一種正品半夏的檢測方法

2023-12-08 13:02:16 2

專利名稱：一種正品半夏的檢測方法
技術領域：
本發明涉及正品半夏的檢測方法，屬於中藥領域。
背景技術：
半夏來源於天南星科植物半夏Pinellia ternata (Thunb. ) breit.的乾燥塊莖， 呈類球形，有的稍偏斜少數為長遠球形，直徑f1. 5cm;表面白色或淺黃色，頂端有凹陷的莖痕，周圍密布麻點狀根痕；下面鈍圓，較光滑；質堅實，斷面潔白，富粉性，粉末嗅之嗆鼻； 氣微，味辛辣、麻舌而刺喉。
近幾年半夏的市場需求量持續增加，野生資源逐年減少，人工栽培發展緩慢，使得半夏資源蘊藏量和產量都在大幅下降。導致市場上出現了很多偽品，給半夏藥材的質量、用藥的安全性及有效性帶來了很大的衝擊。
通過對中藥材市場的調研發現，半夏的偽品主要為水半夏、虎掌南星和禹白附。
水半夏，為天南星科植物鞭簷的乾燥塊莖。呈近圓形、橢圓形、圓錐形或倒卵形，直徑O. 5^1. 5cm，高O. 8 3cm。表面類白色或淡黃色，不平滑，遍體隱約可見狀根痕；上端類圓形，常用有偏斜而凸起的葉痕或芽痕，黃棕色，下端有點兒略尖。質堅實，斷面白色，粉性。氣微，味辛辣，麻舌而刺喉。
虎掌南星，為天南星科植物掌葉半夏的乾燥塊莖。呈近球形，直徑3 4cm，外皮粗糙，褐色，剝去外皮為類白色或淡棕黃色，頂端有深陷的莖痕，有的周邊生有數個扁球狀塊莖，形如虎掌，氣微，味辛辣。
禹白附，為天南星科植物獨角蓮的乾燥塊莖。呈橢圓形或卵圓形，直徑f2cm，高 2 5cm。表面白色或黃白色，略粗糙，有環紋及根痕，頂端具凹陷莖痕，下端鈍圓。質堅硬，難折斷，斷面類白色，粉性。氣微，味淡，嚼之麻辣刺舌。
目前，正品半夏的有效檢測方法是傳統形態特徵和理化特性的鑑別方法，其非常複雜並具有一定的局限性。發明內容
為了解決上述問題，本發明提供了一種正品半夏的檢測方法。
本發明正品半夏的檢測方法，包括如下步驟
(I)取待檢樣品，加f 3倍重量的水，水溫為0°C飛。C，勻漿，離心，得上清液；
(2)用SDS-PAGE電泳方法檢測步驟(I)的上清液，其在Rm值O. 208、0.232、 O. 312,0. 335,0. 383,0. 405,0. 429,0. 491,0. 615,0. 85 和 / 或 O. 897 有譜帶，所述電泳濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度12%。
其中，步驟(I)中，所述冰水重量為待檢樣品重量的2倍，所述離心為2000r/min離心 2min。
其中，步驟(2)中，所述上清液在Rm 值 O. 208,0. 232,0. 312,0. 335,0. 383,0. 405、 O. 429,0. 491,0. 615,0. 85 和 O. 897 有譜帶。
SDS-PAGE電泳十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳。
Rm值相對遷移率或者相對泳動率=蛋白絕對遷移距離/溴酚藍遷移距離。
其中，所述步驟(2)包括如下步驟
I)取上清液，加入O. Γ1倍體積樣品緩衝液，混勻，離心，得上樣液，所述樣品緩衝液是lmol/1 Tris-鹽酸緩衝液，並添加有O. 15mol/l SDS和O. 03mol/l溴酚藍；
2)取步驟I)的上樣液上樣，電泳，固定，染色，洗脫即可，所述電泳緩衝液為 Tris-甘氨酸緩衝液。
其中，步驟I)中，所述樣品緩衝液為上清液的O.1倍；混勻後在沸水中加熱3min ； 所述離心的條件是4000r/min離心離心30s。
其中，步驟I)中，所述樣品緩衝液還添加有20% (v/v)甘油和10% (ν/ν) β -巰基乙醇。
其中，步驟2)中，所述固定採用的固定液為10%的三氯醋酸溶液；所述染色採用的染色液為考馬氏亮藍染色液；所述洗脫採用的洗脫液為考馬氏亮藍洗脫液。
優選地，所述染色是用考馬氏亮藍染色液浸泡凝膠，50°C 60°C水浴加熱15min， 並不斷振蕩，放冷後傾去染色液。
本發明方法可以準確檢測正品半夏，準確度高，檢測方法簡單、快速，可以替代傳統檢測方法，具有良好的應用前景。
顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
以下通過實施例形 式的具體實施方式
