光滅活的病毒和系統及其使用方法

2023-12-08 08:19:36

專利名稱：光滅活的病毒和系統及其使用方法
技術領域：
本發明公開的各種實施方式大體上涉及光滅活微生物的系統和方法。更具體地，本發明的各種實施方式直接涉及使用至少一個呋喃香豆素類化合物和廣譜脈衝光的光滅活微生物諸如病毒。
背景技術：
皰疫 B 病毒(Herpesvirus simiae 或 Cercopithecine herpesvirus I)是Alphaherpesvirinae亞科和Simplexvirus群的成員，已知自然發生在恆河猴(MacacaSPP)上。獼猴感染可能無症狀，或可能引起輕微的疾病。其他物種如人類的感染，是罕見的但後果嚴重，如果不及時治療則是致死性疾病。通過用血清學方法檢測抗B病毒的抗體來鑑定既往感染。然而，由於相對較高發生率的與單純性皰疹病毒感染(如HSV-I和/或HSV-2)的免疫交叉反應使人類B病毒感染的血清學診斷變得複雜化。在獼猴中可以證實既往感染，而沒有這些複雜情況，因為已知的感染獼猴的單純病毒僅有B病毒。識別被B病毒感染的獼猴，對於管理圈養的獼猴，發展特定的無病原的群體，以及管理獼猴的人的潛在暴露和感染的預防來講，是重要的。因此，所需要的是用於鑑別感染了微生物的個體的組合物、系統和方法。本發明針對新的這樣的組合物、系統和方法，用來鑑別感染了微生物，諸如B病毒的個體。

發明內容
本發明的各種實施方式公開了大體關於光滅活微生物，更特別地是，關於使用至少一種呋喃香豆素類化合物(furanocoumarin)和廣譜的脈衝光滅活病毒的系統和方法。例如，本發明的一個方面，包括微生物的滅活方法，包括對微生物提供至少一種呋喃香豆素類化合物，並且將微生物暴露於廣譜脈衝光的至少一個脈衝，從而滅活微生物。微生物選自病毒、細菌和真菌組成的組，最好包括病毒。示例性的病毒包括皰疹病毒，如皰疹B病毒或狒狒皰疹病毒2。呋喃香豆素類化合物可以包括補骨脂素(psoralen)，所述補骨脂素可以以大約O. I μ g/ml至大約60 μ g/ml的濃度使用。在示例性的實施方式中，補骨脂素以至少約5g/ml的濃度存在。將微生物暴露於廣譜脈衝的光的至少一個脈衝可以包括將微生物暴露於大約O. 45焦耳/釐米2至大約13. 5焦耳/釐米2廣譜光。在另一實施方式中，將微生物暴露於廣譜脈衝的光的至少一個脈衝，可以包括將微生物暴露於至少大約4. 05焦耳/釐米2的廣譜光到至少約13. 5焦耳/釐米2的廣譜光。本發明的另一方面，包括含有光化學滅活的核酸的滅活的微生物，其中光化學滅活的核酸是通過至少一個呋喃香豆素類化合物和廣譜脈衝光的至少一個脈衝進行的光化學滅活。所述的微生物選自可以選自由病毒、細菌和真菌組成的組，最好是病毒。示例性的病毒包括皰疹病毒，如皰疹B病毒或狒狒皰疹病毒2。呋喃香豆素類化合物可以包括補骨脂素，所述補骨脂素可以以大約O. I μ g/ml至約60 μ g/ml範圍內的濃度使用。在示例性的實施方式中，補骨脂素以至少約5g/ml的濃度使用。光化學滅活病毒可以包括將微生物暴露於廣譜脈衝光的至少一個脈衝，其利用大約O. 45焦耳/釐米2的廣譜光到大約13. 5焦耳/釐米2的廣譜光。在示例性的實施方式中，光化學滅活病毒可以包括將微生物暴露於至少大約4. 05焦耳/釐米2的廣譜光到大約13. 5焦耳/釐米2的廣譜光。例如，被滅活的微生物可以通過暴露於濃度至少約5 μ g/ml的補骨脂素以及廣譜脈衝的光的至少一個脈衝，其包括至少約4. 05焦耳/釐米2的廣譜脈衝光，將其滅活。本發明的另一個方面，包括檢測受試者中抗體的系統，包括抗原成分，其中，抗原暴露於呋喃香豆素類化合物和廣譜脈衝的光的至少一個脈衝；以及報告成分，其能夠檢測到受試者的抗體結合到至少一部分抗原。所述的抗原可以選自由病毒、細菌和真菌組成的組，最好包括病毒。在示例性的實施方式中，病毒抗原是皰疹病毒抗原，其可以包括，但不僅限於來自皰疹B病毒或狒狒皰疹病毒2的抗原。呋喃香豆素類化合物是補骨脂素，並且廣 譜脈衝光可以包括約O. 45焦耳/釐米2至約13. 5焦耳/釐米2的廣譜光。在一個實施方式中，抗原成分可以進一步包括放置在基質上的抗原。報告成分可以包括，例如，能夠結合至少一部分抗體的報告抗體，所述的抗體能夠結合至少一部分抗原。本發明的另一個方面包括免疫受試者的方法，包括滅活免疫原性微生物，包括將免疫原性微生物暴露於呋喃香豆素類化合物和廣譜脈衝的光的至少一個脈衝；並且向受試者施用有效量的免疫原性微生物，以產生免疫反應。這種方法設想利用滅活的免疫原性微生物免疫受試者。所述免疫原性微生物可以包括病毒、細菌、真菌或其組合。在示例性的實施方式中，免疫原性微生物包括病毒，最好是皰疹病毒，更優選皰疹B病毒或狒狒皰疹病毒2。呋喃香豆素類化合物可以包括補骨脂素，其可以是約O. I μ g/ml至約60 μ g/ml的濃度。在示例性的實施方式中，補骨脂素是至少約5μ g/ml的濃度。