活的減毒嵌合豬圓環病毒疫苗的製作方法

2023-12-10 08:07:32 2

本申請是分案申請，其母案的申請號是：201180024467.4，國際申請號是pct/us2011/028665，申請日是：2011年3月16日。相關申請的引用本專利申請要求2010年3月16日申請的美國臨時專利申請號61/314,362的權益，其說明書本文通過引用以其整體結合到本說明書中。本發明涉及豬圓環病毒(pcv)(特別是pcv1和pcv2(特別是亞型pcv2b)的嵌合病毒)的感染性dna克隆、活的減毒疫苗和滅活疫苗以及用於針對pcv感染和豬圓環病毒相關的疾病(pcvad)進行保護的方法。
背景技術：
：：豬圓環病毒(pcv)是一種小的、無包膜的dna病毒，其屬於圓環病毒科(circoviridae)(todd,d.等,2005,circoviridae,第327-334頁.載於c.m.fauquet等(主編),virustaxonomy:eighthreportoftheinternationalcommitteeontaxonomyofviruses,elsevieracademicpress,sandiego)。1型pcv(pcv1)在七十年代中期作為豬腎pk-15細胞系的汙染物被發現(tischer,i.等,1974,characterizationofpapovavirus-andpicornavirus-likeparticlesinpermanentpigkidneycelllines(永久豬腎細胞系中的乳多空病毒和小rna病毒樣顆粒的表徵),zentralblbakterioloriga226:153-67)。pcv1被認為是非致病的病毒，因為用來源於pk-15細胞系的pcv1病毒接種豬不引起豬的任何疾病(tischer,i.等,1986,studiesonepidemiologyandpathogenicityofporcinecircovirus(對豬圓環病毒的流行病學和致病性的研究),archviroi91:271-6)。在1997年，在加拿大的患有萎縮病的小豬中發現了pcv的變異株(命名為2型pcv(pcv2))(allan,g.m.等,1998,isolationofporcinecircovirus-likevirusesfrompigswithawastingdiseaseintheusaandeurope(從美國和歐洲的患有萎縮病的豬中分離豬圓環病毒樣病毒).jvetdiagninvest10:3-10；clark,e.g.,1997,報告於美國豬醫師協會(americanassociationofswinepractitioners)第28屆年會；ellis,j.等,1998,isolationofcircovirusfromlesionsofpigswithpostweaningmuitisystemicwastingsyndrome(從患有斷奶後多系統衰竭症候群的豬的損害中分離圓環病毒),canvetj39:44-51；meehan,b.m.等,1998,characterizationofnovelcircovirusdnasassociatedwithwastingsyndromesinpigs(與豬的衰竭症候群相關的新的圓環病毒dna的表徵),jgenvirol79(pt9):2171-9)。目前，pcv2是豬圓環病毒相關的疾病(pcvad)的主要病原體，豬圓環病毒相關的疾病包括消瘦、死亡、呼吸徵、腸炎、不能繁殖和豬皮炎腎病症候群(pdns)(opriessnig,t.等,2007,porcinecircovirustype2associateddisease:updateoncurrentterminology,clinicalmanifestations,pathogenesis,diagnosis,andinterventionstrategies(2型豬圓環病毒相關的疾病：對目前術語、臨床表現、病理、診斷和介入策略的更新),jvetdiagninvest19:591-615)。pcv2目前被認為是全球豬群中最經濟上重要的病毒病原體之一，並在世界的每個主要產豬國家發現(gillespie,j.等,2009,porcinecircovirustype2andporcinecircovirus-associateddisease(2型豬圓環病毒和豬圓環病毒相關的疾病),jvetinternmed)。在用pcv2單獨實驗感染的常規豬中觀察到重度臨床pcvad是不常見的，並通常需要與其他豬病原體(例如豬繁殖與呼吸症候群病毒(prrsv)或豬細小病毒(ppv))共感染以誘導全譜的臨床pcvad(allan,g.m.等,2000,experimentalinfectionofcolostrumdeprivedpigletswithporcinecircovirus2(pcv2)andporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(prrsv)potentiatespcv2replication(用豬圓環病毒2(pcv2)和豬繁殖與呼吸症候群病毒(prrsv)實驗感染剝奪初乳的小豬增強pcv2複製),archvirol145:2421-9；opriessnig,t.等2007.同上；roca,m.等,2004,invitroandinvivocharacterizationofaninfectiouscloneofaeuropeanstrainofporcinecircovirustype2(2型豬圓環病毒歐洲株的感染性克隆的體外和體內表徵),jgenvirol85:1259-66；rovira,a.等,2002,experimentalinoculationofconventionalpigswithporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusandporcinecircovirus2(用豬繁殖與呼吸症候群病毒與豬圓環病毒2實驗接種常規豬),jvirol76:3232-9；tomas,a.等,2008,ameta-analysisonexperimentalinfectionswithporcinecircovirustype2(pcv2)(對2型豬圓環病毒(pcv2)實驗感染的綜合分析),vetmicrobiol132:260-73)。然而，用pcv2單獨感染剖腹產來源剝奪初乳的(cd/cd)豬已引起重度臨床pcvad和死亡(allan,g.等2003,reproductionofpostweaningmuitisystemicwastingsyndromeinpigsexperimentallyinoculatedwithaswedishporcinecircovirus2isolate(在用瑞典豬圓環病毒2隔離群實驗接種的豬中再現斷奶後多系統衰竭症候群),jvetdiagninvest15:553-60；allan,g.m.等,2004,pmws:experimentalmodelandco-infections(pmws：實驗模型與共感染),vetmicrobiol98:165-8；bolin,s.r.等,2001,postweaningmultisystemicwastingsyndromeinducedafterexperimentalinoculationofcesarean-derived,colostrum-deprivedpigletswithtype2porcinecircovirus(在用2型豬圓環病毒實驗接種剖腹產來源剝奪初乳的小豬後誘導斷奶後多系統衰竭症候群),jvetdiagninvest13:185-94；harms,p.a.等,2001,experimentalreproductionofseverediseaseincd/cdpigsconcurrentlyinfectedwithtype2porcinecircovirusandporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(在用2型豬圓環病毒和豬繁殖與呼吸症候群病毒同時感染的cd/cd豬中實驗再現重度疾病),vetpathol38:528-39；kennedy,s.等,2000,reproductionoflesionsofpostweaningmuitisystemicwastingsyndromebyinfectionofconventionalpigswithporcinecircovirustype2aloneorincombinationwithporcineparvovirus(通過用2型豬圓環病毒單獨或與豬細小病毒聯合感染常規豬來再現斷奶後多系統衰竭症候群的損害),jcomppathol122:9-24)。pcv2的數篇病理、免疫學和分子生物學綜合綜述是可得的(allan,g.m.和j.a.ellis,2000,porcinecircoviruses:areview(豬圓環病毒：綜述).jvetdiagninvest12:3-14；ellis,j.等,2004,porcinecircovirus-2andconcurrentinfectionsinthefield(豬圓環病毒-2和野外並發感染),vetmicrobiol98:159-63；finsterbusch,t.和a.mankertz,2009,porcinecircoviruses-smallbutpowerful(豬圓環病毒-小但有力),virusres143:177-83；gillespie,j.等,2009,同上；mankertz,a.等,2004,molecularbiologyofporcinecircovirus:analysesofgeneexpressionandviralreplication(豬圓環病毒的分子生物學：基因表達和病毒複製的分析),vetmicrobiol98:81-8；opriessnig,t.等2007,同上；ramamoorthy,s.和x.j.meng,2009,porcinecircoviruses:aminusculeyetmammothparadox(豬圓環病毒：一個微小但龐大的悖論),animhealthresrev10:1-20；segales,j.等,2005,porcinecircovirusdiseases(豬圓環病毒疾病),animhealthresrev6:119-42)。雖然致病的pcv2與非致病的pcv1的基因組組構類似，但是pcv1與pcv2的基因組享有僅大約68-76%的核苷酸序列同一性(fenaux,m.等,2004,detectionandinvitroandinvivocharacterizationofporcinecircovirusdnafromaporcine-derivedcommercialpepsinproduct(來自豬來源的商業胃蛋白酶產品的豬圓環病毒dna的檢測以及體外和體內表徵),jgenvirol85:3377-82；hamel,a.l等,1998,nucleotidesequenceofporcinecircovirusassociatedwithpostweaningmuitisystemicwastingsyndromeinpigs(與豬的斷奶後多系統衰竭症候群有關的豬圓環病毒的核苷酸序列),jvirol72:5262-7；tischer,i.等,1982,averysmallporcineviruswithcircularsingle-strandeddna(具有圓形單鏈dna的非常小的豬病毒),nature295:64-6)，並且已報導了轉錄模式和衣殼蛋白的抗原概況中的差異(cheung,a.k.2003,comparativeanalysisofthetranscriptionalpatternsofpathogenicandnonpathogenicporcinecircoviruses(致病與非致病的豬圓環病毒的轉錄模式的比較分析),virology310:41-9；lekcharoensuk,p.等,2004,epitopemappingofthemajorcapsidproteinsoftype2porcinecircovirus(pcv2)byusingchimericpcv1andpcv2(通過使用嵌合pcv1和pcv2來對2型豬圓環病毒(pcv2)的主要衣殼蛋白進行表位作圖),jvirol78:8135-45；shang,s.b.