一種毛細血管網及其製備方法與流程
2023-12-09 17:21:16 1
本發明涉及組織工程技術領域，具體而言，涉及一種毛細血管網及其製備方法。
背景技術：
雖然部分組織工程化的器官如皮膚、氣管等對血供要求不高的組織已開始運用於臨床，並取得了令人滿意的效果。但對於較厚的實質臟器如肝臟、腎臟等要實現體內的移植存活就沒那麼樂觀。因此構建充足有效的毛細血管網系統是十分必要的。
目前體外構建人工血管的相關技術有浸漬一瀝濾法、混凝法、去細胞組織複合法、同軸靜電紡絲法、旋轉曝光法以及3D快速成型技術等。去細胞組織複合法是將小腸黏膜下層膜剪成一定尺寸的膜片，卷至一定直徑的聚乙烯軸上，通過粘接、交聯、清洗和縫製獲得小口徑血管。這方法工序較為複雜且無法精確獲得人工血管的二維以及三維微納米結構。浸漬一瀝濾法的原理是將模具在原料液中反覆浸漬和晾乾，到達成型的目的。採用這種方法可以控制人工血管的內徑、壁厚、密度、孔徑、孔隙率等尺寸參數和微觀結構，進而改善人工血管的各項理化性能。而混凝法製備小口徑人工血管的技術，與浸漬一瀝濾法類似，同樣是將模具進行混凝浴，此兩種方法較步驟簡單，但是無法精確獲得人工血管的二維以及三維微納結構，所以需要結合其他方法進行微納米尺度加工。同軸靜電紡絲技術是將不互溶的芯層和殼層材料溶液分別裝入兩個注射器中，以適當的流速通過一個同軸的內外層針頭裝置，殼層液體流出與芯層溶液匯合，在同一電壓下形成泰勒錐，通過同軸靜電紡絲得到「殼·芯」結構納米纖維，然後用物理或化學法將芯質材料去除,留下殼層材料,就可以得到中空纖維，雖然此法製備的中空三維納米纖維結構與天然細胞外基質(ECM)很相似且直徑可以從幾十納米到幾微米，同時具有孔隙率高、比表面積大、孔徑分布較寬的特點，但該技術存在著製備過程中需要施加高壓電場、生產效率低的固有缺陷，從而限制了該方法商業化的大規模使用。因此在成本、規模、可控性研究方面離實用化及應用需求還有很大距離。旋轉曝光法是將光線精確聚焦在可旋轉、透明的裝有高分子預聚體系的圓桶模具的內壁處，然後在控制模具轉動的同時，利用紫外聚合的方法，對聚合物溶液體系按照軸向進行可控光聚合加工。這種方法製備的人工血管即使具有仿生的內外表面微結構和具有良好的生物相容性，但無法精確獲得人工血管的二維以及三維微納米結構。就連目前快速成型行業中最有生命力之一的技術—三維快速成型印表機(three dimensional printing，3DP)技術也無法直接列印微納米級的血管。
有鑑於此，特提出本發明。
技術實現要素：
本發明的第一目的在於提供一種毛細血管網的製備方法，所述的毛細血管網的製備方法工藝簡單，不需要高壓靜電場，也不需要大量模具，僅利用同軸轉筒旋轉產生的離心力作為中空納米纖維成絲的動力，不僅大大提高了生產產量，極大降低了能耗成本，而且提高了生產操作的安全性，滿足了大規模生產工程化組織三維毛細血管網的需求。
本發明的第二目的在於提供一種採用上述的毛細血管網的製備方法製備得到的毛細血管網，所述的毛細血管網成本低，能夠為較厚的工程化組織或器官如肝臟、腎臟等構建充足有效的血管網系統提供所需的三維毛細血管網。
為了實現本發明的上述目的，特採用以下技術方案：
一種毛細血管網的製備方法，通過離心紡絲方法製備得到可溶性三維紡絲網，在所得可溶性三維紡絲網上培養動物細胞，所述動物體細胞沿可溶性三維紡絲網生長增殖，可溶性三維紡絲網完全溶解後，得到一種毛細血管網。