，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的範圍僅限於以下的實例。凡基於本發明上述內容所實現的技術均屬於本發明的範圍。


圖1樣品處理方法檢測結果，其中，泳道I 9 :方法I 9，M :標準蛋白；
圖2染色方法檢測結果；
圖3待見樣品檢測結果；
圖4待見樣品檢測結果；
圖5待見樣品檢測結果。
具體實施方式
試劑
A液1. 5MTris-HCL溶液(分離膠儲存液)
精密稱取Tris鹼(分析純)18. 15g，加適量的超純水溶解，用濃鹽酸(分析純)調 PH值至8.8，加超純水定容至10011^。貼上標貼，4°C保存。此溶液有效使用期限為三個月。
B液IMTris-HCL溶液(濃縮膠儲存液)
精密稱取Tris鹼(分析純)12.1g,加適量的超純水溶解，用濃鹽酸(分析純)調 pH值至6. 8，加超純水定容至100mL。貼上標貼，4°C保存。此溶液有效使用期限為三個月。
C液30%丙烯醯胺儲存液
精密稱取丙烯醯胺(Acr，分析純)29. 2g、N，N』 -甲叉雙丙烯醯胺(分析純)O. Sg, 加適量的超純水溶解，再定容至IOOmL,用濾紙過濾，貼上標貼，避光4°C保存。此溶液有效使用期限為三個月。
D 液10%SDS 溶液
精密稱取SDS (分析純)10g，用超純水溶解至IOOmL,貼上標貼，室溫儲存。此溶液有效使用期限為三個月。
E液10%過硫酸胺(AP)溶液
精密稱取過硫酸胺(分析純)10g，用超純水溶解至IOOmL,貼上標貼，_20°C保存。 此溶液最好於臨用前配置。
F 液1%TEMED 溶液
精密吸取T液lmL，加超純水定容至IOOmL,置於棕色瓶中於4°C保存。
取上述原料，配製濃度為5%濃縮膠和濃度為12%的分離膠。
電泳緩衝液精密稱取稱取Tris鹼(分析純)6g、甘氨酸(分析純)28. 8g、SDS (分析純)10g，加超純水定容至IOOOmL,臨用前加超純水稀釋10倍，貼上標貼，室溫儲存。
樣品緩衝液精密稱取SDS(分析純)4g，溴酚藍(分析純)0. 2g,加20mL甘油 (分析純)，IOmLlMTris-HCl (ρΗ6· 8)溶液，IOmL β -巰基乙醇(分析純)，加超純水溶解至 IOOmL,貼上標貼，室溫儲存。
考馬氏亮藍染色液精密稱取考馬氏亮藍R — 250 (分析純)lg，加甲醇(分析純)200mL,冰醋酸(分析純)50mL,以超純水定容至500mL，貼上標貼，室溫儲存。
考馬氏亮藍洗脫液量取乙醇(分析純)250mL,冰醋酸(分析純)80mL,加超純水定容至IOOOmL,貼上標貼，室溫儲存。
染色固定液10%的三氯醋酸溶液。
實施例1本發明檢測方法
1、檢測方法
(I)供試品的製備
稱取半夏藥材2g，加冰水4mL，在研缽中快速研磨，立即轉移至離心管中，於 2000r/min條件下離心2min ；
取上清液50 μ 1，加樣品 緩衝液5 μ 1，混勻後於沸水中加熱3min，於4000r/min條件下離心30s，冷凍儲存備用。
(2)電泳
製備濃縮膠和分尚膠，待分尚膠與濃縮膠充分凝固後，在電泳槽中加入稀釋10倍的電泳緩衝液，加入量以沒過玻璃板為準。然後用移液槍吸取20μ I樣品，注入加樣孔中。 接通電源，起始電壓為100V，當指示劑進入分離膠後，電壓調至220V進行恆壓電泳。待指示劑行至電泳槽下端Icm處時停止電泳。
(3)固定、染色及脫色
電泳停止後，取出玻璃板，將凝膠慢慢剝離下來，置於10%的三氯醋酸染色固定液，放置30min後除去固定液，用純淨水衝洗；
用考馬氏亮藍染色液浸泡凝膠，50°C 60°C水浴加熱15min，並不斷振蕩，放冷後傾去染色液，先用蒸餾水漂洗幾次，然後反覆用洗脫液進行洗脫，最後再用蒸餾水衝洗。
(4)計算 Rm 值
檢測凝膠的電泳條帶在Rm 值 O. 208、O. 232、O. 312、O. 335、O. 383、O. 405、O. 429、 O. 491,0. 615,0. 85 和 / 或 O. 897 否有譜帶。
實施例2本發明方法的參數篩選實驗
1、樣品處理方法的優選
樣品處理方法按照如下方法廣9，其餘方法同實施例1。
方法1:取上清液50μ 1，加樣品緩衝液50μ 1，混勻後於沸水中加熱3min，於 4000r/min條件下離心30s。
方法2 :取上清液50 μ 1，加樣品緩衝液50 μ I，不加熱處理，於4000r/min條件下離心30s。
