糞腸球菌及其應用與其飼料添加劑和發酵劑的製作方法

2023-12-10 03:19:31 1

專利名稱：糞腸球菌及其應用與其飼料添加劑和發酵劑的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及一株糞腸球菌(Enterococcus faecal is)及其應用與其飼料添加劑和發酵劑。
背景技術：
在我國養殖業中，抗生素的過度使用，造成了藥物殘留以及大量耐藥性細菌產生， 其結果嚴重阻礙了畜、禽、水產養殖業的健康持續發展，為食品安全和消費者的身體健康埋下了隱患，因此尋找安全、無殘留的抗生素替代品迫在眉睫。包含益生菌的生物飼料添加劑是一種十分理想的部分抗生素的替代品，而益生菌菌株是開發質量穩定、效果顯著、性價比高的生物飼料添加劑的重要基礎。益生菌的研究和開發的關鍵問題在於優良菌株的分離和篩選、良好的益生菌處理工藝。目前，益生菌菌種存在以下幾個問題1.大多數的益生菌為不產芽孢的乳酸菌，且多屬專性厭氧菌，極易受到溫度、氧氣、水分及酸鹼等外界環境因素的影響，通常菌活性保持比較困難；2.多數益生菌在飼料加工過程中難以耐受飼料制粒時的高溫；3.菌種本身的特性不好，產酶、抑菌能力差。

發明內容
本發明的目的在於提供一株抗逆性強、益生功能優秀的益生菌一糞腸球菌 (Enterococcus faecalis)，保藏編號為CGMCC No. 5092，此菌具有良好的抗逆性功能和益生功能耐人工胃酸、耐膽汁液、耐高溫、對大腸桿菌K88、K99和金黃色葡萄球菌有較強抑制作用，產酸能力較強、能夠抑制黴菌。本發明的另一個目的是提供了該糞腸球菌的應用。本發明還提供了包含該糞腸球菌的飼料添加劑和發酵劑。本發明的目的是通過如下技術方案實現的本發明提供一株糞腸球菌，其保藏編號為CGMCC No. 5092。其中，該菌的16s rRNA基因序列如SEQ ID NO 1所示。本發明的糞腸球菌可用於製備飼料添加劑。飼料添加劑主要用於畜、禽或者水產養殖飼料中，如雞、鴨、豬、牛、羊、魚等，其中飼料添加劑中糞腸球菌的活菌數為 IO9-IOiciCfWig ；飼料添加劑添加於禽畜或水產養殖飼料後，飼料中糞腸球菌的活菌數為 106-108cfu/g。本發明還提供了包含該糞腸球菌CGMCC No. 5092的飼料添加劑，其特徵在於飼料添加劑中糞腸球菌的活菌數為IO9-IOiciCfu/^本發明的糞腸球菌也可用於製備發酵劑。其中，所述的發酵劑為用於豆粕、棉粕、青草和/或玉米秸稈的發酵劑，發酵劑加入豆粕、棉粕、青草和/或玉米秸稈後的活菌數為106-107cfu/g。本發明還提供了包含該糞腸球菌CGMCC No. 5092的發酵劑，其特徵在於發酵劑中糞腸球菌的活菌數為108-101QCfU/g。
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本發明的糞腸球菌(Enterococcus faecalis)為申請人從豬大腸中分離得到，其生物學特徵如下菌落圓整，表面光滑，不透明，乳白色，邊緣光滑，革蘭氏陽性菌；單個菌體為球狀或橢圓狀。本發明的糞腸球菌經過人工胃液、膽汁液及耐熱性的篩選；又經過產酶能力篩選和抑菌能力篩選，可以耐受pH2.0，l%胃蛋白酶的人工胃液，可以耐受0.3%的人工膽汁液，可以耐受85°C的制粒溫度，也可以抑制致病性大腸桿菌K88，K99和金黃色葡萄球菌，具有較強的產酸和抑制豆粕、棉粕、玉米秸稈中黴菌的能力。