鑑於現有技術存在的諸多問題，本發明採用特定方法，藉助離心紡絲手段，製備得到毛細血管網，離心紡絲是一種高效低耗的微納米纖維製備技術，其原理是聚合物熔體或溶液從噴絲孔甩出後在離心力作用下拉伸成纖維。在此過程中，離心力起著重要作用，它對聚合物熔體或溶液有一定的壓實作用，聚合物熔體或溶液被擠出後，高速旋轉所產生的離心力是聚合物拉伸的主要作用力之一。理論上任何可溶解或熔融的材料均可進行離心紡絲加工。本發明動物細胞在培養過程中，軸芯可在數小時內溶解，然後形成中空的可溶性三維紡絲網，剩下的軸殼會逐漸溶解並釋放細胞因子，至完全溶解時，毛細血管網早已形成。本發明毛細血管網的製備方法成本低，產量高，原料適應性廣，紡絲原料既可以是溶液也可以是熔體，工藝參數可調易控，故更能滿足植入物所需的毛細血管網的製備。
本發明不需要高壓靜電場，也不需要大量模具，僅利用離心力作為生產可溶性三維紡絲網的動力，不僅大大提高了生產產量，極大降低了能耗成本，而且提高了生產操作的安全性，滿足了大規模生產工程化組織三維毛細血管網的需求,也有利於克服組織工程構建物進入臨床的重要障礙。
優選地，所述可溶性三維紡絲網包括具有芯殼結構的可溶性三維紡絲網，所述具有芯殼結構的可溶性三維紡絲網包括軸芯和包覆在軸芯外側的軸殼。
進一步優選地，所述軸芯的材質包括糖，優選包括在37℃或37℃以下可被水溶解的糖，進一步優選包括糖畫糖、白沙糖、麥芽糖和艾素糖中的一種或多種，更進一步優選包括糖畫糖。
進一步優選地，所述軸殼的材質包括水溶性可降解生物材料，優選包括聚乙烯醇、聚乳酸、殼聚糖、透明質酸、纖維素、聚環氧乙烷、聚丙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯亞烷、聚乙二醇、聚環氧乙烷、聚乙醇酸、聚羥基脂肪酸酯、甲殼素和聚羥基脂肪酸脂中的一種或多種，進一步優選包括聚乙烯醇。
優選地，所述可溶性三維紡絲網由離心紡絲得到的紡絲纖維構成，所述紡絲纖維內包含細胞因子。
進一步優選地，所述細胞因子包括血管內皮生長因子、鹼性成纖維細胞生長因子中的一種或兩種，更進一步優選包括血管內皮生長因子和鹼性成纖維細胞生長因子。
優選地，所述軸殼內包含細胞因子。
進一步優選地，所述細胞因子包括血管內皮生長因子和鹼性成纖維細胞生長因子中的一種或兩種，更進一步優選包括血管內皮生長因子和鹼性成纖維細胞生長因子。
優選地，所述動物細胞包括血管內皮細胞、內皮祖細胞和成纖維細胞中的一種或多種，優選包括血管內皮細胞和成纖維細胞，或內皮祖細胞和成纖維細胞。
優選地，所述具有芯殼結構的可溶性三維紡絲網通過同軸離心紡絲方法製備得到。
優選地，所述離心紡絲方法所採用的離心轉速為3000-9000rpm，優選為4500-7500rpm，進一步優選為6000rpm。
優選地，所述離心紡絲方法所採用的噴孔直徑為0.8-1.2mm，優選為0.9-1.1mm，進一步優選為1mm。
採用上述的一種毛細血管網的製備方法製備得到的毛細血管網。
本發明毛細血管網製備成本低，能夠為較厚的工程化組織或器官如肝臟、腎臟等構建充足有效的血管網系統提供所需的三維毛細血管網。
與現有技術相比，本發明的有益效果為：
