含hsp70啟動子和gfp的四膜蟲轉基因載體及製備方法和應用的製作方法

2023-12-10 06:24:42 2

專利名稱：：含hsp70啟動子和gfp的四膜蟲轉基因載體及製備方法和應用的製作方法
技術領域：
：本發明屬於生物
技術領域：
，具體涉及一種含HSP70啟動子和GFP的四膜蟲轉基因載體，同時還涉及含HSP70啟動子和GFP的四膜蟲轉基因載體的製備方法，還涉及含HSP70啟動子和GFP的四膜蟲轉基因載體在快速且高通量檢測三丁基錫中的應用。
背景技術：
：熱休克蛋白(heatshockprotein,HSP)是生物適應環境溫度或應激變化的一個重要媒介分子，過高或過低的溫度都會誘導細胞或機體產生應激反應，迅速合成HSP作為分子伴侶參與蛋白質的合成、摺疊、裝配、運轉和降解等過程，以維持細胞蛋白自穩，提高細胞對應激源的耐受性，增強抗氧化作用，使細胞維持正常的生理功能。熱休克蛋白70(Hsp70)是HSP家族的主要一員，它是細胞在應激條件下的主要表達產物，用HSP70啟動子作為調控外源基因表達的啟動子，有利於啟動外源基因的表達，並可通過應激對外源基因的轉錄進行調控(BukauB，HorwichAL.TheHsp70andHsp60chaperonemachines.Cell.1998.92(3):351-366;S0rensenJQKristensenTN,LoeschckeV.Theevolutionaryandecologicalroleofheatshockproteins.EcolLett.2003，6(11):1025-1037;陳全，朱道銀，駱旭東，蔣英，江山。用結核分枝桿菌HSP70啟動子構建分枝桿菌穿梭表達質粒的研究。重慶醫科大學學報。2003，28(6):697-700;馮立芳，繆煒。不同緯度螅狀獨縮蟲耐熱能力及Hsp70m認A表達水平的比較。動物學報。2008，54(3):525-530。)。綠色螢光蛋白(Greenfluorescenceprotein,GFP)是從水母中分離出來的一種發光蛋白，以它作為標記蛋白具有諸多優點檢測方便，用螢光顯微鏡或激發光源即可觀察；螢光穩定，無光漂白現象，能耐受長時間的光照，在很大pH值範圍內(712)均正常發光；靈敏度高；對受體細胞基本無毒害；不受假陽性幹擾，四膜蟲本身不含有GFP，故不會出現假陽性結果；不需任何反應底物和輔助因子參與；可製成永久標本；分子量小，與其它基因的融合表達載體在真核細胞中所表達的融合蛋白具有目的基因和綠色螢光蛋白的雙重活性，從GFP的螢光強度即能準確反映基因的表達水平，同時還能對目的基因進行亞細胞定位分析(TsienRY.Thegreenfluorescentprotein.AnnuRevBiochem.1998,67:509-544;王曉麗，邵衛星，單虎。綠色螢光蛋白研究進展。動物醫學進展。2008,29(1):56-59。)。四膜蟲(7^ra/^me"a)是一種營自由生活的單細胞真核生物，隸屬於原生動物中的纖毛門寡毛綱膜口目，廣泛分布於全球各地的淡水環境中。四膜蟲作為第一種實現細胞同步化的真核生物可以進行無菌純培養，而且生長快(2—2.5小時繁殖一代)；比較基因組的研究也顯示嗜熱四膜蟲較酵母等模式生物和人類具有更高程度的功能保守性；加之四膜蟲中已建立了成熟的基因操作技術，是毒理學與生態毒理學研究中的優良模式生物(TurkewitzAP,OriasE,KaplerG.Functionalgenomics:thecoiningofageforre&a/^附ewa^zerwop/n7a.TrendsGenet.2002,18(1):35-40;CoollinsK,GorovskyMA.Tetrahymenathermophila.CurrBiol.32005，15(外R317-318;傅誠傑，俞婷，繆煒，沈韞芬。四膜蟲毒理學與生態毒理學研究中的優良模式生物。動物學雜誌。2005,40(1):108-113。)。丁基錫化合物作為添加劑廣泛用於聚氯乙稀穩定劑、工業催化劑、農業殺蟲劑、木材防腐劑等，尤其是自20世紀60年代以來，大規模用於船舶的防汙塗料以防止海洋生物對船舶的吸附。然而，丁基錫化合物是有毒化合物，會危害水生態系統，其中以三丁基錫(Tributyltin,TBT)的毒性為最大。TBT浸溶於水中後通過遺傳毒性、細胞毒性、神經毒性、致畸、免疫抑制、內分泌紊亂等危害貝類、蛤類、水蚯蚓、海星、魚類等水生生物，並進入食物鏈進而影響到其它生物(HochM.Organotincompoundsintheenvironment—anoverview.ApplGeochem.2001,16(7-8):719-743;Antizar-LadislaoB.Environmentallevels,toxicityandhumanexposuretotributyltin(TBT)_contaminatedmarineenvironment.Areview.EnvironInt.2008,34(2):292-308.)。目前，不少發達國家已經禁止或限制小型船舶(<25m)使用TBT作為船舶防汙劑，但港口、造船廠等船隻活動頻繁的水域，TBT的含量仍然較高；此外，諸多發展中國家還沒有限制使用TBT，在江河湖泊中可檢測到高濃度TBT的存在(CaoDD,JiangGB，ZhouQF,YangRQ.OrganotinpollutioninChina:anoverviewofthecurrentstateandpotentialhealthrisk.JEnvironmanage.2009,90(suppl1):SI6隱24;KotriklaA.EnvironmentalmanagementaspectsforTBTantifoulingwastesfromtheshipyards.JEnvironmanage.2009,90(suppl1):S77-85.)。所以，水體中TBT的檢測非常重要，在快速、高通量檢測方面顯得尤為迫切(FengLF,MiaoW，WuYX.Differentiallyexpressedgenesofinresponsetotributyltin(TBT)identifiedbysuppressionsubtractivehybridizationandrealtimequantitativePCR.AquatToxicol.2007，81(1):99-105.)。Blechinger等、Seok等利用HSP70基因5'端順式調控序列作為啟動子，以GFP為報告基因而構建的載體，在轉染高等生物斑馬魚體內的應用己有報導(BlechingerSR,WarrenJT,K麗adaJY,KronePH.Developmentaltoxicologyofcadmiuminlivingembryosofastabletransgeniczebrafishline.EnvironHealthPersp.2002,110(10):1041-1046;SeokSH,BaekMW,LeeHY,KimDJ,NaYR,NohKJ,ParkSH,LeeHK,LeeBH,RyuDY，ParkJH.QuantitativeGFPfluorescenceasanindicatorofarsenitedevelopmentaltoxicityinmosaicheatshockprotein70transgeniczebrafish.ToxicolApplPharm.2007,225(2):154-161.)。但構建的載體轉染生物體技術複雜、成功率低，具體應用到環境汙染檢測方面難度大。Bartos等以GFP為報告基因而構建的載體轉染低等生物酵母體內應用於環境汙染檢測也已有報導(BartosT,LetzschS,SkarekM,FlegrovaZ,CuprP,HoloubekI.GFPassayasasensitiveeukaryoticscreeningmodeltodetecttoxicandgenotoxicactivityofazaarenes.EnvironToxicol.2006,21(4):343-348.)。但構建的載體啟動子效率低，對有些化合物的檢測靈敏度不夠高。最近，有關外源基因導入四膜蟲體內技術的運用日益成熟，如Gaertig等、Barchetta等通過電穿孔技術將外源基因整合到四膜蟲rDNA上，使得外源基因在四膜蟲體內得到了大量的倍增(GaertigJ,KaplerG.TransientandstableDNAtransformationof7fe"a/y;me"af/zermop/H7abyelectroporation.MethodCellBiol:re^a/^OTewa^zerwop/zf/a.Academicpress.2000,vol62:485-500;BarchettaS,LaTerzaA,BallariniP,PucciarelliS,MiceliC.Combinationoftworegulatoryelementsinthere/ra/y;wewa^zerwop/n7agenecontrolsheatshockactivation.EukaryotCell.2008,7(2):379-386.)。因此，構建能高效穩定表達、轉染生物體的4操作技術簡單、成功率高的含HSP70啟動子和GFP的四膜蟲轉基因載體用於環境中三丁基錫(Tributyltin，TBT)的檢測具有重要的應用價值。