將免疫原暴露於呋喃香豆素類化合物和廣譜脈衝的光的至少一個脈衝可以包括將免疫原暴露於約O. 45焦耳/釐米2至約13. 5焦耳/釐米2的廣譜光，更具體地是將免疫原暴露於至少約4. 05焦耳/釐米2的廣譜光。本發明的另一個方面，包括至少對抗原的一部分具有特異親和力的抗體，其中抗原衍生自經暴露於至少一種呋喃香豆素類化合物和廣譜脈衝光的至少一個脈衝的微生物。所述抗原可以衍生自微生物，如病毒、細菌或真菌。在示例性的實施方式中，微生物是病毒，更具體的是皰疹病毒，更加具體的皰疹B病毒或狒狒皰疹病毒2。呋喃香豆素類化合物可以是以約O. I g/ml至約20g/ml的濃度存在的補骨脂素。在示例性的實施方式中，將補骨脂素是以至少約5_μ g/ml的濃度存在。廣譜脈衝的光的至少一個脈衝可以包括約4. 05焦耳/釐米2至大約13. 5焦耳/釐米2的廣譜光。在示例性的實施方式中，廣譜脈衝的光的至少一個脈衝包括大約至少約4. 05焦耳/釐米2的廣譜光。抗體可以是多克隆抗體或其片段，或者單克隆抗體或其片段。本發明的另一方面，包括含有滅活的核酸的滅活的微生物，其中滅活的微生物保留其抗原性。微生物可以包括病毒、細菌或真菌。在示例性的實施方式中，滅活的微生物是病毒，如皰疹病毒。在示例性的實施方式中，滅活的微生物包括皰疹B病毒或狒狒皰疹病毒2。滅活的核酸包括交聯的核酸。滅活的微生物能夠在受試者中產生免疫反應，其基本上類似於非滅活的微生物產生的免疫反應。


圖I顯示了在補骨脂素存在(+補骨脂素)、不存在(無補骨脂素)的條件下，暴露於廣譜脈衝光(BSPL)的狒狒皰疹病毒2 (HVP2)的不同樣品的PCR結果。圖2用圖形描繪了用BSPL處理的HVP2樣品相比於活的HVP2製備物(HVP-2Pr印)的抗原性。圖中字母「P」代表BSPL脈衝並且數字代表了脈衝的數目。圖3用圖形描述了用BSPL加補骨脂素處理的HVP2樣品相比於加入了補骨脂素但沒有暴露於BSPL (HVP-2+Psor)的活的HVP2製備物(HVP_2Pr印)的抗原性。圖中字母「P」代表BSPL脈衝並且數字代表了脈衝的數目。圖4說明暴露於BSPL的存在(+補骨脂素)和不存在(無補骨脂素)補骨脂素的不 同HVP2樣品的PCR抑制的結果。圖5提供了根據表3中數據的補骨脂素相對於HVP2斑點數目的劑量反應曲線。圖6顯示了通過不同濃度的補骨脂素和BSPL的9脈衝的HVP2DNA的PCR抑制。圖7顯示存在補骨脂素的暴露於BSPL的B病毒的PCR抑制結果。圖8顯示使用補骨脂素加BSPL光滅活的B病毒樣本的抗原性。標準的恆河猴的抗B病毒血清滴定光滅活抗原和標準「吐溫/D0C」抗原(BVAg)。圖中字母「P」代表BSPL脈衝並且數字代表了脈衝的數目，LIN=未感染、對照抗原。 圖9說明使用B病毒特異gB引物的提取的DNA擴增。圖10說明通過tELISA測試滅活的B病毒免疫的抗原性。圖11圖形描繪了來自3隻使用3T3細胞中生長的B病毒(BV)免疫的小鼠的小鼠血清滴度，在包被初始抗原的微滴度孔中以及來自3T3細胞的未感染(UN)對照。圖12圖形描繪了圖11中同樣三種小鼠血清在包被生長在Vero細胞B病毒抗原和未感染(UN) Vero細胞對照的微滴度孔中的滴度。圖13說明了 BV-免疫Dip Strip的實施方式。圖14是在96深孔板用於放置和孵育dip-strips用相應數字標記的孔位編號的示意圖。圖15A-B代表預料的與BV-免疫Dip Strips反應的陰性(A)和陽性(B)。注意在第三個反應位點(UN)的帶子應該總是無色的。圖16是硝化纖維製備的示意圖。圖17是硝化纖維卡製備的示意圖。圖18從硝化纖維卡製備條帶的示意圖。 圖19是一 BV-免疫Dip Strip實施方式。
具體實施例方式本發明的各個實施方式針對光滅活的微生物和系統及其使用方法。例如本發明的一個實施方式包括滅活微生物的方法，包括向微生物提供至少一種呋喃香豆素類化合物(furanocoumarin),將微生物暴露於廣譜脈衝光的至少一個脈衝,從而滅活微生物。
這裡所用的術語「微生物」是指許多細菌、病毒、真菌和寄生蟲。本發明示例性的實施方式中，微生物是病毒，其可以包括但不僅限於，腺病毒、沙粒病毒科、絲狀病毒、玻那病病毒科、布尼亞病毒科、皰疫病毒、正粘病毒科、多瘤病毒科、乳頭瘤病毒科、副粘病毒、細小病毒、小RNA病毒科、痘病毒科、呼腸孤病毒、逆轉錄病毒、彈狀病毒科、披膜病毒科、嗜肝DNA病毒科和曬菌體。