用於指導鹽酸右美託咪定用藥相關基因多態性檢測的引物組、試劑盒及方法與流程
2023-10-17 14:47:24 1
本發明涉及體外診斷技術領域，特別的，涉及一種用於指導鹽酸右美託咪定用藥相關基因多態性檢測的引物組、試劑盒及方法。
背景技術：
鹽酸右美託咪定是一種相對選擇性α2受體激動藥，有鎮靜、抗焦慮、催眠、鎮痛和交感神經阻滯作用。右美託咪定幾乎完全被生物轉化，極少以原形從尿和糞便中排出。生物轉化包括直接葡萄苷酸化和細胞色素p450介導的代謝。右美託咪定的主要代謝途徑是：直接n-葡萄苷酸化成非活性代謝產物；脂肪羥基化作用(主要由cyp2a6介導)產生3-羥基右美託咪定、3-羥基右美託咪定葡糖苷酸和3-羧基右美託咪定；右美託咪定n-甲基化產生3-羥基n-甲基右美託咪定、3-羧基n-甲基右美託咪定和n-甲基o-葡糖苷酸右美託咪定。
關於cyp2a6的研究發現，cyp2a6基因全長近6kb，包括9個外顯子，位於19q12-19q13.2之間，它和cyp2a7、cyp2a13以及兩個cyp2a7假基因一起位於一個350kb的基因簇內。在cyp2a6的多個等位基因中，具有正常酶活性的等位基因是cyp2a6*1，而cyp2a6*4等位基因編碼的酶缺乏活性。cyp2a6*4等位基因是cyp2a6基因的整體缺失，該缺失位點源於高度相似的cyp2a6和cyp2a7基因的3』端區域的不等交換，造成一個等位基因缺失，其交換區域位於第8內含子或第9外顯子上。
cyp2a6*4基因是高度多態性的，大約有40個等位基因變體。這些等位基因是純合子的cyp2a6缺乏活性。cyp2a6*4等位基因頻率在中國人群為15％，芬蘭人為1.0％，西班牙為0.5％，cyp2a6*4等位基因是促成亞洲人群pm表型(cyp2a6基因部分缺失或全部缺失促成pm表型)的主要等位基因。因此在給藥時，應給予含有cyp2a6*4等位基因的患者留有足夠的注意力，以防不良反應的發生。
目前常用的檢測基因多態性的方法有dna直接測序法、限制性片段長度多態性分析法(pcr－pflp)、高解析度溶解曲線(hrm)、基因晶片、液相晶片法、螢光定量pcr法等。測序技術是公認的檢測基因突變的金標準，但其設備成本高、檢測周期長、檢測通量低、檢測靈敏度低、對實驗人員的技術操作要求高、結果判定步驟繁瑣等原因，較難形成商業化的診斷產品；限制性片段長度多態性分析法檢測靈敏度同樣不高、操作步驟繁瑣，檢測的結果仍需要進行一代測序法的再次驗證，尤其當樣本量多時極易造成pcr產物的交叉汙染容易出現酶切不充分或酶切過度而出現假陰性或假陽性結果，因此也無法應用到臨床上。晶片檢測因其檢測結果的準確性和重複性較差，實驗周期長等缺點，也不適於開發臨床檢測試劑盒。螢光定量pcr的檢測方法擁有成本低、靈敏度高、特異性好，結果的重複性好等優點。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種指導鹽酸右美託咪定用藥相關基因多態性檢測的引物組、試劑盒及方法，具有操作簡單、檢測快速、準確性高及特異性好等優點。
本發明提供一種用於指導鹽酸右美託咪定用藥相關基因多態性檢測的引物組，所述引物組包括特異性引物及探針，如下：
cyp2a6*1正向引物：
5』-aaaatgggcatgaacgccc-3』；
cyp2a6*1反向引物：
5』-gaggggcgcagctaagac-3』；
cyp2a6*4反向引物：
5』-cggaagaggcgggtataagaa-3』；
cyp2a6*1檢測探針：
5』fam-ctttccgccatcct-3』；
cyp2a6*4檢測探針：
5』vic-ctttcccgcatctt-3』。
本發明還提供一種用於指導鹽酸右美託咪定用藥相關基因多態性檢測的試劑盒，包括含有如上文所述的特異性引物及探針的pcr反應液，所述pcr反應液包括cyp2a6*1正向引物、cyp2a6*1反向引物、cyp2a6*4反向引物、cyp2a6*1檢測探針、cyp2a6*4檢測探針、10×pcrbuffer，dntps、hs-taq酶及無核酸酶水。
在本發明提供的所述試劑盒一較佳實施例中，所述pcr反應液的成分終濃度為：1×pcrbuffer，0.1～0.3μmcyp2a6*1正向引物、0.1～0.3μmcyp2a6*1反向引物、0.1～0.3μmcyp2a6*4反向引物、0.1～0.3μmcyp2a6*1檢測探針、0.1～0.3μmcyp2a6*4檢測探針，0.2～0.3mm的dntps，1u的hs-taq酶。
在本發明提供的所述試劑盒一較佳實施例中，還包括陽性對照品一、陽性對照品二及陽性對照品三；