發明內容本發明的目的是在於提供了一種含HSP70啟動子和GFP的四膜蟲轉基因載體HSP702-GFP-pD5H8。該載體上含有的四膜蟲HS屍70-2基因啟動子HSP70-25'UTR是一個強啟動子，以實現她基因的高效表達；該載體上含有可替換的外源基因她，通過替換不同的外源基因，以實現四膜蟲成為一個外源基因表達系統；在巴龍黴素藥物篩選作用下，該載體替換掉四膜蟲體內原有的絕大部分rDNA，使外源基因在四膜蟲體內大量倍增，以實現目標基因的遺傳轉化。本發明的另一個目的是在於提供了一種含HSP70啟動子和GFP的四膜蟲轉基因載體HSP702-GFP-pD5H8的製備方法，方法簡便易行，實驗操作方便。本發明的再一個目的是在於提供了一種含HSP70啟動子和GFP的四膜蟲轉基因載體HSP702-GFP-pD5H8在汙染物三丁基錫檢測中的應用，將含HSP70啟動子和GFP的四膜蟲轉基因載體HSP702-GFP-pD5H8在轉染進四膜蟲中後用於TBT的檢測，而且檢測結果具有高度的可信性和可重複性。為了達到上述目的，本發明採用如下技術措施本發明所述的載體HSP702-GFP-pD5H8是一種/KP70-2基因啟動子驅動她基因的四膜蟲轉基因表達載體。四膜蟲的HSP70-2基因啟動子是一個強啟動子，能高效啟動下遊基因的表達。以39'C熱激和50嗎/L濃度的TBT處理條件下的四膜蟲cDNA為模板，採用實時定量PCR方法比較嗜熱四膜蟲HSP70-2基因與目前已報導嗜熱四膜蟲/ZS屍70-7基因(BarchettaS，LaTerzaA，BallariniP,PucciarelliS,MiceliC.Combinationoftworegulatoryelementsinther"ra^ynte加genecontrolsheatshockactivation,EukaryotCell.2008,7(2):379-386.)，發現無論在熱激還是TBT處理條件下，基因的相對表達量更高，如圖6所示，相應的HSiV0-2基因的啟動子效率也更高，對TBT的響應更敏感。基於此，本發明所述的載體HSP702-GFP-pD5H8上含有的四膜蟲//SP70-2基因啟動子是一個強啟動子，能夠實現g步基因的高效表達和對TBT的迅速響應。本發明所述的載體HSP702-GFP-pD5H8上含有的外源基因她是個可替換的外源基因。由於載體HSP702-GFP-pD5H8上含有多個Sflw/n與WoI酶切位點，不適合直接酶切替換，而質粒HSP702-GFP(本發明所構，見圖3)上僅含1個與1個，oI酶切位點。首先將擬研究對象外源基因X(可在四膜蟲體內表達的任何無毒外源基因)經PCR擴增，在其起始密碼子ATG前加上^wz//I酶切位點，在其終止密碼子TGA後加上I酶切位點。接著經5aw/H+，oI酶切將質粒HSP702-GFP上的外源基因她替換為擬研究對象——外源基因X,得到質粒HSP702-X。然後將質粒HSP702-X經AWI酶切後插入到pD5H8載體(GaertigJ，GorovskyMA.Efficientmasstransformationofrwra/2，e"a/7ze7wo/7/n7flbyelectroporationofconjugants.ProcNatlAcadSciUSA.1992,89(19):9196-9200.)上唯一的iVwI酶切位點，構成所需質粒HSP702-X-pD5H8(具體操作過程可參考本發明中所述表達載體HSP702-GFP-pD5H8的構建方法)。最後用電穿孔法轉染所構質粒HSP702-X-pD5H8到四膜蟲體內，便使四膜蟲成為一個表達外源基因X的表達系統。將所述的載體HSP702-GFP-pD5H8通過電穿孔法轉染到四膜蟲體內後，在巴龍黴素藥物篩選作用下，使得外源基因她在四膜蟲體內拷貝數大量倍增。以7&基因代表四膜蟲體內本身具有的rDNA拷貝數(KarrerKM.7^ra/^膨""genetics:twonucleiarebetterthanone.MethodCellBiol:7fe加/z戸ewaAerwopMa.Academicpress.2000,vol62:138-140.)，以妳基因代表轉染質粒HSP702-GFP-pD5H8在四膜蟲體內的拷貝數。用實時定量PCR方法比較四膜蟲7&基因與她基因的相對數量，即可推算出四膜蟲體內rDNA與質粒HSP702-GFP-pD5H8的拷貝數(詳見7)。如圖7所示，在巴龍黴素藥物篩選作用下，四膜蟲的絕大部分rDNA被替換掉，只剩下約550個拷貝；質粒HSP702-GFP-pD5H8則大量倍增，高達約8450個拷貝，也就是說，外源基因她在四膜蟲體內拷貝數達到約8450個拷貝，實現了目標基因的遺傳轉化。構建一種含HSP70啟動子和GFP的四膜蟲轉基因載體HSP702-GFP-pD5H8的具體實驗技術參考J.薩姆布魯克與D.W.拉塞爾著的《分子克隆實驗指南》(黃培堂等譯，2002年8月第三版，北京科學出版社)。本發明中所用限制性內切酶均購買自TOYOBO公司、Biospin膠回收試劑盒購買自BioFlux公司、質粒DNA小量提取試劑盒購買自BioFlux公司、pGEM-T載體購買自Promega公司、DNA聚合酶購買自BDBiosciences公司、T4連接酶購買自NewEnglandBiolabs公司、熱敏磷酸酶購買自NewEnglandBiolabs公司、轉化用大腸桿菌五.co//DH5a購買自天根生化公司、DNA分子量標記Marker均購買自天根生化公司、瓊脂糖購買自Biowest公司、TBT購買自AcrosOrganic公司、所有離心管、吸頭均購買自Axygen公司、所用引物均由武漢鼎國生物技術有限公司合成，所有測序均由聯合基因上海聯眾基因研究院完成。本發明所用嗜熱四膜蟲(7^ra/^me朋,Zze，opM")SB210株系信息參考Eisen等(EisenJA,CoyneRS,WuM,WuD,ThiagarajanM,WortmanJR,BadgerJH,RenQ，AmedeoP,JonesKM,TallonLJ,DelcherAL,SalzbergSL，SilvaJG，HaasBJ,MajorosWH,FarzadM,GarltonJM,SmithRKJr,GargJ,PearlmanRE,KarrerKM,SunL,ManningG,EldeNC,TurkewitzAP,AsaiDJ,WilkesDE,WangY,CaiH,CollinsK，StewartBA，LeeSR,WilamowskaK,WeinbergZ,RuzzoWL,WlogaD,GaertigJ,FrankelJ，TsaoCC,GorovskyMA,KeelingPJ,WallerRF,PatronNJ，CherryJM,StoverNA，KriegerCJ，delToroC，RyderHF,WilliamsonSC,BarbeauRA，HamiltonEP,OriasE.Macronucleargenomesequenceoftheciliater"ra/z，e朋^zewzo/j/zz'/a,amodeleukaryote.PlosBiol.2006,4(9):e286.)，質粒rDNA-GFP信息參考Barchetta等(BarchettaS,LaTerzaA,BallariniP，PucciarelliS,MiceliC.Combinationoftworegulatoryelementsintherefra/i戸ena決ermo;MaHSP70-_/genecontrolsheatshockactivation.EukaryotCell.2008，7(2):379-386.)，質粒pD5H8信息參考Gaertig等(GaertigJ,GorovskyMA.Efficientmasstransformationof7fe/m/，e朋Ae^wop/z//"byelectroporationofconjugants.ProcNatlAcadSciUSA.1992,89(19):9196-9200.)。