一類苯並吡喃類化合物及其應用的製作方法
2023-12-10 06:03:02 5
本發明涉及新化合物及其抗菌應用，具體涉及一類苯並吡喃類化合物及其抗細菌生物膜的應用。
背景技術：
吡喃類化合物是一種重要的含氧雜環化合物，很多天然化合物如香豆素、黃烷、黃酮、生物鹼、紫檀素等中常出現這類結構，具有廣泛的特性和應用價值。吡喃類化合物中的兩個剛性環結構使其在可見光區範圍內具有很強的螢光性能，在螢光探針、螢光增白劑、螢光燃料，等功能材料方面應用較好。此外，此類化合物具有良好的藥理活性和生物學活性，如抗氧化活性、抗凝血、抗腫瘤活性等，被廣泛應用於抗凝劑、抗癌藥、抗過敏藥等多種藥劑，具有巨大的臨床應用前景。
細菌生物膜是指細菌粘附於惰性表面，通過分泌多糖基質、纖維蛋白、脂質蛋白等，將其自身包繞其中而形成的膜樣聚合物。在臨床，生物膜可以在生物及非生物表面附著，如肺組織、植人物、心臟瓣膜、骨骼、牙齒及各種醫療設備。在細菌生物被膜的保護下，細菌可以增強自身對抗生素、環境壓力及宿主免疫系統攻擊的耐受能力，使其耐藥性提高10-1000倍。因此，細菌生物膜感染是臨床感染遷延不愈，病原菌難以徹底清除的重要原因。然而截止目前，尚未有抗細菌生物膜藥物應用於臨床。
技術實現要素：
本發明的目的之一在於提供一類苯並吡喃類化合物。
所提供化合物結構式如式ⅰ所示：
式ⅰ中：r＝3-f、4-f、3,5-2f、3,4,5-3f、4-cl、3,4-2cl、3-br或4-br。
本發明的另一目的在於提供上述化合物作用於製備抗金黃色葡萄球菌生物膜製劑的應用。
本發明的化合物對金黃色葡萄球菌生物膜形成具有較強的抑制作用。
附圖說明
圖1為本發明的化合物9的核磁共振圖譜；
圖2為本發明的化合物10的核磁共振圖譜；
圖3為本發明的化合物11的核磁共振圖譜；
圖4為本發明的化合物12的核磁共振圖譜；
圖5為本發明的化合物13的核磁共振圖譜；
圖6為本發明的化合物14的核磁共振圖譜；
圖7為本發明的化合物15的核磁共振圖譜；
圖8為本發明的化合物16的核磁共振圖譜；
圖9為化合物對金黃色葡萄球菌生物膜形成的抑制作用；
圖10為化合物對金黃色葡萄球菌生物膜形成抑制作用的螢光染色觀察結果，其中c:空白對照、9-16分別為9-16號化合物，比例尺為20nm。
具體實施方式
本發明合成了的系列新型吡喃類化合物，並針對臨床容易形成生物膜的金黃色葡萄球菌，評價化合物抑制細菌生物膜形成的活性。
本發明化合物的合成路線及方法為：
a：將適量的1,3-環己二酮，丙二腈和不同取代基的芳香醛按照1:1:1摩爾混合後加熱至溶解；
b：加入催化量的4-二甲氨基吡啶,加熱回流3-4小時；
c：冷卻後固體析出，抽濾，固體再用無水乙醇重結晶，最終得純品。
實施例：
該實施例合成通式如式ⅱ所示的化合物：
其中：
(1)僅有苯環，即無取代基r；
(2)r＝2-no2,4-no2,2-cn,4-cn,5-cn,4-oh,4-ch3,3-f,4-f,3,5-2f,3,4,5-3f,4-cl,3,4-2cl,3-br,4-br。
合成方法為：
a：在250ml三口燒瓶中將適量的1,3-環己二酮，丙二腈和不同取代基的芳香醛按照1:1:1摩爾混合後加熱至溶解；
b：加入催化量的4-二甲氨基吡啶,加熱回流3-4小時；
c：冷卻後固體析出，抽濾，固體再用無水乙醇重結晶，最終得純品。
結構鑑定：
利用質譜(ms)、核磁共振波譜(nmr)、紅外吸收光譜(ir)和紫外吸收光譜(uv)等有機波譜，對上述合成的系列新型吡喃類化合物進行分子量、結構和純度等鑑定。
鑑定結果為：
化合物1：
2-amino-5-oxo-4-phenyl-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:
1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.269-7.306(t,2h),7.146-7.205(m,3h),7.019(s,2h),4.183(s,1h),2.599-2.640(q,2h),2.226-2.318(m,2h),1.876-1.988(m,2h).
化合物2：
2-amino-4-(2-nitrophenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.800-7.823(q,1h),7.634-7.656(q,1h),7.374-7.451(m,2h),7.202(s,2h),4.933(s,1h),2.578-2.608(t,2h),2.133-2.255(m,2h),1.824-1.953(m,2h).
化合物3：
2-amino-4-(4-nitrophenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):8.156-8.178(d,2h),7.454-7.475(d,2h),7.199(s,2h),4.366(s,1h),2.624-2.654(t,2h),2.255-2.330(m,2h),1.913-1.978(m,2h).
化合物4：
2-amino-4-(2-cyanophenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.750-7.769(d,1h),7.612-7.635(q,1h),7.377-7.419(q,2h),7.191(s,2h),4.525(s,1h),2.606-2.619(d,2h),2.224-2.315(m,2h),1.906-1.983(m,2h).
化合物5：
2-amino-4-(4-cyanophenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.759-7.780(d,2h),7.366-7.386(d,2h),7.159(s,2h),4.293(s,1h),2.607-2.632(t,2h),2.253-2.322(m,2h),1.907-1.970(m,2h).
