通過二硫化物交聯進行體外蛋白質合成的方法

2023-12-09 19:13:51 3

專利名稱：通過二硫化物交聯進行體外蛋白質合成的方法
技術領域：
本發明涉及通過體外轉錄/翻譯系統進行蛋白質合成的方法。更具體而言，本發明涉及通過體外轉錄/翻譯系統高效合成具有分子內或分子間二硫鍵的蛋白質的方法。
背景技術：
人們試圖通過基因重組技術來生產可用作藥物或試劑的蛋白質。優選地，考慮到操作的簡便性和效率，人們已將諸如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌，黴菌和酵母這樣的微生物，諸如蠶這樣昆蟲，諸如牛這樣哺乳動物，以及可栽培植物、昆蟲和動物細胞，目前已用於基因重組技術中。通過基因重組技術生產蛋白質的方法已被廣泛應用。不過，使用這種方法可能導致，譬如目的蛋白的表達水平低、表達無活性的蛋白及形成聚集物這些問題。因此，需要反覆進行諸如檢查培養條件、生長條件或誘導條件，或試驗多種表達系統這樣的試誤(trial-and-error)過程。已報導許多蛋白甚至在考察這些條件後，也很難被合成。
與此同時，已知一種不使用這些生物或細胞的蛋白質合成方法，其也被稱為「無細胞蛋白質合成」。這種無細胞蛋白質合成系統也描述為「體外轉錄/翻譯系統」。通過該系統，用從大腸桿菌、兔網織紅細胞、麥胚細胞或其它類似細胞中所製備的提取物或天然成分對模板基因進行轉錄/翻譯，從而合成蛋白質。無細胞蛋白質合成系統的特徵在於可克服使用生物或細胞所遇到的限制。這是因為用該系統可合成幹擾生物和細胞功能的蛋白質，可通過96孔板或384孔板的形式合成多種蛋白質，並可同時對多種合成條件進行測試。
但已知即使使用這種無細胞蛋白質合成系統，仍有一個問題，即合成的蛋白質形成了凝聚物而不形成為相應的天然結構。其原因可能是具有分子間和/或分子內二硫鍵的蛋白質的二硫鍵不能正確交聯。有些蛋白質具有分子間和/或分子內二硫鍵，而有些沒有。許多轉運並分泌到細胞表面或細胞外環境的蛋白質具有二硫鍵。而這些蛋白質具有特別重要的應用價值。例如，諸如胰島素、細胞因子和血細胞生長因子等絕大多數已商品化的蛋白質製品，其組分中都含有具有分子間二硫鍵的蛋白。
因此，為了高效生產這種具有分子間/分子內二硫鍵的蛋白質，對無細胞蛋白質合成系統進行了改進。例如，已進行了以下方法向細胞提取物中加入微粒體組分的方法(非專利文獻1Biochem.J.254805-810(1988)，下文以現有技術1表示)；對細胞提取物進行透析的方法，添加氧化型穀胱甘肽和還原型穀胱甘肽的方法，凝膠過濾的方法，調節氧化-還原(redox)電勢的方法(非專利文獻2FEBS Lett.514290-4(2002)；非專利文獻3Nature Biotech.1579-84(1997)；專利文獻1JP Patent Publication(Kokai)No.2003-116590；專利文獻2WO 03/072796 A1，下文以現有技術2表示)。
而且已知一種使用了可維持還原態的酶的缺失變異體來形成二硫鍵的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.9613703-13708(1999)，下文以現有技術3表示)。通過該方法，目的蛋白可用缺失硫氧還蛋白還原酶和穀胱甘肽還原酶的大腸桿菌進行表達。但通常缺失這種酶的細胞系生長非常緩慢，或者需要特殊的培養條件，這在工業實用性上是很大的障礙。這種方法利用可在大腸桿菌中導致基因重組的系統來表達蛋白。不過如上所述，對生物的直接使用存在多種限制。此外，許多生物除硫氧還蛋白還原酶和穀胱甘肽還原酶外，還含有許多未被鑑定的可控制氧化-還原反應的酶和底物(非專利文獻4Nature ReviewMolecular Cell Biology 3836-847(2002))。因此，即使外源蛋白可用這種缺失變異體進行表達，或用以缺失變異體的細胞提取物為無細胞蛋白合成系統來進行蛋白質合成，也很難形成穩定的二硫鍵。因此，報導了一種用碘乙醯胺處理細胞提取物以滅活這些酶和底物的方法(US 6,548,276 B2，下文以現有技術4表示)。根據該方法，不僅可滅活穀胱甘肽還原酶和氧還蛋白還原酶，而且也可以滅活多種控制細胞內氧化-還原反應的酶和底物。但由於碘乙醯胺以非特異形式修飾硫醇，因此它也可能修飾轉錄/翻譯相關的因子和酶基團、核糖體蛋白及類似物質。從而產生的問題是體外蛋白合成反應的高效性和精確性被破壞。
同時，與已廣泛使用的、用生物和細胞通過重組方式來合成蛋白的方法一樣，化學合成的肽或通過無細胞蛋白合成系統合成的蛋白質也可用變性劑進行完全變性，然後對其進行再生(非專利文獻5Biochemistry 263129-3134(1987)，下文以現有技術5表示)。在現有技術5中，由於蛋白質是化學合成的、或即使使用生物體也是以無活性的不可溶形式回收的，因此可生產例如毒素蛋白。當蛋白質再生時，不再使用細胞，試劑和鹽可相互自由結合，從而在具有二硫鍵的蛋白質中正確地引入二硫鍵。但當使用該方法時也有一些問題，需要不同的步驟來進行蛋白質合成和蛋白質結構再生，而蛋白質結構再生是耗時的步驟(需要幾天到一周的時間)。
另外，根據眾所周知的測定催化促進和/或異構化二硫鍵的酶的活性的方法，用作底物的核糖核酸酶A(RNaseA)被還原而變性，RNaseA與某種測定了活性的酶一起再摺疊並再生後測定其活性，所獲得的核糖核酸酶活性可作為一個指標(非專利文獻6Biochem J.1976159377-384)。
專利文獻1JP Patent Publication(Kokai)No.2003-116590 A專利文獻2WO 03/072796 A1專利文獻3US 6,548,276 B2非專利文獻1Biochem.J.254805-810(1988)非專利文獻2FEBS Lett.514290-294(2002)非專利文獻3Nature Biotech.1579-84(1997)非專利文獻4Nature Review Molecular Cell Biology 3836-847(2002)非專利文獻5Biochemistry 263129-3134(1987)非專利文獻6Biochem J.159377-384(1976)發明內容[蛋白質合成]傳統的無細胞蛋白質合成系統在生產具有分子內和/或分子間二硫鍵的蛋白時具有下列缺點。在現有技術1中，要考慮到必須從胰腺或者其它部位通過勻化和離心的方式來製備微粒體部分；微粒體部分是通過破壞被稱作內質網——二硫鍵最初就是在這裡形成的——的細胞器來獲得的，這樣微粒體部分中形成二硫鍵的效率要低於內質網；並且形成的二硫鍵與天然狀態會有所差異，因此可能會觀察不到蛋白活性——這是個問題。在現有技術2中，無需製備微粒體部分，可通過諸如添加氧化型穀胱甘肽與還原型穀胱甘肽或者透析這樣的簡單方法來製備細胞提取物。不過，難以製備具有很好重複性的氧化-還原狀態從而使得二硫鍵可以高效交聯的反應液。這是因為通常用作無細胞蛋白質合成系統的細胞提取物含有多種類型的處於還原態的酶和底物，包括硫氧還蛋白還原酶[EC 1.6.4.5]和穀胱甘肽還原酶[EC 1.6.4.2](Nature Review Molecular Cell Biology 3836-847(2002))。因此，認為這些酶和底物的功能在調節氧化-還原態時會出現困難，即便經透析或添加穀胱甘肽也如此。當向無細胞蛋白質合成系統中加入諸如氧化型穀胱甘肽(GSSG)這樣的氧化劑時，可使用GSSG和還原型穀胱甘肽(GSH)的氧還緩衝液。GSSG∶GSH的比例一般在1∶5到1∶10之間。該比例基於氧化劑濃度以及從多項研究中所獲得的比例，在這些研究中，先將RnaseA或溶菌酶還原變性進行再摺疊，由此檢測結構與活性之間的相互關係(Biochemistry 1991 30613-619；Biochemistry 197095015-5023))。因此，該比例對於無細胞蛋白質合成系統而言並非一定合適。此外，術語「氧化-還原電位」指的是由於氧化型與還原型之間化學電位差異形成的電位，通過在可實現可逆電轉移的平衡態中使用諸如鉑電極這樣的電極來測量。該電位只是基於參與溶液中氧化還原反應的多種有機/無機物(例如，氧、金屬、半胱氨酸和亞鐵血紅素)在氧化還原平衡態時的電位的觀察資料獲得的。因此，它並不是一個能夠表現硫醇和二硫化物之間平衡態的指標，並不反應蛋白質的氧化還原狀態。所以，即便氧化-還原電位能夠如現有技術2中所示那樣輕易調節到給定水平，想要調控蛋白質中二硫鍵的形成也是非常困難的。
在現有技術1和2兩個實例中，問題在於蛋白合成效率會降低。這是因為當細胞提取物經過諸如添加微粒體、透析或者添加氧化型穀胱甘肽及還原型穀胱甘肽等處理後，其細胞內環境與最初進行蛋白合成的細胞內環境相比已經發生了變化。因此，無細胞蛋白質合成系統在工業水平上的應用非常困難。