一種含HSP70啟動子和GFP的四膜蟲轉基因載體HSP702-GFP-pD5H8的構建方法，包括如下步驟A、將質粒rDNA-GFP經M/I酶切，然後回收2.1kbDNA小片段，得到HSP70誦15'UTR-GFP-HSP70-13'UTR;B、將HSP70-15'UTR-GFP-HSP70-13'UTR經酶切，然後回收1.2kbDNA片段，得到GFP-HSP70-13'UTR，兩端酶切位點為5gHI與;C、合成PCR擴增嗜熱四膜蟲SC戶2基因啟動子的引物，其序列如下6上遊引物5'國GCGGCCGCTGTTGAAATGCCTTGCTTGT-3'(下劃線為wwi酶切位點)下遊引物5'-AGATCCAACGGCGAAGTGGTAAACAG-3'(下劃線為Bg/II酶切位點)；D、以嗜熱四膜蟲基因組DNA為模板，用上述引物擴增得到的SC屍2基因啟動子片段與pGEM-T載體連接，得到質粒T-SCP2;E、將質粒T-SCP2經Sg/II+A^1酶切，然後回收大片段，其長度為3kb;F、將步驟B中回收得到的1.2kbDNA片段GFP-HSP70-13'UTR與步驟E中回收得到的3kbDNA片段連接，得到質粒GFP-BglII，克隆示意過程見圖1(質粒rDNA-GFP經WWI酶切得到片段HSP70-15'UTR-GFP-HSP70-13'UTR，片段HSP70-15'UTR-GFP-HSP70-13'UTR經Sg/II酶切得到片段GFP-HSP70-13'UTR;PCR擴增得到SC屍2基因啟動子片段，接著與PGEM-T載體連接得到質粒T-SCP2，質粒T-SCP2經Sg/II+iVWI酶切後與片段GFP-HSP70-13'UTR連接得到質粒GFP-BglII);G、合成PCR擴增步驟F中得到質粒GFP-BglII的引物，以修改5g/II酶切位點變為Sam//1酶切位點，其序列如下上遊引物5'-GGATCCATGAGTAAAGGAGAAGAACT-3':(下劃線為5"w/n酶切位點)下遊引物5'-TAGAATACTCAAGCTATGCATCCAAC-3';H、以步驟F中得到質粒GFP-BgUI為模板，用上述引物擴增得到片段GFP-BamHI，其一端含有5am/H酶切位點，將該片段與pGEM-T載體連接，得到質粒T-GFP，克隆示意過程見圖2(質粒GFP-BglII經PCR擴增得到片段GFP-BamHI，接著與pGEM-T載體連接得到質粒T-GFP);I、將步驟H中的質粒T-GFP經5am/H+S^zI酶切，然後回收小片段，其長度為1306bp;J、合成PCR擴增嗜熱四膜蟲/ffi屍70-2基因啟動子的引物，其序列如下上遊引鬥勿5'-GCGGCCGCAATTGTTCTTGCTTGTTTTGG-3'(下劃線為A^I酶切位點)下遊引物5'-GGATCCAGCTTTTTATTTTCCAGACAT-3'(下戈(J線為^Brnn//1酶切位點)；K、以嗜熱四膜蟲基因組DNA為模板，用上述引物擴增得到的HS屍70-2基因啟動子片段與pGEM-T載體連接，得到質粒T-HSP702;L、將質粒T-HSP702經S"w/fl十印/7l酶切，然後回收大片段，其長度為4132bp;M、將步驟I中回收得到的小片段與第L步中回收得到的大片段連接，得到質粒HSP702-GFP，對質粒HSP702-GFP進行測序，得到HSP70-25'UTR-GFP-HSP70-13'UTR片段(圖3中HSP702-GFP載體圖的HSP70國25'UTR部分、GFP部分、HSP70-13'UTR部分)的序列為SEQIDNO.l所示的核苷酸序列，克隆示意過程見圖3(PCR擴增得到/ZSP70-2基因啟動子片段，接著與pGEM-T載體連接得到質粒T-HSP702;質粒T-HSP702與質粒T-GFP分別經Sam/H+5^/I酶切後連接，得到質粒HSP702-GFP);N、將步驟M中得到質粒HSP702-GFP經A/ofI酶切，然後回收含HSP70-25'UTR-GFP-HSP70-13'UTR的小片段，其長度為2341bp，酶切結果見圖5中的泳道"1"(質粒HSP702-GFP經mfi酶切所得電泳結果)；0、將質粒pD5H8經a^i酶切，回收長度為13839bp的大片段，酶切結果見圖5中的泳道"2"(質粒pD5H8經iVwI酶切所得電泳結果)，並用熱敏磷酸酶對該回收大片段進行去磷酸化處理；P、將步驟N中回收得到的小片段與第O步中經去磷酸化酶處理後得到的大片段連接，得到所述表達載體HSP702-GFP-pD5H8，克隆示意過程見圖4(質粒HSP702-GFP與質粒pD5H8經WWI酶切後連接，得到質粒HSP702-GFP-pD5H8)。將質粒HSP702-GFP-pD5H8經Mj/i酶切鑑定，得到約2.3kb與14kb的兩個片段，酶切結果見圖5中的泳道"3"(質粒HSP702-GFP-pD5H8經m^I酶切所得電泳結果)，表明載體構建正確。用此載體轉化大腸桿菌五.co/!'DH5a感受態細胞，用於其增殖和一70°C加甘油保藏。本發明提供了一種含HSP70啟動子和GFP的四膜蟲轉基因載體HSP702-GFP-pD5H8，將四膜蟲熱休克蛋白70啟動子、編碼綠色螢光蛋白的基因她、四膜蟲熱休克蛋白70終止子連接進嗜熱四膜蟲的rDNA載體pD5H8中，連入的三部分序列HSP70-25'UTR-GFP-HSP70-13'UTR為SEQIDNO.l所示的核苷酸序列。這些序列由聯合基因上海聯眾基因研究院經2次測序確認。HSP70-25'UTR-GFP-HSP70-13'UTR全長2341bp，具體位置信息描述如下awi酶切位點為1-8和2334-2341;5ami/1酶切位點為1127-1132;屈ol酶切位點為1850-1855;HS戶70-2基因啟動子(HSP70-25'UTR):9-1126;她基因起始密碼子(ATG):1133-1135;終止密碼子(TGA):1847-1849;i/S/V0-7基因終止信號(HSP70-13'UTR):1850-2333。將本發明的表達載體HSP702-GFP-pD5H8，經電穿孔法轉染到四膜蟲體內，然後將轉染過的四膜蟲暴露在一定濃度範圍的TBT環境中(lpg/L至100pg/L)，通過觀察四膜蟲細胞螢光強度的大小，以確定環境TBT濃度的高低，這在檢測水環境中TBT的汙染具有重要的應用價值。本發明中所用不同交配型的野生型嗜熱四膜蟲(refra^me朋B2086與CU428株系信息參考Hamilton與Orias(HamiltonEP,OriasE.Geneticcrosses:settingupcrosses,testingprogeny,andisolatingphenotypicassortants.MethodCellBiol:refra/y/mena^zerwop/zz'/a.Academicpress.2000，vol62:219-228.);SPP培養基配方參考Orias等(OriasE，HamiltonEP,OriasJD.7e加/戸e朋asalaboratoryorganism:usefUlstrains,cellculture,andcelllinemaintenance.MethodCellBiol:re&a/zywewaAerwop/n'/a.Academicpress.2000.vol62:194.);四膜蟲細胞的固定、計數方法參考章宗涉、黃祥飛編著的《淡水浮遊生物研究方法》(北京科學出版社。1991:334-339。);電穿孔技術方法參考Gaertig等(GaertigJ,KaplerG.TransientandstableDNAtransformationof7^ra/z，e朋f/zez-wop/zZ/abyelectroporation.MethodCellBiol:7fefr"a/2ymewaAermop/n'Za.Academicpress.2000，vol62:485-500.);TBT溶液配製方法參考Feng等(FengLF,MiaoW,WuYX.Differentiallyexpressedgenesofinresponsetotributyltin(TBT)identifiedbysuppressionsubtractivehybridizationandrealtimequantitativePCR.AquatToxicol.2007,81(1):99-105.);圖像分析軟體Image-ProPlus6.0使用方法參考MediaCybernetics公司編寫的《Image-ProPlusv6.0(forwindows)快速入門指南》。載體HSP702-GFP-pD5H8轉染進四膜蟲用於TBT檢測中的應用基本操作步驟如下-.(1)載體HSP702-GFP-pD5H8經電穿孔法轉染到四膜蟲體內。A.將不同交配型的野生型嗜熱四膜蟲(7^ra/^we朋Amop/7fl)B2086與CU428株系分別在50mlSPP培養基中培養，直至密度長到3X105個/ml。B.用10mMpH7.530'C溫育的Tris緩衝液(上海三浦化工有限公司產品)洗滌四膜蟲2次。C.用10mMpH7.5的Tris緩衝液調整細胞密度至3X105個/ml，並於30°C水浴中溫育2小時。D.將B2086與CU428按1:1細胞數目比例在2L容量的錐形瓶內混合，並於30'C水浴搖床160rpm振蕩18小時。E.停止振蕩10小時後，取15ml配對四膜蟲(4X1(^個細胞)用10mMpH7.530。C溫育的Hepes緩衝液(Sigma公司產品)清洗四膜蟲一次，並富集至125W。