本發明的糞腸球菌 (Enterococcus faecalis)申請人已於2011年7月沈日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCJia 北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 5092。有效效果(1)本發明的糞腸球菌CGMCC No. 5092的抗逆性強，可以耐受制粒高溫，耐受人工胃液，人工膽鹽，因此在經過飼料制粒，動物胃腸道環境後，還有大量活菌可以順利進入動物的腸道，在腸道中發揮益生功能，提高動物免疫力，降低養殖成本；(2)本發明的糞腸球菌可以有效抑制動物腸道內常見致病菌大腸桿菌K88，K99和金黃色葡萄球菌。(3)本發明的糞腸球菌可以大量的產酸，能夠降低腸道內的PH抑制有害菌的生長和繁殖，同時也有助於消化。(4)本發明的糞腸球菌經過培養和高密度發酵可作為生物飼料添加劑加到養殖動物的飲水或者飼料中，改善動物腸道健康，提升動物免疫力，增加動物的生產性能。(5)本發明的糞腸球菌還可以作為發酵劑，對豆粕、棉粕、菜粕和/或玉米秸稈進行處理，可以抑制黴菌的產生，增加養殖動物對豆粕、棉粕、菜粕或者玉米秸稈中營養成分的吸收。


圖1 圖1為糞腸球菌抑制大腸桿菌K88，K99和金黃葡萄球菌的抑菌圈圖片。圖2 糞腸球菌(CMGCC No. 5092)發酵玉米粉的圖片通過下列實施例將更具體的說明本發明，但是應理解所述實施例僅是為了說明本發明，而不是以任何方式限制本發明的範圍。
具體實施例方式實施例1糞腸球菌CGMCC No. 5092的篩選。1、初篩取樣品豬糞、牛糞和雞糞等樣品各5g，浸泡於20ml無菌0. 85%生理鹽水中，震蕩打散樣品，使樣品充分與生理鹽水接觸，70°C恆溫水浴鍋靜置3分鐘，取上清，5000rpm離心 10分鐘，棄去上清。將離心後的菌體沉澱加入IOml人工胃液中，37°C靜置池，然後離心，收集菌體後，將菌體沉澱加入IOml人工膽鹽中，37°C靜置4h，收集菌體，稀釋塗布於LB培養基。37°C培養箱培養12-24h後，對菌落進行純化分離。對得到的菌進行保存，並進一步復篩。生理鹽水的配製方法是0. 85%氯化鈉溶液，高壓滅菌後備用。
人工胃液的配製方法是1 %胃蛋白酶，0. 85%氯化鈉，用濃鹽酸調pH值到2. 0，經細菌過濾器過濾除菌後備用。人工膽鹽的配製方法是在液體肉湯中添加0. 3%的豬膽鹽(分析純)，高壓滅菌後備用。LB固體培養基的製作方法是蛋白腖10g，酵母膏5g，氯化鈉10g，瓊脂1. 5%， PH7.0，高壓滅菌後備用。2、復篩(1)將配置好、滅完菌的LB培養基溫度冷卻至45°C，加入過夜培養的大腸桿菌 K88、K99和金黃色葡萄球菌(每毫升培養基加入1微升菌液)，震蕩混勻，倒入無菌平板，水平凝固後，每個平板利用四個牛津杯進行打孔，每隻牛津杯中加入200 μ 1待測菌液，蓋好皿蓋，小心移至37°C培養箱，平皿正放靜置培養。培養20h後，打開皿蓋，移去牛津杯，用卡尺測量抑菌圈直徑。實施例2糞腸球菌的分子鑑定利用細菌的通用引物對篩選到的菌株進行PCR鑑定按細菌DNA提取試劑盒操作說明書提取模板DNA。使用16S rRNA保守序列的上遊引物5，-AGAGTT TGA TCC TGG CTC AG-3，，見 SEQ ID No. 2 和下遊引物 5，-GGT TACCTT GTT ACG ACT T-3，見 SEQ ID No. 3 擴增細菌16s rRNA基因片段。