酸化RNA並使用RT-PCR-試劑盒(Titan One tube RT-PCR System，Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)、按照製造商的方案對其進行反轉錄。使用寡核苷酸Zm-R1-2(Seq.ID No.5)和Wh-R1-5(Seq.ID No.6)和作為模板的RT-反應物的等分部分進行編碼R1-蛋白質的cDNA的擴增。
將下列引物選作用於分離編碼R1蛋白質的所需DNA的雜交探針引物結合位點定位於Seq.ID NOs.7和9中的1-24位和3402-3418位上Zm-R1-2(Seq.ID No.5)5』-CTG TGG TCT TGT CTG GAC-3』Wh-R1-5』(Seq.ID No.6)5』-GAG GAA GCA AGG AAG GAA CTG CAG-3』按照Eppendorf MastercyclerTM梯度(Eppendorf，Hamburg，Germany)進行PCR-反應且該反應中含有10mM Tris-HCl pH 8.85、25mM KCl、5mM(NH4)SO4、1.5mM MgSO4、0.8mM dNTPs、1μM引物Zm-R1-2、1μM引物Wh-R1-5和1個單位的Pwo-DNA-聚合酶。進行下列溫度程序開始在94℃下2分鐘；然後在94℃下1分鐘、在55℃下1分鐘且在72℃下3分鐘，共計35個循環；和最後在72℃下5分鐘的步驟。將獲得的3.4 kb DNA-片段克隆入pBluescript SK(-)載體的EcoRV-位點，從而產生質粒RE 23-88，與GATC GmbH(Konstanz，Germany)配合進一步分析其核苷酸序列且如SEQ ID No.7所述。它代表其中5』-端的～1kb和3』-端的～300bp缺失的R1-基因的主要部分。缺失的3』-區與如實施例1和2中所述的部分R1-cDNA克隆的相應區互補，從而產生質粒RS 26-88且包括SEQ ID No.9。為了獲得它，用限制性內切核酸酶Ec/136消化克隆RS 23-88。將所得的大片段用於進一步克隆，而棄去較小的140bp片段。用限制性內切核酸酶Xhol處理來自實施例1和2的含有來自小麥的R1 cDNA 3』-區的克隆TaR1-11，使用T4-DNA-聚合酶將限制位點填補成平端並通過用限制性內切核酸酶Ec/136消化使來自小麥的R1 cDNA的3』-區從載體中釋放出來。將這種產生的片段連接到Ec/136消化的RS 23-88的平端上。通過限制酶切分析控制所連接片段的方向。通過經GATC GmbH(Konstanz，Germany)進行的序列分析再次測定完整cDNA克隆(～3.7kb)的一級結構且如SEQ IDNo.9所述。
序列表序列表110Aventis CropScience GmbH120來自小麥的核酸分子、轉基因植物細胞和植物及其在生產改性澱粉中的應用130AGR 1999/M 214150DE 199 26 771.51511999-06-1116010170PatentIn Ver.2.12101211672212DNA213普通小麥220221CDS222(3)..(449)4001ct gaa gtg gtg aaa gga ctt gga gag aca ctt gtg gga gct tat cct47Glu Val Val Lys Gly Leu Gly Glu Thr Leu Val Gly Ala Tyr Pro1 5 10 15ggc cgt gcc atg agc ttc gtg tgt aag aaa gat gac ctt gac tct ccc 95Gly Arg Ala Met Ser Phe Val Cys Lys Lys Asp Asp Leu Asp Ser Pro20 25 30aag gta ctg ggt tac cct agc aag cca att ggt ctc ttc ata aag cgg 143Lys Val Leu Gly Tyr Pro Ser Lys Pro Ile Gly Leu Phe Ile Lys Arg35 40 45tca atc atc ttc cgc tca gac tct aat ggt gag gat ctg gaa ggt tac 191Ser Ile Ile Phe Arg Ser Asp Ser Asn Gly Glu Asp Leu Glu Gly Tyr50 55 60gct gga gca ggg ctg tat gat agt gtc cct atg gat gtg gaa gat gaa 239Ala Gly Ala Gly Leu Tyr Asp Ser Val Pro Met Asp Val Glu Asp Glu65 70 75gtt gta ctc gac tac acg acc gac cct ctc atc act gac tct gga ttc 287Val Val Leu Asp Tyr Thr Thr Asp Pro Leu Ile Thr Asp Ser Gly 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Asp Gly Lys Ile Tyr Val Val Gln Thr112511301135Tyr His Arg Cys Asn Met Tyr Val Tyr Ala Ala Gln Val Val Glu114011451150