等,2009,finemappingofantigenicepitopesoncapsidproteinofporcinecircovirus,andantigenicphenotypeofporcinecircovirustype2(豬圓環病毒的衣殼蛋白上的抗原表位的優良作圖和2型豬圓環病毒的抗原表型),molimmunol46:327-34)。由病毒基因組編碼的兩個主要基因包括942bp複製酶(rep)基因(mankertz,a.和b.hillenbrand,2001,replicationofporcinecircovirustype1requirestwoproteinsencodedbytheviralrepgene(1型豬圓環病毒的複製需要由病毒rep基因編碼的兩種蛋白),virology279:429-38)和702bp衣殼基因(cap)(nawagitgul,p.等,2000,openreadingframe2ofporcinecircovirustype2encodesamajorcapsidprotein(2型豬圓環病毒的開放閱讀框2編碼一種主要的衣殼蛋白),jgenvirol81:2281-7)。rep基因在pcv1與pcv2之間是高度保守的，具有約83%的核苷酸序列同一性，而cap基因享有僅約67-70%的同一性(mankertz,a.等,2004,同上)。目前，在全世界豬群中已鑑定了至少3種pcv2的亞型：pcv2a、pcv2b和pcv2c(dupont,k.等,2008,genomicanalysisofpcv2isolatesfromdanisharchivesandacurrentpmwscase-controlstudysupportsashiftingenotypeswithtime(來自丹麥檔案與當前pmws病例的pcv2隔離群的基因組分析-對照研究支持基因型隨時間轉變),vetmicrobiol128:56-64；segales,j.等,2008,pcv-2genotypedefinitionandnomenclature(pcv-2基因型定義和命名),vetrec162:867-8)。pcv2a和pcv2b兩者都與不同嚴重程度的臨床pcvad相關(an,d.j.等,2007,phylogeneticcharacterizationofporcinecircovirustype2inpmwsandpdnskoreanpigsbetween1999and2006(1999-2006年之間的pmws和pdns韓國豬的2型豬圓環病毒的系統發育表徵),virusres129:115-22；ciacci-zanella,j.r.等,2009,detectionofporcinecircovirustype2(pcv2)variantspcv2-1andpcv2-2inbrazilianpigpopulation(巴西豬群的2型豬圓環病毒(pcv2)變體pcv2-1和pcv2-2的檢測),resvetsci87:157-60；lager,k.m等,2007,mortalityinpigsgivenporcinecircovirustype2subgroup1and2virusesderivedfromdnaclones(給予來源於dna克隆的2型豬圓環病毒亞型1和2病毒的豬的死亡率),vetrec161:428-9；madson,d.m.等,2008,characterizationofsheddingpatternsofporcinecircovirustypes2aand2binexperimentallyinoculatedmatureboars(實驗接種的成熟野豬中的2a和2b型豬圓環病毒的釋放模式表徵),jvetdiagninvest20:725-34；opriessnig,t.等,2006,geneticandexperimentalcomparisonofporcinecircovirustype2(pcv2)isolatesfromcaseswithandwithoutpcv2-associatedlesionsprovidesevidencefordifferencesinvirulence(來自有和沒有pcv2相關損害的病例的2型豬圓環病毒(pcv2)隔離群的基因和實驗比較為毒力差異提供證據),jgenvirol87:2923-32；opriessnig,t.等,2008,differencesinvirulenceamongporcinecircovirustype2isolatesareunrelatedtoclustertype2aor2bandpriorinfectionprovidesheterologousprotection(2型豬圓環病毒隔離群之間的毒力差異與簇類型2a或2b不相關且感染之前提供異種保護),jgenvirol89:2482-91)。2005年之前，在美國和加拿大的豬群中僅發現pcv2a，而在歐洲和中國存在pcv2a和pcv2b兩者(chae,j.s.andk.s.choi,2009,geneticdiversityofporcinecircovirustype2frompigsinrepublicofkorea(來自韓國的豬的2型豬圓環病毒的遺傳多樣性),resvetsci；dupont,k.等,2008,同上)。自2005年以來，新的pcv2b株在美國被識別，且在豬群中存在的全球性變化是pcv2b的佔優勢盛行，同時臨床pcvad的嚴重性增加(carman,s.等,2008,theemergenceofanewstrainofporcinecircovirus-2inontarioandquebecswineanditsassociationwithsevereporcinecircovirusassociateddisease-2004-2006(安大略和魁北克豬中出現的豬圓環病毒-2的新毒株及其與重度豬圓環病毒相關的疾病的關係-2004-2006),canjvetres72:259-68；chae,j.s.和k.s.choi,2009,同上；cheung,a.k.等,2007,detectionoftwoporcinecircovirustype2genotypicgroupsinunitedstatesswineherds(在美國豬群中檢測到兩種2型豬圓環病毒基因型的類型),archvirol152:1035-44；ciacci-zanella,j.r.等,2009,同上；dupont,k.等,2008,同上；gagnon,c.a.等,2007,theemergenceofporcinecircovirus2bgenotype(pcv-2b)inswineincanada(在加拿大的豬中出現豬圓環病毒2b基因型(pcv-2b)),canvetj48:811-9；lipej,z.等,2005,postweaningmuitisystemicwastingsyndrome(pmws)inpigsincroatia:detectionandcharacterisationofporcinecircovirustype2(pcv2)(克羅埃西亞豬的斷奶後多系統衰竭症候群(pmws)：檢測和表徵2型豬圓環病毒(pcv2)),actavethung53:385-96；wang,f.等,2009,geneticvariationanalysisofchinesestrainsofporcinecircovirustype2(2型豬圓環病毒的中國株的遺傳變異分析),virusres145:151-6；wiederkehr,d.d.等,2009,anewemerginggenotypesubgroupwithinpcv-2bdominatesthepmwsepizootyinswitzerland(pcv-2b中新出現的基因型亞型控制瑞士的pmws病),vetmicrobiol136:27-35)。pcv2c的致病性不清楚，因為它僅在1980、1987和1990年在丹麥的無疾病豬群中被報導(dupont,k.等,2008,同上)。目前可得的商業疫苗都為基於pcv2a亞型的死疫苗或重組疫苗(opriessnig,t.等2007,同上；ramamoorthy,s.和x.j.meng,2009,同上)。發明人之前已成功開發了基於pcv1-2a嵌合病毒(在pcv1的骨架中具有pcv2a的衣殼基因)的滅活疫苗suvaxynpcv2®onedose™(fenaux,m.等,2004a,achimeticporcinecircovirus(pcv)withtheimmunogeniccapsidgeneofthepathogenicpcvtype2(pcv2)clonedintothegenomicbackboneofthenonpathogenicpcv1inducesprotectiveimmunityagainstpcv2infectioninpigs(致病的2型pcv(pcv2)的免疫原性衣殼基因克隆到非致病的pcv1的基因組骨架中的嵌合豬圓環病毒(pcv)誘導針對豬的pcv2感染的保護性免疫),jvirol78:6297-303；fenaux,m.等,2003,immunogenicityandpathogenicityofchimericinfectiousdnaclonesofpathogenicporcinecircovirustype2(pcv2)andnonpathogenicpcv1inweanlingpigs(斷奶豬的致病的2型豬圓環病毒(pcv2)和非致病的pcv1的嵌合感染性dna克隆的免疫原性和致病性),jvirol77:11232-43；gillespie,j.等,2008,ageneticallyengineeredchimericvaccineagainstporcinecircovirustype2(pcv2)isgeneticallystableinvitroandinvivo(針對2型豬圓環病毒(pcv2)的基因工程嵌合疫苗在體外和體內遺傳穩定),vaccine26:4231-6)。然而，因為pcv2b亞型現在在商品豬中已成為與重度臨床pcvad相關的全球主要基因型，且因為pcv2a和pcv2b有多達10%核苷酸序列同一性的差異(fenaux,m.等,2000,geneticcharacterizationoftype2porcinecircovirus(pcv-2)frompigswithpostweaningmuitisystemicwastingsyndromeindifferentgeographicregionsofnorthamericaanddevelopmentofadifferentialpcr-restrictionfragmentlengthpolymorphismassaytodetectanddifferentiatebetweeninfectionswithpcv-1andpcv-2(遺傳表徵來自北美不同地理區域的患斷奶後多系統衰竭症候群的豬的2型豬圓環病毒(pcv-2)以及開發差異pcr-限制性片段長度多態性測定以檢測和區分pcv-1與pcv-2之間的感染),jclinmicrobiol38:2494-503；olvera,a.等,2007,molecularevolutionofporcinecircovirustype2genomes:phylogenyandclonality(2型豬圓環病毒基因組的分子進化：系統發育和克隆形成能力),virology357:175-85)，所以是否當前基於pcv2a亞型的死疫苗或重組疫苗針對全新識別的pcv2b亞型提供全面保護是未知的。一些研究已證明目前市售疫苗針對pcv2b攻擊的有效性(fort,m.等,2008,porcinecircovirustype2(pcv2)vaccinationofconventionalpigspreventsviremiaagainstpcv2isolatesofdifferentgenotypesandgeographicorigins(2型豬圓環病毒(pcv2)疫苗接種常規豬針對不同基因型和地理來源的pcv2隔離群預防病毒血症),vaccine26:1063-71；fort,m.等,2009,onedoseofaporcinecircovirus2(pcv2)sub-unitvaccineadministeredto3-week-oldconventionalpigletselicitscell-mediatedimmunityandsignificantlyreducespcv2viremiainanexperimentalmodel(將單劑量的豬圓環病毒2(pcv2)亞單位疫苗給予3周齡常規小豬引起細胞介導的免疫並顯著降低實驗模型中的pcv2病毒血症),vaccine27:4031-7；opriessnig,t.