鑑於現有技術存在的諸多問題，本發明採用特定方法，藉助離心紡絲手段，製備得到毛細血管網，離心紡絲是一種高效低耗的微納米纖維製備技術，其原理是聚合物熔體或溶液從噴絲孔甩出後在離心力作用下拉伸成纖維。在此過程中，離心力起著重要作用，它對聚合物熔體或溶液有一定的壓實作用，聚合物熔體或溶液被擠出後，高速旋轉所產生的離心力是聚合物拉伸的主要作用力之一。理論上任何可溶解或熔融的材料均可進行離心紡絲加工。本發明動物細胞在培養過程中，軸芯可在數小時內溶解，然後形成中空的可溶性三維紡絲網，剩下的軸殼會逐漸溶解並釋放細胞因子，至完全溶解時，三維毛細血管網早已形成。本發明毛細血管網的製備方法成本低，產量高，原料適應性廣，紡絲原料既可以是溶液也可以是熔體，工藝參數可調易控，故更能滿足植入物所需的毛細血管網的製備。
本發明不需要高壓靜電場，也不需要大量模具，僅利用離心力作為生產可溶性三維紡絲網的動力，不僅大大提高了生產產量，極大降低了能耗成本，而且提高了生產操作的安全性，滿足了大規模生產工程化組織三維毛細血管網的需求,也有利於克服組織工程構建物進入臨床的重要障礙。
本發明毛細血管網製備成本低，能夠為較厚的工程化組織或器官如肝臟、腎臟等構建充足有效的血管網系統提供所需的三維毛細血管網。
附圖說明
為了更清楚地說明本發明具體實施方式或現有技術中的技術方案，下面將對具體實施方式或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發明的一些實施方式，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。
圖1為本發明一種具體實施方式提供的同軸離心紡絲機示意圖；
圖2為本發明一種具體實施方式提供的動物細胞與具有芯殼結構的可溶性三維紡絲網共培養示意圖；
附圖標記：
1-內筒； 2-外筒； 3-同軸噴頭；
4-三維紡絲網； 5-接收棒； 6-離心裝置；
7-軸殼； 8-軸芯； 9-動物細胞。
具體實施方式
下面將結合附圖和具體實施方式對本發明的技術方案進行清楚、完整地描述，但是本領域技術人員將會理解，下列所描述的實施例是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例，僅用於說明本發明，而不應視為限制本發明的範圍。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。實施例中未註明具體條件者，按照常規條件或製造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。
在本發明的描述中，需要說明的是，術語「中心」、「上」、「下」、「左」、「右」、「豎直」、「水平」、「內」、「外」等指示的方位或位置關係為基於附圖所示的方位或位置關係，僅是為了便於描述本發明和簡化描述，而不是指示或暗示所指的裝置或元件必須具有特定的方位、以特定的方位構造和操作，因此不能理解為對本發明的限制。此外，術語「第一」、「第二」、「第三」僅用於描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性。
在本發明的描述中，需要說明的是，除非另有明確的規定和限定，術語「安裝」、「相連」、「連接」應做廣義理解，例如，可以是固定連接，也可以是可拆卸連接，或一體地連接；可以是機械連接，也可以是電連接；可以是直接相連，也可以通過中間媒介間接相連，可以是兩個元件內部的連通。對於本領域的普通技術人員而言，可以具體情況理解上述術語在本發明中的具體含義。