化合物6：
2-amino-4-(3-cyanophenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.662–7.678(d,1h),7.626(s,1h),7.509–7.525(d,2h),7.104(s,2h),4.289(s,1h),2.591–2.683(m,2h),2.228–2.311(m,2h),1.922–1.962(q,2h).
化合物7：
2-amino-4-(4-hydroxyphenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):9.263(s,1h),6.926-6.947(q,4h),6.644-6.665(q,2h),4.074(s,1h),2.573-2.606(q,2h),2.214-2.302(m,2h),1.854-1.973(m,2h).
化合物8：
2-amino-4-(4-methylphenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):6.989-7.073(m,6h),4.138(s,1h),2.585-2.623(m,2h),2.250-2.305(m,5h),1.869-1.978(m,2h).
化合物9：
2-amino-4-(3-fluorophenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.310-7.365(m,1h),7.088(s,2h),7.008-7.049(m,2h),6.941-6.976(m,1h),4.231(s,1h),2.610-2.651(q,2h),2.270-2.322(m,2h),1.922-1.967(q,2h).
化合物10：
2-amino-4-(4-fluorophenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.178-7.214(q,2h),7.084-7.128(t,2h),7.051(s,2h),4.210(s,1h),2.592-2.627(q,2h),2.252-2.314(m,2h),1.885-1.961(m,2h).
化合物11：
2-amino-4-(3,5-difluorophenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.144(s,2h),7.042-7.088(m,1h),6.878-6.904(q,2h),4.267(s,1h),2.601-2.660(q,2h),2.281-2.324(m,2h),1.924-1.966(q,2h).
化合物12：
2-amino-4-(3,4,5-trifluorophenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.130-7.168(t,4h),4.264(s,1h),2.580-2.678(m,2h),2.272-2.317(q,2h),1.933-1.979(q,2h).
化合物13：
2-amino-4-(4-chlorophenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.335-7.356(d,2h),7.177-7.199(d,2h),7.081(s,2h),4.202(s,1h),2.593-2.626(t,2h),2.248-2.313(m,2h),1.875-1.980(m,2h).
化合物14：
2-amino-4-(3,4-dichlorophenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.549-7.570(d,1h),7.409-7.414(d,1h),7.153-7.163(d,3h),4.249(s,1h),2.589-2.642(q,2h),2.260-2.315(m,2h),1.902-1.957(m,2h).
化合物15：
2-amino-4-(3-bromophenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.388-7.409(q,1h),7.320-7.329(t,1h),7.249-7.287(t,1h),7.166-7.186(d,1h),7.116(s,2h),4.209(s,1h),2.594-2.651(m,2h),2.266-2.319(m,2h),1.907-1.963(q,2h).
化合物16：
2-amino-4-(4-bromophenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.469-7.490(q,2h),7.120-7.141(q,2h),7.084(s,2h),4.187(s,1h),2.612-2.625(d,2h),2.247-2.313(m,2h),1.874-1.980(m,2h).
上述實施例製備的化合物對細菌生物膜作用的形態學研究：
(1)結晶紫染色實驗過程如下：
a：分別從劃線培養的m-h瓊脂培養基上挑取不同實驗菌株的單克隆菌落，接種於4ml的tsb培養基中，以220r/min，37℃的條件培養至對數生長期。
b：在96孔板每孔中加入100μl的m-h肉湯培養基，吸取100μl的菌液加入第1孔中吹打混勻後吸取100μl加入第2孔中，依次類推，最後1孔混勻後吸取100μl棄去。
c：在酶標儀上選定630nm檢測，記錄od630值為0.1時菌液所稀釋的倍數(此時菌液濃度約為108cfu/ml)，將菌液用含2％葡萄糖的tsb培養基稀釋至相對應的倍數後再按1：100的比例向菌液稀釋至106cfu/ml。
d：向96孔板每孔分別加入tsb溶解的濃度為8μg/ml上述各化合物100μl後，加入已製備的濃度為106cfu/ml的菌液100μl，取一排孔加入200μl含2％葡萄糖的tsb培養基作為空白對照，將96孔板放入37℃孵箱恆溫孵育24h。
e：吸去上清，用0.01m的pbs洗三遍，每孔加入150μl甲醇固定30min，輕柔棄去甲醇，加入150μl1％的結晶紫溶液染色15min。
f：輕柔吸去結晶紫溶液，用0.01m的pbs輕洗3遍，放入烘箱烘乾，每孔加入33％冰醋酸溶液150μl，使用酶標儀在630nm處測吸光度。
將沒有經過化合物處理的細菌作為空白對照組(c)，和對照組相比，化合物1,2,3,4,5,6,7,8在濃度為8μg/ml時，對生物膜的形成沒有抑制作用(p>0.05)。化合物9,10,11,12,13,14,15,16在濃度為8μg/ml時，對生物膜的形成具有顯著的抑制作用(p<0.05)，如圖9所示。
(2)螢光染色實驗過程如下：
a：取指數生長期耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(mrsa)usa300，用含有0.5％葡萄糖的tsb培養基稀釋後接種到24孔板，每孔1ml。
b：向24孔板每孔中加入8μg/ml的化合物9,10,11,12,13,14,15和16，對照孔不加化合物，培養24h。
c：向每孔中加入10mg/ml異硫氰酸螢光素(fitc)染料孵育細菌2h,離心後棄上清液，用pbs緩衝液漂洗細菌3次。
d：螢光顯微鏡488mm波長處觀察細菌生物膜的形態。
和空白對照組(c)相比，8μg/ml的化合物9,10,11,12,13,14,15,16能明顯抑制生物膜的形成，如圖10所示。