等,2009,comparisonofefficacyofcommercialonedoseandtwodosepcv2vaccinesusingamixedprrsv-pcv2-sivclinicalinfectionmodel2-3-monthspostvaccination(疫苗接種後2-3月使用混合的prrsv-pcv2-siv臨床感染模型來比較商業單劑量和雙劑量pcv2疫苗的功效),vaccine27:1002-7)，然而開發針對pcvad的基於pcv2b亞型的疫苗是必要的，優選為活減毒疫苗。基於新的pcv2b亞型的活減毒疫苗在本領域可能比當前可得的基於pcv2a亞型的死疫苗和亞單位疫苗提供更大的保護。技術實現要素：本發明提供一種豬圓環病毒(pcv)的核酸分子，其包含編碼非致病的嵌合pcv的核酸分子，所述嵌合pcv來源於1型pcv(pcv1)的基因組序列和2型pcv(pcv2)(優選為亞型pcv2b)的衣殼蛋白的至少一部分編碼序列。在本發明的一個實施方案中，pcv2的衣殼蛋白的編碼序列選自亞型pcv2a、pcv2b和pcv2c。在本發明的另一個實施方案中，pcv2的衣殼蛋白的編碼序列為亞型pcv2b的。在本發明的另一個實施方案中，pcv2的衣殼蛋白的編碼序列為pcv2(優選為亞型pcv2b)的至少一部分開放閱讀框2(orf2)。在本發明的又一個實施方案中，核酸分子編碼超過一份拷貝的非致病的嵌合pcv，所述嵌合pcv來源於1型pcv(pcv1)的基因組序列和2型pcv(pcv2)(優選為亞型pcv2b)的衣殼蛋白的至少一部分編碼序列。本發明還提供一種生物功能質粒或病毒載體，其包含編碼非致病的嵌合pcv的核酸分子，所述嵌合pcv來源於1型pcv(pcv1)的基因組序列和2型pcv(pcv2)(優選為亞型pcv2b)的衣殼蛋白的至少一部分編碼序列。本發明還提供一種被載體轉染的合適宿主細胞，所述載體包含編碼非致病的嵌合pcv的核酸分子，所述嵌合pcv來源於1型pcv(pcv1)的基因組序列和2型pcv(pcv2)(優選為亞型pcv2b)的衣殼蛋白的至少一部分編碼序列。本發明還提供一種由合適宿主細胞產生的無毒感染性嵌合pcv，所述宿主細胞被包含編碼非致病的嵌合pcv的核酸分子的載體轉染，所述嵌合pcv來源於1型pcv(pcv1)的基因組序列和2型pcv(pcv2)(優選為亞型pcv2b)的衣殼蛋白的至少一部分編碼序列。本發明還提供一種滅活的嵌合pcv，其包含2型pcv(pcv2)(優選為亞型pcv2b)的衣殼蛋白的至少一部分。在本發明的一個實施方案中，pcv2的衣殼蛋白的編碼序列選自亞型pcv2a、pcv2b和pcv2c。在本發明的另一個實施方案中，pcv2的衣殼蛋白的編碼序列為亞型pcv2b的。在本發明的另一個實施方案中，pcv2的衣殼蛋白的編碼序列為pcv2的至少一部分開放閱讀框2(orf2)。本發明還提供一種病毒疫苗，其包含生理上可接受的載體和免疫原性量的選自以下的成員：(a)豬圓環病毒(pcv)的核酸分子，其包含編碼嵌合非致病的pcv的核酸分子，所述嵌合非致病的pcv來源於1型pcv(pcv1)的基因組序列和2型pcv(pcv2)的衣殼蛋白的至少一部分編碼序列，(b)生物功能質粒或病毒載體，其包含含有編碼嵌合非致病的pcv的核酸分子的pcv的核酸分子，所述嵌合非致病的pcv來源於pcv1的基因組序列和pcv2的衣殼蛋白的至少一部分編碼序列，(c)無毒感染性非致病的嵌合pcv，其包含含有編碼嵌合非致病的pcv的核酸分子的pcv的核酸分子，所述嵌合非致病的pcv來源於pcv1的基因組序列和pcv2的衣殼蛋白的至少一部分編碼序列，和(d)滅活的嵌合pcv，其包含pcv2(優選為亞型pcv2b)的衣殼蛋白的至少一部分。在本發明的一個實施方案中，疫苗包含活的嵌合pcv病毒。在本發明的一個實施方案中，疫苗包含滅活的嵌合pcv病毒。在本發明的另一個實施方案中，疫苗另外包含佐劑。在本發明的另一個實施方案中，疫苗針對pcv2a和pcv2b感染保護。本發明還提供一種針對pcv2病毒感染免疫豬的方法，其包括將免疫有效量的病毒疫苗給予豬，所述病毒疫苗包含生理上可接受的載體和免疫原性量的選自以下的成員：(a)豬圓環病毒(pcv)的核酸分子，其包含編碼嵌合非致病的pcv的核酸分子，所述嵌合非致病的pcv來源於1型pcv(pcv1)的基因組序列和2型pcv(pcv2)的衣殼蛋白的至少一部分編碼序列，(b)生物功能質粒或病毒載體，其包含含有編碼嵌合非致病的pcv的核酸分子的pcv的核酸分子，所述嵌合非致病的pcv來源於pcv1的基因組序列和pcv2的衣殼蛋白的至少一部分編碼序列，(c)無毒感染性非致病的嵌合pcv，其包含含有編碼嵌合非致病的pcv的核酸分子的pcv的核酸分子，所述嵌合非致病的pcv來源於pcv1的基因組序列和pcv2的衣殼蛋白的至少一部分編碼序列，和(d)滅活的嵌合pcv，其包含pcv2(優選為亞型pcv2b)的衣殼蛋白的至少一部分。在本發明的一個實施方案中，所述方法包括將核酸分子或活的減毒嵌合pcv病毒給予豬。在本發明的一個實施方案中，所述方法包括將滅活的嵌合pcv病毒給予豬。在本發明的另一個實施方案中，所述方法包括將將疫苗胃腸外、鼻內、皮內或經皮給予豬。在本發明的又一個實施方案中，所述方法包括將疫苗淋巴內或肌內給予豬。本發明還提供一種針對豬圓環病毒相關的疾病(pcvad)保護豬的方法，其包括將免疫有效量的病毒疫苗給予豬，所述病毒疫苗包含生理上可接受的載體和免疫原性量的選自以下的成員：(a)豬圓環病毒(pcv)的核酸分子，其包含編碼嵌合非致病的pcv的核酸分子，所述嵌合非致病的pcv來源於1型pcv(pcv1)的基因組序列和2型pcv(pcv2)的衣殼蛋白的至少一部分編碼序列，(b)生物功能質粒或病毒載體，其包含含有編碼嵌合非致病的pcv的核酸分子的pcv的核酸分子，所述嵌合非致病的pcv來源於pcv1的基因組序列和pcv2的衣殼蛋白的至少一部分編碼序列，(c)無毒感染性非致病的嵌合pcv，其包含含有編碼嵌合非致病的pcv的核酸分子的pcv的核酸分子，所述嵌合非致病的pcv來源於pcv1的基因組序列和pcv2的衣殼蛋白的至少一部分編碼序列，和(d)滅活的嵌合pcv，其包含pcv2(優選為亞型pcv2b)的衣殼蛋白的至少一部分。附圖說明結合附圖閱讀下述發明詳述，可更清楚地理解本發明的上述特徵，其中：圖1闡明全長pcv2b和嵌合pcv1-2bdna克隆的結構和基因組組構。圖1(a)顯示pcv2b單體dna克隆。在用pcr引物a(seqidno:3)和b(seqidno:4)(表1)擴增後，使用獨特的sacii位點，在pbsk+載體中克隆野生型pcv2b的完整基因組。圖1(b)顯示嵌合pcv1-2b單體dna克隆。使用pcr引物c-h(seqidno:5-10)(表1)，通過重疊延伸pcr來構建嵌合pcv1-2bdna克隆。圖2闡明用嵌合pcv1-2b病毒和野生型pcv2b病毒實驗接種的剖腹產來源剝奪初乳的(cd/cd)豬中的pcv2衣殼特異性抗體反應。貫穿實驗對各處理組繪製平均值血清s/p比+/-sem，其中(*)表示在那天顯著不同。由於死亡或早期安樂死一些pcv2b感染的豬，在35-42dpi的組中採樣的豬少於5隻。具有不同字母的組在那天為顯著不同。圖3顯示用pbs緩衝液、嵌合pcv1-2b病毒和野生型pcv2b病毒接種的剖腹產來源剝奪初乳的(cd/cd)豬中的總體淋巴損害評分在21dpi的比較。比較處理之間的淋巴結、脾和扁桃體的組合的淋巴萎縮(lymphoiddepletion)、組織細胞置換和pcv2特異性抗原評分。在18dpi死亡的pcv2b接種的豬包括在該分析中。圓圈表示中位數，箱是第1和第3四分位數，和箱須(whisker)表示全部的數據範圍。具有不同字母的處理是顯著不同的。圖4闡明用嵌合pcv1-2b病毒和pcv2b病毒實驗接種的剖腹產來源剝奪初乳的(cd/cd)豬的血清和淋巴組織中的病毒dna載量的定量。圖4(a)顯示使用qpcr來定量血清中的病毒血症和病毒dna載量。對各處理組繪製每ml血清的組平均值log病毒基因組拷貝+/-sem，其中(*)表示在那天顯著不同。0dpi的所有樣品以及來自pbs接種的豬的所有樣品為陰性。由於死亡或早期安樂死一些pcv2b感染的豬，在35-42dpi的組中採樣的豬少於5隻。圖4(b)顯示使用qpcr來定量tbln組織中的病毒dna載量。在豬死亡或被安樂死的那天繪製對各豬所測定的淋巴結組織病毒dna載量，其中在21和42dpi繪製組平均值+/-sem。來自pbs接種的豬的所有樣品為陰性，由於pcvad而死亡或被早期安樂死的pcv2b感染的豬(實心圓圈)不包括在組平均值的分析中。(*)表示在那天顯著不同。圖5闡明用嵌合pcv1-2b病毒疫苗接種並隨後用pcv2a或pcv2b野生型病毒攻擊的常規無特異性病原體豬中的pcv2特異性抗體反應。貫穿實驗對各處理組繪製平均值血清s/p比+/-sem，其中(*)表示接種疫苗組(vax)與未接種疫苗組(pbs)之間顯著不同。用pcv2a或pcv2b在56dpv攻擊所有豬。77dpv(或21dpc)的具有不同字母的組在那天是顯著不同的。圖6顯示用pcv1-2b疫苗或pbs緩衝液接種並隨後用pcv2a或pcv2b攻擊的常規spf豬中的總體淋巴損害評分的比較。通過攻擊pcv2病毒亞型，比較接種疫苗豬與未接種疫苗豬之間的淋巴結、脾和扁桃體的組合的淋巴萎縮、組織細胞置換和pcv2特異性抗原評分。圓圈表示中位數，箱是第1和第3四分位數，和箱須表示數據範圍。具有(*)的處理對為顯著不同。圖7闡明用pbs緩衝液或pcv1-2b疫苗接種並隨後用pcv2a或pcv2b攻擊的常規豬的血清和淋巴組織樣品中的pcv2病毒dna載量的檢測和定量。圖7(a)顯示使用qpcr來定量血清中的病毒血症和病毒載量。對各處理組繪製每ml血清的組平均值log病毒基因組拷貝+/-sem。56dpv(或0dpc)的所有樣品以及來自接種疫苗豬的所有樣品對pcv2a或pcv2bdna為陰性。圖7(b)顯示使用qpcr來定量tbln組織中的病毒dna載量。繪製對各豬所測定的淋巴組織中的中位數病毒dna載量。圓圈表示中位數，箱是第1和第3四分位數，和箱須表示全部的數據範圍。在用pcv2a或pcv2b攻擊時，在所有未接種疫苗的豬的淋巴結中檢測到病毒dna，但是僅1/10的vax/pcv2b豬和5/10的vax/pcv2a豬具有可檢測的病毒dna。(*)表示基於攻擊病毒亞型，接種疫苗對與未接種疫苗對之間顯著不同。發明詳述pcv2感染和pcvad持續對全球豬群形成主要威脅。pcvad可能是如今豬工業面臨的最經濟上重要的疾病。消瘦、淋巴萎縮與組織細胞浸潤的顯微損害以及損害中存在pcv2抗原或dna是診斷豬的pcvad的三個特徵標準(segales,j.等,2005,同上)。然而，據知不是所有感染pcv2的豬將發生臨床pcvad，共感染病毒和細菌病原體對誘導全譜的臨床pcvad通常是必需的(albina,e.等,2001,anexperimentalmodelforpost-weaningmuitisystemicwastingsyndrome(pmws)ingrowingpiglets(一種發育小豬的斷奶後多系統衰竭症候群(pmws)的實驗模型),jcomppathol125:292-303；magar,r.等,2000,experimentaltransmissionofporcinecircovirustype2(pcv2)inweanedpigs:asequentialstudy(斷奶豬的2型豬圓環病毒(pcv2)的實驗傳遞：序貫研究),jcomppathol123:258-69)。在2005年之前，從美國和加拿大的pcvad病例中檢測的病毒幾乎排他地為pcv2a亞型。因此，四種全部基於pcv2a亞型的商業疫苗被開發且目前在全世界豬群中使用。全世界分離的pcv2a株是密切相關的並享有95-99%的核苷酸序列同一性，並因此這些商業疫苗已有效針對全球豬群中的pcv2a和pcvad。最近，美國和加拿大的某些地區爆發的更嚴重的pcvad病例已歸因於出現的一種新pcv2b亞型(gagnon,c.a.等,2007,同上)。pcv2a與pcv2b亞型之間的核苷酸序列相差多達10%，並已鑑定區分兩種亞型的獨特胺基酸序列基序(cheung,a.k.等,2007,同上)，從而提出是否目前完全基於pcv2a亞型的商業疫苗可針對新的pcv2b亞型感染進行全面保護的問題。