本發明人已經揭示了一種方法，其中構成體外DNA轉錄/翻譯系統或者RNA翻譯系統反應液中的部分或者全部蛋白組分，均用一對可彼此附著的物質中的一個來標記(JP Patent Publication(Kokai)No.2003-102495 A，即下文中的重構蛋白質合成系統(再構成タンパク質合成系)。該方法與傳統無細胞系統及體外蛋白質合成系統(即下文中的無細胞蛋白質合成系統)完全不同。具體而言，該方法的特點在於在不使用細胞提取物的情況下純化與蛋白合成相關的不同組分，通過重構合成蛋白質，由此可以合成或者快速純化不具有分子內二硫鍵的蛋白(Nature Biotechnology 19732-734(2001))。但並沒有關於具有分子內/分子間二硫鍵的蛋白，由不同組分以怎樣的濃度重構可使得它們能具有原始結構和功能，並且可高效合成。
因此，期待出現一種更方便、且可有效生產具有分子內和/或分子間二硫鍵的蛋白質的方法。本發明的目的就是提供一種通過使用重構蛋白質合成系統，可方便、高效生產具有二硫鍵的蛋白質的方法。
上述傳統方法的問題是需要將RNaseA進行暫時變性，而且再摺疊的步驟比較耗時。
本發明的發明人為了達到上述目的進行了深入的研究，從而發現通過使用除去了影響氧化還原狀態的酶和底物、並能夠人工調節二硫鍵和硫醇之間的氧化還原平衡狀態的重構蛋白質系統可高效合成具有原始結構和活性的、含有分子間/分子內二硫鍵的蛋白。該體系可代替細胞提取物或粗組分，所述細胞提取物或粗組分由於含有多種硫氧還蛋白還原酶[EC 1.6.4.5]和穀胱甘肽還原酶[EC 1.6.4.2]等維持還原狀態的酶和底物而使氧化還原狀態難以調節。
另外，本發明的發明人發現由純度90％或以上的核糖體、起始因子、延伸因子、終止因子、氨醯-tRNA合成酶、甲硫氨醯tRNA轉移酶、tRNAs、胺基酸、核苷三磷酸、10-甲醯基5，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水所組成的重構蛋白質合成系統是特別優選的。從而完成了本發明。
一般來說，在細胞內的蛋白合成位點，氧化還原狀態接近於還原態，因此細胞中合成的蛋白是還原態的。在無細胞蛋白合成系統中，再現了這種細胞內的狀態，因此在體系中通常含有DTT和其它還原劑。不過也報導當不含有還原劑時，則不利於提取物的保存或降低翻譯效率(Eur.J Biochem.2704780-4786(2003))同時，與硫醇形成二硫鍵也不需要還原態。因此，希望除去體外轉錄/翻譯體系中作為還原劑的DDT，或降低加入到該體系中的DTT的量，以在蛋白中形成二硫鍵。但如上所述，其得到的效果有限。
另一方面，根據本發明的方法，既然在重構蛋白質合成系統中影響二硫鍵和硫醇平衡狀態的組分的量是可以確定的，因此可加入幾μM到1mM的量DTT。另外，也可以不加入DTT。
另外，一般認為使用不含DTT的無細胞蛋白質合成系統的傳統方法，即使在蛋白質可形成二硫鍵的條件下，合成的蛋白質量也會降低，而且合成有活性的目標蛋白的效率被削弱。但令人驚訝的是，當使用本發明所述的重構蛋白質合成系統時，合成的蛋白質量不發生改變，甚或會增加，從而可高效合成蛋白質。
換句話說，與傳統方法不同，本發明提供了一種高效合成具有二硫鍵的蛋白質的方法，其中蛋白質合成試劑包含特定存在量和純度、且不含影響氧化還原狀態的雜質的核糖體、起始因子、延伸因子、終止因子、氨醯-tRNA合成酶、甲硫氨醯tRNA轉移酶、tRNAs、胺基酸、核苷三磷酸、10-甲醯基5，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水再生的，不使用無細胞提取物；而且重構蛋白質合成系統質的二硫鍵和硫醇間的氧化還原平衡是可人工調節的。
另外，優選地，經重構的上述蛋白質合成基本試劑，使其含有特定量的、高度純化的且純度為90％或以上的核糖體、起始因子、延伸因子、終止因子、氨醯-tRNA合成酶、甲硫氨醯tRNA轉移酶、tRNAs、胺基酸、核苷三磷酸、10-甲醯基5，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水。蛋白質合成基本試劑例如可以使用除去了DTT的Pure system(PostGenome Institute Co.，Ltd.)。根據上述的蛋白質合成方法，可通過向上述蛋白質合成試劑中加入(i)調節氧化還原狀態的試劑和/或(ii)催化氧化還原反應的酶而人工調節二硫鍵和硫醇間的氧化還原平衡。可在反應起始前、反應中或反應後加入這些物質。
更具體而言，(i)作為調節氧化還原狀態的試劑，包括例如DTT和氧化型穀胱甘肽。另外，(ii)作為催化氧化還原反應的酶的實例，包括蛋白質二硫鍵異構酶和二硫鍵交換蛋白。
此外，本發明的蛋白質合成方法可用作生產蛋白質的方法。
進一步，本發明提供了一種檢測方法，包括測定生產的蛋白質的活性、加入的催化氧化還原反應的氧化還原酶試劑添加量和加入的氧化還原試劑的添加量之間的關係。蛋白質合成試劑是由預定的、特定存在量和純度的核糖體、起始因子、延伸因子、終止因子、氨醯-tRNA合成酶、甲硫氨醯tRNA轉移酶、tRNAs、胺基酸、核苷三磷酸、10-甲醯基5，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水重構的。優選地，可以變更蛋白質合成試劑中可催化氧化還原反應的氧化還原酶試劑和氧化還原試劑的量。如上所述，通過向重構蛋白質合成系統中加入可改變氧化還原平衡狀態的試劑至所需的終濃度，則可以在生產的蛋白質中形成或不形成二硫鍵交聯。
換句話說，根據本發明通過重構蛋白質合成系統正確地了解所生產的蛋白質形成所需的二硫鍵交聯的條件。因此得到的信息可作為上述蛋白質合成條件。
可在反應起始前、反應中或反應終止後加入氧化還原酶試劑和氧化還原試劑。
氧化還原酶試劑的實例包括DTT和GSSG。氧化還原試劑的實例包括蛋白質二硫鍵異構酶和二硫鍵交換蛋白。
可提前製備不同濃度的試劑，並在反應起始前(加入模板核酸前)、反應中或反應終止後加到各反應體系中。
具體而言，可以使用前述蛋白質合成系統通過上述方法來進行活性測定，但要在翻譯時或翻譯後加入已測定活性的催化促進和/或異構化二硫鍵的酶。作為底物的蛋白質是以編碼該蛋白質的模板DNAs或RNA加入的。用作底物的蛋白質類型沒有特別限定。優選地，這種蛋白質具有已知的結構，更優選地，它們是酶類。這種底物的實例包括溶菌酶和鹼性磷酸酶。另外，根據本方法，可測定促進二硫鍵形成和/或催化二硫鍵異構化的酶活性，而另一方面，可篩選抑制所述活性的底物。對於篩選而言，可使用催化促進二硫鍵形成或催化二硫鍵異構化的酶與檢測底物進行篩選。
進一步，本發明包括由以下(1)a)和b)、(2)a)和c)或(3)a)，b)和c)所組成的試劑盒a)包含具有特定的存在量和純度的多種組分的、在加入模板核酸後可合成由模板核酸編碼的蛋白質的蛋白質合成反應基本試劑；b)至少一種具有特定的存在量和純度的可催化氧化還原的氧化還原酶；及c)至少一種具有特定的存在量和純度的調節氧化還原狀態的氧化還原試劑。
具體而言，根據本發明，提供一種包含以下a)到c)的試劑盒a)包含具有特定的存在量和純度的核糖體、起始因子、延伸因子、終止因子、氨醯-tRNA合成酶、甲硫氨醯tRNA轉移酶、tRNAs、胺基酸、核苷三磷酸、10-甲醯基5，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水的蛋白質合成反應基本試劑，而且在加入模板核酸後可合成由模板核酸編碼的蛋白質；b)至少一種具有特定的存在量和純度的可催化氧化還原的氧化還原酶；及c)至少一種具有特定的存在量和純度的調節氧化還原狀態的氧化還原試劑。
本發明描述包括作為本申請優先權基礎的日本專利申請No.2004-136520的說明書和/或附圖等處所述的部分或全部內容。
附圖簡要描述

圖1所示的是核糖體粗提取物的6％到36％蔗糖密度梯度組分。
圖2所示的是經12％SDS-PAGE/考馬斯亮蘭染色的His標記的丙氨醯-tRNA合成酶(AlaRS)、精氨酸tRNA合成酶(ArgRS)、天冬醯氨tRNA合成酶(AsnRS)、天冬氨酸tRNA合成酶(AspRS)、半胱氨酸tRNA合成酶(CysRS)、穀氨醯胺tRNA合成酶(GlnRS)和穀氨酸tRNA合成酶(GluRS)的照片。
圖3所示的是合成的人溶菌酶的電泳照片(鍵頭指示合成的人溶菌酶)。
圖4所示的是合成的人溶菌酶的比活性。
圖5所示的是合成的mIL6蛋白質的量。
圖6所示的是合成的DHFR蛋白質的量。