F.將富集的125pi四膜蟲與50嗎相同體積的30'C溫育的質粒HSP702-GFP-pD5H8混勻，並迅速轉移到3(TC溫育的0.2cm電擊杯(Bio-Rad公司產品)中，用Bio-Rad電穿孔儀進行電擊，電擊參數為300V,25pF,5(b，電擊後的電擊杯於室溫(20-25°C，以下相同)靜置1min。(2)轉染後四膜蟲的培養及篩選A.將電擊後的四膜蟲轉移到24mlSPP培養基中，於3(TC恆溫箱靜置2小時，然後均勻分裝到24孔一次性培養皿(CellStar公司產品)。B.電擊1216小時後向24孔培養皿內加巴龍黴素(Sigma公司產品)，使每孔內的巴龍黴素濃度達到100pg/ml。C.電擊後第3天，將長勢良好的四膜蟲轉移至新的24孔一次性培養皿中，並將巴龍黴素濃度提高至200^g/ml。此後每天增加的巴龍黴素濃度梯度為200(xg/ml，直至1000pg/ml。D.從1000嗎/ml巴龍黴素濃度下長勢良好的四膜蟲培養液中挑取單個四膜蟲細胞到96孔一次性培養皿(CellStar公司產品)中。E.單細胞挑選3天後，從96孔一次性培養皿內選取長勢良好的四膜蟲轉移到含有2mlSPP培養基的24孔一次性培養皿中3(TC恆溫培養，保持培養基內巴龍黴素濃度為1000ng/ml。F.待24孔一次性培養皿中四膜蟲長到對數期時，加入TBT至終濃為50Hg/L，處理1小時。G.處理四膜蟲用ZEISS顯微鏡(ZeissAxioplan2imaging顯微成像系統)在藍色激發光下(濾光片FITC)對誘導的四膜蟲進行螢光檢測，四膜蟲發出強烈的綠色螢光，則相應的96孔一次性培養皿內篩選到的四膜蟲轉染成功，四膜蟲的rDNA上含有HSP702-GFP-pD5H8片段。(3)轉染的四膜蟲在TBT檢測中的應用。A.將轉染成功的四膜蟲轉接至裝有50mlSPP培養基的錐形瓶中於3(TC培養，巴龍黴素濃度為1000嗎/ml。B.待四膜蟲密度長至3Xl5個/ml，取2ml四膜蟲於24孔一次性培養皿中，共取4孑L，並在每孔內加入不同濃度的TBT(1嗎/L,15嗎/L,50pg/L,100昭/L)溶液，處理1小時。C.取TBT處理後的1ml四膜蟲富集至50^，離心條件為1500rpm、30。C、2min，然後用ZEISS顯微鏡在藍色激發光下(濾光片FITC)對誘導的四膜蟲進行螢光觀察，並用ZEISS顯微鏡配套的數碼成像系統拍照記錄，照片保存格式選用TIF,如圖8所示。D.為方便高效地評估四膜蟲在TBT處理條件下所產生的綠色螢光強度，申請人:用圖像分析軟體Image-ProPlus6.0(MediaCybernetics公司產品)計算所拍照片上四膜蟲產生綠色螢光強度的光密度值，一個四膜蟲產生的綠色螢光強度計為一個光密度值。用SPSS13.0統計4個濃度的TBT處理條件下四膜蟲產生的平均光密度值(表l)，其中Mean表示平均光密度值，N表示某一濃度TBT處理條件下拍照記錄的四膜蟲個數，Std.Deviation表示樣本均數標準差。tableseeoriginaldocumentpage10E.從表1中，可以看出隨著TBT濃度的升高，四膜蟲產生的光密度值也隨之增加，提示我們，TBT濃度與光密度值間存在某種相關性。將TBT濃度與每個四膜蟲產生的光密度值之間用SPSS13.0進行相關性分析，結果如表2所示。tableseeoriginaldocumentpage10F.從表2中，可知TBT濃度與光密度值是顯著相關的，可進一步做回歸分析。以不同濃度的TBT為自變量，在不同濃度的TBT處理條件下四膜蟲產生的光密度值為因變量，用SPSS13.0計算光密度值與TBT濃度之間的關係。在多次實驗中，申請人都模擬出了TBT濃度與光密度值間關聯度很好的線性關係。以圖9為例(所用數據為表l中的764個光密度值)R2=0.805，說明TBT濃度對四膜蟲產生綠色螢光強度的光密度值的解釋力度達到80.5%;1.320462991774e-272<0.01，說明TBT濃度與光密度值的關係是為Y-41"X+255。此結果證明了在不同批次的實驗中，轉染四膜蟲產生的綠色螢光強度與TBT的濃度間存在著線性關係，且結果可信、重複性高，能夠快速、高通量檢測一定濃度範圍的TBT。綜上所述，所述表達載體HSP702-GFP-pD5H8上含有四膜蟲i/5P70-2基因啟動子序列、她基因、與四膜蟲rDNA序列高度相似的pD5H8載體序列，具有如下特徵(1)表達載體HSP702-GFP-pD5H8上含有高效表達啟動子。四膜蟲//SiV6W基因啟動子是一個強啟動子，能高效啟動下遊基因的表達。與現已報導的四膜蟲基因相比，在熱激和TBT處理條件下，效率分別高1.9倍與1.5倍(見圖6)，實現她基因的大量表達。(2)該載體上含有可替換的外源基因她，通過替換不同的外源基因，以實現四膜蟲作為一個外源基因表達系統；(3)在巴龍黴素藥物篩選作用下，表達載體HSP702-GFP-pD5H8替換掉四膜蟲體內原有的絕大部分rDNA(見圖7),使外源基因在四膜蟲體內大量倍增，高達8450個拷貝，實現目標基因的遺傳轉化。本發明所述的載體HSP702-GFP-pD5H8經電穿孔法轉染到四膜蟲體內後用於檢測環境中TBT的方法與現有技術相比具有以下優點(1)只需將表達載體HSP702-GFP-pD5H8經電穿孔法轉染到四膜蟲體內即可。(2)將轉染後的四膜蟲暴露在1嗎/L至100ng/L濃度範圍的TBT環境中，通過觀察四膜蟲細胞的螢光強度，可確定環境中TBT濃度的高低，並且TBT濃度與光密度值間具有關聯度很好的線性關係。(3)暴露於TBT的每一個四膜蟲產生的綠色螢光都被用來計算各個光密度值，因此基於光密度值所反映的環境中TBT濃度具有高度的可信性和可重複性。(4)由於檢測綠色螢光蛋白不需要破碎細胞，因此使用該法可對環境樣品進行實時檢測。(5)相比化學分析法和免疫學法，該法檢測簡便、快速、費用低，以及可以高通量操作，更能準確反應TBT對生物機體的影響。下面結合附圖對本發明的具體實施方式作進一步的詳細說明。圖1為質粒GFP-BglII構建示意圖。圖2為質粒T-GFP構建示意圖。圖3為質粒HSP702-GFP構建示意圖。圖4為質粒HSP702-GFP-pD5H8構建示意圖。圖5為質粒HSP702-GFP-pD5H8用iVWI酶切結果。其中，Ml:DNA分子標記，條帶從大到小分別為7000、5500、3500、2000、1000、500bp;1:質粒HSP702-GFP被WWI酶切；2:質粒pD5H8被WWI酶切；3:質粒HSP702-GFP-pD5H8被M/1酶切；M2:DNA分子標記，條帶從大到小分別為15000、10000、7500、5000、2500、1000、250bp。圖6為用實時定量PCR方法比較ZffiiV0-7基因與//SiV0-2基因分別在39°C熱激與50昭/L濃度的TBT處理條件下的相對表達量。將四膜蟲分別在39'C熱激與50嗎/L濃度的TBT條件下處理1小時，然後用Trizol試劑(Invitrogen公司產品)分別抽提總RNA，接著用反轉錄試劑盒(Promega公司產品)將總RNA11逆轉錄為cDNA(具體操作步驟參考FengLF,MiaoW，WuYX.Differentiallyexpressedgenesofinresponsetotributyltin(TBT)identifiedbysuppressionsubtractivehybridizationandrealtimequantitativePCR.AquatToxicol.2007,81(1):99-105.)。根據嗜熱四膜蟲基因組資料庫(TetrahymenaGenomeDatabase,http:〃www,ciliate.org/)提供的全基因組序列，用軟體PrimerPremier5.0分別設計嗜熱四膜蟲HS屍70-2基因引物hsp702-F:5'-ATCTTGGTTGATGTCACTCCTC-3';hsp702-R:5'-TTCATCCTCAGCCTTGTATTAT隱3';與/^屍70-/基因引物hsp701-F:5'-AGATAATGGAGGAACTTCTACTGA-3';hsp701-R:5'-AAGGTCTTTAGCACTCACATTTA-3'。以上述2個處理條件下的cDNA為模板，用ifSTVO-/基因與Z^P70-2基因特異引物分別進行擴增，採用實時定量PCR方法(PfafflMW,HorganGW,DempfleL.Relativeexpressionsoftwaretool(REST)forgroup-wisecomparisonandstatisticalanalysisofrelativeexpressionresultsinreal-timePCR.NucleicAcidsRes.2002,30(9):e36.)分析這兩個基因在不同處理條件下各自的相對表達量。發現7f57V0-2基因較基因在熱激和TBT處理條件下的相對表達量分別高1.9倍與1.5倍，說明//SP70-2基因的啟動子效率更高，對TBT的響應更敏感，能夠實現她基因的高效表達，為後面應用GFP發光指示環境中TBT濃度高低打下了堅實的基礎。