在最近幾年，全球豬群的pcv2盛行已主要轉移至pcv2b亞型，事實上，美國大多數的最近pcvad病例與新的pcv2b亞型相關(cheung,a.k.等,2007,同上；firth,c等,2009,insightsintotheevolutionaryhistoryofanemerginglivestockpathogen:porcinecircovirus2(洞察新興家畜病原體的進化史：豬圓環病毒2),jvirol83:12813-21)。基於pcv2a亞型的疫苗仍在全世界使用，因為pcv2a疫苗已顯示提供交叉保護(fort,m.等,2008,同上；fort,m.等2009,同上；opriessnig,t.等,2009,同上；segales,j.等,2008,同上)。然而，基於pcv2a的疫苗所提供的針對流通的新pcv2b亞型的交叉保護程度是未知的，全球豬工業將必定獲益於能夠使用基於目前流通的主要pcv2b亞型的疫苗。因此，本發明的目的之一在於開發一種基於新的pcv2b亞型的新一代疫苗並評價基於pcv2b的疫苗針對pcv2a和pcv2b攻擊兩者的功效。本發明提供一種減毒的活的pcv1和pcv2的嵌合病毒。在一個特定實施方案中，構建了表達pcv2亞型pcv2b的衣殼蛋白的pcv1病毒。作為例示性方法，發明人首先產生了pcv2b亞型的感染性dna克隆，然後構建了新的嵌合病毒pcv1-2b，其在非致病的pcv1的基因組骨架中包含pcv2b亞型的免疫原性衣殼基因。首先在cd/cd豬中評價新的嵌合pcv1-2b病毒的致病性和免疫原性。隨後，在常規豬中進行攻擊和交叉攻擊研究以確定pcv1-2b嵌合疫苗病毒的疫苗功效。發明人證實，嵌合pcv1-2b疫苗病毒在豬中是減毒的並誘導針對pcv2b的保護性免疫和針對pcv2a的交叉保護性免疫。因此，該新的嵌合pcv1-2b疫苗應該是作為針對pcv2b和pcv2a感染兩者以及pcvad的活的減毒疫苗的優秀候選物。下述實施例展示本發明的某些方面。然而，將理解，這些實施例僅是為了例示說明，並不意在完全限制本發明的條件和範圍。應當認識到，當給出典型的反應條件(例如，溫度、反應時間等)時，儘管通常較不合宜，但還是可使用高於和低於特定範圍的條件。在室溫(約23℃-約28℃)和大氣壓下進行實施例。除非另外指定，否則本文涉及的所有份數和百分比以重量為基礎，所有溫度以攝氏度表示。實施例1pcv1和pcv2病毒隔離群：在之前的研究中構建了pcv1感染性dna克隆並在豬中顯示為非致病的(fenaux,m.等,2002,clonedgenomicdnaoftype2porcinecircovirusisinfectiouswheninjecteddirectlyintotheliverandlymphnodesofpigs:characterizationofclinicaldisease,virusdistribution,andpathologiclesions(當直接注射到豬的肝和淋巴結中時，2型豬圓環病毒的克隆的基因組dna是感染性的：臨床疾病、病毒分布和病理損害的表徵),jvirol76:541-51；fenaux,m.等2004a,同上；fenaux,m.等,2003,同上)。pcv2a隔離群isu-40895(seqidno:1,genbank登錄號af264042)於1998年在愛荷華州農場的患有pcvad的豬中發現(fenaux,m.等,2000,同上)，並已廣泛用於pcv2致病性研究(fenaux,m.等,2002,同上；fenaux,m.等,2004,同上；fenaux,m.等,2003,同上；opriessnig,t.等,2006,evidenceofbreed-dependentdifferencesinsusceptibilitytoporcinecircovirustype-2-associateddiseaseandlesions(易患2型豬圓環病毒相關的疾病和損害的品種依賴性差異的證據),vetpathol43:281-93；opriessnig,t.等,2006,effectsofthetimingoftheadministrationofmycoplasmahyopneumoniaebacterinonthedevelopmentoflesionsassociatedwithporcinecircovirustype2(豬肺炎支原體菌苗的給藥時機對發生與2型豬圓環病毒相關的損害的影響),vetrec158:149-54；opriessnig,t.等,2004,experimentalreproductionofpostweaningmuitisystemicwastingsyndromeinpigsbydualinfectionwithmycoplasmahyopneumoniaeandporcinecircovirustype2(通過用豬肺炎支原體和2型豬圓環病毒雙重感染來實驗再現豬的斷奶後多系統衰竭症候群),vetpathol41:624-40；opriessnig,t.等,2003,effectofvaccinationwithselectivebacterinsonconventionalpigsinfectedwithtype2porcinecircovirus(用選擇性菌苗接種對用2型豬圓環病毒感染的常規豬的影響),vetpathol40:521-9)。pcv2a-40895在實驗條件下能夠引起pcvad顯微損害和臨床疾病(opriessnig,t.等,2006,同上；opriessnig,t.等,2004,effectofporcineparvovirusvaccinationonthedevelopmentofpmwsinsegregatedearlyweanedpigscoinfectedwithtype2porcinecircovirusandporcineparvovirus(豬細小病毒疫苗接種對在用2型豬圓環病毒和豬細小病毒共感染的隔離早期斷奶豬中發生pmws的影響),vetmicrobiol98:209-20；opriessnig,t.等,2004,同上)。通過測序完整的病毒基因組(seqidno:2,genbank登錄號gu799576)，證實了研究中使用的pcv2b株為真正的pcv2b亞型。pcv2b的基因組dna被用作用於構建pcv2b的感染性dna克隆以及嵌合pcv1-2b感染性dna克隆的來源。在本發明之前，未在實驗感染中測定pcv2b病毒的致病性。實施例2pcv2b和嵌合pcv1-2b的感染性dna克隆的產生：之前已報導了用於構建pcv2a-40895的感染性dna克隆的方法(fenaux,m.等,2002,同上)，在本發明中使用類似的方法來產生pcv2b的感染性dna克隆(圖1a)。簡言之，使用一對具有包含存在於所有pcv2株中的sacii限制酶位點的重疊區的引物a(seqidno:3)和b(seqidno:4)(表1)，通過pcr來擴增pcv2b的全長基因組。然後用sacii(newenglandbiolabs)消化pcr產物並連接到pbluescriptiisk(+)(pbsk+)(stratagene)中以產生pcv2b的感染性dna克隆。為了產生嵌合pcv1-2b感染性dna克隆，使用重疊延伸pcr來將pcv1感染性克隆的骨架中的pcv1衣殼基因代替為來自pcv2b的衣殼基因(圖1b)。從3個重疊pcr片段(表1)裝配全長嵌合pcv1-2b基因組。使用具有相同擴增參數(95℃3分鐘；40個循環的95℃30秒、55℃30秒、68℃1分鐘)的platinumtaqhifimastermix(invitrogen)來產生各擴增子。使用qia快速凝膠提取試劑盒(qiaquickgelextractionkit,qiagen)來純化pcr產物。將由兩步組成的融合pcr用於裝配嵌合pcv1-2bdna克隆：使用50ng的各片段作為模板的不需要引物的裝配反應(20個循環的95℃30秒、55℃30秒、68℃1分鐘)，然後使用外部引物擴增(40個循環的95℃30秒、55℃30秒、68℃1分鐘)。將用引物g(seqidno:9)和h(seqidno:10)(表1)從pcv1克隆擴增的1,043bp片段首先與包含用引物c(seqidno:5)和d(seqidno:6)(表1)從pcv2b擴增的完整衣殼基因的718bp片段融合。然後加入用引物e(seqidno:7)和f(seqidno:8)(表1)從pcv1擴增的122bp片段，得到側翼為kpni限制性位點的完整嵌合pcv1-2b基因組。隨後用kpni(newenglandbiolabs)消化嵌合融合產物並克隆到pbsk+中。對單體dna克隆進行完整測序以確認在pcr擴增步驟期間沒有引入不需要的突變。實施例3pcv2b和pcv1-2bdna克隆的二聚化：之前的研究顯示，二聚化pcv2a克隆在pk-15細胞的體外轉染和豬的體內轉染兩者中更有效地產生感染性病毒，其中2份拷貝的全長pcv2a基因組通過首尾串連來連接(fenaux,m.等,2002,同上；fenaux,m.等,2004a,同上；fenaux,m.等,2003,同上)。因此，在本發明中，將pcv2b和pcv1-2b克隆兩者二聚化以產生更健壯(robust)和有效的感染性克隆。簡言之，使用qiaprepspinminiprep試劑盒(qiagen)來提取包含pcv2b和pcv1-2b單體基因組的質粒dna。使用scai(newenglandbiolabs)來線性化純化的質粒dna並通過在37℃孵育30秒來使其經受kpni的部分消化以產生大約3,100和3,700bp的兩個片段，這些片段然後通過凝膠提取來純化。使用t4dna連接酶(promega)來組合和連接兩個片段以產生pcv2b和pcv1-2b兩者的串聯二聚化感染性dna克隆。實施例4pcv2b和pcv1-2b感染性dna克隆在pk-15細胞中的生存力測試：如之前所述，在使用間接螢光測定(ifa)來轉染後，體外測試pcv2b和嵌合pcv1-2bdna克隆的生存力和感染性(fenaux,m.等,2002,同上)。簡言之，將6.5µg的各二聚化dna克隆加入1,250µloptimem培養基(invitrogen)和6.25µlplus試劑(invitrogen)中，並在室溫孵育5分鐘。加入16µllipofectamineltx(invitrogen)後，將混合物在室溫孵育30分鐘，再加入250µloptimem培養基。將包含60-70%匯合的pk-15細胞的t25細胞培養瓶(corning)用mem培養基(invitrogen)洗滌，加入轉染混合物，然後將瓶在37℃孵育6小時。孵育後，將8ml生長培養基(包含10%胎牛血清和2x抗生素/抗真菌溶液的mem[invitrogen])加入各瓶中，並在37℃孵育另外的72小時。然後將各t25瓶中的轉染細胞在-80℃冷凍和解凍3次，將細胞裂解物在4℃以2,500xg離心10分鐘以移除細胞碎片。收穫上清液並用於感染以50%匯合接種於48孔板(bd-falcon)的新鮮pk-15細胞。每孔加入100µl的轉染上清液後，將板在37℃孵育1小時，之後向各孔加入500µl生長培養基並在37℃孵育72小時。如之前所述，使用ifa來可視化感染的pk-15細胞的核中的衣殼蛋白(fenaux,m.等2002,同上)。簡言之，使用pbs中的80%丙酮在4℃固定細胞30分鐘，用pbs緩衝液洗滌1次，用1:1,000稀釋的pcv2單特異性小鼠單克隆抗體(ruraltechnologies,inc.；brookings,southdakota)在37℃孵育45分鐘。用pbs緩衝液洗滌3次後，將細胞用1:50稀釋的fitc標記的第二山羊抗小鼠igg(kpl)在37℃孵育45分鐘。用pbs緩衝液洗滌後，然後用fluoromountg(southernbiotech)蓋上細胞並在螢光顯微鏡下檢查。當轉染到pk-15細胞中時，pcv2b和嵌合pcvl-2bdna克隆是感染性的：pcv2b和嵌合pcv1-2b的全長單拷貝和串聯二聚化dna克隆被構建並由全長測序證實。用兩種dna克隆的二聚體轉染pk-15細胞引起感染性子代病毒體的產生，如通過ifa與pcv2衣殼特異性單克隆抗體來檢測的。pcv2b和嵌合pcv1-2b病毒貯液兩者的感染效價為大約104.5tcid50/ml。實施例5感染性pcv2a、pcv2b和pcv1-2b病毒貯液的產生和滴定：為了製備用於豬體內研究的接種物，通過用二聚化感染性dna克隆轉染t25瓶中的pk-15細胞來產生pcv2a-40895、pcv2b和pcv1-2b的感染性病毒貯液(參見上文)(fenaux,m.