圖7所示的是合成的人溶菌酶的比活性(PDI濃度的影響)。
圖8所示的是合成的人溶菌酶的比活性(存在0.13μM PDI時DTT濃度的影響)。
圖9所示的是合成的鹼性磷酸酶的活性(存在0.13μM PDI和1mMDTT時GSSG濃度的影響)。
圖10所示的是合成的鹼性磷酸酶的活性(存在PDI時DTT濃度變化的影響)。
圖11所示的是合成的溶菌酶的活性(加入或不加DsbC的影響)。
圖12所示的是合成的鹼性磷酸酶的活性(本發明的方法與使用細胞提取物的方法的比較)。
圖13所示的是EF-Tu洗脫組分的電泳照片。
圖14所示的是純化的DsbA(泳道1)和DsbC(泳道2)的電泳照片。
發明的優選實施方案以下對本發明的優選實施方案進行詳細描述，但本發明不限於以下的優選實施方案。另外，所有修改和變化都在本發明的範圍內。
本發明的體外DNA轉錄/翻譯體系或RNA翻譯體系包括加入諸如mRNA、cDNA等可編碼目標蛋白的模板的蛋白質合成的基本組分的蛋白質合成試劑、和(i)用來人工調節二硫鍵和硫醇間的氧化還原平衡的調節氧化還原狀態的試劑、和/或(ii)催化氧化還原的酶。
本發明的方法包括合成具有分子內或分子間二硫鍵的蛋白質的方法，包括用(1)包含以下a)和b)的反應體系，(2)包含以下a)，b)和c)的反應體系，(3)包含以下a)，b)和d)的反應體系，(4)包含以下a)，b)，c)和d)的反應體系a)至少一個編碼目標蛋白的模板核酸；b)蛋白質合成反應的基本試劑，其包含具有特定存在量和純度的多種成分，在加入模板核酸後可合成由模板核酸編碼的蛋白質；c)至少一種具有特定存在量和純度的可催化氧化還原的氧化還原酶；及d)至少一種具有特定存在量和純度的調節氧化還原狀態的氧化還原試劑。

蛋白質合成基本試劑，特徵在於其組分包括具有特定存在量和純度的核糖體、起始因子、延伸因子、終止因子、氨醯-tRNA合成酶、甲硫氨醯tRNA轉移酶、tRNAs、胺基酸、核苷三磷酸、10-甲醯基5，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水。但不必包括以上所有組分，可以根據需要選擇性地包含上述組分。
用於構建體系的組分不必包括細胞提取物或細胞提取物的粗成分。另外，期望能夠計算影響蛋白質二硫鍵形成的物質的濃度。
在本發明的重構蛋白質合成系統中，構建體系的所有組分都是重構的。因此很容易確定這些組分並計算其含量。
本發明的蛋白質合成基本反應試劑可用於進行DNA轉錄/翻譯或RNA翻譯等用於蛋白質合成的反應系統。在本發明中，術語「蛋白質」是指兩個或多個胺基酸通過肽鍵相互連接，包括肽、寡肽和多肽。術語「RNA」包括化學合成的RNA和mRNA。術語「DNA」包括合成的DNA、DNA載體、基因組DNA、PCR產物和cDNA。
本發明的蛋白質合成基本反應試劑，包括具有特定存在量和純度的組分，各組分指分別進行純化、其濃度可測定且可以定量的組分。在本發明中，具有特定存在量和純度的多種組分，是那些通過諸如鹽析、色譜、電泳、溶解度差異、重結晶和離心等純化物質的方法分別進行純化的物質。這些通過色譜、電泳、質量分析、離心等類似分析方法所獲得的物質的純度均在約80％或以上，更優選地在90％或以上。例如，對蛋白質而言，主要通過色譜進行純化，其純度通過SDS聚丙烯醯氨凝膠電泳(SDS-PAGE)進行測定。對核糖體而言，主要通過超離心純化，其純度通過超離心沉降分析而測定。核糖體是一種聚合的分子，分子量為幾百萬，包括大量RNA分子(原核生物中有3種RNA分子23S、5S和16S；真核生物中有4種RNA分子28S、5.8S、5S和18S)和大量核糖體蛋白(原核生物中約50種，真核生物中約80種)。由於是聚合的分子，故可通過沉降分析來鑑定並測定其純度。另外，tRNAs通常是包含74到94個核苷酸並具有多種核苷酸序列的分子，可通過電泳來分離鑑定分子，並測定260nm和280nm處吸光度而測定其純度。另外，低分子量物質例如胺基酸和鹽可通過常規方法例如色譜、融點測定、元素分析和質量分析進行鑑定，並測定其純度。
作為蛋白質合成基本試劑的用於轉錄/翻譯的因子和酶的實例，不僅包括來源於大腸桿菌等原核細胞中的物質，而且也包括來源於真核細胞的物質(1)對基於RNA的翻譯而言，包括核糖體、起始因子、延伸因子、終止因子、氨醯-tRNA合成酶、tRNAs、三磷酸腺苷(ATP)、鳥苷三磷酸(GTP)、胺基酸、10-甲醯基5，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水，對於來源於大腸桿菌等原核細胞的反應體系進一步包括甲硫氨醯tRNA轉移酶；及(2)對基於DNA的轉錄/翻譯而言，除了(1)，還包括尿苷三磷酸(UTP)、胞苷三磷酸(CTP)和諸如T7 RNA聚合酶之類的RNA聚合酶。
構建本發明的反應體系的各種類型的因子和酶在大腸桿菌、黴菌、酵母和培養細胞等生物體內均存在。因此，可分別高效純化這些物質作為組分。但優選地是使用重組產物，因為這可以大規模地獲得各種蛋白質，而且會減少未知的、不必要的或抑制性組分被引入反應體系的可能性。
具體而言，將編碼起始因子、延伸因子、終止因子、氨醯-tRNA合成酶、甲硫氨醯tRNA轉移酶或RNA聚合酶的基因連接到合適的載體上，然後轉化大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、黴菌、酵母或類似系統進行表達誘導。
然後純化蛋白質，獲得構建本發明的反應體系的組分。當用轉化子產生各種類型的因子和酶時，蛋白質可完整表達或以融合蛋白的形式表達。融合蛋白的實例包括組氨酸標籤(以下以His-Tag表示)、strept-Tag、GST-Tag和FLAG-Tag(Appl Microbiol Biotechnol.60(5)523-533(2003))。
根據需要可從多種方法中選擇使用已知的His-Tag和鎳柱來純化His標記的蛋白質組分。作為實例，這種方法簡要描述如下1.通過基因工程技術獲得目標蛋白N末端結合了His-Tag(含6個His)的融合蛋白；2.在冰上超聲破碎表達His標記蛋白的細胞，並將細胞懸浮於上樣緩衝液(300mM NaCl，50mM NaH2PO4，pH 8.0)中；3.將細胞裂解液進行離心(30,000g，4℃，30分鐘)分離；4.向上述獲得的上清中加入用冰冷上樣緩衝液平衡的50％Ni2+-NTA漿(Qiagen公司制)，4℃攪拌1小時；
5.將樹脂上樣到柱上，然後用20倍柱體積的上樣緩衝液在4℃洗滌柱；6.用20倍柱體積的上樣緩衝液(含10mM咪唑，pH 8.0)在4℃洗滌柱；及7.用20倍柱體積的上樣緩衝液使目標蛋白從柱上洗脫下來，收集組分(每份1ml)，並通過SDS-PAGE確定目標蛋白，其中，所述緩衝液中咪唑濃度梯度設定為從10到250mM。
更優選地，在上述蛋白質純化後，向本發明的反應體系中加入以下不直接參與蛋白質合成反應的、構建反應體系的各種因子和酶如肌酸激酶、肌激酶和核苷二磷酸激酶等與能量再生相關的酶；及諸如無機焦磷酸酶這樣的降解轉錄/翻譯反應所產生的無機焦磷酸的酶。
此處，鹽必須含有轉錄/翻譯所需的陽離子和陰離子。通常使用包括穀氨酸鉀、氯化銨、醋酸鎂和氯化鈣等。除了上述鹽類，也可以選擇使用其他合適的鹽。水包括不含離子、微生物、酶的水，例如用Milli-Qsystem(Millipore)生產的水製備裝置製備的水及商品化的純水。
核糖體是肽合成的場所。當其與mRNA結合時，氨醯tRNA位於核糖體A位點，而甲醯甲硫氨醯tRNA或肽醯tRNA位於P位點，從而形成肽鍵(Science 289920-930(2000))。在本發明中，只要是具有這種功能的核糖體即可，與其來源無關。可用的實例包括來源於大腸桿菌的核糖體和來源於真核細胞的核糖體。優選地，本發明所用的核糖體來源於如大腸桿菌A19菌株和大腸桿菌MRE600菌株等大腸桿菌。
作為本發明的體外蛋白質合成系統中的起始因子是形成翻譯起始複合物所必需的，或明顯促進翻譯起始複合物形成的因子，可使用那些已知來源於大腸桿菌的因子，譬如IF1、IF2和IF3(Biochemistry295881-5889(1990))。起始因子IF3啟動作為翻譯起始的必要步驟的70S核糖體解離為30S亞基和50S亞基。另外，它在翻譯起始複合物形成時抑制除了甲醯甲硫氨醯tRNA外的其他tRNA插入到P位點。起始因子IF2與甲醯甲硫氨醯tRNA結合，並將甲醯甲硫氨醯tRNA運送到30S核糖體亞基的P位點，從而形成翻譯起始複合物。起始因子IF1促進起始因子IF2和IF3的功能。本發明中所用的起始因子的優選實例包括來源於例如大腸桿菌K12菌株等大腸桿菌的起始因子。另外，也可使用來源於真核細胞的起始因子。