經過測序得到該菌屬於糞腸球菌，擴增片段的測序結果見SEQ ID No. 1。實施例3糞腸球菌抗逆性的驗證(1)耐高溫性將培養12h的糞腸球菌進行離心收集，置入生理鹽水中進行重懸後，取樣塗布，計活菌數；再將生理鹽水在70°C的水浴鍋裡加熱十分鐘後，迅速冷卻，再進行平板計數，殘存活菌數為85.3%。(2)人工胃液的耐受性取0. 5ml培養1 糞腸球菌的菌液，溶於4. 5ml生理鹽水中，用平板計數法計活菌數。再取定量上述菌液加入4. 5ml人工膽鹽培養基中，37°C靜置池，平板計數法計殘存活菌數，殘存活菌數為92.2%。(3)人工膽汁液的耐受性取0. 5ml培養1 糞腸球菌的菌液，溶於4. 5ml生理鹽水中，用平板計數法計活菌數。而後另取0. 5ml上述菌液加入4. 5ml人工膽汁液培養基中，37°C靜置池，平板菌落計數法計殘存活菌數，殘存活菌數為86. 2%。結果以上幾個實驗表明，本發明中從豬大腸中分離到的糞腸球菌的抗逆性較強， 可以耐受較高的溫度，耐受人工胃液，人工膽鹽，因此作為飼料添加劑使用，能夠保證大量的菌體順利通過動物的腸道，在腸道中存活，發揮其益生功能。實施例4糞腸球菌(CGMCC No. 5092)的益生功能(1)抑菌功能驗證過夜培養的致病性大腸桿菌K88，K99和金黃色葡萄球菌菌液用平板計數法計數。 分別在3管5ml的大腸桿菌K88、K99和金黃色葡萄球菌中加入5ml糞腸球菌菌液。37°C培養4h，平板菌落計數法計算殘存的大腸桿菌K88、K99和金黃色葡萄球菌的活菌數。殘存致病性大腸桿菌K88、K99和金黃色葡萄球菌的活菌數為24. 7%,30. 2%和31. 8%。(2)在豆粕或者玉米粉中抑制黴菌的驗證取培養1 的糞腸球菌的菌液20ml，與30g玉米粉或者豆粕進行均勻混合，空白實驗為20ml無菌水與30g玉米粉或者豆粕進行均質混合，然後分別在3d、5d、8d和IOd對兩瓶裡面的玉米或豆粕及黴菌的生長情況進行觀察。通過實驗表明，在5天後，沒有加入糞腸球菌菌液的玉米粉和豆粕中均有黴菌絲長出，而加入糞腸球菌菌液的玉米粉和豆粕的顏色仍然新鮮，有所分解但無黴菌斑或者黴菌絲的出現。實施例5糞腸球菌(CGMCC No. 592)飼料添加劑的製備(1)糞腸球菌的高密度發酵發酵糞腸球菌時用的發酵培養基由以下成分組成紅糖18g/L，蛋白腖4g/L，牛肉膏3g/L，酵母浸粉，0. 8/L，七水合硫酸鎂0. 4g/L，硫酸錳0. 005g/L, pH為7. 2。發酵條件為發酵溫度為37°C，發酵時間為12h，pH值為7. 2，轉速為IOOrpm，初始接種量為2%。發酵結束後，得到7. 3X109cfu/ml的菌液。(2)糞腸球菌(CMGCC No. 5092)飼料添加劑的製備對糞腸球菌進行高溫噴霧乾燥，其保護劑成分為黃原膠，海藻糖，麥芽糊精，進風 180°C，出風70°C，得到流散性好，易溶於水、活菌數在4X 101(lCfU/g的糞腸球菌菌粉。實施例6糞腸球菌(CGMCC No. 5092)在發酵玉米粉過程中的作用將玉米粉和水以1 0.5的比例充分混勻，以的接種量接種糞腸球菌CGMCC No. 5092菌粉，添加量為107/g，發酵溫度為37°C，發酵時間為3d。發酵容器為250mL的錐形瓶，而後置入培養箱中進行發酵。空白對照為不接種糞腸球菌菌粉的玉米粉與水(1 0.5) 的混合物，對照2為接種量接種枯草芽孢桿菌菌粉的玉米粉和水(1 0. 