一種靶向敲除家蠶核型多角體病毒複製非必需基因的方法
2023-12-10 06:34:27 1
一種靶向敲除家蠶核型多角體病毒複製非必需基因的方法
【專利摘要】本發明涉及一種靶向敲除家蠶核型多角體病毒BmNPV複製非必需基因的方法，所述方法以BmNPV為材料，通過PCR對其一個複製非必需片段兩端的同源序列進行擴增並克隆至載體pUC19中；通過重疊PCR法依次拼接BmNPV的IE1早期啟動子、標記基因(EGFP)、終止序列SV40polyA，並克隆至上述載體pUC19獲得重組轉移載體pUC19-lef7-IE1-EGFP-SV40polyA-gp64；將該載體與野生BmNPV的基因組共轉染BmN細胞，經同源重組獲得帶有螢光標記的重組病毒RBmNPV-EGFP；將其基因組DNA與不帶有標記基因的轉移載體pUC19-lef7-gp64共轉染BmN細胞，通過同源重組獲得不帶有螢光標記基因的重組病毒RBmNPV。本發明解決了重組病毒基因組中帶有標記基因的問題，提高了陽性重組病毒的篩選效率，且此標記基因可以被反覆利用。
【專利說明】—種靶向敲除家蠶核型多角體病毒複製非必需基因的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及DNA重組技術和基因打靶【技術領域】，特別涉及一種靶向敲除家蠶核型多角體病毒複製非必需基因的方法。【背景技術】
[0002]基因敲除是80年代後半期應用DNA同源重組原理發展起來的。80年代初，胚胎幹細胞(ES細胞)分離和體外培養的成功奠定了基因敲除的技術基礎。1985年，首次證實的哺乳動物細胞中同源重組的存在奠定了基因敲除的理論基礎。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES細胞基因敲除的小鼠模型。直到現在，運用基因同源重組進行基因敲除依然是構建基因敲除動物模型中最普遍的使用方法。也是研究基因功能的重要手段。現在基因敲除技術被廣泛的應用於病毒基因組功能的研究中。所以一般設計一種替換型載體與病毒基因組共轉染細胞來缺失基因。但是病毒基因組上留有標記基因的問題，還未進行全面的改善，這給病毒本身的功能帶來了巨大的影響以及後續的病毒篩選也帶來了很大的麻煩，因此我們採用兩次同源重組的方法既缺失了靶基因又解決了病毒基因組上帶有標記基因的難題，這為以後的科學實驗有著重要的意義。
【發明內容】
[0003]有鑑於此，本發明的目的之一在於提供一種可敲除家蠶核型多角體病毒BmNPV複製非必需基因的帶有標記基因的轉移載體pUC19-1El-EGFP-SV40polyA及其製備方法。
[0004]為達到上述目的，本發明提供一種帶有標記基因的轉移載體的製備方法，所述方法包括以下步驟:
1)用PCR的方法依次獲得基因:IE、EGFP、SV40polyA；
2)採用重疊PCR方法依次拼接IE1、EGFP，以IEl-EGFP的連接產物作為亞基因與基因SV40polyA進行拼接，獲得三聯體基因IEl-EGFP_SV40polyA ；
3)將步驟2)所得的三聯體基因IEl-EGFP-SV40polyA克隆至載體pUC19中，獲得轉移載體 pUC19-1El-EGFP-SV40polyA ；
4)轉移載體pUC19-1El-EGFP-SV40polyA轉化DH5a大腸桿菌感受態細胞；
5)藍白斑篩選(含氨節青黴素Ampicillin的固體培養基)，挑取含有轉移載體pUC19-1E1-EGFP-SV40poIyA 的白色菌落。
[0005]6)轉移載體pUC19-1El-EGFP-SV40polyA進行PCR和雙酶切鑑定並送華大基因測序。
[0006]本發明進一步提供一種帶有標記基因的轉移載體，通過上述的方法製得。
[0007]本發明目的之二在於提供一種靶向敲除家蠶核型多角體病毒複製非必需基因的方法，以解決重組病毒基因組上含有標記基因的難題，且此標記基因可被重複利用。
[0008]為達到上述目的，本發明還提供一種靶向敲除家蠶核型多角體病毒複製非必需基因的方法，所述方法包括以下步驟:1)抽提家蠶核型多角體病毒BmNPV基因組；
2)PCR方法獲得複製非必需片段兩端的同源序列LEF7、gp64；
3)將步驟2)所得的同源序列lef7、gp64克隆至上述的轉移載體pUC 19-1E1-EGFP-SV40po I yA 中，獲得重組轉移載體 pUC19-lef7-1El-EGFP_SV40polyA-gp64，並與家蠶核型多角體病毒基因組共轉染BmN細胞，經同源重組獲得帶有EGFP標記(螢光蛋白標記基因)的重組病毒RBmNPV-EGFP，對該重組病毒RBmNPV-EGFP進行鑑定並擴大培養;
4)提取重組病毒RBmNPV-EGFP的基因組與無標記基因的轉移載體pUC19-lef7-gp64 (通過脂質體介導轉染法)共轉染BmN細胞；