等2002.同上；fenaux,m.等2003,同上)。基本上如之前所述進行，通過ifa來滴定這些感染性病毒貯液(fenaux,m.等2002,同上)。簡言之，將pk-15細胞以60%匯合接種於48孔板(bd-falcon)，並在37℃孵育3小時。在mem中產生各病毒貯液的系列10倍稀釋液，並將各稀釋液以100µl每孔接種於四個單獨的孔。將板在37℃孵育1小時，之後向各孔加入500µl生長培養基並在37℃繼續孵育72小時。使用ifa來可視化各孔中感染細胞的核的陽性信號(參見上文)。根據reed&muench的方法來計算每ml的50%組織培養感染劑量(tcid50)。實施例6pcv2b和嵌合pcv1-2b在剖腹產來源剝奪初乳的(cd/cd)豬中的致病性研究的實驗設計：cd/cd豬被認為是用於研究pcv2致病性的優秀模型系統，因為可在該模型中再現典型的病理損害和臨床pcvad(allan,g.等,2003,同上；bolin,s.r.等,2001,同上；harms,p.a.等,2001,同上；kennedy,s.等,2000,同上；tomas,a.等,2008,同上)。為了測定嵌合pcv1-2b病毒的致病性並將其與野生型pcv2b病毒比較，將大約9周齡的總計30隻cd/cd豬(struvelabs,manning,ia)以每個房間10隻動物的形式隨機分配成三組。接種之前，對各豬稱重、出血並確認其對pcv2抗體的存在為陰性。將組1豬用3mlpbs緩衝液各自模擬接種(2ml鼻內和1ml肌內)，並充當未感染的對照。將組2中的豬用3ml的包含2x104.5tcid50嵌合pcv1-2b病毒的接種物各自接種(2ml鼻內和1ml肌內)。將組3中的豬用2x104.5tcid50野生型pcv2b病毒各自類似接種。接種之前和在此之後每周從各豬中收集血液樣品直至21或42天的接種後天數(dpi)屍體解剖。在21dpi，屍體解剖來自各組的5隻隨機分配的豬。在42dpi，屍體解剖各組中剩下的5隻豬。實施例7pcv2b和嵌合pcv1-2b在剖腹產來源剝奪初乳的(cd/cd)豬中的致病性研究的實驗設計：cd/cd豬被認為是用於研究pcv2致病性的優秀模型系統，因為可在該模型中再現典型的病理損害和臨床pcvad(allan,g.等,2003,同上；bolin,s.r.等,2001,同上；harms,p.a.等,2001,同上；kennedy,s.等,2000,同上；tomas,a.等,2008,同上)。為了測定嵌合pcv1-2b病毒的致病性並將其與野生型pcv2b病毒比較，將大約9周齡的總計30隻cd/cd豬(struvelabs,manning,ia)以每個房間10隻動物的形式隨機分配成三組。接種之前，對各豬稱重、出血並確認其對pcv2抗體的存在為陰性。將組1豬用3mlpbs緩衝液各自模擬接種(2ml鼻內和1ml肌內)，並充當未感染的對照。將組2中的豬用3ml的包含2x104.5tcid50嵌合pcv1-2b病毒的接種物各自接種(2ml鼻內和1ml肌內)。將組3中的豬用2x104.5tcid50野生型pcv2b病毒各自類似接種。接種之前和在此之後每周從各豬中收集血液樣品直至21或42天的接種後天數(dpi)屍體解剖。在21dpi，屍體解剖來自各組的5隻隨機分配的豬。在42dpi，屍體解剖各組中剩下的5隻豬。嵌合pcvl-2b病毒在cd/cd豬中是減毒的，而野生型pcv2b病毒誘導pcvad的病理損害和臨床疾病特徵：為了明確評估嵌合pcv1-2b病毒的致病潛能，在cd/cd豬模型中進行致病性研究，該模型已顯示為最可重現和高度靈敏的pcvad疾病模型(allan,g.等,2003,同上；bolin,s.r.等,2001,同上；harms,p.a.等,200,1同上；kennedy,s.等2000,同上)。臨床體徵和肉眼損害：用嵌合pcv1-2b病毒或pbs緩衝液實驗接種的cd/cd豬貫穿整個研究沒有pcvad的明顯臨床體徵，而用野生型pcv2b實驗接種cd/cd豬在10隻pcv2b感染的豬的4隻中引起pcvad相關的死亡或早期安樂死：1隻豬在18dpi死亡，另一隻在27dpi死亡，其餘兩隻由於進行性體重減輕在34dpi不得不被安樂死。來自3個處理組的每一個的豬直至21dpi都具有類似的體重增加，但野生型pcv2b感染的豬在21dpi後在5隻豬中的4隻中具有體重增加的下降(由於體重減輕3隻豬死亡或被早期安樂死)。在用嵌合pcv1-2b病毒接種的豬中未觀察到肉眼可見的肺損害，而在27dpi和34dpi屍體解剖的3隻pcv2b接種的豬顯示中等的肺損害。與pbs對照相比，pcv1-2b和pcv2b兩者感染的豬中的淋巴結擴大。然而，pcv1-2b感染的豬中具有擴大淋巴結的豬數量與擴大量比野生型pcv2b豬中的少(數據未顯示)。顯微損害：通過以下兩組中的處理來分析顯微損害：在21dpi或之前屍體解剖的所有豬(包括在18dpi死亡的pcv2b感染的豬)，和在42dpi屍體解剖的所有豬(包括在27dpi和34dpi死亡或被安樂死的3隻pcv2b感染的豬)。肺、肝、胸腺、心、腎、迴腸、結腸、淋巴結、脾和扁桃體中的顯微損害在表2中概述。正如預期的，用pbs緩衝液接種的豬中沒有顯著的顯微損害。在21和42dpi，與用野生型pcv2b實驗接種的豬相比，用嵌合pcv1-2b病毒接種的豬的淋巴組織中的典型的pcv2相關顯微損害的發生率和嚴重性都下降(表2)。其他非淋巴組織中的顯微損害包括淋巴細胞和巨噬細胞的輕度至嚴重浸潤(表2)。在野生型pcv2b感染的豬中幾乎排他地發現了小腸和大腸中的損害。在21dpi，用嵌合pcv1-2b病毒接種的豬的平均值組總體淋巴損害評分顯著(p=0.045)低於用野生型pcv2b病毒接種的豬的評分，並與用pbs緩衝液接種的豬沒什麼不同(圖3)。pcv2血清學：將從死亡或被早期安樂死的豬中獲得的血清樣品與來自下一步預定屍體解剖的血清樣品一起分析(例如，在分析來自21dpi屍體解剖的樣品時包括來自在18dpi死亡的豬的血清)。早在7dpi就在一些pcv1-2b感染的豬的血清中檢測到pcv2衣殼特異性igg抗體，其中9/10的豬至21dpi血清轉變(圖2)。嵌合pcv1-2b病毒接種的豬中的pcv2igg抗體效價至28dpi達到穩定並直至研究結束(42dpi)保持高的。在用野生型pcv2病毒實驗接種的豬中，血清轉變較不一致：僅3/10的豬至21dpi血清轉變，而5/10的豬在該研究中不具有可檢測的血清轉變。然而，僅2/5的pcv2b感染的豬活到dpi42的預定屍體解剖，且兩者在28dpi進行血清轉變，直至研究結束都具有增加的igg抗體效價。由於臨床pcvad而死亡或被早期安樂死的豬中，在任何時間僅1/4具有可檢測的pcv2特異性抗體，沒有豬在它們被屍體解剖的那天具有可檢測的血清抗pcv2抗體。貫穿該研究在任何pbs緩衝液接種的豬中都未檢測到pcv2衣殼特異性抗體。通過ihc確定的組織中的患病率和pcv2特異性抗原的量：不同組織中的患病率和pcv2抗原的平均值組量在表3中概述。一起分析在21dpi或之前屍體解剖的所有豬(包括在18dpi死亡的pcv2b感染的豬)，並一起分析在42dpi屍體解剖的所有豬(包括在27dpi和34dpi死亡或被安樂死的3隻pcv2b感染的豬)。通常，與用野生型pcv2b病毒接種的豬相比，用嵌合pcv1-2b病毒接種的豬的發病率和pcv2抗原的量都較低(表3)。在除了扁桃體外的所有21dpi組織中有1隻pcv1-2b接種的豬引起陽性結果，在扁桃體中5隻豬中的4隻為陽性。來自pcv1-2b接種的豬的組織在42dpi大部分為陰性，其中淋巴結除外，在淋巴結中5隻豬中的4隻檢測到少量的pcv2抗原。pcv2病毒血症和血清病毒載量：使用擴增部分pcv2b衣殼基因的改良qpcr測定來測定感染的動物的血清中的pcv2病毒載量，已知qpcr測定對pcv2b和pcv1-2b兩者起作用(yang,z.z.等,2007,detectionofpcv2dnabysybrgreenl-basedquantitativepcr(通過基於sybr綠l的定量pcr來檢測pcv2dna).jzhejiangunivscib8:162-9)。確認在接種前0天和貫穿該研究從pbs緩衝液接種的豬中取得的所有血清樣品不具有可檢測的pcv2dna。將從由於pcvad疾病而死亡或被早期安樂死的豬中取得的血清樣品與來自下一步預定屍體解剖的血清樣品一起分析(例如，在分析來自21dpi的樣品時包括來自在18dpi死亡的豬的血清)。從14dpi直至研究結束，用嵌合pcv1-2b病毒接種的豬中存在的血清病毒載量顯著(p≤0.009)低於pcv2b接種的豬中的血清病毒載量(圖4a)。pcv1-2b感染的豬中的平均血清病毒載量在14dpi達到峰值107基因組拷貝/ml，並平穩下降直至研究結束。對於任何單個pcv1-2b感染的豬所實現的最大值為在14dpi的108基因組拷貝/ml。與此相比，pcv2b感染的豬中的平均值血清病毒載量從14dpi直到28dpi後都保持高於108基因組拷貝/ml，其中單個豬所實現的最大值為1012。由於pcvad而早期死亡或被安樂死的4隻豬比其他pcv2b接種的豬具有較高水平的血清病毒載量。7dpi後，pcv2b感染的豬的每ml血清的病毒基因組拷貝是pcv1-2b感染的豬的至少10倍，並在21dpi和28dpi為100倍。淋巴組織中的pcv2病毒載量：使用如上文的相同qpcr測定來測定在屍體解剖各豬時所收集的tbln組織中的pcv2病毒dna的量。確認來自pbs緩衝液接種的豬的所有tbln組織樣品對pcv2dna為陰性。為了能夠進行21dpi與42dpi的組平均值病毒載量的有意義比較，測試但在分析中不包括由於pcvad疾病而早期死亡或被安樂死的豬。發現在21dpipcv1-2b接種的豬中的每mg的tbln組織中存在的病毒載量顯著低於pcv2b接種的豬中的病毒載量(p=0.005)(圖4b)。在所有被測試的tbln組織中，由於pcvad而死亡或被早期安樂死的豬在tbln組織中都具有最高的病毒載量。實施例8嵌合pcv1-2b病毒在常規無特異性病原體(spf)豬中的疫苗接種和免疫原性研究的實驗設計：從商業農場(virginiatechswinecenter,blacksburg,va)購買總計40隻3周齡雜交種spf豬，已知這些豬不含pcv、prusv、ppv、豬肺炎支原體和豬戊型肝炎病毒。將小豬隨機分配成2組，每組20隻豬並單獨圈養。接種之前，對各豬稱重、出血並確認其對pcv2抗體為陰性。將組1豬用1ml的嵌合pcv1-2b病毒各自肌內(im)接種疫苗(每隻豬103.5tcid50感染性病毒)。將組2豬用1mlpbs緩衝液各自im模擬接種疫苗並充當未接種疫苗的對照。每天監控所有動物的臨床體徵，並在接種之前和在此之後直至56天的接種疫苗後天數(dpv)每周從各豬中收集血液樣品。實施例9用野生型pcv2b亞型和pcv2a亞型分別攻擊和交叉攻擊接種疫苗的豬的實驗設計：在56dpv，將20隻接種疫苗的豬進一步分為每組10隻豬的兩組，並在單獨的房間中圈養：將10隻接種疫苗的豬各用2x104.5tcid50野生型pcv2b病毒攻擊(2ml鼻內和1mlim)，將另外10隻接種疫苗的豬各用2x104.5tcid50野生型pcv2a病毒類似地交叉攻擊。亦將20隻未接種疫苗的對照豬進一步分為兩組，每組10隻豬，並分別用pcv2b和pcv2a類似地接種。每周收集血液樣品直至21天的攻擊後天數(dpc)(或77dpv)，在那時將所有豬屍體解剖。用嵌合pcv1-2b病毒疫苗接種針對pcv2b亞型攻擊和pcv2a亞型交叉攻擊賦予常規豬的保護性免疫：因為嵌合pcv1-2b疫苗旨在常規豬的領域使用，所以發明人使用常規spf豬來進行該疫苗功效和攻擊研究。臨床體徵和肉眼損害：貫穿該研究沒有豬發生與pcvad一致的臨床體徵，且在處理組之間未觀察到體重增加的差異。分配到未接種疫苗/pcv2b攻擊組的1隻豬在2dpc死於與pcvad不相關的細菌性敗血症，且不包括在分析中。在屍體解剖時，在任何處理組中都未觀察到肉眼可見的肺損害。在所有處理組中都看到了輕微至中等擴大的淋巴結，其中處理之間未觀察到顯著差異。血清學：研究之前確定所有豬對針對pcv2、prrsv、ppv和siv的抗體為陰性。早在14dpv就在pcv1-2b疫苗接種的豬的血清中檢測到了pcv2衣殼特異性抗體，其中在21dpv15/20的豬發生血清轉變，並至28dpv20/20的豬發生血清轉變(圖5)。pcv2igg抗體效價至35dpv達到穩定並在56dpv攻擊時保持高的。直到在14dpc攻擊後，在未接種疫苗的對照豬中未檢測到抗pcv2的抗體(圖5)：在14dpc，與僅2/9血清陽性的pcv2b攻擊的豬相比，10/10pcv2a攻擊的豬為血清陽性的。