更具體地說，病毒可以包括腺病毒，犬腺病毒、Pinchinde病毒、拉沙病毒、特洛克病毒、加利福尼亞腦炎病毒、單純皰疫病毒I、單純皰疫病毒2,巨細胞病毒、偽狂犬病病毒、EB病毒、水痕帶狀抱疫病毒、B病毒(Macacine herpesvirusl),沸沸抱疫病毒2 (herpesvirus papio 2，Papiine herpes virus 2)、病毒流感、猴病毒 40,人類乳頭狀瘤病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、脊髓灰質炎病毒、柯薩奇病毒、埃可病毒、牛痘病毒，雞痘病毒、藍舌病毒、科羅拉多蝶發燒病毒、羅塔病毒、人類免疫缺陷病毒、勞斯肉瘤病毒、小鼠肉瘤病毒、人類T細胞白血病病毒、rhabies病毒、vesticular stomatitis、西方馬腦炎病毒、西尼羅河病毒、登革熱病毒、聖路易斯腦炎病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、λ噬菌體、立克次氏體等等。在本發明示例性的實施方式中，病毒是Macacine皰疹病毒I(也稱為Cercopithecine virus I, herpesvirus simiae,皰疫B病毒或者B病毒)或狒狒皰疹病毒2 (也稱為Cercopithecine皰疹病毒16，狒狒皰疹病毒2)。
微生物的滅活，是指抑制、幹擾、防止、減少或改變核酸，諸如DNA、RNA或其組合的複製或合成。此處使用的術語「防止」、「幹擾」、「減少」、「改變」或「抑制」是指從第一狀態例如微生物未經處理的狀態，到第二狀態，例如微生物經處理的狀態，在程度上的差異。例如，在未經本發明的方法或組合物處理的情況下，核酸的複製或合成以第一速率發生。如果微生物經本發明的方法或組合物暴露處理，核酸的複製或合成從第一速率改變、減輕，或降低，以第二速率發生。術語「防止」、「幹擾」、「滅活」、「降低」、「改變」或「抑制」在該申請中可交替使用，並且可以指部分降低、基本降低、幾乎完全降低、完全降低或不存在核酸的複製或合成。此處使用的術語「核酸」可以指核苷酸、核苷、多核苷酸或其部分、基因組或其部分、基因或其部分、寡核苷酸、適配子、轉錄子、DNA、RNA、或DNA/RNA的嵌合體等等。這裡所用的術語「呋喃香豆素類化合物」是指含有融合到苯並吡喃酮的呋喃環的化學物質。示例性的呋喃香豆素類化合物包括自然發生的補骨脂素或其衍生物，合成的補骨脂素和其衍生物，以及它們的組合。例如，補骨脂素可以是甲氧基補骨脂素(例如，8-M0P，5-M0P )、三甲基補骨脂素(TMP )、4-氨基甲基-三甲沙林(AMT )，或者其組合。向微生物提供至少一種呋喃香豆素類化合物，包括使用有效量的至少一種呋喃香豆素類化合物插入微生物的核酸。精確的有效量是呋喃香豆素類化合物組合物滅活微生物獲得有效結果的量。這個量(即劑量)可能隨著許多因素變化，包括但不僅限於，呋喃香豆素類化合物或其衍生物的性質、微生物以及施用的廣譜脈衝光的量等。例如，有效量的補骨脂素的濃度範圍從大約O. I μ g/ml到大約60 μ g/ml。在本發明的一個實施方式中，補骨脂素以超過O. 3 μ g/ml的濃度使用。在本發明的另一個實施方式中，補骨脂素以至少約5 μ g/ml的濃度使用。在本發明的另一個實施方式中，補骨脂素以至少約20μ g/ml的濃度使用。本發明中的另一個實施方式中，補骨脂素以至少約50μ g/ml的濃度使用。將微生物暴露於廣譜脈衝光的至少一個脈衝包括將微生物暴露於光的一個脈衝或光的多個光脈衝。光的脈衝是持續時間很短，但可以被測量的光量，例如，微秒(μ s)。滅活微生物所需的光脈衝的數量可能會有所不同，取決於許多因素，包括但不僅限於，呋喃香豆素類化合物或其衍生物，微生物和其濃度，懸浮微生物的介質的透光性，容納微生物懸液的容器的透光性，廣譜脈衝光的來源/波長，等等。在本發明示例性的實施方式中，廣譜脈衝光的來源是能夠產生連續廣譜光的氙氣燈，大約從深紫外光譜到大約紅外光譜範圍。紫外線(UV)光是電磁福射,其波長比可見光短,但長於X-射線，在IOnm至400nm的範圍內，能量在3eV到124eV的範圍內(IeV相當於I. 60217653 X 10_19焦耳)。紅外(IR)輻射是波長在O. 7至300微米(μ m)之間的電磁輻射，頻率範圍相當於約I到430THz之間。因此，廣譜光可以包括大約從IOnm到大約300 μ m的波長。在本發明示例性的實施方式中，將微生物暴露於廣譜脈衝的光的至少一個脈衝，包括將微生物暴露於大約O. 45焦耳/釐米2到大約13. 5焦耳/釐米2的廣譜光。在一個實施方式中，微生物例如皰疹B病毒，被暴露於大約5. 4焦耳/釐米2的廣譜光。例如，微生物諸如皰疹B病毒，被暴露於累計大約5. 4焦耳/釐米2的廣譜光。在另一個實施方式中，微生物例如皰疹B病毒，被暴露於大約12. 15焦耳/釐米2的廣譜光。例如，微生物諸如皰疹B病毒，被暴露於累計大約12. 15焦耳/釐米2的廣譜光。在本方法中使用的廣譜光單劑量或多劑量(任一情況下，累計/總量)典型地在大約4. 05焦耳/釐米2到大約13. 5焦耳/釐米2的範圍內，但是只要能夠保持抗原的免疫原性，可以超過這個量。廣譜脈衝光的 累計量可以以不同長度的脈衝傳遞，其可以間隔各種時間長度。例如，廣譜光脈衝可以以約360 μ S的脈衝寬度傳遞，其中每秒可產生三個脈衝，每個脈衝產生約O. 