共有兩種類型的EF-Tu延伸因子GTP和GDP。GTP與氨醯tRNA結合，將其轉運到核糖體的A位點。當EF-Tu離開核糖體時，GTP被水解轉變為GDP(EMBOJ.177490-7497(1998))。同時，延伸因子EF-Ts與EF-Tu(GDP)結合，促進GDP轉化為GTP(Archives ofBiochemistry and Biophysics 348157-162(1997))。另外，延伸因子EF-G在肽鏈延伸過程中肽鍵形成後促進轉位反應(Nature StructureBiology 6643-647(1999)；FEMS Microbiology Reviews 23317-333(1999))。本發明所用的延伸因子的優選實例是來源於大腸桿菌的延伸因子，例如來源於大腸桿菌K12菌株的延伸因子。另外，也可使用來源於真核細胞的延伸因子。
終止因子是在蛋白質合成終止、翻譯的肽鏈解離並開始後續的mRNA翻譯的過程中核糖體再生所必須的。當在沒有終止因子的反應體系中進行蛋白質合成時，反應在終止密碼子之前停止，從而形成核糖體、肽和mRNA的穩定複合物(多聚體展示方法、核糖體展示方法和體外病毒方法)。另外，通過從反應體系中省略RF1和/或RF2而可向肽鏈中引入非天然胺基酸。換句話說，當分別省略RF1和RF2時，可分別在UAG密碼子和UGA密碼子處高效引入非天然胺基酸。
當終止密碼子(UAA、UAG或UGA)來到核糖體的A位點時，終止因子RF1和RF2移動到A位點以促進肽鏈從肽醯tRNA(位於P位點)解離。RF1可識別終止密碼子UAA和UAG，而RF2可識別UAA和UGA。終止因子RF3可在RF1和RF2引起肽鏈解離後將RF1和RF2從核糖體上解離下來。核糖體循環因子(RRF)促進在P位點的tRNA在蛋白質合成終止後解離下來，使核糖體再生以進行後續蛋白質合成。在本發明中，RRF也被看作是一種終止因子。另外，在EMBOJ.164126-4133(1997)和EMBOJ.164134-4141(1997)中解釋了RF1、RF2、RF3和RRF終止因子的功能。本發明所用的終止因子的優選實例是來源於例如源自大腸桿菌K12菌株等大腸桿菌的終止因子。另外，也可使用來源於真核細胞的終止因子。
氨醯tRNA合成酶是一種在ATP存在下通過將胺基酸與tRNA共價連接而合成氨醯tRNA的酶(RNA 3954-960(1997)；Protein，NucleicAcid and Enzyme，391215-1225(1994))。本發明所用的氨醯tRNA合成酶的優選實例是來源於諸如自大腸桿菌K12菌株等大腸桿菌的氨醯tRNA合成酶。另外，也可使用來源於真核細胞的氨醯tRNA合成酶。另外，也可使用識別非天然胺基酸的人工氨醯tRNA合成酶(JP PatentNo.2668701)。
甲硫氨醯tRNA轉移酶(MTF)是一種將甲醯基連接到甲硫氨醯tRNA氨基上而合成N-甲醯甲硫氨醯(fMet)tRNA進行原核生物蛋白質合成的酶。即甲硫氨醯tRNA轉移酶可使N10-甲醯基葉酸的甲醯基轉移到對應於起始密碼子的甲硫氨醯tRNA的N末端，形成fMet-tRNA(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96875-880(1999))。增加的甲醯基可被起始因子IF2識別，作為蛋白質合成的起始信號。MTF不存在於真核細胞質中的合成系統中；但存在於真核線粒體和葉綠體合成系統中。本發明所用的MTF的優選實例是來源於諸如自大腸桿菌K12菌株等大腸桿菌的MTF。
RNA聚合酶是一種將DNA序列轉錄為RNA的酶，存在於各種生物中。其中一個實例是來源於T7噬菌體的T7 RNA聚合酶。該酶可與稱為T7啟動子的特異DNA序列結合，將下遊的DNA轉錄為RNA。本發明的發明人在T7 RNA聚合酶的N末端加入一個His-Tag，從而可在大腸桿菌BL21細胞系中以融和蛋白的形式大量表達聚合酶，並用鎳柱通過親和層析進行純化。在本發明中，可與T7 RNA聚合酶一樣使用其它類型的RNA聚合酶。例如，在本發明中可使用商品化的T3RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶。
胺基酸的實例包括天然或非天然胺基酸和帶有天然或非天然胺基酸的tRNA。當用這種帶非天然胺基酸的tRNA時，可將非天然胺基酸引入到蛋白質中。
所用的tRNA的實例包括從大腸桿菌、酵母和類似物質中純化的tRNA。另外，可使用反義密碼子或其它鹼基被選擇性修飾的人工合成的tRNA(J.Am.Chem.Soc.12134-40(1996)，Nature Biotech.20177-182(2002))。例如，當以CUA為反義密碼子的tRNA帶有非天然胺基酸時，則作為終止密碼子的UAG可被翻譯為非天然胺基酸。用這種方法可通過位點特異的方式在蛋白質中引入非天然胺基酸。
另外，通常使用磷酸鉀緩衝液(pH 7.3)作為緩衝液。

影響二硫鍵形成的物質的實例包括可催化二硫鍵氧化還原反應的氧化還原酶和/或可調節二硫鍵氧化還原狀態的氧化還原試劑。更具體而言，影響二硫鍵形成的酶和/或試劑的實例包括(i)催化氧化還原的酶，例如包括穀胱甘肽還原酶、硫氧還蛋白還原酶、蛋白質二硫鍵異構酶、二硫鍵交換蛋白和硫氧還蛋白樣蛋白的蛋白質；和/或(ii)調節氧化還原狀態的試劑，例如低分子量化合物，包括還原型穀胱甘肽、氧化型穀胱甘肽、DTT、2-巰基乙醇和硫氧還蛋白。本發明中的術語「氧化還原試劑」是指可將二硫鍵還原為硫醇或將硫醇氧化形成二硫鍵的試劑。
優選地，促進/調節蛋白質中二硫鍵交聯的酶和/或底物可用作影響二硫鍵形成的物質的(i)氧化還原酶(催化氧化還原反應的酶)和/或(ii)氧化還原試劑(可調節氧化還原狀態的試劑)，。另外，在翻譯反應中不必加入(i)催化氧化還原反應的酶和/或(ii)調節氧化還原狀態的試劑，其可在反應終止後加入這些試劑。優選地，當在翻譯終止後加入這些試劑時，應在加入後將其放置在37℃幾十分鐘到約1小時。
當DTT用作調節氧化還原狀態的試劑時，其濃度為0到1mM，優選地為0.001到0.5mM，更優選地為0.060到0.5mM。
當氧化型穀胱甘肽作為調節氧化還原狀態的試劑時，其濃度為0到8mM，優選地為0.1到4mM，更優選地為1到4mM。
根據上述蛋白質合成的方法，二硫鍵交換蛋白優選地為DsbA和/或DsbC。
蛋白質二硫鍵異構酶(EC 5.3.4.1.)是一種分子量約為55 kDa的酶，存在於真核生物的內質網內壁，可催化二硫鍵的形成、異構化和/或還原反應。還認為該蛋白質具有分子伴侶類似的活性。如上所述，該蛋白質可在從生物中純化後用作組分。而且可通過重組合成的方法獲得該蛋白質。例如，可使用從牛肝純化的蛋白質二硫鍵異構酶(PIRdatabase accession no.ISBOSS)或通過使用大腸桿菌重組表達酵母的蛋白質二硫鍵異構酶基因而獲得的純化蛋白質。
另外，已知以下蛋白質是蛋白質二硫鍵異構酶，它們可用作本發明的蛋白質二硫鍵異構酶人蛋白質二硫鍵異構酶(PIR database accession no.ISHUSS)；人蛋白質二硫鍵異構酶相關的蛋白質(GenBank accession no.4758304)；和酵母蛋白質二硫鍵異構酶同系物(PIR database accessionno.A44483)。
至於二硫鍵交換蛋白，有四種類型分別稱為二硫鍵交換蛋白A、B、C和D(DsbA、B、C和D)的蛋白質存在於大腸桿菌等。DsbA是一種21 kDa具有類似硫氧還蛋白摺疊結構的酶，可催化二硫鍵的形成。DsbB是20kDa的蛋白質，具有四個跨膜區和兩個周質區。DsbB可維持DsbA的氧化狀態。DsbC是一種周質蛋白，可形成同型二聚體，具有類似硫氧還蛋白的摺疊。DsbC是一種主要負責二硫鍵異構化、並作為分子伴侶的酶。DsbD是一種分子量59 kDa的蛋白質，包括2個周質區和8個跨膜區。DsbD的功能是可維持半胱氨酸作為處於還原狀態的DsbC的活性中心。
已知以下蛋白質是二硫鍵交換蛋白，可用作本發明的二硫鍵交換蛋白大腸桿菌的DsbA(SWISS-PROT protein database accession no.P24991)；大腸桿菌的DsbC(SWISS-PROT protein database accession no.P21892)；鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)的蛋白質二硫鍵異構酶dsbA同系物(PIR database accession no.S32895)；腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)的硫醇-二硫鍵交換蛋白dsbA同系物NMB0278(PIR database accession no.C81217)；線蟲(Caenorhabditis elegans)的蛋白質二硫鍵異構酶I型異構體(GeneBank accession no.AAB94647)；和Datisca glomerata的蛋白質二硫鍵異構酶同系物(GeneBankaccession no.AAD28260)。