至21dpc，7/9未接種疫苗的pcv2b攻擊的豬血清轉變。顯微損害：攻擊後，與接種疫苗的豬相比，未接種疫苗的豬的淋巴組織中的顯微損害評分的發生率和嚴重性較高(表4)。大體上，與未接種疫苗的對照相比，接種疫苗的豬的典型淋巴萎縮和組織細胞置換評分較低(表4)。對於pcv2a(p=0.0001)和pcv2b(p=0.04)攻擊組兩者，接種疫苗的豬的總體淋巴損害評分都顯著低於未接種疫苗的豬的評分(圖6)。通過ihc確定的組織中的pcv2抗原的量：將ihc用於檢測各組織類型(表4)中的pcv2特異性抗原。與組織損害類似，與未接種疫苗的對照相比，大體上接種疫苗的豬的組織中的發生率和pcv2抗原的量都降低(表4)。病毒血症和血清病毒載量：使用改良qpcr測定來定量攻擊後血清中的pcv2a或pcv2b病毒dna的量，該測定對檢測pcv2a或pcv2brep基因特異但不能夠擴增疫苗病毒pcv1-2b(mcintosh,k.a.等2009.developmentandvalidationofasybrgreenreal-timepcrforthequantificationofporcinecircovirustype2inserum,buffycoat,feces,andmultipletissues(開發和驗證用於定量血清、棕黃層、排洩物和多種組織中的2型豬圓環病毒的sybr綠實時pcr).vetmicrobiol133:23-33)。確認在56dpv攻擊之前收集的血清樣品不具有可檢測的pcv2dna。在攻擊後的任何時間點在接種疫苗的豬中沒有可檢測的pcv2a或pcv2b病毒血症。與此相比，在攻擊後的每個時間點在所有未接種疫苗的豬中都檢測到了pcv2a或pcv2b病毒血症(圖7a)。用pcv2a或pcv2b病毒攻擊的未接種疫苗的豬之間在血清病毒載量方面無統計上顯著差異。淋巴組織中的pcv2a或pcv2b病毒載量：屍體解剖時tbln組織中所收集的pcv2a或pcv2b病毒dna的量在圖7b中概述。在pcv2a(p=0.0001)和pcv2b(p<0.0001)攻擊組兩者中，與未接種疫苗的豬相比，發現接種疫苗的豬中每mg的tbln組織中的病毒載量顯著較低(圖7b)。僅1/10的接種疫苗的且pcv2b攻擊的豬在tbln組織中具有可檢測的pcv2b病毒dna，其中病毒載量為105基因組拷貝/mg。5/10的接種疫苗的且pcv2a攻擊的豬在tbln組織中具有可檢測的pcv2a病毒dna，其中各自的病毒載量為105-106基因組拷貝/mg。未接種疫苗的豬的tbln組織中的病毒載量範圍為108-1010基因組拷貝/mg，而不管pcv2a抑或pcv2b攻擊。實驗材料和方法細胞：之前通過終點稀釋pk-15細胞(atccccl-33)來產生無pcv1汙染的pk-15細胞系的亞克隆(fenaux,m.等,2000,同上；fenaux,m.等,2002,同上)。將無pcv1的pk-15細胞系用於產生感染性病毒貯液和本發明使用的病毒貯液的感染性滴定。血清學：如之前所述，將elisa用於檢測各血清樣品中的抗pcv2igg(nawagitgul,p.等,2002,modifiedindirectporcinecircovirus(pcv)type2-basedandrecombinantcapsidprotein(orf2)-basedenzyme-linkedimmunosorbentassaysfordetectionofantibodiestopcv(用於檢測抗pcv的抗體的改良的間接的基於2型豬圓環病毒(pcv)和基於重組衣殼蛋白(orf2)的酶聯免疫吸附測定),clindiagnlabimmunol9:33-40)。血清樣品具有樣品：陽性(s:p)比大於0.2被認為對抗pcv2抗體陽性。在開始動物實驗之前通過elisa來確認所有豬為pcv2血清陰性的。臨床評價：接種、接種疫苗或攻擊後，每天評價豬的pcvad的臨床體徵，pcvad的臨床體徵包括消瘦、呼吸窘迫和行為變化(例如嗜睡和食欲不振)。肉眼可見病理學和組織病理學：以盲方式在指定時間對所有豬進行屍體解剖用於致病性(dpi21和42)或攻擊實驗(dpc21或dpv77)。進行肉眼可見的肺損害(感染的肺範圍為0-100%)和淋巴結大小(範圍為0[正常]-3[4倍正常大小])的估算，並對各豬評分(halbur,p.g.等,1995,comparisonofthepathogenicityoftwousporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusisolateswiththatofthelelystadvirus(兩種us豬繁殖與呼吸症候群病毒隔離群與萊利斯塔德病毒的致病性的比較),vetpathol32:648-60；opriessnig,t.等,2004,同上)。在各屍體解剖期間收集肺、淋巴結(腹股溝表面的、縱膈的、氣管支氣管的和腸繫膜的)、扁桃體、心、胸腺、迴腸、腎、結腸、脾和肝的切片，並固定在10%中性緩衝福馬林中和常規處理用於組織學檢查和免疫組織化學(ihc)。同樣，從各豬收集氣管支氣管淋巴結(tbln)樣品用於dna提取並通過實時pcr來定量病毒基因組。如之前所述，以盲的方式對肺、心、肝、腎、迴腸和結腸中的顯微損害評分(opriessnig,t.等,2004,同上)。基於淋巴萎縮和濾泡的組織細胞置換評價了包括淋巴結、脾和扁桃體在內的淋巴組織，範圍為0(正常)-3(嚴重)(opriessnig,t.等,2004,同上)。免疫組織化學(ihc)：使用兔多克隆抗血清對福馬林固定石蠟包埋的肺、淋巴結(腹股溝表面的、縱膈的、氣管支氣管的和腸繫膜的)、扁桃體、心、胸腺、迴腸、腎、結腸、脾和肝的切片進行用於檢測pcv2特異性抗原的ihc(sorden,s.d.等1999.developmentofapolyclonal-antibody-basedimmunohistochemicalmethodforthedetectionoftype2porcinecircovirusinformalin-fixed,paraffin-embeddedtissue(開發基於多克隆抗體的免疫組織化學方法用於檢測福馬林固定石蠟包埋的組織中的2型豬圓環病毒).jvetdiagninvest11:528-30)。以盲的方式估算各組織中的pcv2抗原的評分，評分範圍為0(無抗原)-3(淋巴組織中超過50%淋巴濾泡含有陽性pcv2抗原染色的細胞或者其他組織切片中的pcv2抗原量高)(opriessnig,t.等,2004,同上)。總體顯微淋巴損害評分：如之前所述，對各豬計算總體顯微淋巴損害的平均評分(opriessnig,t.等,2004,同上)。這些損害評分是基於淋巴組織中存在的組合的淋巴萎縮(ld)、組織細胞置換(hr)和pcv2抗原，如通過ihc測定的。定量實時pcr測定病毒dna載量：根據由製造商提供的「血液和體液」方案，使用qiaampdnaminikit(qiageninc)來從血清樣品中提取總dna。將屍體解剖期間所收集的tbln組織勻漿化以產生無菌pbs緩衝液中的10%組織勻漿懸浮液，並根據製造商(qiageninc)提供的「組織」方案，使用qiaampdnaminikit來提取總dna。將所有tblndna提取物在無菌水中至少以1:100稀釋，以便消除來自與豬基因組dna結合的sybr綠的背景螢光。由於一些樣品中極其高的病毒dna濃度，將一些血清和tbln提取物稀釋達1:106，以便使它們在qpcr檢測的線性範圍內。將兩種基於sybr綠i的qpcr測定改良用於本發明，以定量tbln和血清dna提取物中存在的pcv2基因組(mcintosh,k.a.等,2009,developmentandvalidationofasybrgreenreal-timepcrforthequantificationofporcinecircovirustype2inserum,buffycoat,feces,andmultipletissues(開發和驗證用於定量血清、棕黃層、排洩物和多種組織中的2型豬圓環病毒的sybr綠實時pcr),vetmicrobiol133:23-33；yang,z.z.等,2007,同上)。在cd/cd豬致病性研究中，發明人使用一種之前公布的qpcr測定，該測定擴增部分pcv2b衣殼基因以定量血清和tbln中存在的病毒基因組(yang,z.z.等,2007,同上)。修改方案以使得能夠使用sensimixsybr和螢光素試劑盒(quantace)。各25µl反應包括200nm各引物(p1(seqidno:11):5'-ataacccagcccttctcctacc-3')；p2(seqidno:12):5'-ggcctacgtggtctacatttcc-3')、200µmdntp、3mmmgcl2和5µldna提取物。使用修改的程序(95℃10分鐘；35個循環的95℃15秒、59℃30秒、72℃30秒)，在myiqqpcr循環變溫器(biorad)中對各樣品運行一式三份的反應。使用相對ct法，針對pcv2b感染性dna克隆的重複標準品定量病毒基因組，具有6-log線性範圍的定量(103-108拷貝)。在攻擊和交叉攻擊常規spf豬研究中，發明人使用一種之前公布的qpcr測定，該測定擴增pcv2複製酶基因區的高度保守區以定量血清和tbln組織中存在的病毒基因組的量(mcintosh,k.a.等,2009,同上)。該測定不檢測疫苗接種中所使用的嵌合pcv1-2b疫苗病毒，並因此允許僅精確定量攻擊pcv2a或pcv2b病毒。修改該方案以使得能夠使用sensimixsybr和螢光素試劑盒。各25µl反應包括200nm各引物(pcv2-83f(seqidno:13):5'-aaaagcaaatgggctgctaa-3'；pcv2-83r(seqidno:14):5'-tggtaaccatcccaccactt-3')、200µmdntp、5mmmgcl2和5µldna提取物。使用修改的程序(95℃10分鐘；35個循環的95℃15秒、60℃15秒、72℃15秒)，在myiqqpcr循環變溫器中對各樣品運行一式三份的反應。使用相對ct法，針對pcv2b感染性dna克隆的重複標準品定量病毒dna基因組，具有5-log線性範圍的定量(5x102-5x106拷貝)。通過qpcr檢測的病毒的序列確認：測試從各組所選擇的豬中提取的tbln組織dna提取物，以確認由qpcr檢測的病毒與各研究開始時接種到豬中的病毒相同。使用對pcv1-2b特異的引物(pcv2f(seqidno:15):5'-tgttgaagatgccatttttcc-3'；pcv1r(seqidno:16):5'-gaggagttctaccctcttcc-3')，通過pcr擴增和部分測序來確認cd/cd致病性研究中的pcv1-2b。使用對pcv2特異的引物(pcv2f(seqidno:17):5'-tgttgaagatgccatttttcc-3'；pcv2r(seqidno:18):5'-gaggtgttcgtccttcctca-3')，擴增和測序pcv2a和pcv2b。統計分析：使用重複措施方差分析(anova)來分析血清學和血清qpcr。使用簡單anova來分析來自cd/cd致病性研究的tblnqpcr。對於所有anova模型，使用glimmix程序的切片選項來研究簡單的效果比較，之後使用tukey的程序用於多重比較。使用精確wilcoxon2樣品測試來分析來自攻擊研究的tblnqpcr結果。用精確kruskal-wallis單向anova評估來自兩組實驗的淋巴損害、組織病理學損害和ihc的評分，之後將精確wilcoxon2樣品測試用於所關注的雙向比較。使用bonferroni的程序來調整雙向比較用於多重比較。將統計顯著性設為α=0.05。使用市售軟體(sas版本9.2,cary,nc,usa)來進行所有分析。發明人之前基於從pcv2a亞型製備的嵌合疫苗已開發了滅活疫苗suvaxynpcv2®onedose™(fenaux,m.等2004,同上；fenaux,m.等2003,同上)，該死疫苗是有效的且目前在全球市場上可得。通過使用類似地策略，在本研究中，發明人首先開發了一種新的嵌合病毒pcv1-2b，其中pcv2b亞型的衣殼基因克隆到非致病pcv1的基因組骨架中。在cd/cd和常規豬模型中針對pcv2和pcvad充分研究了使用該嵌合pcv1-2b病毒作為活減毒的新一代疫苗。對於使用嵌合pcv1-2b病毒作為活減毒疫苗，重要的是確定疫苗病毒是減毒的。雖然pcv2單獨很少引起實驗模型中的全譜臨床疾病，但是使用cd/cd豬已引起臨床pcvad的成功再現(allan,g.