本發明提供了一種毛細血管網的製備方法，通過離心紡絲方法製備得到可溶性三維紡絲網4，在所得可溶性三維紡絲網4上培養動物細胞9，所述動物體細胞沿可溶性三維紡絲網4生長增殖，可溶性三維紡絲網4完全溶解後，得到一種毛細血管網。
鑑於現有技術存在的諸多問題，本發明採用特定方法，藉助離心紡絲手段，製備得到毛細血管網，離心紡絲是一種高效低耗的微納米纖維製備技術，其原理是聚合物熔體或溶液從噴絲孔甩出後在離心力作用下拉伸成纖維。在此過程中，離心力起著重要作用，它對聚合物熔體或溶液有一定的壓實作用，聚合物熔體或溶液被擠出後，高速旋轉所產生的離心力是聚合物拉伸的主要作用力之一。理論上任何可溶解或熔融的材料均可進行離心紡絲加工。本發明動物細胞9在培養過程中，軸芯8可在數小時內溶解，然後形成中空的可溶性三維紡絲網，剩下的軸殼7會逐漸溶解，至完全溶解時，三維毛細血管網早已形成。本發明毛細血管網的製備方法成本低，產量高，原料適應性廣，紡絲原料既可以是溶液也可以是熔體，工藝參數可調易控，故更能滿足植入物所需的毛細血管網的製備。
優選地，所述可溶性三維紡絲網4採用醫用級原材料，通過離心紡絲方法製備得到。
優選地，所述可溶性三維紡絲網4包括具有芯殼結構的可溶性三維紡絲網4，所述具有芯殼結構的可溶性三維紡絲網4包括軸芯8和包覆在軸芯8外側的軸殼7。
進一步優選地，所述軸芯8的材質包括糖，優選包括在37℃或37℃以下可被水溶解的糖，進一步優選包括糖畫糖、白沙糖、麥芽糖和艾素糖中的一種或多種，更進一步優選包括糖畫糖。
進一步優選地，所述軸殼7的材質包括水溶性可降解生物材料，優選包括聚乙烯醇、聚乳酸、殼聚糖、透明質酸、纖維素、聚環氧乙烷、聚丙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯亞烷、聚乙二醇、聚環氧乙烷、聚乙醇酸、聚羥基脂肪酸酯、甲殼素和聚羥基脂肪酸脂中的一種或多種，進一步優選包括聚乙烯醇。
優選地，所述軸芯8和軸殼7的材質分別採用食用級和醫用級原材料。
本發明採用特定的具有芯殼結構的可溶性三維紡絲網4，有助於其在動物細胞9生長過程中充分溶解，其中軸芯8材料先溶解，形成中空結構，促進軸殼7材料的充分溶解，當軸殼7材料完全溶解時，動物細胞9早已形成三維毛細血管網。
優選地，所述可溶性三維紡絲網4由離心紡絲得到的紡絲纖維構成，所述紡絲纖維內包含細胞因子。
進一步優選地，所述細胞因子包括血管內皮生長因子、鹼性成纖維細胞生長因子中的一種或兩種，更進一步優選包括血管內皮生長因子和鹼性成纖維細胞生長因子。
優選地，所述軸殼7內包含細胞因子。
進一步優選地，所述細胞因子包括血管內皮生長因子和鹼性成纖維細胞生長因子中的一種或兩種，更進一步優選包括血管內皮生長因子和鹼性成纖維細胞生長因子。
本發明採用特定細胞因子，能夠促進動物細胞9生長和增殖。
優選地，所述動物細胞9包括血管內皮細胞、內皮祖細胞和成纖維細胞中的一種或多種，優選包括血管內皮細胞和成纖維細胞，或內皮祖細胞和成纖維細胞。
本發明可選擇人或其他動物的細胞，採用特定動物細胞9，有助於其以可溶性三維紡絲網4作為支架，通過生長和增殖，形成三維毛細血管網。
優選地，所述具有芯殼結構的可溶性三維紡絲網4通過同軸離心紡絲方法製備得到。
優選地，所述離心紡絲方法所採用的離心轉速為3000-9000rpm，優選為4500-7500rpm，進一步優選為6000rpm。