圖7為四膜蟲本身具有的rDNA與轉染進四膜蟲的質粒HSP702-GFP-pD5H8，二者的拷貝數比較。載體pD5H8上含有基因(GaertigJ，GorovskyMA.Efficientmasstransformationofre加/i!，e"fl！//^,//n7abyelectroporationofconjugants.ProcNatlAcadSciUSA.1992,89(19):9196-9200.)，故所構載體HSP702-GFP-pD5H8上同樣也含有7&基因，選用7&基因可代表質粒HSP702-GFP-pD5H8與rDNA的拷貝數之和(KarrerKM.r"ra/zyme"agenetics:twonucleiarebetterthanone.MethodCellBiol:7fe加/z戸e"aAemopMa.Academicpress.2000，vol62:138-140.)，選用她基因可代表質粒HSP702-GFP-pD5H8的拷貝數。通過比較7&基因與她基因之間的相對表達量，可推算出轉染質粒HSP702-GFP-pD5H8在巴龍黴素藥物篩選作用下四膜蟲體內的拷貝數。由於只在同一個樣品內比較不同基因相對表達水平的差異，不需要調整樣品的初始濃度，所以這裡就不需要看家基因來對樣品的濃度進行標準化處理。根據嗜熱四膜蟲基因組資料庫(TetrahymenaGenomeDatabase,http://www.ciliate.org/)提供的全基因組序列和質粒T-GFP測序所得結果(見SEQIDNO.l所示的核苷酸序列)，用軟體PrimerPremier5.0分別設計基因引物18s-F:5'-CCTGGGAAGGTACGGGTAAT-3';18s-R:5'-AAGGTTCACCAGACCATTCG-3';與她基因引物GFP國F:5'國GAAGCGTTCAACTAGCAGACC-3';GFP-R:5'國ATGTGGCTCCTTATCTTACCCTA-3'。以轉染質粒HSP702-GFP-pD5H8的四膜蟲基因組DNA為模板，用實時定量PCR方法得到Ms基因與她基因的相對數量比值為1.13，即rDNA:HSP702-GFP-pD5H8=13:200(拷貝數之比)。已知野生型四膜蟲體內rDNA拷貝數高達9000個，則轉染質粒HSP702-GFP-pD5H8拷貝數與rDNA拷貝數之和也為9000個(TurkewitzAP，OriasE，KaplerG.Functionalgenomics:thecomingofagefor7fe加/z，e"fl[Aefmo;/i"a.TrendsGenet.2002,18(1):35-40.),rDNA與HSP702-GFP-pD5H8的拷貝數分別約為550個與8450個。所以，在巴龍黴素藥物篩選作用下，質粒HSP702-GFP-pD5H8替換了四膜蟲體內絕大部分的rDNA，使得外源基因她在四膜蟲體內拷貝數大量倍增，實現了目標基因的遺傳轉化。圖8a為1嗎/L濃度的TBT處理轉染質粒HSP702-GFP-pD5H8的四膜蟲1小時後，在螢光顯微鏡下觀察到的示意圖；圖8b為15jig/L濃度的TBT處理轉染質粒HSP702-GFP-pD5H8的四膜蟲1小時後，在螢光顯微鏡下觀察到的示意圖；圖8c為50嗎/L濃度的TBT處理轉染質粒HSP702-GFP-pD5H8的四膜蟲1小時後，在螢光顯微鏡下觀察到的示意圖；圖8d為100pg/L濃度的TBT處理轉染質粒HSP702-GFP-pD5H8的四膜蟲1小時後，在螢光顯微鏡下觀察到的示意圖。可以看到，本發明中的載體HSP702-GFP-pD5H8能在四膜蟲體內順利表達出綠色螢光蛋白；而且隨著TBT濃度的增加，螢光信號有增強的趨勢，此結果表明本發明中的載體HSP702-GFP-pD5H8在轉染四膜蟲後所產生的綠色螢光強度與環境中的TBT濃度間存在著正相關關係，這就為後面的用四膜蟲產生的綠色螢光強度反映環境中的TBT打下了基礎。圖9為不同濃度TBT處理條件下四膜蟲產生綠色螢光強度與相應的TBT濃度間的線性關係圖。根據每個濃度(1嗎/L,15嗎/L，50昭/L,100嗎/L)TBT處理條件下四膜蟲產生的綠色螢光強度，用圖像分析軟體Image-ProPlus6.0得到相應的光密度值，一個四膜蟲產生的綠色螢光強度計為一個光密度值。然後以不同濃度的TBT為自變量，在不同濃度TBT處理條件下四膜蟲產生的光密度值為因變量，用SPSS13.0模擬出了TBT濃度與光密度值間關聯度很好的線性關係R2-0.805，說明TBT濃度對四膜蟲產生綠色螢光強度的光密度值的解釋力度達至1」80.5%;p=1.320462991774e-272<0.01,說明TBT濃度與光密度值的關係是為Y=411*X+255。此結果證明基於本發明用轉染質粒HSP702-GFP-pD5H8的四膜蟲反映環境中的TBT具有很高的可信性和可重複性。具體實施例方式下面結合附圖對本發明的具體實施方式作進一步的詳細說明-實施例1:質粒T-GFP構建(1)將質粒rDNA-GFP經WWI在37'C酶切10小時，酶切體系為5pi10XBuffer,10嗎質粒rDNA-GFP，5plA/^I酶，補無菌水至50pl。將酶切產物用1.0%(質量比)瓊脂糖凝膠進行電泳，經電泳分離後，在紫外燈下用刀片切下目的帶，然後用Biospin膠回收試劑盒回收2.1kbDNA小片段(回收過程參考Biospin膠回收試劑盒說明書)，得到HSP70-15'UTR-GFP-HSP70-13'UTR片段。回收的2.1kbDNA小片段再用Sg/II在37。C酶切3小時，酶切體系為510XBuffer，30pl回收的HSP70-15'UTR-GFP-HSP70-13'UTR片段，5^1^Bg/II酶，補無菌水至50(j1。將酶切產物用1.2%(質量比)瓊脂糖凝膠進行電泳，經電泳分離後，在紫外燈下用刀片切下目的帶，然後用Biospin膠回收試劑盒回收1.2kbDNA大片段，此步驟得到GFP-HSP70-13'UTR片段，酶切過程見圖1。(2)(a)根據嗜熱四膜蟲基因組資料庫(TetrahymenaGenomeDatabase,htW/www.ciliate.org/)提供的全基因組序列，用軟體PrimerPremier5.0設計引物。(b)所用引物如下上遊引物5'-GCGGCCGCTGTTGAAATGCCTTGCTTGT-3'，其中GCGGCCGC為iVWI酶切位點；下遊引物5'-AGATCCAACGGCGAAGTGGTAAACAG-3'，其中AGATCC為Sg/II酶切位點。(c)以嗜熱四膜蟲(7fe/ra/y^e"aAmn印MaSB210)基因組DNA為模板，用EppendorfPCR儀擴增出1239bp長度的基因啟動子序列。(d)PCR反應體系組分5pllOXBuffer(含MgCl2),1pidNTP(10mM)，1pi上遊引物(IOpM),1^下遊引物(IOnM),1^DNA，0.5^TITANIUMTaqDNAPolymerase,補雙蒸水至50|il。(e)加樣過程在冰上操作，加完後彈勻管內液體，並短暫離心，然後置於PCR儀中。(f)PCR反應條件94°C變性5min;94°C30s,50°C30s,72°C70s循環35次；72°C延伸10min。(g)用Biospin膠回收試劑盒回收純化目的DNA片段後，與pGEM-T載體16'C過夜連接。(h)連接產物轉化到大腸桿菌DH5a感受態中，在含50pg/ml氨苄青黴素的LB固體培養基上培養16小時。(i)挑取單個菌落轉入含50嗎/ml氨苄青黴素的5mlLB液體培養基，在轉速為200rpm的搖床上，37"培養16小時。(j)用質粒DNA小量提取試劑盒提取構建的新質粒T-SCP2(質粒提取過程參考BioFlux公司的質粒DNA小量提取試劑盒說明書)。(k)質粒T-SCP2經Sg/III雙酶切及I單酶切在37'C反應2小時，電泳鑑定表明質粒T-SCP2構建正確。(1)將經酶切鑑定的T-SCP2質粒送往聯合基因上海聯眾基因研究院測序，測序結果表明SC戶2基因啟動子序列以逆時針方向插入。此步驟得到的質粒T-SCP2含有化/11、AWI、5^zl酶切位點。具體克隆過程見圖1。(3)(a)將步驟(2)中得到的質粒T-SCP2經+iVWI在37'C酶切2小時，酶切產物用1.0%(質量比)瓊脂糖凝膠進行電泳，經電泳分離後，在紫外燈下用刀片切下目的帶，然後用Biospin膠回收試劑盒回收3kbDNA大片段。(b)將步驟(l)中回收得到的1.2kb"GFP-HSP70-13'UTR"DNA片段與步驟(3)中回收得到的3kbDNA大片段按5:1的比例混合，加T4連接酶16'C過夜連接。(c)連接產物轉化到大腸桿菌DH5a感受態中，在含50^g/ml氨苄青黴素的LB固體培養基上培養16小時。(d)然後從中挑取單個菌落轉入含50pg/ml氨苄青黴素的5mlLB液體培養基，在轉速為200rpm的搖床上，37。