所述陽性對照品一為30ng/ul的cyp2a6*4基因位點野生型質粒；
所述陽性對照品二為30ng/ul的cyp2a6*4基因位點野生型與突變型按1：1數量比雜合的質粒；
所述陽性對照品三為30ng/ul的cyp2a6*4基因位點突變型質粒。
在本發明提供的所述試劑盒一較佳實施例中，還包括空白對照品，所述空白對照品為無核酸酶水。
本發明還提供一種指導鹽酸右美託咪定用藥相關基因多態性檢測多態性的方法，包括如下步驟：
步驟一：取待檢測樣本抽提的dna，作為pcr模板；
步驟二：提供如上文所述的試劑盒，取出適量pcr反應液，將所述pcr反應液與適量所述pcr模板混勻；
步驟三：進行pcr擴增反應：25℃ung酶處理10min；95℃變性5min；40cycles，95℃15sec，60℃30sec；
步驟四：pcr結果判定：在所述試劑盒的陽性對照品和空白對照品符合規定的情況下，根據螢光擴增曲線得到ct值進行結果判定，得到待測樣本的基因型。
相較於現有技術，本發明提供的用於指導鹽酸右美託咪定用藥相關基因多態性檢測的引物組、試劑盒及方法的有益效果在於：通過設計特異性高的引物及taqman-mgb螢光檢測探針並通過檢測螢光的釋放和強度來檢測基因多態性，得到cyp2a6*4的基因型，在給藥時，給予含有cyp2a6*4等位基因的患者更多的注意力，以防不良反應的發生；此外再配置成使用方便且檢測結果可靠的試劑盒，設計出科學合理的pcr反應體系，使得本發明具有操作簡單、檢測快速、準確性高及特異性好的特點。
附圖說明
圖1為臨床樣本cyp2a6*4野生型的pcr擴增曲線圖；
圖2為臨床樣本cyp2a6*4雜合型的pcr擴增曲線圖；
圖3為臨床樣本cyp2a6*4突變型的pcr擴增曲線圖。
具體實施方式
為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，下面結合附圖及實施例，對本發明進行進一步的詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。
實施例1：試劑盒的製備
一、引物和探針的設計與合成
針對人基因組中cyp2a6*4基因位點(序列參見ncbi資料庫公開的人類全基因組序列)，使用primerpremier3.0及methylprimerexpressv1.0軟體，分別設計特異性引物及mgb標記的探針。
特異性引物及探針序列，如表一所示：
表一、特異性引物及探針序列
二、對照品選擇
陽性對照品一為30ng/ul的cyp2a6*4基因位點野生型質粒；
陽性對照品二為30ng/ul的cyp2a6*4基因位點野生型與突變型按1：1數量比雜合的質粒；
陽性對照品三為30ng/ul的cyp2a6*4基因位點突變型質粒；
空白對照品為無核酸酶水。
三、pcr反應液組成
所述pcr反應液包括cyp2a6*1正向引物、cyp2a6*1反向引物、cyp2a6*4反向引物、cyp2a6*1檢測探針、cyp2a6*4檢測探針、10×pcrbuffer，dntps、hs-taq酶及無核酸酶水。
其中，所述10×pcrbuffer、dntp及無核酸酶水均購自大連寶生物(寶生物(大連)工程有限公司)；所述無核酸酶水為(nuclease-freewater)用depc(diethylpyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)處理過並經高溫高壓滅菌的超純水；hs-taq酶(takarataqhotstartversion，購自大連寶生物)是針對普通taqdna聚合酶靈敏度高，易產生非特異性條帶的情況，專門研製的高特異性嗜熱dna聚合酶產品。
所述pcr反應液成分的終濃度為：1×pcrbuffer，0.1～0.3μmcyp2a6*1正向引物、0.1～0.3μmcyp2a6*1反向引物、0.1～0.3μmcyp2a6*4反向引物、0.1～0.3μmcyp2a6*1檢測探針、0.1～0.3μmcyp2a6*4檢測探針，0.2～0.3mm的dntps，1u的hs-taq酶，無核酸酶水適量(將體系補充至18.5ul)。
實施例2：利用上述試劑盒檢測cyp2a6*4基因多態性的方法
一、生物樣本
本發明所採用的生物材料均來自湘雅醫學檢驗所。為2016年6-12月期間在湘雅醫學檢驗所檢測的500例剩餘人群抗凝血。
二、取待檢測樣本抽提的dna，作為pcr模板：
dna提取試劑盒為自主研發的提取試劑盒《核酸提取或純化試劑》進行提取(備案號：湘長械備20150166)。
1)取無菌的1.5mlep管，加入250ul全血；