如上所述，可從微生物中純化這些二硫鍵交換蛋白作為組分，而且它們也可以通過重組方法來獲得。
當使用蛋白質二硫鍵異構酶(PDI)作為氧化還原酶時，其濃度優選地是0到10μM，更優選地是0.001到5μM，進一步優選地是0.001到2μM。當用二硫鍵交換蛋白作為氧化還原酶時，其濃度優選地是0到10μM，更優選地是0.01到10μM，進一步優選地是0.1到10μM。
另外，優選地，二硫鍵交換蛋白包含最低量的穀胱甘肽還原酶和硫氧還蛋白還原酶。優選地，硫氧還蛋白還原酶和/或穀胱甘肽還原酶在構成蛋白質合成系統的組分中的含量為100ng/ml或更少。
另外，如上所述的各組分純度的測定方法將在下面舉例說明。
可通過以下方式計算純度上述含有諸如起始因子、延伸因子、終止因子、甲硫氨醯tRNA轉移酶、DsbA和DsbC這樣的蛋白質的組分，通過His-Tag和鎳柱純化His標記蛋白的方法進行純化；通過SDS-PAGE確定目標蛋白；通過光密度計測定每個泳道的電泳圖譜。
純化的核糖體的純度可通過蔗糖密度梯度分析進行測定。
通常已商品化的試劑，譬如tRNAs、胺基酸、核糖核苷三磷酸、FD、其它類型的緩衝液、DTT和氧化型穀胱甘肽，可按這種試劑商品化形式的純度使用。另外，所有這些商品化的試劑純度均為80％或以上。
對於本發明的檢測方法，可使用[合成具有分子內或分子間二硫鍵的蛋白質的方法]所述的反應體系。
本發明的檢測方法包括測定氧化還原酶濃度、氧化還原試劑濃度與至少含有一個肽鏈的合成蛋白質的活性之間的相關性，其中，所述的合成蛋白質可通過一個二硫鍵形成交聯，而且基於這種交聯形式可調節其活性。通過包含以下a)到d)，和具體地(1)a)，b)和c)，(2)a)，b)和d)，和(3)a)，b)和c)和d)的反應體系進行檢測a)至少一個模板核酸；b)包含多種具有特定的存在量和純度、在加入模板核酸後可合成由模板核酸編碼的蛋白質的組分；c)至少一種具有特定的存在量和純度的、可催化二硫鍵氧化還原的氧化還原酶；及d)至少一種具有特定的存在量和純度的、調節二硫鍵氧化還原狀態的氧化還原試劑。
測定通過以上反應體系合成的蛋白質的活性，從而測定添加的c)氧化還原酶和d)氧化還原試劑之間的相關性。所測定的蛋白質的活性不僅限於酶活性，還可包含例如，受體和蛋白質的結合活性、細胞增殖活性、結合活性和細胞增殖活性之間的比活性等活性。
更具體而言，製備各種濃度的c)氧化還原酶和d)氧化還原試劑，其中c)和d)均可只含有單一物質或者是多種物質的混合物。這種氧化還原酶的實例包括蛋白質二硫鍵異構酶、二硫鍵交換蛋白和同系物的酶類。這種氧化還原試劑的實例包括DTT、GSSG、GSH和硫氧還蛋白。然後起始蛋白合成反應。此處，c)和d)可在蛋白質合成反應開始時加入，也可以在合成反應中加入，或者在合成反應停止後加入。當在合成反應終止後加入c)和d)時，優選地，產物在加入後置於37℃靜置幾十分鐘到1小時。在上述蛋白質合成的每個例子中，測定反應溶液中所合成的蛋白質的活性。此處，被合成的蛋白質沒有特別限定，只要是至少具有一個分子間和/或分子內二硫鍵交聯形成的蛋白質即可。例如，可在反應溶液中合成多種蛋白質，從而形成異源寡聚體或類似物質，從而可測定其活性。
如上所述，可測定蛋白質活性、c)氧化還原酶和/或d)氧化還原試劑的相關性。
利用所獲得的相關性，通過測定實現預定活性水平(期望活性水平)必須的c)氧化還原酶和/或d)氧化還原試劑的濃度；向b)蛋白合成反應試劑中加入c)氧化還原酶和/或d)氧化還原試劑，使其達到可獲得期望活性的濃度；及加入a)編碼目標蛋白的模板核酸，從而可在反應體系中高效合成目標蛋白。
參考以下實施例對本發明進行詳細描述，但本發明的技術範圍不限定於此。
實施例1核糖體的製備用氧化鋁顆粒破碎處於對數生長期中的大腸桿菌A19細胞系(300克)。將破碎的細胞懸浮在緩衝液A(10mM HEPES-氫氧化鉀(pH 7.6，HEPES-KOH)，10m氯化鎂(MgCl2)，50mM氯化鉀(KCl)和1mMDTT)中。然後通過離心(30,000g，4℃，1小時)除去氧化鋁顆粒和破碎的細胞。接著向得到的上清部分加入脫氧核糖核酸酶(DNase)至終濃度1μg/ml，然後離心(100,000g，4℃，4小時)。將得到的沉澱懸浮在緩衝液A中，製備粗核糖體提取物。將粗核糖體提取物進行6％到36％(w/v)蔗糖密度梯度離心。圖1所示的片段來自分離成分。將得到的核糖體組分在100,000g進行離心。將得到的沉澱懸浮在核糖體緩衝液(20mM HEPES-KOH(pH 7.6)，6mM MgOAc，30mM NH4Cl，7mMβ-巰基乙醇)中，從而得到純化的核糖體。將部分純化的核糖體進行6％到36％(w/v)蔗糖密度梯度分析，可形成單一的峰。核糖體的純度為90％或以上。
實施例2構建高表達氨醯-tRNA合成酶的質粒及轉化子的生產用從大腸桿菌A19細胞系提取的基因組為模板，通過PCR擴增編碼丙氨醯-tRNA合成酶的基因序列，從而得到5′端被SphI，3′端被HindIII識別的DNA片段。將得到的DNA片段插入到已被SphI和HindIII切割的質粒pQE30(QIAGEN公司制)中。從而得到可高表達N端融合His-Tag的丙氨醯-tRNA合成酶的載體。用得到的載體轉化大腸桿菌BL21/pREP4。另一個高表達ARS的載體以同樣方法構建。表1列出載體、限制性酶和His-Tag的位置。另外，用表1列出的pQE系列質粒和pET系列質粒分別轉化大腸桿菌BL21/pREP4和大腸桿菌BL21/DE3。


備註″R.E.″表示限制性酶。
實施例3構建其它可高表達蛋白因子和酶的質粒以下高表達蛋白因子和酶的質粒按實施例2中所述方式構建MTF、T7聚合酶、IF1、IF2、IF3、EF-G、EF-Tu、EF-Ts和RF1。
此外，表達未列到表1中的蛋白因子和酶的質粒也可以相同方式構建。另外，使用pQE系列載體或pET系列載體分別轉化大腸桿菌BL21/pREP 4或大腸桿菌BL21/DE3。
實施例4
蛋白因子和酶的高表達與純化為了高表達His標記的丙氨醯-tRNA合成酶，在LB培養基(6升)培養實施例2獲得的大腸桿菌BL21/pREP4細胞轉化子至660nm吸光度為0.7。向培養液中加入異丙基-1-硫代-β-D-半乳糖胺(IPTG)至終濃度為0.1mM，然後在37℃再培養4小時。將培養液離心，得到的細胞懸浮在懸浮緩衝液(50mM HEPES-KOH(pH 7.6)，1M NH4Cl，10mM MgCl2，0.3mg/ml白蛋白溶菌酶，0.1％TritonX-100，0.2mM苯甲基磺醯氟(PMSF)和6mM β-巰基乙醇)中。超聲懸浮液以破碎細胞。將超聲懸浮液離心(100,000g，4℃ 1小時)。然後除去破碎的細胞。將獲得的上清部分加入已預裝Ni2+的10-ml Hi-Trap鰲合柱(Pharmacia公司制)中，然後用100ml含10mM咪唑(50mMHEPES-KOH(pH 7.6)，1M NH4Cl和10mM MgCl2)的HT緩衝液洗滌。用線性梯度為10到400mM咪唑的HT緩衝液將His標記的丙氨醯-tRNA合成酶從柱上洗脫下來。用儲液緩衝液(50mM HEPES-KOH(pH 7.6)，100mM KCl，10mM MgCl2和30％甘油)透析含純化蛋白質的組分。根據以牛血清白蛋白(BSA)為參照、用蛋白質檢測試劑盒(Bio-Rad)製備的標準曲線，計算純化的His標記的丙氨醯-tRNA合成酶的濃度。將純化的His標記的丙氨醯-tRNA合成酶等分為1ml，並用液氮快速冷凍，然後儲存於-80℃。以相同方法純化His標記的丙氨醯-tRNA合成酶(AlaRS)、精氨酸tRNA合成酶(ArgRS)、天冬醯氨tRNA合成酶(AsnRS)、天冬氨酸tRNA合成酶(AspRS)、半胱氨酸tRNA合成酶(CysRS)、穀氨醯胺tRNA合成酶(GlnRS)和穀氨酸tRNA合成酶(GluRS)。圖2所示的是His標記的因子經12％SDS-PAGE電泳圖進行分離(進行考馬斯亮蘭染色)。通過光密度計計算出每種因子的純度均為90％或以上。另外，未顯示在圖2中的表1中的其它因子和酶也通過SDS-PAGE分離。用光密度計以相同方法計算每種因子的純度均為90％或以上。