C培養16小時。(e)用質粒DNA小量提取試劑盒提取構建的新質粒GFP-BglII。(f)質粒GFP-BglII經Sg/III雙酶切及7VWI單酶切，在37'C反應2小時，電泳鑑定表明質粒GFP-BglII構建正確。(g)將經酶切鑑定的GFP-BglII質粒送往聯合基因上海聯眾基因研究院測序，測序結果表明GFP-HSP70-13'UTR序列以順時針方向插入。此步驟得到質粒GFP-BglII內含有GFP-HSP70-13，UTR序列，序列兩端酶切位點為Bg/II與A^1。具體克隆過程見圖l。(4)(a)根據步驟(3)中測序得到的GFP-BglII序列，用軟體PrimerPremier5.0設計引物。(b)所用引物如下上遊引物5'-GGATCCATGAGTAAAGGAGAAGAACT-3'，其中GGATCC為Saw//1酶切位點，用於替換質粒GFP-BglII上的5g/II酶切位點；下遊引物5'-TAGAATACTCAAGCTATGCATCCAAC-3'。(c)以步驟(3)中得到質粒GFP-BglII為模板，用EppendorfPCR儀擴增出1275bp長度的GFP-BamHl序列。(d)PCR反應體系組分5pilOXBuffer(含MgCl2),1pidNTP(10mM)，1^上遊引物(IOpM)，1pi下遊引物(IOnM),1^DNA,0.5^TITANIUMTaqDNAPolymerase,補雙蒸水至50pl。(e)加樣過程在冰上操作，加完後彈勻管內液體，並短暫離心，然後置於PCR儀中。(f)PCR反應條件94°C變性5min;94°C30s，50°C30s，72°C70s循環35次；72°C延伸10min。(g)用Biospin膠回收試劑盒回收純化目的DNA片段GFP-BamHl後，與pGEM-T載體16'C過夜連接。(h)連接產物轉化到大腸桿菌DH5a感受態中，在含50[ig/ml氮苄青黴素的固體培養基上培養16小時。(i)然後從中挑取單個菌落轉入含50pg/ml氨苄青黴素的5mlLB液體培養基，在轉速為200rpm的搖床上，37。C培養16小時。(j)用質粒DNA小量提取試劑盒提取構建的新質粒T-GFP。(k)質粒T-GFP經5aw//1+iVWI雙酶切及AWI單酶切在37。C反應2小時，電泳鑑定表明質粒T-GFP構建正確。(1)將經酶切鑑定的T-GFP質粒送往聯合基因上海聯眾基因研究院測序，測序結果表明GFP-HSP70-13'UTR序列以逆時針方向插入到PGEM-T載體中。此步驟得到的質粒T-GFP含有5"w//I、loI、WWI、S//zI酶切位點。具體克隆過程見圖2。實施例2:質粒T-HSP702構建.-(1)根據嗜熱四膜蟲基因組資料庫(TetmhymenaGenomeDatabase,http:〃www.ciliate.org/)提供的全基因組序列，用軟體PrimerPremier5.0設計iiS7V0-2基因啟動子引物。所用引物如下上遊引物5'-GCGGCC0￡AATTGTTCTTGCTTGTTTTGG國3'，其中^￡0_0￡^^為I酶切位點；下遊引物5'-GGATCCAGCTTTTTATTTTCCAGACAT-3'，其中GGATCC為Sam/n酶切位點。(2)以嗜熱四膜蟲(7^ra/^me朋Aemop/n7aSB210)基因組DNA為模板，用EppendorfPCR儀擴增出1132bp長度的ZffP70-2基因啟動子序列。(3)PCR反應體系組分5^tl10XBuffer(含MgCl2),1dNTP(10mM)，1pi上遊引物(10pM),1^下遊引物(10nM),1nlDNA,0.5piTITANIUMTaqDNAPolymerase,補雙蒸水至50pl。加樣過程在冰上操作，加完後彈勻管內液體，並短暫離心，然後置於PCR儀中。(4)PCR反應條件94°C變性5min;94°C30s,50°C30s,72°C70s循環35次；72°C延伸lOmin。(5)將PCR產物用1.2%(質量比)瓊脂糖凝膠進行電泳，經電泳分離後，在紫外燈下用刀片切下目的帶，用Biospin膠回收試劑盒回收純化目的DNA片段。(6)pGEM-T載體與第(5)步中回收DNA按1:5比例混合，加T4連接酶16'C過夜連接。(7)連接產物轉化到大腸桿菌DH5a感受態中，在含50(ig/ml氨苄青黴素的LB固體培養基上培養16小時。(8)挑取單個菌落轉入含50pg/ml氨苄青黴素的5mlLB液體培養基，在轉速為200rpm的搖床上，37t)培養16小時。(9)用質粒DNA小量提取試劑盒提取構建的新質粒T-HSP702。(10)質粒T-HSP702經Baw//1I雙酶切及Baw/ZI+5^I雙酶切在37'C反應2小時，電泳鑑定表明質粒T-HSP702構建正確。(11)將經酶切鑑定的T-HSP702質粒送往聯合基因上海聯眾基因研究院測序，啟動子序列部分與四膜蟲基因組資料庫提供的序列一致，測序結果表明HSP702啟動子序列以逆時針方向插入到pGEM-T載體中。實施例3:質粒HSP702-GFP構建(1)將實施例2中質粒T-HSP702經萬aw//1十S;^I在37。C酶切2小時，酶切產物用1.2%(質量比)瓊脂糖凝膠進行電泳，經電泳分離後，在紫外燈下用刀片切下目的帶，然後用Biospin膠回收試劑盒回收4.1kbDNA片段。(2)將實施例1中質粒T-GFP經5a/w//1I在37。C酶切2小時，酶切產物用1.2%(質量比)瓊脂糖凝膠進行電泳，經電泳分離後，在紫外燈下用刀片切下目的帶，然後用Biospin膠回收試劑盒回收1.2kbDNA小片段。(3)將步驟(1)中回收的4.1kb大片段與步驟(2)中回收的1.2kb小片段按1:5的比例混合，加T4連接酶16i:過夜連接。(4)連接產物轉化到大腸桿菌DH5a感受態中，在含50pg/ml氨苄青黴素的LB固體培養基上培養16小時。(5)挑取單個菌落轉入含50嗎/ml氨苄青黴素的5mlLB液體培養基，在轉速為200rpm的搖床上，37'C培養16小時。(6)用質粒DNA小量提取試劑盒提取構建的新質粒HSP702-GFP。質粒HSP702-GFP經5am/HI雙酶切及7VofI單酶切，在37。C反應2小時，電泳鑑定表明質粒HSP702-GFP構建正確。將質粒HSP702-GFP送往聯合基因上海聯眾基因研究院測序，測序結果表明//S屍70-2基因啟動子、添加酶切位點的DNA序列、GFP-HSP70-13，UTR序列與實施例1、2所得結果一致，詳細見SEQIDNO.l所示的核苷酸序列。此步驟得到的質粒HSP702-GFP含有5flmiH、loI、AWI、S;/zI酶切位點。具體克隆過程見圖3。實施例4:質粒HSP702-GFP-pD5H8構建(1)將實施例3中質粒HSP702-GFP經WWI單酶切10小時，酶切產物用0.8%(質量比)瓊脂糖凝膠進行電泳，經電泳分離後，在紫外燈下用刀片切下目的帶，然後用Biospin膠回收試劑盒回收2.3kb小片段，見圖5中的泳道"1"所示DNA條帶位置。(2)將質粒pD5H8經」VWI單酶切10小時，酶切產物用0.8%(質量比)瓊脂糖凝膠進行電泳，經電泳分離後，在紫外燈下用刀片切下目的帶，然後用Biospin膠回收試劑盒回收13.8kb大片段，見圖5中的泳道"2"所示DNA條帶位置。(3)用熱敏磷酸酶對步驟(2)中的13.8kb大片段回收產物進行去磷酸化處理，反應在含1X熱敏磷酸酶緩衝液的50pl體系中進行，37'C作用30min，然後65°C5min熱失活。(4)將步驟(1)中回收的2.3kb小片段與步驟(3)中經去磷酸化酶處理後的13.8kb大片段按5:l的比例混合，加T4連接酶16'C過夜連接。(5)連接產物轉化到大腸桿菌DH5a感受態中，在含50pg/ml氨苄青黴素的LB固體培養基上培養16小時。(6)挑取單個菌落轉入含50pg/ml氨苄青黴素的5mlLB液體培養基，在轉速為200rpm的搖床上，37。C培養16小時。(7)用質粒DNA小量提取試劑盒提取構建的新質粒HSP702-GFP-pD5H8。16(8)質粒HSP702-GFP-pD5H8經WWI單酶切，在37。C反應2小時，酶切產物用0.8%(質量比)瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳鑑定得到圖5中的泳道"3"所示DNA條帶位置所示，表明質粒HSP702-GFP-pD5H8構建正確。具體克隆過程見圖4。實施例5:表達質粒HSP702-GFP-pD5H8的提取及轉染進入四膜蟲(1)將含有質粒HSP702-GFP-pD5H8的菌液轉接到含有50嗎/ml氨苄青黴素的50mlLB液體培養基，在轉速為200rpm的搖床上，37。C培養16小時。(2)用E.Z.N.A.Endo-FreePlasmidMiniKit(Omega公司產品)去內毒素質粒DNA小量提取試劑盒提取質粒HSP702-GFP-pD5H8，最後用200^10mMpH7.5的H印es緩衝液(Sigma公司產品)洗脫回收柱上的質粒。