45焦耳/釐米2每脈衝的能量。使用這樣的例子，微生物，例如皰疹B病毒，使用約12脈衝就可以被滅活。此夕卜，每個脈衝的能量也可以是變化的。每個脈衝的能量可以在約O. 3焦耳/釐米2每脈衝到約O. 6焦耳/釐米2每脈衝的範圍內。例如，可以使用能量約O. 45焦耳/釐米2/脈衝的脈衝。其他的脈衝寬度也可以使用。例如，可以使用約250μ S至約450μ S的脈衝寬度,調整脈衝數以獲得大約4. 05焦耳/釐米2到13. 5焦耳/釐米2的累積量，或者在更具體的例子中，從約3焦耳/釐米2到約13. 5焦耳/釐米2。本發明的另一方面，包括滅活的微生物，其包括光化學滅活的核酸，其中光化學滅活的核酸是指通過至少一種呋喃香豆素類化合物和廣譜脈衝光的至少一個脈衝進行光化學滅活。微生物可以是本文披露的任何微生物，可以通過本文所述的任何滅活方法產生。在示例性的實施方式中，微生物可以是病毒，如皰疹病毒，更具體地說，Macacine皰疹病毒I或狒狒皰疹病毒2 (HVP2)。由於其具有滅活的DNA，並且保留了其表面抗原的結構完整性的組合特徵，本發明的滅活的微生物具有增強的功能。例如，通過洗滌劑滅活病毒對於包膜病毒比非包膜病毒更有效。通過與脂質相互作用，並且使蛋白質或糖蛋白從富含脂質的包膜釋放的方式，洗滌劑破壞了細胞膜和包膜病毒的脂質膜。在皰疹病毒的例子中，表面活性劑(如吐溫40)和洗滌劑(例如去氧膽酸鈉)的組合，可以用來破壞包膜，從而滅活皰疹病毒。使用基於洗滌劑的方法，病毒的DNA不會受到此過程的影響。相比之下，上述的補骨脂素/BSPL技術破壞核酸(如DNA和RNA)，因此不局限於任何特定的包膜或非包膜的微生物。經滅活的微生物可用於檢測抗體的系統中。抗體可以是多克隆或單克隆的，並可以包括片段如Fab、Fe、重鏈、輕鏈，恆定、可變或超變片段或區，以及任何類型的抗體，包括但不限於IgM、IgG、IgA、IgD和IgE。抗體對至少部分抗原具有特異性。談及抗體時，本文使用的詞語「對抗原具有特異性」也可以被稱為靶標相關抗體的「結合活性」、「親和力」或「特異親和力」。這些詞在本文中可以互換使用，是指配體結合或不結合到靶標的傾向。在「結合活性」和「結合親和力」中，這些相互作用的能量是重要的，因為它們定義了相互作用的生物分子所需的濃度、這些生物分子能夠關聯的比率，以及在溶液中結合的和游離的生物分子的相對濃度。在各種方式中，能量通過確定解離常數Kd來表徵。結合的特異性，通過比較配體與靶標，相對於配體與細胞環境中的其他物質或一般不相關分子的相對解離常數(Kd)來定義。典型地，抗體對抗原的Kd至少2倍，優選5倍，更加優選10倍，低於靶標與無關物質或細胞環境中存在的物質的Kd。甚至更加優選的是，Kd 50倍，更優選100倍，尤其優選地200倍地低於靶標與無關物質或細胞環境中存在的物質的Kd。這種抗體檢測系統可包括抗原成分，其中的抗原暴露於呋喃香豆素類化合物和廣譜脈衝的光的至少一個脈衝；和報告成分，其能夠檢測到受試者的抗體與至少一部分抗原的結合。例如，抗原成分可以是Macacine皰疫病毒I或其抗原成分,或者狒狒皰疫病毒2或其抗原成分。呋喃香豆素類化合物和脈衝光照射可按照所述的任何方法進行。抗原成分可以放置於基質上，舉例來說，比如微孔板、硝酸纖維素膜或類似物。報告成分可以是能夠結合至少抗體的一部分的報告抗體，所述抗體能夠結合抗原的至少一部分。因此，經滅活的微生物或由此衍生的成分可用於檢測受試者中抗體的存在，所述的抗體對經滅活的微生物或其衍生成分至少具有一些特異性。例如，所述系統可用於檢測受試者，比如人類或者非 人類靈長類動物中的Macacine皰疹病毒I或狒狒皰疹病毒2特異抗體。暴露於呋喃香豆素類化合物和廣譜脈衝光的至少一個脈衝的抗原，可以被用於許多免疫分析，包括但不限於酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、放射免疫法(RIA)、磁免疫、免疫印跡(Western blotting)、免疫沉澱、免疫組織化學、親和層析和流式細胞分析等等。本發明的另一個方面包括免疫受試者的方法，包括滅活免疫原性微生物，包括將免疫原性微生物暴露於呋喃香豆素類化合物和廣譜脈衝光的至少一個脈衝,並且向受試者施用有效量的免疫原性微生物，以產生免疫反應。因此，本發明經滅活的微生物可以被用來產生受試者中的免疫應答，如適應性免疫應答或先天免疫應答。在本發明示例性的實施方式中，滅活的微生物可以引起B細胞應答、T細胞應答，或二者的結合。在本發明的另一個示例性的實施方式中，滅活的微生物可以引起保護性免疫應答。例如，本發明經滅活的微生物可以用於接種受試者抵抗微生物，如病毒。在一個實施方式中，經滅活的微生物可以是可用於接種人類或者非靈長類動物的滅活的皰疹B病毒。使用本發明的經滅活的微生物,可以產生針對滅活的微生物的抗體,其中所述抗體對滅活微生物的至少一部分具有特異親和力。