實施例5翻譯實驗(一般方法)蛋白質合成反應基本試劑的成分(50μl)如下2mM ATP，2mMGTP，1mM CTP，1mM UTP，10mM磷酸肌酸，2.8A 260單位tRNA混合物，0.5μgFD，0.1mM各種胺基酸，9mM醋酸鎂，5mM磷酸鉀(pH 7.3)，95mM穀氨酸鉀，5mM氯化銨，0.5mM氯化鈣，1mM亞精胺，8mM腐胺，12pmol核糖體，1μg IF1，2μg IF2，0.75μg IF3，1μg EF-G，2μg EF-Tu，1μg EF-Ts，0.5μg RF1，0.5μg RF3，0.5μgRRF，30-300單位ARS MTF，0.2μg肌酸激酶(CK)，0.15μg肌激酶(MK)，0.054μg核苷二磷酸激酶(NDK)，1.78單位PPiase，和0.5μgT7 RNA聚合酶。向這種蛋白質合成反應基本試劑中加入1pmol模板DNA，37℃反應1小時。
在反應後必須除去核糖體時，使用分子量為100kDa或更小的物質才可通過的超濾膜除去核糖體。
另外，核糖體和上述列於表1中的組分項目通過實施例1和4所述的方法製備，並測定其純度。其它所用的組分是商品化的純化試劑。
而且當上述組分應用於下述實施例6和12時，表1所列的項目、核糖體、DsbA和DsbC通過實施例1、4和13所述的方法製備，並測定其純度。其它所用的組分是商品化的純化試劑。
實施例6人溶菌酶的合成已報導溶菌酶是一種具有四個分子內二硫鍵，而且兩個或多個這樣的二硫鍵必須互相交聯以表現出活性的蛋白質(J Biol Chem2513147-3153(1976))。因此，溶菌酶一直作為檢測結構與活性相關性的模式蛋白。此處，根據本發明的方法和傳統方法合成了人溶菌酶，以檢測合成的蛋白量和比活性。
使用以下兩條引物從人溶菌酶cDNA克隆(人基因庫，Stratagene公司)中通過PCR擴增大小為0.42 kbp的成熟的人溶菌酶基因正向引物序列AAGGAGATATACCAATGAAGGTCTTTGAAAGGTGTG；及反向引物序列GGATTAGTTATTCATTACAGTCCACAACCTTGAACAT。
然後用序列為GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCA的正向引物和上述反向引物通過PCR擴增含T7啟動子區的長約0.51kbp的模板DNA。模板DNA的序列如序列表中的SEQ IDNO4所示。
向實施例5中所述的每個蛋白質合成反應基本試劑(用於本發明方法)，及50μl通過向反應試劑加入1mM DTT得到的反應液(用於傳統方法)中，加入1pmol製備好的模板DNA，進行蛋白質合成反應。
合成的蛋白質通過SDS-PAGE分離，並用SYPRO Orange(Amersham pharmacia公司制)進行染色。將分子量為17000的人溶菌酶帶與已知濃度的BSA帶相比較，以得到合成的人溶菌酶的濃度。用Micrococcus luteus ATCC 4698細胞系冷凍乾燥粉(SIGMA)，在每分鐘可降低0.001的450nM吸光度的酶量為1個單位的條件下測定人溶菌酶活性(Imoto T.，Johnson L. N.，North A.T.C.，Phillips D.C.，Rupley J.A.，The Enzymes，3rd ed.，7，665-868(1972))。圖3和4所示的分別是合成蛋白質的電泳圖和比活性。從圖3和4可明顯看出，在傳統方法下，合成的蛋白質可通過電泳確定，但沒有檢測到酶活性。而在本發明的方法中，可檢測到比活性約為300單位/毫克。因此表明根據本發明的方法，具有二硫鍵的蛋白進行了正確摺疊。而且檢測了其它具有二硫鍵的蛋白，也可得到大致相當的結果。
實施例7鼠白介素6(mIL 6)的合成用鼠cDNA文庫以與實施例6相同方式製備mIL6。另外，用大腸桿菌基因組DNA以與實施例6相同方式製備大腸桿菌二氫葉酸還原酶(DHFR)的模板DNA。然後製備以下5種反應溶液向實施例5(傳統方法)的蛋白合成反應試劑中加入1mM DTT得到的反應溶液；實施例5的蛋白質合成反應基本試劑；和向實施例5的試劑中分別加入終濃度為2、4和8mM GSSG而得到的反應溶液。每種反應溶液中均加入1pmol模板DNA，以進行各反應溶液中的蛋白質合成。在DHFR合成時，蛋白質合成後將反應溶液通過超濾膜。然後將DHFR的反應溶液和mIL6的反應溶液分別進行SDS-PAGE，並用SYPRO Red對蛋白質進行螢光染色。用螢光圖像儀分析染色圖譜，根據mIL6和DHFR的染色濃度計算反應溶液中蛋白質的量。圖5和6所示的分別是獲得的mIL6蛋白和DHFR蛋白的量。從圖5和6可明顯看出，當合成沒有分子間二硫鍵的DHFRs時，傳統方法可得到最大量的蛋白質，而本發明的方法得到的蛋白質的量少一些。另外表明，當合成有分子間二硫鍵的mIL6時，本發明的方法產生的蛋白質量超過傳統方法產生的量。另外進行了同樣的實驗，只是使用了不同的具有二硫鍵的蛋白質的模板DNA來代替mIL6模板DNA。因此得到了大致相當的結果。
實施例8蛋白質二硫鍵異構酶(PDI)的影響製備4種反應溶液，每種均包含實施例5中的蛋白質合成基本反應試劑，並加入2mM GSSG。然後向反應溶液中加入來源於牛的PDI(Takara Bio Inc.)至終濃度分別為0、0.0325、0.13和0.52μM。然後，向50μl反應溶液中加入人溶菌酶模板DNA(1pmol)，進行蛋白質合成。以與實施例6所用相同方式測定溶菌酶的比活性。圖7所示的是加到反應體系中的PDI濃度與合成的人溶菌酶比活性間的關係。從圖7可明顯看出，當PDI濃度為0.0325μM或更多時，可提高具有二硫鍵的蛋白質的比活性。另外，可通過本發明的方法測定PDI活性。另外，當用其它類型的PDIs和二硫鍵交換蛋白來代替牛PDI時，可得到大致相當的結果。
實施例9二硫蘇糖醇(DTT)濃度的影響製備6種反應溶液，每種均包含實施例5中的蛋白質合成反應基本試劑，並加入0.13μM PDI。然後向反應溶液中加入DTT至終濃度分別為1000、500、250、125、62.5和0μM。然後，向50μl反應溶液中加入1pmol人溶菌酶模板DNA，進行蛋白質合成。以與實施例6所用相同方式測定溶菌酶的比活性。如圖8所示的結果。從圖8可明顯看出，當DTT濃度為125μM或更少時，可得到較強的溶菌酶活性。
實施例10鹼性磷酸酶的合成鹼性磷酸酶是具有兩個分子內二硫鍵的蛋白質，因此它可作為模式蛋白來檢測二硫鍵形成與酶活性的關係。在這裡合成了鹼性磷酸酶。
使用針對大腸桿菌基因組DNA和大腸桿菌鹼性磷酸酶的PCR引物，以與實施例6相同的方式來合成大腸桿菌鹼性磷酸酶的模板DNA。製備5種反應溶液，每種都包含實施例5的蛋白質合成反應基本試劑，並加入1mM DTT和0.13μM PDI。之後，分別向反應溶液中加入濃度為0、1、2、3和4 mM的GSSG。
然後，向50μl反應溶液中加入1pmol鹼性磷酸酶的模板DNA，進行蛋白質合成。以與實施例5相同的方法測定合成的蛋白質的濃度。通過以對硝基苯基磷酸二鈉鹽為底物(Biochim Biophys Acta.258178-87(1972))測定405nm處吸光度來測定所合成的鹼性磷酸酶的活性。圖9所示的是鹼性磷酸酶的相對活性。從圖9可明顯看出，通過傳統方法，也就是用蛋白反應試劑加入1mM DTT和0.13μMPDI，沒有檢測到鹼性磷酸酶的活性。另一方面，通過本發明的方法，也就是用蛋白反應試劑加入1mM或2mM GSSG，可獲得鹼性磷酸酶的活性。甚至在體系中存在1mM DTT時也可檢測到鹼性磷酸酶的活性。因此，可證明合成的蛋白質發生了正確的摺疊。另外，製備不同的反應溶液，分別包含實施例5中的反應溶液和濃度為1000、500、250、125和0μM DTT。如上所述，向每種反應溶液中加入模板DNA，然後鹼性蛋白合成。然後測定鹼性磷酸酶的活性。結果如圖10所示。沒有PDI，只是改變DTT的濃度。因此，結果表明可在DTT的濃度為500μM或更小時獲得鹼性磷酸酶的活性。
實施例11DsbC的影響通過PCR擴增大腸桿菌的DsbC，並以與實施例2相同的方法構建高表達dsbC的載體，只是所獲得的DNA片段其序列可被5′的BamHI和3′的HindIII識別。用獲得的載體轉化大腸桿菌BL21/pREP4。然後，以與實施例4相同的方法獲得純化的DsbC。蛋白質純度在90％或以上。通過向實施例5的蛋白質合成試劑中加入1mM DTT和2mMGSSG而製備3種反應溶液(每種50μl)。向這些反應溶液中分別添加濃度0、0和0.5μM的DsbC，及0、1和1pmol的實施例6中的人溶菌酶基因的模板DNA。通過與實施例6所用相同的方法測定合成的蛋白質量和溶菌酶的活性。圖11所示的是特異的酶活性。從圖11可以明顯看出，加入DsbC可使溶菌酶的比活性顯著增加。另外，當使用其它的二硫鍵交換蛋白代替DsbC時，以及當不同類型的二硫鍵交換蛋白同時使用時，可得到大致相當的結果。