等,2003,同上；bolin,s.r.等,2001,同上；harms,p.a.等,2001,同上；kennedy,s.等,2000,同上；tomas,a.等,2008,同上)。因此，在本發明中，為了明確確定嵌合pcv1-2b病毒的致病性並將它與其親代野生型pcv2b病毒比較，發明人選擇cd/cd豬模型用於致病性研究。正如預期的，野生型pcv2b單獨引起cd/cd豬的重度臨床pcvad，導致4/10的pcv2b感染的豬由於pcvad的臨床表現而死亡或早期安樂死。這與之前的顯示pcv2感染的cd/cd豬的25%的死亡率和顯著的臨床pcvad的研究一致(allan,g.等,2003,同上；bolin,s.r.等,2001,同上；harms,p.a.等,2001,同上)。pcv2b感染的豬的總體淋巴損害評分與中等至重度全身性pcvad一致(opriessnig,t.等2007,同上)。雖然宿主變異阻止單獨明確的診斷截止值(cut-off)，但是重度pcvad病例的病毒血症的一般可接受閾值為每ml的血清107病毒基因組拷貝(brunborg,i.m.等,2004,quantitationofporcinecircovirustype2isolatedfromserum/plasmaandtissuesamplesofhealthypigsandpigswithpostweaningmuitisystemicwastingsyndromeusingataqman-basedreal-timepcr(使用基於taqman的實時pcr來定量從健康豬和患有斷奶後多系統衰竭症候群的豬的血清/血漿和組織樣品中分離的2型豬圓環病毒),jvirolmethods122:171-8；olvera,a.等,2004,comparisonofporcinecircovirustype2loadinserumquantifiedbyarealtimepcrinpostweaningmuitisystemicwastingsyndromeandporcinedermatitisandnephropathysyndromenaturallyaffectedpigs(由實時pcr定量的斷奶後多系統衰竭症候群和豬皮炎腎病症候群天然感染的豬的血清中2型豬圓環病毒載量的比較),jvirolmethods117:75-80；segales,j.等,2005,quantificationofporcinecircovirustype2(pcv2)dnainserumandtonsillar,nasal,tracheo¬bronchial,urinaryandfaecalswabsofpigswithandwithoutpostweaningmuitisystemicwastingsyndrome(pmws)(定量患有和不患有斷奶後多系統衰竭症候群(pmws)的豬的血清以及扁桃體、鼻、氣管-支氣管、尿和糞便的化驗標本中的2型豬圓環病毒(pcv2)dna),vetmicrobiol111:223-9)。至21dpi，與僅1/10的嵌合pcv1-2b病毒感染的豬相比，9/10的pcv2b感染的豬超過該閾值。由於pcvad而死亡或被較早安樂死的4隻豬都在血清和淋巴組織中具有較高的pcv2dna病毒載量，但不具有可檢測的pcv2igg抗體，這表明這些pcv2b感染的豬死於不足的免疫反應和較高水平的病毒複製。該結果與之前報導的低抗體反應與增加的pcvad嚴重性之間的相關性一致(meerts,p.等,2006,correlationbetweenthepresenceofneutralizingantibodyagainstporcinecircovirus2(pcv2)andprotectionagainstreplicationofthevirusanddevelopmentofpcv2-associateddisease(存在針對2型豬圓環病毒(pcv2)的中和抗體與針對病毒複製和發生pcv2相關疾病的保護之間的相關性),bmcvetres2:6)。數據清楚表明本發明中使用的pcv2b亞型是高毒力的。儘管用至少20倍正常疫苗接種劑量的劑量來接種cd/cd豬，還是發現嵌合pcv1-2b病毒在cd/cd豬模型中為顯著減毒的(fenaux,m.等,2004,同上)。嵌合pcv1-2b病毒的減毒由用於比較嵌合pcv1-2b和野生型pcv2b病毒的所有定量和定性參數清楚證明。與約一半的pcv2b感染的豬中看到的死亡和消瘦相比，用嵌合pcv1-2b病毒感染的豬中未看到死亡或發病。嵌合pcv1-2b感染的豬的淋巴組織中的顯微損害評分和pcv2特異性抗原的量顯著低於用野生型pcv2b感染的豬，表明嵌合pcv1-2b病毒僅引起亞臨床感染。總體上，嵌合pcv1-2b感染的豬的淋巴損害評分與用pbs緩衝液接種的對照豬無顯著不同。此外，血清和淋巴組織中較低的pcv2b病毒載量與嵌合pcv1-2b感染的豬中顯著較低的典型損害或疾病嚴重性直接相關，如之前的研究中所觀察的(brunborg,i.m.等,2004,同上；dupont,k.等,2009,transmissionofdifferentvariantsofpcv2andviraldynamicsinaresearchfacilitywithpigsmingledfrompmws-affectedherdsandnon-affectedherds(pmws感染的豬群與未感染的豬群混合的研究設施中的不同pcv2變體的傳遞和病毒動力學),vetmicrobiol139:219-26；fenaux,m.等,2004,同上；harding,j.c等,2008,porcinecircovirus-2dnaconcentrationdistinguisheswastingfromnonwastingpigsandiscorrelatedwithlesiondistribution,severity,andnucleocapsidstainingintensity(豬圓環病毒-2dna濃度區分消瘦豬和非消瘦豬，且與損害分布、嚴重性和核衣殼染色強度相關),jvetdiagninvest20:274-82；krakowka,s.等,2005,featuresofporcinecircovirus-2disease:correlationsbetweenlesions,amountanddistributionofvirus,andclinicaloutcome(豬圓環病毒-2疾病的特徵：損害、病毒的量和分布與臨床結果的相關性),jvetdiagninvest17:213-22；mcintosh,k.a.等,2009,同上；olvera,a.等,2004,同上；yang,z.z.等,2007,同上)。在證明嵌合pcv1-2b病毒在易受感染和敏感性cd/cd豬模型中為減毒的後，發明人然後在常規spf豬中進行了組合免疫原性和攻擊研究。選擇3周齡常規雜交種spf豬用於免疫原性/攻擊實驗以便更加密切模擬野外疫苗接種條件，因為這樣的活減毒疫苗將最終用於常規豬。雖然基於我們較早公布的研究，在該常規spf模型中不預期臨床pcvad(fenaux,m.等,2002,同上；fenaux,m.等,2004,同上；fenaux,m.等,2004,同上；fenaux,m.等,2003,同上,fenaux,m.等,2004a.同上；opriessnig,t,等,2009,differenceinseverityofporcinecircovirustypetwo-inducedpathologicallesionsbetweenlandraceandpietrainpigs(2型豬圓環病毒誘導的病理學損害的嚴重性在蘭德瑞斯豬與皮特蘭豬之間的差異),janimsci87:1582-90；opriessnig,t.等,2008,同上)，但是預期由pcv2誘導的常規豬模型的淋巴組織中的病毒血症、病毒載量和典型組織學損害的水平是用於評價疫苗功效的充分參數(fenaux,m.等,2004,同上)。作為活減毒疫苗，重要的是確定是否嵌合pcv1-2b病毒在對豬接種疫苗時可誘導足夠水平的保護性抗體反應。4種目前可得的疫苗中的2種是基於重組pcv2a衣殼蛋白，因此已知pcv2衣殼特異性體液免疫反應對保護重要。本發明的結果顯示，早在14dpv就在pcv1-2b疫苗接種的豬的血清中檢測到pcv2衣殼特異性抗體，並至28dpv所有的20隻接種疫苗的豬都血清轉變為抗pcv2衣殼特異性抗體。抗體效價至35dpv達到穩定並在56dpv攻擊時保持高的，表明嵌合pcv1-2b疫苗病毒能夠引起常規豬中的強體液免疫反應。在用野生型pcv2a或pcv2b亞型攻擊時，與未接種疫苗的對照相比，用減毒的嵌合pcv1-2b病毒疫苗接種的常規spf豬具有在血清和tbln組織中顯著較低的病毒dna載量、顯著減少的典型顯微損害的嚴重性和發生率水平和顯著較低的淋巴組織中的pcv2特異性抗原的量，表明嵌合pcv1-2b病毒誘導針對野生型病毒攻擊的保護性免疫。結果亦顯示，與未接種疫苗的對照相比，用嵌合pcv1-2b病毒疫苗接種的豬針對pcv2b亞型的同源攻擊和pcv2a亞型的異源攻擊被同等地保護，這由完全沒有pcv2a或pcv2b病毒血症、淋巴組織中的病毒7載量的顯著減少和接種疫苗的豬中的顯著較低的總體淋巴損害評分所證實，而不管攻擊病毒亞型。因此，似乎新的活減毒嵌合pcv1-2b疫苗候選物誘導針對兩種pcv2亞型的保護性免疫和交叉保護性免疫。一些最近的研究已報導，當與pcv2a亞型相比時，通常pcv2b亞型與更嚴重的臨床疾病相關(carman,s.等,2008,同上；chae,j.s.andk.s.choi,2009,同上；grau-roma,l等,2008,aproposalonporcinecircovirustype2(pcv2)genotypedefinitionandtheirrelationwithpostweaningmuitisystemicwastingsyndrome(pmws)occurrence(對2型豬圓環病毒(pcv2)基因型定義及其與斷奶後多系統衰竭症候群(pmws)發生的關係的建議),vetmicrobiol128:23-35)。然而，是否pcv2b亞型比pcv2a亞型更加有毒力仍然有爭議，因為其他研究不能明確顯示pcv2a與pcv2b在毒力方面的顯著差異(an,d.j.等,2007,同上；lager,k.m.等,2007,同上；madson,d.m.等,2008,同上；opreissnig,t.等,2006,同上；opreissnig,t.等,2008,同上)。由於pcv2a與pcv2b之間的序列趨異，pcv2的兩種亞型在致病性方面可不同是可能的，因為已顯示，cap基因中僅兩個胺基酸變化足以改變pcv2a的致病性(fenaux,m.等,2004,twoaminoacidmutationsinthecapsidproteinoftype2porcinecircovirus(pcv2)enhancedpcv2replicationinvitroandattenuatedthevirusinvivo(2型豬圓環病毒(pcv2)的衣殼蛋白中的2個胺基酸突變增強體外pcv2複製和體內使病毒減毒),jviol78:13440-6)。在當前研究的未接種疫苗的對照組中，其中一半的豬用pcv2a或pcv2b攻擊，發明人未觀察到組之間在毒力方面的任何顯著差異。pcv2a與pcv2b的攻擊劑量是等效的，但是血清和tbln組織中的pcv2病毒載量、典型的顯微損害評分或淋巴組織中的pcv2抗原的量在pcv2a與pcv2b攻擊組之間無顯著差異。在未接種疫苗的豬中，與pcv2a相比，對pcv2b的抗體反應有一些較小的差異，包括稍延遲的血清轉變(圖5)。在接種疫苗的豬中，pcv2b攻擊引起稍高的總體淋巴損害評分，而pcv2a攻擊引起較高數量的qpcr陽性的tbln組織。總體上，結果與其他發現pcv2a與pcv2b致病性在實驗條件下無顯著差異的研究一致(an,d.j.等,2007,同上；lager,k.m等,2007,同上；madson,d.m.等,2008,同上；opriessnig,t.等,2006,同上；opriessnig,t.等,2008,同上)。已報導了pcv2a與pcv2b亞型之間的抗原概況的差異，推測目前基於pcv2a的商業疫苗所缺失的足夠的交叉保護水平可歸因於全球豬群中與pcv2b亞型相關的pcvad嚴重性的增加(cheung,a.k.等,2007,同上；dupont,k.等,2008,同上；lekcharoensuk,p.