優選地，所述離心紡絲方法所採用的噴孔直徑為0.8-1.2mm，優選為0.9-1.1mm，進一步優選為1mm。
優選地，所述同軸離心紡絲方法所採用的同軸噴孔直徑為0.8-1.2mm，優選為0.9-1.1mm，進一步優選為1mm。
本發明通過離心紡絲方法可製備得到具有芯殼包覆結構的可溶性三維紡絲網4，通過選擇離心轉速和噴孔直徑，可以得到特定尺寸的可溶性三維紡絲網4，進而得到特定尺寸的毛細血管網。
採用上述的一種毛細血管網的製備方法製備得到的毛細血管網。
本發明毛細血管網製備成本低，能夠為較厚的工程化組織或器官如肝臟、腎臟等構建充足有效的血管網系統提供所需的三維毛細血管網。
可選地，本發明毛細血管網的製備方法，包括如下步驟：
第一步：製備軸芯8材料，將軸芯8材料融化且高壓滅菌,得到軸芯8材料液，然後以溶液狀態保存備用；
第二步：製備軸殼7材料，配製軸殼7材料水溶液，滅菌後靜置，然後加入細胞因子並充分混合，得到軸殼7材料液；
第三步：分別將步驟一和步驟二所得溶液灌注到帶有內外兩個儲液筒的高速旋轉同軸離心紡絲機中(已滅菌)，其中內筒1填裝軸芯8材料液，外筒2填裝軸殼7材料液。
第四步：採用同軸離心紡絲方法製備具有芯殼結構的可溶性三維紡絲網4；可通過離心裝置6使內容和外筒2高速離心旋轉，通過同軸噴頭3，在同軸噴頭3和接收棒5之間形成具有芯殼結構的可溶性三維紡絲網4；
第五步：然後將預先分離、培養好的動物細胞9滴加至步驟四所得可溶性三維紡絲網4上並置入細胞培養箱中培養一段時間，在培養的過程中軸芯8材料會在數小時內溶解，進而形成中空結構，與此同時，動物細胞9沿軸殼7材料爬附並增殖，待軸殼7材料完全溶解後，三維毛細血管網已形成。
優選地，本發明所採用的水為超純水。
優選地，軸殼7材料水溶液中軸殼7材料的質量分數為10％-35％，優選為15％-25％，進一步優選為15％-20％。
優選地，所述細胞因子的濃度為5-15ng/mL，優選為5-10ng/mL，進一步優選為10ng/mL。
實施例1
一種毛細血管網的製備方法，包括如下步驟：
1)將50g糖畫糖融化且高壓滅菌，然後以溶液狀態保存備用；
2)將5g醫用級的聚乙烯醇溶解在50mL的超純水中以配成質量百分濃度為10％的溶液，滅菌後在4℃下靜置；然後將血管內皮生長因子和鹼性成纖維細胞生長因子與所得溶液充分混合；
3)將步驟一和步驟二所得溶液分別灌注到帶有內外兩個儲液筒的無菌高速旋轉同軸離心紡絲機中(已滅菌)，進行同軸離心紡絲；同軸紡絲工藝條件為：內筒溶液為軸芯材料，外筒溶液為軸殼材料，離心轉速為3000r/mi n,同軸噴孔直徑為0.8mm，收集裝置到噴絲頭的距離為15cm；軸殼材料溶液中血管內皮生長因子和鹼性成纖維細胞生長因子的濃度均為10ng/mL；得到具有芯殼結構的可溶性三維纖維網後，然後將預先分離、培養好的第三代SD大鼠內皮細胞(濃度為1x106/mL)和第三代SD大鼠成纖維細胞(濃度為5x105/mL)分別滴加2滴在上述纖維網上並置入細胞培養箱中培養；細胞培養箱的參數為：溫度37℃、二氧化碳體積濃度5％培養，糖畫糖完全溶解後，得到中空結構，之後聚乙烯醇逐漸溶解並釋放細胞因子，與此同時內皮細胞沿聚乙烯醇爬附並增殖，聚乙烯醇完全溶解後，三維毛細血管網已形成。
實施例2
一種毛細血管網的製備方法，包括如下步驟：
1)將50g白砂糖融化且高壓滅菌，然後以溶液狀態保存備用；