實施例12本發明的蛋白質合成試劑與傳統的細胞提取物的比較根據商品說明書通過大腸桿菌細胞提取物的體外蛋白質合成系統(Roche Rapid Translation System 100)合成大腸桿菌的鹼性磷酸酶，不過添加了終濃度為0、1、2和3mM的GSSG。另外，通過本發明的方法以與實施例10所用的相同方式合成大腸桿菌鹼性磷酸酶。圖12所示的是合成的鹼性磷酸酶的比活性。從圖12可明顯看出，用大腸桿菌細胞提取物體系即使加入各種濃度的GSSG也沒有檢測到鹼性磷酸酶的活性，而另一方面，通過本發明的合成方法可得到很高的鹼性磷酸酶的活性。
實施例13EF-Tu、DsbA和DsbC純度的確定在冰上超聲破碎表達含帶有His-Tag的EF-Tu的蛋白的細胞，以將其懸浮在上樣緩衝液(300mM NaCl，50mM NaH2PO4，pH 8.0)中。然後，將得到的細胞裂解物離心(30,000g，4℃，30分鐘)。之後，向上述獲得的上清中加入已在冰冷上樣緩衝液中平衡的50％Ni2+-NTA漿(Qiagen)，並在4℃攪拌1小時。然後將樹脂加到柱上，並在4℃用20倍柱體積的上樣緩衝液(含10mM咪唑，pH 8.0)進行洗滌。用20倍柱體積咪唑濃度梯度為10到250mM的上樣緩衝液將目標蛋白從柱上洗脫下來。然後收集組分(每個1ml)。通過SDS-PAGE確定目標蛋白。用光密度計讀取每個泳道的電泳圖譜，從而可計算純度。圖13所示的是EF-Tu洗脫組分的電泳圖。每個泳道的電泳圖譜通過光密度計讀取，然後收集純度為90％或以上的Ef-Tu組分。
另外，圖1 4所示的是純化的DsbA(泳道1)和DsbC(泳道2)的電泳圖。這兩個酶的純度均為90％或以上。
工業實用性[蛋白質合成方法]根據本發明，可加入幾微摩爾到1mM在傳統反應溶液中要優先除去的DTT。而且也可以不加入DTT。
另外，通常認為使用除去DTT的無細胞蛋白合成系統的傳統方法所合成蛋白的量在這種體系可能會降低，即使二硫鍵可在蛋白質中形成，有活性的目標蛋白的合成效率也將被破壞。但根據本發明，通過重構蛋白質合成系統可使合成蛋白質的量保持穩定，或在某些情況下有所提高。因此，蛋白質可被高效合成。
根據本發明活性測定方法，在蛋白質合成反應中合成的底物為沒有二硫鍵的單鏈多肽，從而不需要還原和變性步驟。因此，在合成時或合成後，加入測定活性的酶，可以摺疊蛋白質的活性或結構作為指示物。因此，本發明的方法的特徵在於所需的步驟和時間與傳統方法相比較大大簡化和縮短。
本申請所引用的所有出版物，專利和專利申請均全部併入本申請作為參考。
序列表110Post Genome Institute Co.，Ltd.
120通過二硫化物交聯進行體外蛋白質合成的方法130PH-2448-PCT150JP 2004-1365201512004-04-301604170PatentIn Ver.2.1210121136212DNA213人工序列220
223人工序列的描述引物4001aaggagatat accaatgaag gtctttgaaa ggtgtg36210221137212DNA
213人工序列220
223人工序列的描述引物4002ggattagtta ttcattacac tccacaacct tgaacat37210321185212DNA213人工序列220
223人工序列的描述引物4003gaaattaata cgactcacta tagggagacc acaacggttt ccctctagaa ataattttgt 60ttaactttaa gaaggagata tacca852104211495212DNA213智人(Homo sapiens)4004gaaattaata cgactcacta tagggagacc acaacggttt ccctctagaa ataattttgt 60ttaactttaa gaaggagata taccaatgaa ggtctttgaa aggtgtgagt tggccagaac 120
tctgaaaaga ttgggaatgg atggctacag gggaatcagc ctagcaaact ggatgtgttt 180ggccaaatgg gagagtggtt acaacacacg agctacaaac tacaatgctg gagacagaag 240cactgattat gggatatttc agatcaatag ccgctactgg tgtaatgatg gcaaaacccc 300aggagcagtt aatgcctgtc atttatcctg cagtgctttg ctgcaagata acatcgctga 360tgctgtagct tgtgcaaaga gggttgtccg tgatccacaa ggcattagag catgggtggc 420atggagaaat cgttgtcaaa acagagatgt ccgtcagtat gttcaaggtt gtggagtgta 480atgaataact aatcc49權利要求
1.一種合成具有分子內或分子間二硫鍵的蛋白質的方法，包括使用包含以下a)，b)，和c)和/或d)的反應系統a)至少一個編碼目標蛋白的模板核酸；b)包含多種具有特定存在量和純度的組分的、在加入模板核酸後可合成由模板核酸編碼的蛋白質的蛋白質合成反應基本試劑；c)至少一種具有特定存在量和純度的、可催化二硫鍵氧化還原的氧化還原酶；及d)至少一種具有特定存在量和純度的調節二硫鍵氧化還原狀態的氧化還原試劑。
2.權利要求1所述的合成蛋白質的方法，其中蛋白質合成基本反應試劑包括核糖體、起始因子、延伸因子、終止因子、氨醯-tRNA合成酶、甲硫氨醯tRNA轉移酶、tRNAs、胺基酸、核苷三磷酸、10-甲醯基5，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水。
3.權利要求1所述的合成蛋白質的方法，其中蛋白質合成反應基本試劑包括核糖體、起始因子、延伸因子、氨醯-tRNA合成酶、甲硫氨醯tRNA轉移酶、tRNAs、胺基酸、核苷三磷酸、10-甲醯基5，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水。
4.權利要求1-3中任一項所述的合成蛋白質的方法，其中氧化還原酶是催化促進和/或異構化蛋白質的二硫鍵的酶。
5.權利要求1-4中任一項所述的合成蛋白質的方法，其中氧化還原酶包括蛋白質二硫鍵異構酶類(PDIs)或二硫鍵交換蛋白。
6.權利要求5所述的合成蛋白質的方法，其中蛋白質二硫鍵異構酶的濃度為0到10μM。
7.權利要求5或6所述的合成蛋白質的方法，其中二硫鍵交換蛋白的濃度為0到10μM。
8.權利要求1-7中任一項所述的合成蛋白質的方法，其中氧化還原試劑為二硫蘇糖醇或氧化型穀胱甘肽。
9.權利要求8所述的合成蛋白質的方法，其中氧化型穀胱甘肽的濃度為0到8mM。
10.權利要求8或9所述的合成蛋白質的方法，其中二硫蘇糖醇的濃度為0到1mM。
11.權利要求1-10中任一項所述的合成蛋白質的方法，其中硫氧還蛋白還原酶在反應體系中的濃度不超過100ng/ml。
12.權利要求1-11中任一項所述的合成蛋白質的方法，其中穀胱甘肽還原酶在反應體系中的濃度不超過100ng/ml。
13.一種檢測方法包括在包含以下a)，b)和c)和/或d)的反應體系中改變氧化還原酶試劑和氧化還原試劑的濃度；合成包含至少一個肽鏈的蛋白質，其中所述肽鏈分子內或分子間通過至少一個二硫鍵進行交聯，其活性可根據這種交聯方式進行調節；測定蛋白質的活性；及測定蛋白質活性、氧化還原酶試劑濃度和氧化還原試劑濃度之間的關係a)至少一個編碼目標蛋白的模板核酸；b)包含具有特定存在量和純度的多種組分、在加入模板核酸後可合成由模板核酸編碼的蛋白質的蛋白質合成反應基本試劑；c)至少一種具有特定存在量和純度的可催化氧化還原的氧化還原酶；及d)至少一種具有特定存在量和純度的調節氧化還原狀態的氧化還原試劑。
14.權利要求13所述的檢測方法，其中蛋白質合成反應基本試劑包括核糖體、起始因子、延伸因子、終止因子、氨醯-tRNA合成酶、甲硫氨醯tRNA轉移酶、tRNAs、胺基酸、核苷三磷酸、10-甲醯基5，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水。
15.權利要求13所述的檢測方法，其中蛋白質合成反應基本試劑包括核糖體、起始因子、延伸因子、氨醯-tRNA合成酶、甲硫氨醯tRNA轉移酶、tRNAs、胺基酸、核苷三磷酸、10-甲醯基5，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水。