提取的質粒HSP702-GFP-pD5H8用Biophotometer分光光度計(Eppendorf公司產品)測定DNA濃度，確認提取的質粒DNA濃度大於或等於0.4pg/ml，若低於該濃度，則需用3M醋酸鈉加無水乙醇進行共沉澱來富集DNA，提高質粒DNA濃度(具體操作過程參考J.薩姆布魯克與D.W.拉塞爾著的《分子克隆實驗指南》，黃培堂等譯。2002年8月第三版，北京科學出版社1688-1689。)。(3)四膜蟲的培養。將不同交配型的野生型嗜熱四膜蟲(7^m/^mea/fenw/7&7")B2086與CU428株系分別轉接到50mlSPP培養基中，在轉速為50rpm的搖床上，30'C培養，直至細胞密度長到3X1S個/ml。SPP培養基配方為1%(質量比)Proteosepeptore(Difco公司產品)，0.1%(質量比)yeastextract(Oxoid公司產品),0.2%(質量比)glucose(分析純，廣州化學試劑廠產品)，0.003%Ferriccitrate(Sigma公司產品)。計數細胞用魯哥氏液(將6克的碘化鉀溶於20毫升水中，待完全溶解後加入4克碘，搖蕩，待碘完全溶解後，加入80毫升水)固定；在0.1ml10X10格玻璃計數框(本領域的普通技術人員均可製備)內計數，計算細胞密度。(4)四膜蟲的清洗。將50ml四膜蟲轉到50ml離心管(CellStar公司產品)內，用水平轉子離心機(Eppendorf公司產品，本發明中所有四膜蟲細胞的離心均用此離心機)1500rpm在30'C離心2min。離心結束後，用5ml移液器(Eppendorf公司產品)小心移去上清液體，然後加入10mMpH7.530。C溫育的Tris緩衝液(上海三浦化工有限公司產品)清洗四膜蟲2次。(5)四膜蟲的飢餓處理。清洗後向離心管中加入35ml10mMpH7.530'C溫育的Tris緩衝液，輕緩振蕩開沉澱四膜蟲，然後將管內液體及四膜蟲全部轉移到無菌錐形瓶中，並於30'C恆溫水浴靜置2小時後計數，最後用10mMpH7.530'C溫育的Tris緩衝液調整四膜蟲密度至3X105個/ml。(6)不同交配型的四膜蟲配對。將第(5)步中不同交配型的野生型嗜熱四膜蟲B2086與CU428按1:1四膜蟲細胞數目在2L容量的滅菌錐形瓶內混合，使瓶內液體在80100ml之間。2L錐形瓶置於30t)水浴搖床160rpm振蕩18小時後停止。停止振蕩4小時後，用5ml移液管吸取0.5ml四膜蟲，計算配對效率。若配對效率在80%以上，有利於提高後續的電穿孔實驗效率。停止振蕩10小時後，取15ml混合的配對四膜蟲於50ml離心管中，1500rpm在30'C離心2min。用5ml移液器小心移去上清液體，然後加入10mMpH7.530。C溫育的Hepes緩衝液(Sigma公司產品)清洗四膜蟲一次。再次於1500rpm在30'C離心2min，棄去上清液，富集四膜蟲至125…。(7)質粒HSP702-GFP-pD5H8通過電穿孔法進入四膜蟲。將富集的125pl四膜蟲與50(ig相同體積的30'C溫育的質粒HSP702-GFP-pD5H8在滅菌離心管中混勻，並迅速轉移到30'C溫育的0.2cm電擊杯(Bio-Rad公司產品)中，然後立即放入電穿孔儀(Bio-Rad公司產品)進行電擊，電擊參數為300v,25^f,50q，電擊後的電擊杯於室溫靜置1min。實施例6:轉染後四膜蟲的培養及篩選本發明中的四膜蟲培養、篩選過程必須無菌操作，四膜蟲的培養、篩選環境為30'c恆溫箱內。具體步驟如下(1)將電擊杯內的四膜蟲用粗口吸管輕緩轉移到30'C溫育的裝有24mlSPP培養基的錐形瓶中，接著在30'C恆溫箱靜置2小時，然後均勻分裝到24孔一次性培養皿(本發明中所用24孔一次性培養皿均由CellStar公司提供)中。(2)電擊1620小時後加巴龍黴素(Sigma公司產品)，使每孔內的巴龍黴素濃度達到100嗎/ml。(3)電擊後第3天，觀察培養皿內細胞生長情況，取100pl生長良好的四膜蟲轉移至新的24孔一次性培養皿中，加卯OplSPP於其內，並且將巴龍黴素濃度提高到200嗎/ml。(4)電擊後第4天，取100pl含巴龍黴素濃度為200pg/ml的四膜蟲至新的24孔一次性培養皿，加900plSPP於其內，並且將巴龍黴素濃度提高到400嗎/ml。(5)電擊後第5天，取100nl含巴龍黴素濃度為400嗎/ml的四膜蟲至新的24孔一次性培養皿，加900plSPP於其內，並且將巴龍黴素濃度提高到600嗎/ml。(6)電擊後第6天，取100^含巴龍黴素濃度為600嗎/ml的四膜蟲至新的24孔一次性培養皿，加900SPP於其內，並且將巴龍黴素濃度提高到800嗎/ml。(7)電擊後第7天，取100pl含巴龍黴素濃度為800pg/ml的四膜蟲至新的24孔一次性培養皿，加900plSPP於其內，並且將巴龍黴素濃度提高到1000嗎/ml。(8)電擊後第8天，在解剖鏡(Zeiss)下，從含巴龍黴素濃度為1000pg/ml的四膜蟲培養液中，用微毛細吸管(Sigma-Aldrich公司產品)挑取單個四膜蟲到96孔一次性培養皿(CellStar公司產品)中，每孔內含一個四膜蟲細胞和1000|ag/ml巴龍黴素的150^SPP培養基，共挑取48孔四膜蟲。(9)單個四膜蟲細胞挑選3天後，在解剖鏡下觀察96孔一次性培養皿內四膜蟲長勢。(10)選取長勢良好的四膜蟲轉移到含有2mlSPP培養基的24孔一次性培養皿中30'c恆溫培養，保持培養基內巴龍黴素濃度為1000pg/ml。(11)待四膜蟲長到對數期時，用濃度為50tig/L的TBT處理24孔一次性培養皿內四膜蟲l小時。(12)用ZEISS顯微鏡(ZeissAxioplan2imaging顯微成像系統)在藍色激發光下(濾光片FITC)對誘導的細胞進行螢光檢測，若細胞發出強烈的綠色螢光，則說明相應的培養皿孔內篩選到的四膜蟲轉染成功，四膜蟲含有質粒HSP702-GFP-pD5H8。實施例7:轉染質粒HSP702-GFP-pD5H8的四膜蟲在TBT檢測中的應用(1)取200nl轉染成功的四膜蟲轉接至裝有50mlSPP培養基的錐形瓶中在30'C培養，巴龍黴素濃度為1000pg/ml。(2)待四膜蟲密度長至3XlS個/ml，取2ml四膜蟲於24孔一次性培養皿中，共取4孔，並在每孔內加入不同濃度的TBT(1pg/L,15pg/L,50pg/L,100照/L)溶液，30〔處理1小時。(3)取TBT處理後的lml四膜蟲富集至50til，離心條件為1500rpm、30°C、2min，然後用ZEISS顯微鏡在藍色激發光下(濾光片FITC)對誘導的四膜蟲進行螢光觀察，並用ZEISS顯微鏡配套的數碼成像系統拍照記錄，照片保存格式選用TIF，如圖8所示。(4)用圖像分析軟體Image-ProPlus6.0(MediaCybernetics公司產品)計算所拍照片上四膜蟲產生綠色螢光強度的光密度值，一個四膜蟲產生的綠色螢光強度計為一個光密度值。(5)對TBT濃度與其相應處理條件下四膜蟲產生的光密度值用SPSS13.0進行相關性分析(以表l中的764個光密度值為例)，所得結果見表2，可知光密度值與TBT濃度是顯著相關的，可進一步做回歸分析。(6)以不同濃度的TBT為自變量，以不同濃度的TBT處理條件下四膜蟲產生的光密度值為因變量，用SPSS13.0對表1中的764個光密度值與4個TBT濃度做線性回歸分析，所得結果見圖9，直線的方程及其相關特徵在圖9的左上角標出。此結果證明了質粒HSP702-GFP-pD5H8轉染四膜蟲產生的綠色螢光強度與TBT的濃度間存在著線性關係，且結果可信、重複性高，申請人在多次實驗中均得到了光密度值與TBT濃度間關聯度很好的線性關係，用轉染質粒HSP702-GFP-pD5H8的四膜蟲能夠快速、高通量檢測一定濃度範圍的TBT(1昭/L至100呢/L)。