2)將5g醫用級的聚乙烯醇和2.5g醫用級的聚乙二醇溶解在50mL的超純水中，所得溶液滅菌後在4℃下靜置；然後將血管內皮生長因子和鹼性成纖維細胞生長因子與所得溶液充分混合；
3)將步驟一和步驟二所得溶液分別灌注到帶有內外兩個儲液筒的無菌高速旋轉同軸離心紡絲機中(已滅菌)，進行同軸離心紡絲；同軸紡絲工藝條件為：內筒溶液為軸芯材料，外筒溶液為軸殼材料，離心轉速為4500r/mi n,同軸噴孔直徑為0.9mm，收集裝置到噴絲頭的距離為15cm；軸殼材料溶液中血管內皮生長因子和鹼性成纖維細胞生長因子的濃度均為15ng/mL；得到具有芯殼結構的可溶性三維纖維網後，然後將預先分離、培養好的第三代SD大鼠內皮細胞(濃度為1x106/mL)和第三代SD大鼠成纖維細胞(濃度為5x105/mL)分別滴加2滴在上述纖維網上並置入細胞培養箱中培養；細胞培養箱的參數為：溫度37℃、二氧化碳體積濃度5％培養，白砂糖完全溶解後，得到中空結構，之後聚乙烯醇和聚乙二醇逐漸溶解並釋放細胞因子，與此同時內皮細胞沿聚乙烯醇和聚乙二醇爬附並增殖，聚乙烯醇和聚乙二醇完全溶解後，三維毛細血管網已形成。
實施例3
一種毛細血管網的製備方法，包括如下步驟：
1)將50g麥芽糖融化且高壓滅菌，然後以溶液狀態保存備用；
2)將5g醫用級的聚乙烯醇、2.5g醫用級的聚乙二醇和2.5g醫用級的聚乙烯吡咯烷酮溶解在50mL的超純水中，所得溶液滅菌後在4℃下靜置；然後將血管內皮生長因子和鹼性成纖維細胞生長因子與所得溶液充分混合；
3)將步驟一和步驟二所得溶液分別灌注到帶有內外兩個儲液筒的無菌高速旋轉同軸離心紡絲機中(已滅菌)，進行同軸離心紡絲；同軸紡絲工藝條件為：內筒溶液為軸芯材料，外筒溶液為軸殼材料，離心轉速為9000r/mi n,同軸噴孔直徑為1.2mm，收集裝置到噴絲頭的距離為15cm；軸殼材料溶液中血管內皮生長因子和鹼性成纖維細胞生長因子的濃度均為5ng/mL；得到具有芯殼結構的可溶性三維纖維網後，然後將預先分離、培養好的第三代SD大鼠內皮細胞(濃度為1x106/mL)和第三代SD大鼠成纖維細胞(濃度為5x105/mL)分別滴加2滴在上述纖維網上並置入細胞培養箱中培養；細胞培養箱的參數為：溫度37℃、二氧化碳體積濃度5％培養，麥芽糖完全溶解後，得到中空結構，之後聚乙烯醇、聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮逐漸溶解並釋放細胞因子，與此同時內皮細胞沿聚乙烯醇、聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮爬附並增殖，聚乙烯醇、聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮完全溶解後，三維毛細血管網早已形成。
實施例4
一種毛細血管網的製備方法，包括如下步驟：
1)將50g艾素糖融化且高壓滅菌，然後以溶液狀態保存備用；
2)將10g醫用級的聚乙烯醇溶解在50mL的三蒸水中，所得溶液滅菌後在4℃下靜置；然後將血管內皮生長因子和鹼性成纖維細胞生長因子與所得溶液充分混合；