的混合物。結果與空白對照相比，玉米粉經過糞腸球菌發酵後，其顏色、粘稠度和風味均明顯改善(圖幻，其中接種糞腸球菌CGMCC No. 5092的發酵玉米粉和接種枯草芽孢桿菌的發酵玉米粉的顏色、粘稠度和風味改善更為明顯。在室溫繼續放置未發酵玉米粉和發酵玉米粉一周後，觀察到未發酵玉米粉被黴菌汙染，發酵玉米粉未被汙染。放置兩周後，枯草芽孢桿菌和糞腸球菌發酵的玉米粉仍然沒有被黴菌汙染，但是糞腸球菌發酵的玉米粉其風味更佳，說明糞腸球菌CGMCC No. 5092具有防止黴菌感染的功效，且作用比枯草芽孢桿菌作用更佳·實施例7糞腸球菌飼料添加劑對蛋雞生產性能、蛋品質、死淘率和抗體水平的影響用日齡相同的產蛋後期海蘭蛋雞9000隻，分三組，每幢一組3000隻，分三個重複， 每個重複1000隻。分組情況如下A組，空白對照組，飼餵蛋雞基礎日糧；B組，在蛋雞基礎日糧中添加抗生素(金黴素)80g/t ；C組，在蛋雞基礎日糧中添加糞腸球菌飼料添加劑0. 18%。前7天為預試期，後觀天為試驗期，並按上述分組重複試驗3次，測定雞舍內NH3、 H2S濃度、雞蛋破損率、哈夫單位、產蛋率、蛋重、死淘率、蛋殼光潔度、抗體水平等指標。結果列於表(1)表1對蛋雞生產性能、蛋白質、死淘率的影響
權利要求
1.一株糞腸球菌(Enterococcus faecal i s)，保藏編號為 CGMCC No. 5092。
2.權利要求1所述的糞腸球菌，其特徵在於該菌16sRNA基因序列如SEQID No 1所示。
3.權利要求1所述的糞腸球菌在製備飼料添加劑中的應用。
4.權利要求3所述的糞腸球菌在製備飼料添加劑中的應用，其特徵在於所述的飼料添加劑主要應用於禽畜或水產養殖飼料中，飼料中糞腸球菌的活菌數為106-108cfu/g。
5.一種包含權1所述的糞腸球菌的飼料添加劑，其特徵在於飼料添加劑中糞腸球菌的活菌數為 109-101QCfU/g。
6.權利要求1所述的糞腸球菌在製備發酵劑中的應用。
7.權利要求6所述的糞腸球菌在製備發酵劑中的應用，其特徵在於所述的發酵劑為用於豆粕、棉粕、青草和/或玉米秸稈的發酵劑，發酵劑加入豆粕、棉粕、青草和/或玉米秸稈後的活菌數為106-107cfu/g。
8.一種包含權1所述的糞腸球菌的發酵劑，其特徵在於發酵劑中糞腸球菌的活菌數為 108-10lclcfu/g。
全文摘要
本發明屬於生物技術領域，涉及一株糞腸球菌(Enterococcus faecalis)及其應用與其飼料添加劑和發酵劑。本發明的糞腸球菌具有良好的抗逆性功能和益生功能可以在保護劑保護下對其進行高溫乾燥、也可耐受90℃制粒溫度；對大腸桿菌k88、k99和金黃葡萄球菌有較強的抑制作用，產酸和纖維素酶的能力很強，可以降低pH值和分解一些纖維素。用本發明的糞腸球菌製備的生物飼料添加劑在禽畜、水產養殖中可以替代部分抗生素，減少抗生素的使用，提高動物的免疫力，提高飼料的轉化率，提高養殖效益。本發明的糞腸球菌也可用於豆粕、棉粕、青草等的發酵，可以有效防止飼料黴變，提高飼料中營養的利用率。
文檔編號C12N1/20GK102517227SQ20111037822
公開日2012年6月27日 申請日期2011年11月24日 優先權日2011年11月24日
發明者付維來, 劉婷, 杜建濤, 王麗英, 王安如, 王松 申請人:內蒙古四季春飼料有限公司, 北京大北農科技集團股份有限公司, 北京科高大北農飼料有限責任公司