SEQUENCELISTING中國科學院水生生物研究所含HSP70啟動子和GFP的四膜蟲轉基因載體及製備方法和應用含HSP70啟動子和GFP的四膜蟲轉基因載體及製備方法和應用1Patentlnversion3.312341<212〉DNA人工構建的重組DNA序列1gcggccgcaattgttcttgcttgttttggtttatatttttttaagtttaatttatatgga60aatttacaaagaaagcatctattttaaaacttaatatttaatt犯tctgtcttacataat120ttxctttaaataaattttacattttaagaattaaaattaatttatttgactgaattattc180taaataatatttgaatgtgttttatgttatcattgaaaatattttttttcatttatttag240atttaaaaaactaatttt肌3c3atctgaaca^肌t肌agca犯tt肌att犯gtgc肌g300c3船tcttM3aMa^t3t3aattg犯aataact肌犯tt犯ac犯ttcctt犯a/tttat360attgtcagatattttagctatgtaatttgcaagcaatatttgtttacaaaacatgaatta420ataaaactaa肌aat3ttcattatataatt肌犯aagg犯cttttaaacaa犯tatctta480atttctatattaatttattaattatttactttaaag犯aaagagaaaacttcta犯tcaa540attaattttaatagaagtttttaatctatctaaatagtaat犯ttgttatatttgaat犯600tataaalttatc朋taaata朋tacattttagc朋aatatttatttttatatttctgctg660ataattaagtgagtgttatagctaattttttaattttaaaatatttttaaaaa犯tttgg720ttgtttggtttgtgatagataattaattatttgtaagttttagtttataatcaatttttt780ttaatctttctaaaattaataataagattttttaatctttcctttttcttatttgctatt840肌taatcaatttattcataaetggatatttaataatttagaaacaatttactgatttctaa900aaltcttttgttattaaaaaatacacttcaaattaaaaaaaataaaatttccaacaattc960tatcagaaatttttttcgctttaaacagctaaaaaga犯tttgatcaaaaataaa/taatc1020肪ttaattca犯犯aacaaa犯犯acactctc肌caB3aatcttcaa犯agcgactc犯a1080caaat犯ttaaaaaagtttacaaa犯tgtctggaaaataaa犯gctggatcc￡Ltga_gta￡i1140aggagaagaacttttcactggagttgtcccaattcttgttg犯ttagatggtgatgttaa1200tgggcacaaattttctgtcagtggagagggtg犯ggtgatgcaacatacgg犯犯cttac1260ccttaaatttatttgcactactggaaaactacctgttccatggccaacacttgtcactac1320tttcggttatggtgttcaatgctttgcgagatacccagatcatatgagacagcatgactt1380tttcaagagtgccatgcccgaaggttatgtEtcaggSL6Lagaactatatttttcaaagatga1440cgggaactac肌gacacgtgctg肌gtcaagtttg犯ggtgatecccttgttaatag犯t1500cgagttELgteigLggtattgattttaaagaagatgg犯acattcttggacacaaattggaata1560c犯ctataactcacacaatgtatacatcatggcagacaaacaaaagaatggaatcaaagt1620taacttcaaaattagacacaacattgaagatgg犯gcgttcaactagcagaccattatcs1680acaaaatactccaattggcgatggccctgtccttttaccagacaacca/ttaxxtgtccac1740acaatctgccctttcgaaagatcccaacgaaaagagagaccacatggtccttcttgagtt1800tgtaacagctgctgggatttcacatggcatggatg肌ctataca犯tgactcgagttgat1860ataaaatttataaatattetaaaataaataa犯ttgtagtgaattatgtttgatataaga1920gtatttaccatacatttgttttattgaagctgatttaattggcaagattttttgaaagca1980aaaatettctt肌aatgtataattgaaatatatagggtaagataaggagccacatgtggaa2040ccacctattttatattatatagatagtatat犯atcatttt犯ttttt犯taattaaaag2100agcatatttgtcatctaatatacctattaatttatatatatttttggtactttttctatt2160ttatataatttaagcacttaaattaactaaaa犯tatgatc犯ttattaatatttgctta2220caaattc肌tcaaatacttceitgagcgtctt犯肌ataatttaagcagaagaata犯犯g2280aggtatttaactatttcatcatgattcatgaggagaagaagaa犯atttatgcgcggccg2340c234權利要求1、一種含HSP70啟動子和GFP的四膜蟲轉基因載體HSP702-GFP-pD5H8，其序列為SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。2、權利要求1所述的一種含HSP70啟動子和GFP的四膜蟲轉基因載體HSP702-GFP-pD5H8的製備方法，包括如下步驟(1)將質粒rDNA-GFP經M^1酶切，然後回收2.1kbDNA片段，得到HSP70-15'UTR-GFP-HSP70-13'UTR;(2)將HSP70-15'UTR-GFP-HSP70-13'UTR經5g/II酶切，然後回收1.2kbDNA片段，得到GFP-HSP70-13'UTR;(3)合成PCR擴增嗜熱四膜蟲SCi^基因啟動子的引物，其序列如下上遊引物5'-GCGGCCGCTGTTGAAATGCCTTGCTTGT-3';下遊引物5'-AGATCCAACGGCGAAGTGGTAAACAG-3';(4)上述引物擴增得到嗜熱四膜蟲SCP2基因啟動子片段與pGEM-T載體連接，得到質粒T-SCP2;(5)將質粒T-SCP2經5gHII酶切，然後回收片段，其長度為3kb;(6)將步驟(2)中回收得到的1.2kbDNA片段與步驟(5)中回收得到的3kbDNA片段連接，得到質粒GFP-BglII;(7)合成PCR擴增步驟(6)中得到質粒GFP-BglII的引物，以修改5g/II酶切位點變為5flm//1酶切位點，其序列如下上遊引物5'-GGATCCATGAGTAAAGGAGAAGAACT國3';下遊引物5'-TAGAATACTCAAGCTATGCATCCAAC-3';(8)上述引物擴增得到的含有酶切位點的片段GFP-BamHI與pGEM-T載體連接，得到質粒T-GFP;(9)將質粒T-GFP經5am//1I酶切，然後回收片段，其長度為1306bp;(10)合成PCR擴增嗜熱四膜蟲/KP70-2基因啟動子的引物，其序列如下上遊引物5'-GCGGCCGCAATTGTTCTTGCTTGTTTTGG-3'下遊引物5'-GGATCCAGCTTTTTATTTTCCAGACAT-3';(11)上述引物擴增得到的啟動子片段與pGEM-T載體連接，得到質粒T-HSP702;(12)將質粒T-HSP702經I酶切，然後回收片段，其長度為4132bp;(13)將步驟(9)中回收得到的片段與步驟(12)中回收得到的片段連接，得到質粒HSP702-GFP;(14)將質粒HSP702-GFP經WWI酶切，然後回收含HSP70-25，UTR-GFP-HSP70-13，UTR的片段，其長度為2341bp，；(15)將質粒pD5H8經M^I酶切，回收長度為13839bp的片段，並用熱敏磷酸酶對該回收片段進行去磷酸化處理；(16)將步驟(14)中回收得到的片段與步驟(15)中經去磷酸化酶處理後得到片段連接，得到所述表達載體HSP702-GFP-pD5H8。3、權利要求1所述一種含HSP70啟動子和GFP的四膜蟲轉基因載體HSP702-GFP-pD5H8在汙染物三丁基錫檢測中的應用。全文摘要本發明公開了一種含HSP70啟動子和GFP的四膜蟲轉基因載體及製備方法和應用。利用質粒rDNA-GFP，通過酶切和PCR酶切位點突變等方法，構建質粒T-GFP；利用嗜熱四膜蟲基因組DNA，通過PCR擴增和克隆等方法，構建質粒T-HSP702；利用質粒T-GFP、T-HSP702和pD5H8，通過酶切和連接最終構建得到質粒HSP702-GFP-pD5H8。該載體含有HSP702啟動子，能實現外源基因高效表達；該載體上含有可替換的外源基因gfp，通過替換不同的外源基因，以實現四膜蟲成為一個外源基因表達系統；在巴龍黴素藥物篩選作用下，該載體替換掉四膜蟲體內原有的絕大部分rDNA，使外源基因在四膜蟲體內大量倍增，以實現目標基因的遺傳轉化。本發明方法易行，操作方便，該載體在轉染進四膜蟲中可用於環境中三丁基錫的檢測。文檔編號C12N15/85GK101586119SQ20091006209公開日2009年11月25日申請日期2009年5月15日優先權日2009年5月15日發明者馮立芳,煒繆申請人:中國科學院水生生物研究所