可以產生針對衍生自微生物的抗原的抗體，所述微生物選自由病毒、細菌和真菌組成的組。如上所述，該抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體等等。例如，使用經滅活的皰疹B病毒，可以產生針對皰疹B病毒的一個或更多個表位的多克隆抗體。此外，可以產生針對皰疹B病毒的一個或更多個表位的單克隆抗體。所述抗體可用於多種免疫分析，包括但不限於酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、放射免疫法(RIA)、磁免疫、免疫印跡法(即Western blotting)、免疫沉澱、免疫組織化學、親和層析，流式細胞分析等等。本發明的另一個方面包括含有滅活核酸的滅活的微生物，其中滅活微生物保留其抗原性。短語「保留其抗原性」指的是，滅活的微生物結合到抗體的能力，所述抗體由針對未經本發明的系統和方法處理的活的微生物的免疫反應產生。例如，在抗體結合的情況下，本發明的滅活微生物至少應該被大多數識別活的微生物的抗體以大致相同的滴度識別。
本發明的另一個方面包括含有滅活的核酸的滅活的微生物，其中滅活的微生物保留其抗原性。短語「保留其抗原性」指的是，滅活的微生物在受試者中產生與未經本發明的系統和方法處理的活的微生物的免疫反應實質上相似的免疫反應的能力。本文包括的所有的專利、專利申請和參考文獻整體通過參考的方式特定地插入本文。當然，應該理解，前面僅涉及本發明示例性的實施方式，其中可以進行多種修飾或改變而不偏離本文前面所述的本發明的實質和範圍。因此，本發明的實施方式參考特定的示例性的實施方式進行了詳細地描述，本領域技術人員明白在所附的權利要求中定義的本發明的範圍內，可以進行改變和修飾。從而本發明各種實施方式的範圍不僅限於上面討論的實施方式，應該只通過下面的權利要求及所有等效形式來限定。本發明通過其中包含的實施例，進一步對本發明進行說明，使理解更清楚。示例性的實施方式，不應該以任何方式被局限性解釋為對其保護範圍的強加的限制。相反，在閱讀了此處的說明書後，應該清楚地理解，其應該有其他各種實施方式、修飾、和其等效形式，可 能提示本領域技術人員而不偏離本發明的實質或所附的權利要求書的範圍。實施例實施例I :使用補骨脂素和廣譜光脈衝滅活病毒的經修飾的光滅活技術之前的光滅活病毒的實驗包括用於「黑光燈」(UVA)照射培養皿中的HVP2補骨脂素混合物的程序。在此程序中，病毒-補骨脂素混合物暴露於「黑光」 UVA燈，進行兩組30分鐘的曝光。這個實驗的結果不能令人滿意，因為它費時，造成了加熱和蒸發，最重要的是導致了較低的抗原性。為了克服上述程序的缺點，本實施例描述一個改進的補骨脂素光滅活技術，其中補骨脂素光滅活通過使用氣氣公司(沃本，麻薩諸塞州)(Xenon Corporation (Woburn, MA))的SteriPulse-XL照射設備(RS-3000C型)進行。關於SteriPulse-XL系統的信息描述於氙氣的出版物，題為「使用高能UV光殺菌去汙」，通過參考的方式插入此處。SteriPulse-XL系統採用了氙燈，在短的控制脈衝內產生廣譜脈衝光(BSPL)，360微秒/脈衝(μ s/pulse)。BSPL的強度大約是太陽能量水平的大約50000至100000倍。BSPL至少包括UVA波長，有利於補骨脂素的光活化，以及UVB和UVC，其與殺菌性能相關。補骨脂素屬於被稱作呋喃香豆素類化合物的一類分子，其插入核酸。在UVA存在的情況下，補骨脂素烷基化核酸產生單加成(monoadducts)和交聯。例如，在雙鏈DNA的情況下，補骨脂素在胸腺嘧啶脫氧核苷的5，6-雙鍵烷基化核酸，有效交聯DNA雙鏈。這可以防止DNA鏈在轉錄和複製中的分離。材料和方法保存於Vero細胞中的病毒和抗原的準備。在980釐米2滾瓶中培養Vero細胞(ATCC # CCL-81)至95%匯合，隨後用HVP2或B病毒感染(多重感染(Μ0Ι) =5)，並培養在高葡萄糖濃度的Dulbecco’s Modified Eagles培養基(DMEM培養基)中，補充I %胎牛血清(FBS)和抗生素(青黴素和鏈黴素)。受感染的細胞在34攝氏度培養22至24小時，直到可以觀察到細胞病變效應(CPE)。然後將細胞刮到培養基中，1500rpm (514Xg)離心10分鐘。細胞顆粒懸浮於4. 5毫升的無菌超純水中。接著將懸浮液在乾冰中冷凍，並在37攝氏度水浴中解凍，共進行3個循環。每個凍結循環至少持續15分鐘。通過離心(1500rpm持續10分鐘)去除細胞碎片，保存上清液(約5ml)。用VeiO細胞中的標準空斑測得該製劑的病毒滴度約KTPFU/ml。雖然在本實施方式中細胞是通過三個循環的凍融裂解的，細胞也可以通過超聲的方式裂解。在一些病毒製劑中，如B病毒，使用基於超聲的方法可提高抗原