權利要求
1.一種編碼R1-蛋白質或R1-蛋白質的部分或衍生物的核酸分子，它選自下列核酸分子組成的組(a)編碼包括選自Seq.ID No.2和Seq.ID No.10組成的組的多肽的R1蛋白質的核酸分子或其部分或其衍生物；(b)編碼選自Seq.ID No.1和Seq.ID No.9組成的組的核酸分子或其部分或其衍生物；(c)包括選自按照DSM號12810的質粒pTa R1-11和按照DSM號13511的質粒RS26-88組成的組的cDNA插入片段編碼區的核酸分子或其部分或其衍生物；(d)編碼一種多肽的核酸分子或其部分或其衍生物，所述多肽包括由cDNA插入片段編碼的多肽，所述的cDNA插入片段選自按照DSM號12810的質粒pTa R1-11和按照DSM號13511的質粒RS26-88組成的組。
2.一種根據權利要求1的核酸分子，它包括一個或多個確保細胞中轉錄和/或翻譯的調節元件。
3.一種根據權利要求1-2中一項或多項的核酸分子，它是DNA分子。
4.一種根據權利要求1-2中一項或多項的核酸分子，它是RNA分子。
5.一種包括權利要求1-4中一項或多項的核酸分子的載體。
6.根據權利要求5所述的載體，它包括一個或多個確保細菌和/或植物細胞中轉錄和/或翻譯的調節元件。
7.一種轉基因宿主細胞，它包括根據權利要求1-4中一項或多項的核酸分子和/或根據權利要求5-6中一項或多項的載體。
8.根據權利要求7所述的宿主細胞，它是植物細胞。
9.一種用於製備根據權利要求7-8中一項或多項的轉基因細胞的方法，該方法包括將根據權利要求1-4中一項或多項的核酸分子和/或根據權利要求5-6中一項或多項的載體引入原核細胞或真核細胞的基因組中的步驟。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述的細胞是植物細胞。
11.一種包括權利要求8所述宿主細胞的轉基因植物。
12.一種用於生產根據權利要求11的植物的方法，該方法包括將根據權利要求1-4中一項或多項的核酸分子和/或根據權利要求5-6中一項或多項的載體引入植物細胞並從該植物細胞再生完整植物的步驟。
13.一種來自權利要求11所述植物的繁殖材料。
14.一種來自權利要求11的轉基因植物的種子。
15.一種用於生產澱粉的方法，該方法包括將根據權利要求8的植物細胞、根據權利要求11的植物、根據權利要求13的繁殖材料和/或根據權利要求14的種子引入用於生產澱粉的工藝中的步驟。
16.一種可獲自根據權利要求8的植物細胞、根據權利要求11的植物、根據權利要求13的繁殖材料和/或根據權利要求14的種子或可用權利要求15的方法獲得的澱粉。
17.一種用於生產改性澱粉的方法，該方法包括將根據權利要求16的澱粉引入對澱粉進行化學和/或物理修飾的工藝中的步驟。
18.一種用於生產Seq.ID No.2和Seq.ID No.10的R1-多肽或其衍生物或其部分的方法，該方法包括在允許表達蛋白質的條件下培養根據權利要求7-8中一項或多項的宿主細胞並從所述細胞和/或培養基中分離所述R1-多肽的步驟。
19.一種由根據權利要求1-4中一項或多項的核酸分子編碼的R1-多肽或其衍生物或其部分。
20.根據權利要求19的R1-多肽在生產單克隆抗體或多克隆抗體中的應用。
21.根據權利要求1-4中一項或多項的核酸分子或其衍生物或其部分在篩選核酸文庫和/或作為雜交探針中的應用，所述的核酸分子或其衍生物或其部分任選地被標記。
22.根據權利要求1-4中一項或多項的核酸分子或其衍生物或其部分在製備轉基因細胞或轉基因植物中的應用。
全文摘要
本發明描述了編碼來自小麥的R1－蛋白質的核酸分子和用於生產可合成改性澱粉的轉基因植物細胞和植物的方法和重組DNA分子。另外，本發明描述了由這些方法產生的植物細胞和植物以及可從中獲得的澱粉。
文檔編號C12N9/00GK1402789SQ00808513
公開日2003年3月12日 申請日期2000年6月2日 優先權日1999年6月11日
發明者G·阿貝爾, H·羅爾茲, S·魯緹克, R-C·施密特 申請人:阿溫提斯作物科學有限公司