3)將步驟一和步驟二所得溶液分別灌注到帶有內外兩個儲液筒的無菌高速旋轉同軸離心紡絲機中(已滅菌)，進行同軸離心紡絲；同軸紡絲工藝條件為：內筒溶液為軸芯材料，外筒溶液為軸殼材料，離心轉速為7500r/mi n,同軸噴孔直徑為1.1mm，收集裝置到噴絲頭的距離為15cm；軸殼材料溶液中血管內皮生長因子和鹼性成纖維細胞生長因子的濃度均為5ng/mL；得到具有芯殼結構的可溶性三維纖維網後，然後將預先分離、培養好的第三代SD大鼠內皮細胞(濃度為1x106/mL)和第三代SD大鼠成纖維細胞(濃度為5x105/mL)分別滴加2滴在上述纖維網上並置入細胞培養箱中培養；細胞培養箱的參數為：溫度37℃、二氧化碳體積濃度5％培養，艾素糖完全溶解後，得到中空結構，之後聚乙烯醇逐漸溶解並釋放細胞因子，與此同時內皮細胞沿聚乙烯醇爬附並增殖，聚乙烯醇完全溶解後，三維毛細血管網早已形成。
實施例5
一種毛細血管網的製備方法，包括如下步驟：
1)將50g糖畫糖融化且高壓滅菌，然後以溶液狀態保存備用；
2)將17.5g醫用級的聚乙烯醇溶解在50mL的三蒸水中，所得溶液滅菌後在4℃下靜置；然後將血管內皮生長因子和鹼性成纖維細胞生長因子與所得溶液充分混合；
3)將步驟一和步驟二所得溶液分別灌注到帶有內外兩個儲液筒的無菌高速旋轉同軸離心紡絲機中(已滅菌)，進行同軸離心紡絲；同軸紡絲工藝條件為：內筒溶液為軸芯材料，外筒溶液為軸殼材料，離心轉速為6000r/mi n,同軸噴孔直徑為1.0mm，收集裝置到噴絲頭的距離為15cm；軸殼材料溶液中血管內皮生長因子和鹼性成纖維細胞生長因子的濃度均為13ng/mL；得到具有芯殼結構的可溶性三維纖維網後，然後將預先分離、培養好的第三代SD大鼠內皮細胞(濃度為1x106/mL)和第三代SD大鼠成纖維細胞(濃度為5x105/mL)分別滴加2滴在上述纖維網上並置入細胞培養箱中培養；細胞培養箱的參數為：溫度37℃、二氧化碳體積濃度5％培養，糖畫糖完全溶解後，得到中空結構，之後聚乙烯醇逐漸溶解並釋放細胞因子，與此同時內皮細胞沿聚乙烯醇爬附並增殖，聚乙烯醇完全溶解後，三維毛細血管網早已形成。
本發明基於同軸離心紡絲技術，使用糖和水溶性可吸收降解生物材料(如PVA)及內皮細胞和成纖維細胞，製備毛細血管網。本發明將糖作為軸芯，醫用級的水溶性可吸收降解生物材料及血管形成誘導因子為軸殼，同軸製備具有芯殼結構的可溶性三維纖維網，然後將預先培養好的第三代內皮細胞或內皮祖細胞及成纖維細胞按一定密度接種在所得具有芯殼結構的可溶性三維纖維網上進行培養，在培養的過程中軸芯材料會先溶解，進而形成中空結構，與此同時，內皮細胞沿軸殼爬附並增殖，待軸殼材料完全溶解之時，毛細血管網早已形成。相對於現有製備血管的方法，本發明採用同軸離心紡絲技術成本低，產量高，原料適應性廣，紡絲原料既可以是溶液也可以是熔體，工藝參數可調易控，故更能滿足植入物所需的毛細血管網的製備。本發明方法工藝簡單且效率高，採用同軸離心紡絲方法製備具有芯殼結構的三維纖維網僅需要數分鐘，軸芯材料完全溶解僅需要數小時，數天後，軸殼材料便可完全溶解，得到所需三維毛細血管網。
儘管已用具體實施例來說明和描述了本發明，然而應意識到，以上各實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制；本領域的普通技術人員應當理解：在不背離本發明的精神和範圍的情況下，可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特徵進行等同替換；而這些修改或者替換，並不使相應技術方案的本質脫離本發明各實施例技術方案的範圍；因此，這意味著在所附權利要求中包括屬於本發明範圍內的所有這些替換和修改。