2)加750ul細胞裂解液，顛倒混勻5-6次，室溫靜置10min；
3)12000rpm離心1.5min；倒掉上部廢液，收集管底沉澱；
4)依次加入20ul蛋白酶k、250ul裂解液abl，渦旋振蕩10s，65℃水浴15min，期間振蕩混勻2-3次；
5)取出，加入250ul無水乙醇，渦旋振蕩10s，短暫離心5s；
6)將吸附柱插入收集管中，將上一步所得混合液轉移至吸附柱中；10,000rpm離心1min；
7)棄收集管中廢液，將吸附柱重新放入收集管；加入500ul洗液i，10,000rpm，1min離心；
8)棄收集管中廢液，加入700ul洗液ii，10,000rpm，1min，離心。棄廢液；(洗液ii使用前需加入無水乙醇至80％)
9)重複步驟8一次；
10)棄流出液，將吸附柱插回收集管，空轉離心，13,000rpm，2min；
11)將吸附柱插入到新的ep管中；加入30-100uldna溶解液(65℃預熱可提高dna獲得率)，室溫靜置5min；
12)10,000rpm，1min，離心，棄吸附柱，ep管內液體即為dna溶液。2-8℃保存，若需長期保存請置於-20℃或更低溫度。
三、提供所述試劑盒，取出適量pcr反應液，將所述pcr反應液與適量所述pcr模板混勻：
從試劑盒中取出所需數量pcr反應液連管(每檢測位點的pcr管數＝樣本數+1個空白對照+3個陽性對照)；
pcr反應液室溫融解後，瞬時離心，揭開管蓋；
從待檢樣本dna(或對照品)中取1.5μl加至pcr反應液中；
振蕩混勻後，瞬時離心10s，將其移至擴增區。
四、進行pcr擴增反應：25℃ung酶處理10min；95℃變性5min；40cycles，95℃15sec，60℃30sec。
使用的pcr儀器為abi7500或杭州博日fqd-96a螢光定量聚合酶鏈式反應(pcr)檢測系統，反應體系為20ul；
pcr反應條件如表二所示：
表二、pcr擴增反應條件
五、pcr結果判定：在所述試劑盒的陽性對照品和空白對照品符合規定的情況下，根據螢光擴增曲線得到ct值進行結果判定，得到cyp2a6*4的基因型。
結果有效性判定，如表三所示：
表三
空白對照結果為陰性(noct或ct值≥38)。
pcr結果判定，如表四所示：
表四
基於本發明的臨床樣本各基因位點檢測結果，參見圖1-圖3，其中圖1為臨床樣本cyp2a6*4野生型的pcr擴增曲線圖，圖2為臨床樣本cyp2a6*4雜合型的pcr擴增曲線圖，圖3為臨床樣本cyp2a6*4突變型的pcr擴增曲線圖。
實施例3：cyp2a6*4的基因型用藥指導
cyp2a6*4通過影響cyp2a6酶含量的表達而改變酶活性或直接導致酶活性的喪失。因此在給藥時，應結合臨床給予含有cyp2a6*4等位基因的患者留有足夠的注意力，以防不良反應的發生。由螢光定量pcr中的結果判定(表四)得出cyp2a6*4的基因型。醫生根據cyp2a6基因型和表型對應得的關係，詳見表五，結合患者的病理生理特徵、合併用藥、臨床表現等其他因素進行綜合判斷以確定最終用藥方案。
表五
本發明提供的用於指導鹽酸右美託咪定用藥相關基因多態性檢測的引物組、試劑盒及方法的有益效果在於：通過設計特異性高的引物及taqman-mgb螢光檢測探針並通過檢測螢光的釋放和強度來檢測基因多態性，得到cyp2a6*4的基因型，在給藥時，給予含有cyp2a6*4等位基因的患者更多的注意力，以防不良反應的發生；此外再配置成使用方便且檢測結果可靠的試劑盒，設計出科學合理的pcr反應體系，使得本發明具有操作簡單、檢測快速、準確性高及特異性好的特點。
以上所述僅為本發明的實施例，並非因此限制本發明的專利範圍，凡是利用本發明說明書內容所作的等效流程變換，或直接或間接運用在其它相關的技術領域，均同理包括在本發明的專利保護範圍內。
sequencelisting
韓林志
用於指導鹽酸右美託咪定用藥相關基因多態性檢測的引物組、試劑盒及方法
2017
5
patentinversion3.5
1
19
dna
人工序列（artificialsequence）
1
aaaatgggcatgaacgccc19
2
18
dna
人工序列（artificialsequence）
2
gaggggcgcagctaagac18
3
21
dna
人工序列（artificialsequence）
3
cggaagaggcgggtataagaa21
4
14
dna
人工序列（artificialsequence）
4
ctttccgccatcct14
5
14
dna
人工序列（artificialsequence）
5
ctttcccgcatctt14