的產量。從被感染的細胞中通過洗滌劑溶解製備病毒抗原。在980釐米2滾瓶中培養Vero細胞(ATCC # CCL-81)至95%匯合，隨後用HVP2或B病毒感染(MOI) =5)，並培養在高葡萄糖濃度的Dulbecco’s Modified Eagles培養基(DMEM培養基)中，補充1%胎牛血清(FBS)和抗生素(青黴素和鏈黴素)。受感染的細胞在34攝氏度培養22至24小時，直到可以觀察到CPE。然後將細胞刮到培養基中，在50ml錐形管中1500rpm (514Xg)離心10分鐘。棄上清，經沉澱懸浮於I. 5ml含有2X蛋白酶完全抑制劑(Complete Protease Inhibitor,Roche)的水中。用含2X完全蛋白酶抑制劑的水將終體積調整到2. Oml0接著用終濃度為1%的吐溫40 (250 μ I的10% Tween 40)和I %的脫氧膽酸鈉(50 μ I的10%的脫氧膽酸鈉)，處理已重新懸浮的沉澱，其相繼加入，充分混合(渦旋)後加入另一個。 用Vero細胞中標準斑塊檢測評價病毒的滅活。通過下面的兩個技術中的任一個用Veix)細胞中標準空斑檢測法評估病毒的滅活情況。I.生長在24孔板的Veix)細胞單層用病毒製劑感染48或72小時。如果在顯微鏡下沒有觀察到細胞病變效應(CPE)，將每孔的細胞刮到少量的培養基(500 μ I)中，重鋪於新的Vero細胞單層(在24孔板上)，再在37攝氏度下，培養72小時。然後用100%的甲醇固定細胞，用結晶紫染色，以便於斑塊計數。2.在24孔板的Vero細胞單層進行六天的病毒感染，並每天檢查CPE的發展。然後在潛伏期末，用100%的甲醇固定單層細胞，並用結晶紫染色以方便CPE確定或病毒引起的斑塊的計數。如果通過任何技術都沒有CPE或斑塊，表明由於滅活而沒有病毒複製。通過tELISA評價病毒的抗原件。通過tELISA進行病毒的抗原性評價，所述tELISA是用於檢測和定量抗體的方法，在96孔微滴定板進行。tELISA基本上按照之前在KatzD, Hilliard JK, Eberle R, Lipper SL(1986a)中描述的方法進行，並進行了一些修改。簡言之，皰疹病毒抗原通過在搖床上，室溫條件下孵育20min，或者4攝氏度過夜，吸附到微孔板。用Blotto (3%脫脂牛奶)封閉(37攝氏度Ih)後，已吸附的抗原與連續稀釋的標準同源血清池反應(37攝氏度lh)。接著加入鹼性磷酸酶偶聯的抗人IgG，並孵育(37攝氏度lh)，以檢測抗原結合的猴抗體。每個孵化步驟後，微孔板用添加了 O. 05% Tween 20的磷酸鹽緩衝液(PBS) (PBST)洗滌3次。添加基質，二硝基-苯基磷酸鹽，並在室溫孵育30min。用微酶標儀在波長405nm下，以光密度(OD)為單位讀取顏色強度。用聚合酶鏈反應(PCR)評估DNA損傷。對PCR擴增產物形成的抑制作用，表明了DNA損傷，驗證了病毒的滅活。最初基於B病毒的gB基因序列和HVP2的gL基因序列設計T PCR引物。BV gB引物組擴增I. 3kb片段的B病毒片段，而HVP2gL引物組擴增I. 2kb的HVP2片段。在以後的實驗中，用以下的引物，擴增BV和HVP2的DNA。引物基於B病毒的gB基因序列設計。正向引物是5』-GTGTACATGTCGCCGTTCTA-3』(BV基因組的53972位)。反向引物是5』 -GTGTACATGTCGCCGTTCTA-3』 (BV基因組的52659位)。如果PCR能夠進行(即DNA沒有損傷)，期望的擴增子將會是1313bp。PCR使用PCR HotStar試劑盒(Qiagen)進行，20 μ I體積中3 μ I經純化的DNA。在ABI熱循環9600使用下面的循環條件進行擴增950C 15min,進行35循環的以下兩步95°C 20s以及65°C 40s。然後，PCR產物連同DNAMarker 一起跑1%瓊脂糖凝膠，以確定的預期大小的PCR片段的存在。樣品擴增後，沒有PCR片段存在，驗證了 DNA的損傷。結果使用BSPL以及補骨脂素-BSPL組合滅活技術進行的HVP2滅活過程的比較實驗例I.本實驗的目的是對通過BSPL講行的滅活過稈和通過補骨脂素和BSPL聯合使用進行的光滅活作比較。單獨通過BSPL進行的滅活按下面方法進行將5個Iml的HVP2稀釋液(108PFU/ml)轉移到5個一端熱密封的聚乙烯管(Polytubing，1X1500' 2Mil中，產品編號S-3520，ULINE，Atlanta GA)。接著，在距離第一封口 5cm的位置進行末端熱封閉。首先將另外5ml稀釋的病毒與補骨脂素(4-Aminomethyl-trioxalenhydrochloride, Sigma, Catalogue # A43305mg)混合至終濃度 20 μ g/ml 補骨脂素，接著分別轉移Iml到上述5個聚乙烯管。用不同劑量的BSPL照射每管(含和不含補骨脂素)。每組中一對聚乙烯管放置在塑料託盤上，其平置在碎冰床上，一個含有病毒，另一個含有病毒和補骨脂素。塑料託盤放置在Steripulse室，距離室頂的燈窗8個架子(4. 26英寸)的距 離，以獲得O. 45焦耳/釐米2每脈衝。每個管曝光3、6、9、12以及15個脈衝。通過將每脈衝輸出的能量(O. 45焦耳/釐米2)乘以脈衝數來確定總能量(見表I)。每個樣品通過斑點檢測來測試感染性。表I提供了通過BSPL進行的滅活的感染性和通過補骨脂素和BSPL聯合使用進行的光滅活進行比較的斑點檢測結果。每個BSPL劑量的斑點數用粗體數字顯示。雖然，在補骨脂素存在的情況下，6BSPL脈衝的最小劑量足以滅活病毒，但是僅通過BSPL滅活病毒需要的脈衝數量是12。表I