5)篩選無標記基因的重組病毒RBmNPV，擴大培養用於後續實驗。
[0009]本發明的有益效果:一是利用本發明構建的轉移載體可以連續敲除BmNPV基因組中不同轉錄時相的複製非必需基因，無需構建太多的載體；二是選用綠色螢光蛋白(EGFP)作為標記基因，可以快速、直觀地獲得重組病毒；三是經兩次同源重組解決了重組病毒基因組中含有標記基因的問題，且此標記基因可以重複使用，無需更換標記基因。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010]圖1 為 IEl , EGFP, SV40polyA 三個基因的電泳圖；M:10kb DNA 標記；1:1E1 的PCR 產物；2 =EGFP 的 PCR 產物；3:SV40polyA 的 PCR 產物；
圖2為IEl與EGFP的重疊PCR的電泳圖；M:1Okb DNA標記；1:1El-EGFP的PCR產
物；
圖3 為三聯體基因IEl-EGFP-SV40polyA的電泳圖；M:10kb DNA標記；1:1El-EGFP-SV40polyA 的 PCR 產物；
圖4為轉移載體pUC19-1El-EGFP-SV40polyA的PCR及雙酶切鑑定圖；M:10kb DNA標記；1: pUC19-1El-EGFP-SV40polyA 的 PCR 產物;2: pUC19-1El-EGFP_SV40polyA 的雙酶切產物；
圖5為轉移載體pUC19-1El-EGFP-SV40polyA-gp64的PCR及雙酶切鑑定圖；M:10kb DNA 標記；I:pUC19-1El-EGFP-SV40polyA-gp64 的 PCR 產物；2:pUC19-1El-EGFP-SV40polyA-gp64 的雙酶切產物；
圖 6 為重組轉移載體 pUC19-lef7-1El-EGFP-SV40polyA-gp64 的 PCR 及雙酶切鑑定圖；M:10kb DNA 標記；I:pUC19-lef7-1El-EGFP-SV40-gp64 的 PCR 產物；2:pUC19-lef7-1El-EGFP-SV40-gp64 的雙酶切產物；
圖7為家蠶正常細胞的顯微圖；
圖8為只轉染了重組轉移載體pUC19-lef7-1El-EGFP-SV40polyA-gp64的家蠶細胞的顯微螢光圖；
圖9為重組病毒RBmNPV-EGFP的基因組與重組轉移載體pUC19-lef7-1El-EGFP_SV40polyA-gp64共轉染的顯微突光圖；
圖10為重組質粒pUC19-LEF7的PCR及雙酶切鑑定圖；M:10kb DNA標記；1:PUC19-LEF7的PCR產物；2:pUC19_LEF7的雙酶切產物；
圖11為無標記基因的轉移載體PUC19-LEF7-GP64的PCR及雙酶切鑑定圖；M:10kb DNA標記；1:pUC19-LEF7-GP64 的 PCR 產物；2:pUC19-LEF7_GP64 的雙酶切產物。
【具體實施方式】
[0011]應該指出，以下具體說明都是例示性的，旨在對本發明提供進一步的說明。
[0012]在本說明書中，除非特別指明，否則所用技術術語為本領域中的普通技術人員常用術語；本說明書中未註明具體條件的實驗方法是按常規實驗方法；本說明書中所用的試驗材料如無特別說明均為市售購買產品，各種試劑和培養基的成分和配製方法可參見常規實驗手冊中的操作。
[0013]通過對BmNPV基因組的分析與研究，推測BmNPV的50%左右的基因對於病毒在培養細胞中的增殖是非必需的。杆狀病毒基因組可以較大區域的缺失，從而增加了外源基因表達的有效途徑。此外，通過去除某些基因，如半胱氨酸蛋白酶(cysteine)、組織蛋白酶(cathepsin)、幾丁質酶(chitinase)基因能增進重組蛋白的穩定性。本發明就以同時敲除組織蛋白酶(cathepsin)和幾丁質酶(chitinase)為例來闡述`
【發明內容】
。
[0014]組織蛋白酶(cathepsin)和幾丁質酶(chitinase)是BmNPV的晚期表達基因，在基因組中處於相鄰的位置，且轉錄方向相反，是家蠶核型多角體杆狀病毒複製的非必需基因，據相關文獻報導敲除之後對病毒基因的複製沒有影響。
[0015]下面結合附圖和實施例對本發明做進一步說明。
[0016]實施例1:轉移載體 pUC19-1El-EGFP_SV40polyA 的構建:
1、以高珍等構建的重組質粒PSK-1E1-EGFP(高珍，洪葉挺，周芳等.家蠶BmAGOl基因的克隆、表達分析及其結合RNA的分離與鑑定[0L].[2012-01-09],中國科技論文在線，http://www.paper, edu.cn/index, php/default/releasepaper/content/201201-252)為模板分別設計:
(IE-1)F: 5- TTIY?7TG^AGTCGTTTGGTTGTTCACGATCG-3 (加粗傾斜部分為 fe7I 的酶切位點)
(IE-1)R: 5-CTCGCCCTTGCTCACCATGATTTGCAGTTCGGGACATAAAT-3
(EGFP)F: 5-TTATGTCCCGAACTGCAAATCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3
(EGFP)R: 5-AATGTGGTATGGCTGATTATGATCTTACTTGTACAGCTCGTC-3
(SV40polyA) F: 5- CATGGACGAGCTGTACAAGTAAGATCATAATCAGCCATACC-3
(SV40po I yA) R: 5_CGG^7^CrATCCAGACATGATAAGATACATTG-3 (加粗傾斜部分為 KpnI
的酶切位點)(三個基因的PCR結果見圖1)，與預期的大小一致。
2、通過重疊PCR的方法拼接三聯體基因:IE1-EGFP-SV40(如圖2、圖3所示)，其中IEl的鹼基序列如SEQ ID NO:1所示，EGFP的鹼基序列如SEQ ID NO:2所示，SV40polyA的喊基序列如SEQ ID NO:3所不:
(I)IEl與EGFP連接的PCR反應體系如下:
【權利要求】
1.一種帶有標記基因的轉移載體的製備方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟: (a)用重疊PCR的方法製備三聯體基因:IEl-EGFP-SV40polyA； (b)將步驟(a)所得的IEl-EGFP-SV40polyA克隆至載體pUC19中，獲得所述轉移載體pUCI9-1E1-EGFP-SV40poIyA。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括: (c)轉移載體pUC19-1El-EGFP-SV40polyA轉化DH5a大腸桿菌感受態細胞； (d)在含氨苄青黴素的固體培養基上進行藍白斑篩選，挑取含有轉移載體pUC 19-1E1-EGFP-SV40po I yA 的白色菌落； (e)轉移載體pUC19-1El-EGFP-SV40polyA進行PCR和雙酶切鑑定，並測序。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟(a)具體包括: 1)用PCR的方法依次獲得基因:IE、EGFP、SV40polyA； 2)採用重疊PCR方法依次拼接IE1、EGFP，以IEl-EGFP的連接產物作為亞基因與基因SV40polyA進行拼接，獲得三聯體基因IEl-EGFP_SV40polyA。
4.一種帶有標記基因的轉移載體，其特徵在於，所述轉移載體通過權利要求1-3任一所述的方法製得。
5.一種靶向敲除家蠶核型多角體病毒複製非必需基因的方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟: (1)製備家蠶核型多角體病毒BmNPV複製非必需片段兩端的同源序列:lef7、gp64； (2)將步驟(1)所得的同源序列lef7、gp64依次克隆至權利要求2所述的轉移載體pUC 19-1E1-EGFP-SV40po I yA 中，獲得重組轉移載體 pUC19-lef7-1El-EGFP_SV40polyA-gp64，並與家蠶核型多角體病毒基因組共轉染BmN細胞，經同源重組獲得帶有EGFP標記的重組病毒 RBmNPV-EGFP ； (3)提取重組病毒RBmNPV-EGFP的基因組與無標記基因的轉移載體pUC19-lef7-gp64共轉染BmN細胞； (4)篩選無標記基因的重組病毒RBmNPV。
6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述步驟(1)具體包括: 1)抽提家蠶核型多角體病毒BmNPV基因組； 2)PCR方法獲得複製非必需片段兩端的同源序列LEF7、gp64。
7.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述步驟(2)中重組轉移載體pUC19-lef7-1El-EGFP-SV40polyA-gp64與家蠶核型多角體病毒基因組通過脂質體介導轉染法共轉染BmN細胞。
【文檔編號】C12N15/66GK103589745SQ201210288003
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年8月14日 優先權日:2012年8月14日
【發明者】田鳳鳴, 陳劍清, 舒特俊, 張耀洲 申請人:天津耀宇生物技術有限公司