16.權利要求13-15中任一項所述的檢測方法，其中氧化還原酶是催化促進和/或異構化蛋白質的二硫鍵的酶。
17.權利要求13-16中任一項所述的檢測方法，其中氧化還原酶包括蛋白質二硫鍵異構酶類(PDIs)或二硫鍵交換蛋白。
18.權利要求13-17中任一項所述的檢測方法，其中氧化還原酶是濃度為0μM到10μM的蛋白質二硫鍵異構酶類。
19.權利要求13-18中任一項所述的檢測方法，其中氧化還原酶是濃度為0μM到10μM的二硫鍵交換蛋白。
20.權利要求13-19中任一項所述的檢測方法，其中氧化還原試劑為二硫蘇糖醇或氧化型穀胱甘肽。
21.權利要求20所述的檢測方法，其中氧化型穀胱甘肽的濃度為0到8mM。
22.權利要求13-21中任一項所述的檢測方法，其中硫氧還蛋白還原酶在反應體系中的濃度不超過100ng/ml。
23.權利要求13-21中任一項所述的檢測方法，其中穀胱甘肽還原酶在反應體系中的濃度不超過100ng/ml。
24.一種測定催化促進和/或異構化蛋白質二硫鍵的酶的活性的方法，包括以下a)，b)和c)a)至少一個模板核酸；b)包含多種具有特定的化合物名稱、存在量和純度的組分、在加入模板核酸後可合成由模板核酸編碼的蛋白質的蛋白質合成基本反應試劑；c)包含至少一種具有特定的化合物名稱、存在量和純度的組分、可調節氧化還原狀態試劑的氧化還原試劑。
25.權利要求24中測定活性的方法，其中蛋白質合成反應基本試劑包括核糖體、起始因子、延伸因子、終止因子、氨醯-tRNA合成酶、甲硫氨醯tRNA轉移酶、tRNAs、胺基酸、核苷三磷酸、10-甲醯基5，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水。
26.權利要求24中測定活性的方法，其中蛋白質合成反應基本試劑包括核糖體、起始因子、延伸因子、氨醯-tRNA合成酶、甲硫氨醯tRNA轉移酶、tRNAs、胺基酸、核苷三磷酸、10-甲醯基5，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水。
27.一種方法，該方法包括在包含下述a)和b)的基本蛋白質合成反應系統中添加不同濃度的c)和d)，合成包含至少一種蛋白質，其中所述蛋白質通過至少一個二硫鍵形成分子內或分子間交聯，而且可根據這種交聯形式調節其活性；測定蛋白質的活性；測定蛋白質活性、催化氧化還原反應的酶濃度和調節氧化還原狀態的試劑濃度之間的關係，由此確定可使目標蛋白活性超過預期活性水平的c)和/或d)的濃度，其中所述的a)～d)如下a)編碼至少一個目標蛋白的至少一個模板核酸；b)包含多種具有特定存在量和純度的組分、在加入模板核酸後可合成由模板核酸編碼的蛋白質的蛋白質合成基本反應試劑；c)至少一種具有特定存在量和純度的可催化氧化還原的氧化還原酶；d)至少一種具有特定存在量和純度的調節氧化還原狀態的氧化還原試劑。
28.權利要求27所述的方法，其中蛋白質合成基本反應試劑包括核糖體、起始因子、延伸因子、終止因子、氨醯-tRNA合成酶、甲硫氨醯tRNA轉移酶、tRNAs、胺基酸、核苷三磷酸、10-甲醯基5，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水。
29.一種合成具有分子內或分子間二硫鍵的蛋白質的方法，包括以下步驟在包含a)編碼至少一個目標蛋白的至少一個模板核酸；b)包含多種具有特定存在量和純度的組分、在加入模板核酸後可合成由模板核酸編碼的蛋白質的蛋白質合成基本反應試劑；c)至少一種具有特定存在量和純度的可催化氧化還原的氧化還原酶；和/或d)至少一種具有特定存在量和純度的調節氧化還原狀態的氧化還原試劑的蛋白質合成反應系統中，在改變c)催化氧化還原的酶的濃度和/或d)調節氧化還原狀態的試劑濃度的合成條件下，合成包含至少一種多肽的蛋白質，其中所述多肽可通過至少一個二硫鍵形成分子內或分子間交聯，而且可根據這種交聯形式調節其活性；測定蛋白質的活性；測定蛋白質活性、催化氧化還原反應的酶濃度和調節氧化還原狀態的試劑濃度之間的關係，由此確定可使目標蛋白活性超過預期活性水平的c)和/或d)的濃度；(2)用包含以上a)、b)和c)和/或d)的蛋白質合成反應系統合成目標蛋白，其中c)和/或d)的濃度已按上述確定的進行了調節。
30.權利要求29所述的合成蛋白質的方法，其中蛋白合成反應基本試劑包括核糖體、起始因子、延伸因子、終止因子、氨醯-tRNA合成酶、甲硫氨醯tRNA轉移酶、tRNAs、胺基酸、核苷三磷酸、10-甲醯基5，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水。
31.權利要求29所述的合成蛋白質的方法，其中蛋白質合成反應基本試劑包括核糖體、起始因子、延伸因子、氨醯-tRNA合成酶、甲硫氨醯tRNA轉移酶、tRNAs、胺基酸、核苷三磷酸、10-甲醯基5，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水。
32.一種包含以下a)、b)和/或c)的試劑盒a)包含具有特定存在量和純度的核糖體、起始因子、延伸因子、終止因子、氨醯-tRNA合成酶、甲硫氨醯tRNA轉移酶、tRNAs、核苷三磷酸、胺基酸、10-甲醯基5，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水的、可在加入模板核酸後合成由模板核酸編碼的蛋白質的蛋白質合成反應基本試劑；b)至少一種具有特定存在量和純度的可催化氧化還原的氧化還原酶；及c)至少一種具有特定存在量和純度的調節氧化還原狀態的氧化還原試劑。
33.一種包含以下a)、b)和/或c)的試劑盒a)包含具有特定存在量和純度的核糖體、起始因子、延伸因子、氨醯-tRNA合成酶、甲硫氨醯tRNA轉移酶、tRNAs、核苷三磷酸、胺基酸、10-甲醯基5，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水的、可在加入模板核酸後合成由模板核酸編碼的蛋白質的蛋白質合成反應基本試劑；b)至少一種具有特定存在量和純度的可催化氧化還原的氧化還原酶；及c)至少一種具有特定存在量和純度的調節氧化還原狀態的氧化還原試劑。
34.一種包含以下a)、b)和/或c)的試劑盒a)包括特定存在量和純度的核糖體、起始因子、延伸因子、終止因子、RNA聚合酶、氨醯-tRNA合成酶、甲硫氨醯tRNA轉移酶、tRNAs、核苷三磷酸、胺基酸、10-甲醯基5，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水的、可在加入模板核酸後合成由模板核酸編碼的蛋白質的蛋白質合成反應基本試劑；b)至少一種具有特定存在量和純度的可催化氧化還原的氧化還原酶；及c)至少一種具有特定存在量和純度的調節氧化還原狀態的氧化還原試劑。
35.一種包含以下a)、b)和/或c)的試劑盒a)包括特定存在量和純度的核糖體、起始因子、延伸因子、RNA聚合酶、氨醯-tRNA合成酶、甲硫氨醯tRNA轉移酶、tRNAs、核苷三磷酸、胺基酸、10-甲醯基5，6，7，8-四氫葉酸(FD)、鹽和水的蛋白質合成反應基本試劑，其量和純度已進行指定，可在加入模板核酸後合成由模板核酸編碼的蛋白質；b)至少一種具有特定存在量和純度的可催化氧化還原的氧化還原酶；及c)至少一種具有特定存在量和純度的調節氧化還原狀態的氧化還原試劑。
36.權利要求32-35中任一項所述的試劑盒，包含編碼對照蛋白質的模板核酸。
37.一種通過含以下a)和b)的反應體系合成具有分子內或分子間二硫鍵的蛋白質的方法a)至少一個編碼目標蛋白的模板核酸；b)包含多種具有特定存在量和純度的組分、在加入模板核酸後可合成由模板核酸編碼的蛋白質的蛋白質合成反應基本試劑。
全文摘要
本發明的目的是提供一種用重構的蛋白質合成系統簡便高效地合成含二硫鍵的蛋白質的方法。已知具有活性的蛋白質可通過使用含有純化組分的重構蛋白合成系統合成獲得，其中可影響氧化還原狀態的酶和底物被除去，並可對二硫化物和硫醇的氧化還原的平衡進行人工調節。這種系統可代替含有多種維持還原狀態酶和底物，例如硫氧還蛋白還原酶[EC 1.6.4.5]和穀胱甘肽還原酶[EC 1.6.4.2]等的細胞提取物或粗組分的、難以調節氧化還原狀態的系統。
文檔編號C12P21/02GK1997739SQ200580022328
公開日2007年7月11日 申請日期2005年4月28日 優先權日2004年4月30日
發明者桑田英文 申請人:株式會社後基因組研究所