脈衝數Πθ Γ~9 ~12 ~15
焦耳 / 釐米 21735 2 70 4705 5 40 6.75
BSPL+補骨脂素2OOOO
僅 BSPL100 82OO將HVP2樣品暴露於BSPL或BSPL+補骨脂素引起的DNA損傷通過PCR評估。圖I顯示了 9脈衝或更高的BSPL+補骨脂素抑制PCR。單獨暴露於BSPL導致劑量相關的條帶濃度的減少，但條帶在暴露在12BSPL脈衝後可清晰觀察到。感染性監測和PCR都顯示了補骨脂素添加的滅活性能。在該實驗例中，由於通過斑點檢測中陰性的樣本中依然存在DNA的擴增，PCR抑制實驗是更敏感的檢測。然而，在其它實驗例中(下面顯示)，在通過PCR抑制中顯示DNA損傷的製備物中顯示活病毒的存在。不同樣本分別由tELISE檢測抗原性。每個樣本1:30稀釋吸附到孔中，洗滌，用Blotto封閉，並用於滴定抗-HVP2標準狒狒血清。從圖2中使用BSPL處理的樣本和圖3中使用BSPL和補骨脂素處理的樣本可以看出，沒有處理改變滅活病毒的抗原性。實驗例2。實驗例I中描述的過程在該實驗例中有一些微小改變地重複。樣本暴露於3脈衝的BSPL沒有經斑點檢測。暴露於6或更高的BSPL脈衝的樣本進行斑點檢測。表2提供通過BSPL與補骨脂素和PSPL結合的光滅活過程相比的HVP2感染的斑點檢測結果。每個BSPL劑量的斑點數目用粗體數字顯示。所有暴露於3BSPL脈衝或更高BSPL脈衝的樣本通過PCR檢測(圖4)。如表2中，樣本與補骨脂素混合併暴露於6或更高BSPL脈衝沒有產生斑點。暴露於BSPL的樣本僅在暴露於6、9和12的脈衝後產生斑點,但在15的脈衝後沒有。表權利要求
1.一種滅活微生物的方法，包括 向微生物提供至少一種呋喃香豆素類化合物，以及 將所述微生物暴露於廣譜脈衝光的至少一個脈衝，從而滅活微生物。
2.根據權利要求I所述的方法，其中所述微生物選自由病毒、細菌和真菌組成的組。
3.根據權利要求I所述的方法，其中所述微生物是病毒。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述病毒是皰疹病毒。
5.根據權利要求4所述的方法，其中所述皰疹病毒選自由皰疹病毒B和狒狒皰疹病毒2組成的組。
6.根據權利要求I所述的方法，其中所述至少一種呋喃香豆素類化合物包括補骨脂素·
7.根據權利要求6所述的方法，其中補骨脂素以大約O.I μ g/ml至大約60μ g/ml的濃度存在。
8.根據權利要求7所述的方法，其中補骨脂素以大約至少0.5yg/ml的濃度存在。
9.根據權利要求6所述的方法，其中將所述微生物暴露於廣譜脈衝光的至少一個脈衝，包括將所述微生物暴露於大約O. 45焦耳/釐米2至大約13. 5焦耳/釐米2的廣譜光。
10.根據權利要求8所述的方法，其中將所述微生物暴露於廣譜脈衝光的至少一個脈衝，包括將所述微生物暴露於至少大約4. 05焦耳/釐米2的廣譜光至大約13. 5焦耳/釐米2的廣譜光。
11.一種滅活的微生物，含有經光化學滅活的核酸，其中所述的光化學滅活的核酸是通過至少一種呋喃香豆素類化合物和廣譜脈衝光的至少一個脈衝滅活的。
12.根據權利要求11所述的滅活微生物，其中所述的微生物選自病毒、細菌和真菌組成的組。
13.根據權利要求12所述的滅活微生物，其中所述的微生物是病毒。
14.根據權利要求13所述的滅活微生物，其中所述病毒是皰疹病毒。
15.根據權利要求14所述的滅活微生物，其中所述皰疹病毒選自由皰疹病毒B和狒狒皰疹病毒2組成的組。
16.根據權利要求11所述的滅活微生物，其中所述至少一種呋喃香豆素類化合物包含補骨脂素。
17.根據權利要求16所述的滅活微生物，其中補骨脂素以大約O.I μ g/ml至大約60 μ g/ml的濃度存在。
18.根據權利要求11所述的滅活微生物，其中所述廣譜脈衝光的至少一個脈衝包括大約O. 45焦耳/釐米2至大約13. 5焦耳/釐米2的廣譜光。
19.根據權利要求15所述的滅活微生物，其中所述至少一種呋喃香豆素類化合物包含濃度至少大約5 μ g/ml的補骨脂素，並且所述廣譜脈衝光的至少一個脈衝，包括至少大約4. 05焦耳/釐米2的廣譜光。