等,2004,同上；shang,s.b.等,2009,同上)。pcv2a與pcv2b之間的多數序列變異似乎在衣殼基因(包括信號獨特的胺基酸基序)中(cheung,a.k.等,2007,同上；olvera,a.等,2004,同上)。針對該基序產生的抗體能夠體外區分pcv2a和pcv2b，表明抗原性可能不同(beach等,未公布數據)。本發明的結果顯示，基於新的pcv2b亞型的衣殼的活減毒疫苗pcv1-2b的確針對pcv2a的異源攻擊保護，因此支持之前基於pcv2a的滅活商業疫苗所賦予的pcv2b亞型的交叉保護的證據(fort,m.,等,2008,同上；fort,m.等,2009,同上；opriessnig,t.等,2009,同上；opriessnig,t.等,2008,同上)。總之，本發明的數據表明，基於新的pcv2b亞型的嵌合pcv1-2b疫苗候選物在cd/cd豬中是減毒的，並針對pcv2b和pcv2a攻擊分別在接種疫苗的常規豬中誘導保護性免疫和交叉保護性免疫。本發明的結果將為進一步開發該嵌合pcv1-2b病毒作為第一個針對pcv2感染和pcvad的活減毒疫苗提供基礎。雖然pcv1-2b疫苗病毒單獨提供針對pcv2a和pcv2b亞型的交叉保護，但是組合本發明的pcv1-2b疫苗與目前基於pcv2a的商業疫苗用於更完全的保護將來可為更有利。感染性病毒和分子dna克隆的疫苗以及使用它們的方法亦包括在本發明的範圍內。接種的豬被保護免受嚴重的病毒感染和由pcv2感染或共感染引起的其他疾病。新的方法通過向豬給予免疫有效量的本發明疫苗(例如，包含免疫原性量的感染性pcvdna、含有pcv的感染性dna克隆的質粒或病毒載體、重組pcvdna、多肽表達產物等的疫苗)來針對病毒感染保護需要保護的豬。可向豬同時給予其他抗原(例如prrsv、ppv)、其他感染性豬病原體和免疫刺激物以針對病毒感染提供廣譜的保護。疫苗包含，例如與無毒的生理上可接受的載體和任選一種或多種佐劑組合的感染性病毒和分子dna克隆、合適質粒或載體(例如psck載體)中的克隆的pcv感染性dna基因組、無毒的活病毒、滅活的病毒等。疫苗亦可包含本文所述的感染性pcv2分子dna克隆。感染性pcvdna、包含感染性病毒基因組的質粒dna和活病毒是優選的，其中活病毒是最優選的。本發明的無毒的活病毒疫苗相對於傳統病毒疫苗提供優勢，傳統病毒疫苗使用有回到有毒狀態風險的減毒活病毒或死的細胞培養物繁殖的完整病毒，其可能不誘導足夠的抗體免疫反應用於針對病毒疾病保護。疫苗和使用它們的方法亦包括在本發明的範圍內。接種的哺乳動物物種被保護免於嚴重的病毒感染，亦可對涉及pcv共感染的疾病提供保護，所述疾病例如pcvad和豬皮炎腎病症候群(pdns)以及其他相關疾病。疫苗包含例如滅活的或減毒的豬ttv病毒、無毒的生理上可接受的載體和任選一種或多種佐劑。佐劑是增加豬對疫苗的免疫反應的物質，其可與本發明的疫苗共同給予。可與疫苗同時並在相同的位點上或者在不同時間(例如，作為加強免疫)給予佐劑。亦可將佐劑以與給予疫苗的方式不同的方式或在與給予疫苗的位點不同的位點上有利地給予豬。合適的佐劑包括但不限於氫氧化鋁(alum)、免疫刺激複合物(iscoms)、非離子型嵌段聚合物或共聚物、細胞因子(像il-1、il-2、il-7、ifn-α、ifn-β、ifn-γ等)、皂苷、單磷醯脂質a(mla)、胞壁醯二肽(mdp)等。其他合適的佐劑包括，例如硫酸鉀鋁、分離自大腸桿菌(escherichiacoli)的熱不穩定或熱穩定的腸毒素、霍亂毒素或其b亞基、白喉毒素、破傷風毒素、百日咳毒素、弗氏不完全或完全佐劑等。可將基於毒素的佐劑(例如白喉毒素、破傷風毒素和百日咳毒素)在使用之前滅活，例如通過用甲醛處理。疫苗可進一步包含另外的抗原以促進感染性pcvdna克隆的免疫活性，所述抗原例如豬繁殖與呼吸症候群病毒(prrsv)、豬細小病毒(ppv)、其他感染性豬病原體和免疫刺激物。本發明的新疫苗不限於任何特定類型或製備方法。克隆的病毒疫苗包括但不限於感染性dna疫苗(即使用質粒、載體或其他常規載體來直接注射dna到豬中)、活疫苗、改良的活疫苗、滅活疫苗、亞基疫苗、減毒疫苗、基因工程疫苗等。這些疫苗由本領域已知的標準方法來製備。作為另外的益處，本發明的優選活疫苗提供一種遺傳穩定的疫苗，其比其他類型的減毒疫苗更容易製備、保存和遞送。本發明的另一優選疫苗使用合適的質粒來遞送非致病的dna克隆至豬中。與使用活病毒或者死的細胞培養物繁殖的完整病毒的傳統疫苗相比，本發明提供用包含感染性病毒基因組的質粒dna直接接種豬。本發明所期需的另外的基因工程疫苗由本領域已知的技術產生。這樣的技術包括但不限於重組dna的另外操作、重組蛋白的胺基酸序列的修飾或置換等。基於重組dna技術的基因工程疫苗例如是通過鑑定編碼負責誘導豬中的較強免疫反應或保護性反應的蛋白(例如來源於orf3、orf4等的蛋白)的病毒基因的備選部分來製備。這樣鑑定的基因或免疫顯性片段可被克隆到標準蛋白表達載體(例如杆狀病毒載體)中，並用於感染合適的宿主細胞(參見例如,o'reilly等,「baculovirusexpressionvectors:alabmanual(杆狀病毒表達載體：實驗室手冊),」freeman&co.,1992)。宿主細胞被培養，因此表達所需的疫苗蛋白，疫苗蛋白可被純化至所需的程度並配製成合適的疫苗產品。如果克隆保留引起疾病的任何不合乎需要的本能，那麼查明病毒基因組中負責任何殘留毒力的核苷酸序列並通過例如定點誘變來將病毒基因改造為無毒的亦是可能的。定點誘變能夠增加、缺失或改變一個或多個核苷酸(參見例如,zoller等,dna3:479-488,1984)。合成包含所需突變的寡核苷酸並退火為單鏈病毒dna的一部分。將從該步驟得到的雜交分子用於轉化細菌。然後，將分離的包含合適突變的雙鏈dna用於通過與隨後轉染到合適的細胞培養物中的全長dna的限制性片段連接來產生全長dna。將基因組連接到用於轉移的合適載體中可通過本領域普通技術人員所知的任何標準技術來實現。可使用任何常規方法將載體轉染到用於產生病毒子代的宿主細胞中，所述常規方法例如磷酸鈣或deae葡聚糖介導的轉染、電穿孔、原生質體融合和其他公知技術(例如，sambrook等,「molecularcloning:alaboratorymanual(分子克隆：實驗室手冊),」coldspringharborlaboratorypress,1989)。克隆的病毒於是顯示所需的突變。備選地，可合成包含合適突變的兩條寡核苷酸。這些核苷酸可退火來形成可插入到病毒dna中以產生全長dna的雙鏈dna。將免疫有效量的本發明疫苗給予需要針對病毒感染保護的豬。通過常規試驗可容易測定或容易滴定接種豬的免疫有效量或免疫原性量。有效量是實現足夠的針對疫苗的免疫反應以保護暴露於pcv病毒的豬的量。優選地，保護豬至病毒疾病的一種至全部不良生理症狀或作用被顯著降低、減輕或完全阻止的程度。可以單劑量或重複劑量給予疫苗。劑量範圍可為例如約1微克-約1,000微克的包含感染性嵌合dna基因組的質粒dna(取決於疫苗的免疫活性成分的濃度)，優選為100-200微克的嵌合pcv1-2dna克隆，但不應該包含足以引起不良反應或病毒感染的生理症狀的基於病毒的抗原量。用於測定或滴定活性抗原物質的合適劑量以發現基於豬的體重、抗原的濃度和其他典型因素的最小有效劑量的方法是本領域已知的。優選地，感染性病毒dna克隆被用作疫苗，或者可在體外產生活的感染性病毒並接著將該活病毒用作疫苗。在這種情況下，例如可將活病毒的約50-約10,000的50%組織培養感染劑量(tcid50)給予豬。本發明的新疫苗不限於任何特定類型或製備方法。疫苗包括但不限於改良的活疫苗、滅活疫苗、亞基疫苗、減毒疫苗、基因工程疫苗等。活疫苗的優點在於激活疫苗受者的所有可能免疫反應，包括全身、局部、體液和細胞介導的免疫反應。活病毒疫苗的缺點在於有被活的外來病毒物質汙染的可能或者病毒可在野外回復毒力的風險，該缺點可能超過優點。為了製備滅活的病毒疫苗，例如，可在培養的豬細胞系(例如但不限於pk-15細胞)中發生病毒繁殖和病毒生產。然後通過本領域普通技術人員通常所知的方案或優選通過本文所述的方法來優化連續的病毒滅活。可通過用滅活劑(例如福馬林或疏水溶劑、酸等)、通過用紫外線或x射線輻射、通過加熱等處理豬圓環病毒來製備滅活的病毒疫苗。以本領域理解的方式進行滅活。例如，在化學滅活中，將包含病毒的合適病毒樣品或血清樣品用足夠量或濃度的滅活劑在足夠高(或低，取決於滅活劑)的溫度或ph下處理足夠長的時間以滅活病毒。通過加熱滅活是在足以滅活病毒的溫度和時間長度下進行。通過輻射滅活是使用一定波長的光或其他能量源輻射足以滅活病毒的時間長度來進行。如果病毒不能感染易受感染的細胞，那麼該病毒被認為是滅活的。在本發明中亦是合意的基因工程疫苗由本領域已知的技術來產生。這樣的技術包括但不限於使用rna、重組dna、重組蛋白、活病毒等。例如，純化後，可通過本領域已知的方法從合適的臨床、生物學樣品(例如血清、排洩物、唾液、精液和組織樣品)中分離野生型病毒，優選通過本文教導的方法，使用感染的豬或感染的合適細胞系。通過本領域已知的方法從生物純病毒或傳染原提取dna，並通過本領域已知的方法來純化，優選通過cscl梯度超速離心法。通過本領域已知的方法來將病毒基因組的cdna克隆到合適的宿主中(參見maniatis等,id.)，然後分析病毒基因組以確定用於產生病毒抗原部分的基因組的必要區域。其後，步驟通常與改良活疫苗、滅活疫苗或亞基疫苗的步驟相同。例如，通過鑑定編碼負責誘導豬的較強免疫反應或保護性反應的蛋白(例如免疫病毒蛋白，如來源於orf2的衣殼蛋白)的病毒基因的一部分來製備基於重組dna技術的基因工程疫苗。可將這種鑑定的基因或免疫顯性片段克隆到標準蛋白表達載體(例如杆狀病毒載體)中，並用於感染合適的宿主細胞(參見例如,o'reilly等,「baculovirusexpressionvectors:alabmanual(杆狀病毒表達載體：實驗室手冊),」freeman&co.,(1992))。宿主細胞被培養，因此表達所需的疫苗蛋白，疫苗蛋白可被純化至所需的程度並配製成合適的疫苗產品。備選地，可將編碼一種或多種衣殼蛋白的來自分離的豬pcv的dna插入活的載體(例如痘病毒或腺病毒)中並用作疫苗。將免疫有效量的本發明疫苗給予需要針對所述感染或症候群保護的豬或哺乳動物物種。通過常規試驗可容易測定或容易滴定「免疫有效量」。有效量是實現足夠的針對疫苗的免疫反應以保護暴露於豬ttv病毒的豬或其他哺乳動物的量，豬ttv病毒可引起pcvad、豬皮炎腎病症候群(pdns)或相關的疾病。優選地，保護豬或其他哺乳動物物種至病毒疾病的一種至全部不良生理症狀或作用被發現顯著降低、減輕或完全阻止的程度。可以單劑量或重複劑量給予疫苗。劑量可包含，例如1-1,000微克的基於病毒的抗原(取決於疫苗的免疫活性組分的濃度)，但不應該包含足以引起不良反應或病毒感染的生理症狀的基於病毒的抗原量。用於測定或滴定活性抗原物質的合適劑量的方法是本領域已知的，其基於鳥類或哺乳動物的體重、抗原的濃度和其他典型因素。可將疫苗給予豬。同樣，可將疫苗給予有高風險被病毒劑感染的人(例如養豬場主)。可口服、頰內、鼻內、經皮、胃腸外等合宜地給予疫苗。胃腸外給予途徑包括但不限於肌內、靜脈內、腹膜內和皮下途徑。當作為液體給予時，可將本疫苗以水性溶液劑、糖漿劑、酏劑、酊劑等的形式製備。這樣的製劑是本領域已知的並通過將抗原與其他典型的添加劑溶解在合適的載體或溶劑體系中來典型地製備。合適的載體或溶劑包括但不限於水、鹽水、乙醇、乙二醇、甘油等。典型的添加劑是，例如認證染料(certifieddye)、食用香料、甜味劑和抗菌性防腐劑(例如硫柳汞(乙汞硫基水楊酸鈉))。可例如通過加入部分水解的明膠、山梨糖醇或細胞培養基來穩定這樣的溶液，並可使用本領域已知的試劑(例如磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、它們的混合物等)，通過常規的方法來緩衝這樣的溶液。液體製劑亦可包括混懸劑和乳劑，其包含與其他標準助劑(coformulant)組合的助懸劑或乳化劑。這些類型的液體製劑可通過常規方法來製備。混懸劑例如可使用膠體磨來製備。乳劑例如可使用勻漿器來製備。設計用於注射到體液系統的胃腸外製劑需要合適的等張性和緩衝至哺乳動物體液的相應水平的ph值。可視需要用氯化鈉和其他鹽來合適地調節等張性。合適的溶劑(例如乙醇或丙二醇)可用於增加製劑中的成分的溶解度和液體製劑的穩定性。可在本疫苗中使用的另外添加劑包括但不限於葡萄糖、常規抗氧化劑和常規螯合劑(例如乙二胺四乙酸)(edta)。胃腸外劑型使用之前也必須是無菌的。當前第1頁12當前第1頁12