20.一個用於檢測受試者中的抗體的系統，包括 抗原成分，其中所述抗原暴露於呋喃香豆素類化合物和廣譜脈衝光的至少一個脈衝；以及 報告成分，其能夠檢測受試者中的抗體結合至少一部分的抗原。
21.根據權利要求20所述的系統，其中所述的抗原選自由病毒、細菌和真菌組成的組。
22.根據權利要求21所述的系統，其中所述的抗原是病毒。
23.根據權利要求22所述的系統，其中所述的病毒抗原是皰疹病毒。
24.根據權利要求23所述的系統，其中所述的病毒抗原選自由皰疹病毒B和狒狒皰疹病毒2組成的組。
25.根據權利要求20所述的系統，其中所述的呋喃香豆素類化合物是補骨脂素。
26.根據權利要求20所述的系統，其中所述的抗原成分進一步包括暴露於基質上的抗原。
27.根據權利要求26所述的系統，其中所述的報告成分包括報告抗體，其能夠結合至少一部分抗體，所述抗體能夠結合至少一部分抗原。
28.—種免疫受試者的方法,包括 滅活免疫原性微生物，包括將免疫原性的微生物暴露於呋喃香豆素類化合物和廣譜脈衝光的至少一個脈衝，並且 對受試者施用有效量的免疫原性微生物以產生免疫反應。
29.根據權利要求28所述的方法，其中所述的免疫原性微生物選自病毒、細菌和真菌組成的組。
30.根據權利要求28所述的方法，其中所述的免疫原性微生物包括病毒。
31.根據權利要求30所述的方法，其中所述的病毒包括皰疹病毒。
32.根據權利要求31所述的方法，其中所述的皰疹病毒選自由皰疹病毒B和狒狒皰疹病毒2組成的組。
33.根據權利要求28所述的方法，其中所述至少一種呋喃香豆素類化合物包括補骨脂素。
34.根據權利要求33所述的方法，其中補骨脂素以大約O.I μ g/ml至大約60 μ g/ml的濃度存在。
35.根據權利要求34所述的方法，其中補骨脂素以大約至少5yg/ml的濃度存在。
36.根據權利要求28所述的方法，其中將所述免疫原暴露於呋喃香豆素類化合物(furanocoumarin)和廣譜脈衝光的至少一個脈衝，包括將所述免疫原暴露於至少大約O.45焦耳/釐米2的廣譜光至大約13. 5焦耳/釐米2的廣譜光。
37.根據權利要求36所述的方法，其中將所述免疫原暴露於呋喃香豆素類化合物和廣譜脈衝光的至少一個脈衝，包括將所述免疫原暴露於至少大約4. 05焦耳/釐米2的廣譜光。
38.一種對至少一部分抗原具有特異親和力的抗體，其中所述的抗原衍生自曾暴露於至少一種呋喃香豆素類化合物和廣譜脈衝光的至少一個脈衝的微生物。
39.根據權利要求38所述的抗體，其中所述的抗體衍生自微生物，其選自病毒、細菌和真菌組成的組。
40.根據權利要求38所述的抗體，其中所述的微生物是病毒。
41.根據權利要求40所述的抗體，其中所述的微生物是皰疹病毒。
42.根據權利要求41所述的抗體，其中所述的皰疹病毒選自由皰疹病毒B和狒狒皰疹病毒2組成的組。
43.根據權利要求38所述的抗體，其中所述呋喃香豆素類化合物是補骨脂素。
44.根據權利要求43所述的抗體，其中補骨脂素以大約O.I μ g/ml至大約20 μ g/ml的濃度存在。
45.根據權利要求43所述的抗體，其中補骨脂素以大約至少5yg/ml的濃度存在。
46.根據權利要求38所述的抗體，其中廣譜脈衝光的至少一個脈衝，包括至少大約4. 05焦耳/釐米2的廣譜光至大約13. 5焦耳/釐米2的廣譜光。
47.根據權利要求46所述的抗體，其中所述廣譜脈衝光的至少一個脈衝包括至少大約4.05焦耳/釐米2的廣譜光。
48.根據權利要求38所述的抗體，其中所述抗體是多克隆抗體。
49.根據權利要求38所述的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
50.一種包括經滅活的核酸的滅活的微生物，其中所述滅活的微生物保留其免疫原性。
51.根據權利要求50所述的滅活的微生物，其中所述的微生物選自病毒、細菌和真菌組成的組。
52.根據權利要求51所述的滅活的微生物，其中所述的微生物是病毒。
53.根據權利要求52所述的滅活的微生物，其中所述的微生物是皰疹病毒。
54.根據權利要求53所述的滅活的微生物,其中所述的皰疫病毒選自由皰疫病毒B和狒狒皰疹病毒2組成的組。
55.根據權利要求50所述的滅活的微生物，其中所述的經滅活的核酸包括交聯的核酸。
56.根據權利要求50所述的滅活的微生物，其中所述的滅活的微生物能夠在受試者中產生免疫反應，其基本上類似於非滅活的微生物產生的免疫反應。
全文摘要
本發明基本上涉及了滅活微生物的系統和方法。特別地，本發明直接使用至少一種呋喃香豆素類化合物和廣譜脈衝光滅活微生物，如病毒。例如，本發明的一方面包括使用補骨脂素和廣譜脈衝光滅活皰疹病毒，如皰疹B病毒或狒狒皰疹病毒2的方法。
文檔編號A61K31/34GK102933211SQ201080064346
公開日2013年2月13日 申請日期2010年12月20日 優先權日2009年12月21日
發明者朱莉亞·赫利爾德, 大衛·卡茲 申請人:喬治亞州立大學研究基金會