方法3 :取上清液50μ I,加樣品緩衝液50μ I,再加loading buffer5 μ I,不加熱處理，於4000r/min條件下離心30s。
方法4 :取上清液50 μ I,加樣品緩衝液50 μ I,再加loading buffer5 μ I,混勻後於沸水中加熱3min，於4000r/min條件下離心30s。
方法5 :取上清液50 μ I,加β -巰基乙醇100 μ I,再加loading buffer5yl,混勻後於沸水中加熱3min，於4000r/min條件下離 心30s。
方法6 :取上清液50 μ I,加β -巰基乙醇50 μ I,再加loading buffer5yl,混勻後於沸水中加熱3min，於4000r/min條件下離心30s。
方法7 :取上清液50 μ I,加β -巰基乙醇50 μ I,再加loading buffer5yl,不加熱處理,於4000r/min條件下離心30s。
方法8 :取上清液50 μ I,加loading buffer5 μ I,混勻後於沸水中加熱3min,於 4000r/min條件下離心30s。
方法9 :取上清液50 μ I,加loading buffer5 μ I,不加熱處理,於4000r/min條件下離心30s。
如圖1所示，Marker的泳道以及本發明方法處理的樣品的泳道(泳道f 4和8、) 的條帶均清楚，尤其是泳道8的條帶最為清楚，而其他處理方法製備的樣品的泳道(泳道 5^7)則出現拖尾現象，說明上述方法f 4和8、的樣品處理方法均是有效的，其中，以方法 8的樣品處理方法最優。
2、染色方法
染色方法按照如下方法f 9，其餘方法同實施例1。
方法1:用考馬氏亮藍染色液浸泡凝膠3h，並且不斷振蕩，傾去染色液，先用蒸餾水漂洗幾次，然後反覆用洗脫液進行洗脫，最後再用蒸餾水衝洗。
方法2 :用考馬氏亮藍染色液浸泡凝膠，50°C 60°C水浴加熱15min，並不斷振蕩， 放冷後傾去染色液，先用蒸餾水漂洗幾次，然後反覆用洗脫液進行洗脫，最後再用蒸餾水衝洗。
方法3 :用考馬氏亮藍染色液浸泡凝膠，置於微波爐(中火)中加熱3min，取出，放冷後傾去染色液，先用蒸餾水漂洗幾次，然後反覆用洗脫液進行洗脫，最後再用蒸餾水衝洗。
結果如圖2所示，本發明用考馬斯亮藍的方法可以有效染色，其中，染色方法I時間較長，且染色後不易洗脫，條帶不夠清晰；染色方法3須經微波爐處理，染色後雖易洗脫， 條帶也較清晰，但條帶多因微波加熱而發生變形，另外加熱過程中凝膠邊緣多皺縮；染色方法2染色較快，較易洗脫，並且條帶清晰，是最優的染色方法。
以下以實驗例的方式說明本發明的有益效果
實驗例I用本發明方法檢測待檢樣品
實驗材料從市場購買的4批藥材，第I批藥材9份(BI B9)，第2批藥材9份 (SI S9)，第3批藥材16份(NI N16)，第4批藥材11份(Fl F11)，分別用本發明方法和傳統檢測方法檢測。
1、檢測方法
(I)本發明檢測
稱取樣品2g，加冰水4mL，在研缽中快速研磨，立即轉移至離心管中，於2000r/min 條件下離心2min,取上清液50 μ I,加樣品緩衝液50 μ I,再加loading buffer5 μ I,混勻後於沸水中加熱3min,於4000r/min條件下離心30s,冷凍儲存備用。
待分尚膠與濃縮膠充分凝固後，在電泳槽中加入稀釋10倍的電泳緩衝液,加入量以沒過玻璃板為準。然後用移液槍吸取20μ I樣品，注入加樣孔中。接通電源，起始電壓為 100V,當指示劑進入分離膠後，電壓調至220V進行恆壓電泳。待指示劑行至電泳槽下端Icm 處時停止電泳。
電泳停止後，取出玻璃板，將凝膠慢慢剝離下來，置於10%的三氯醋酸染色固定液中，放置30min後除去固定液,用純淨水衝洗。然後用考馬氏亮藍染色液浸泡凝膠,水浴加熱15min，並不斷振蕩，放冷後傾去染色液，先用蒸餾水漂洗幾次，然後反覆用洗脫液進行洗脫，最後再用蒸餾水衝洗。
檢測凝膠的電泳條帶在Rm 為 O. 208、O. 232、O. 312、O. 335、O. 383、O. 405、O. 429、 O. 491,0. 615,0. 85 和 / 或 O. 897 否有譜帶。
(2)傳統檢測方法
形態和理化性質鑑定。
2實驗結果
( I)本發明方法檢測結果
檢測結果如表I所示
表I本發明方法的檢測結果
權利要求
1.一種正品半夏的檢測方法，其特徵在於包括如下步驟(1)取待檢樣品，加廣3倍重量的水，水溫(TC飛。C，勻漿，離心，得上清液；(2)用SDS-PAGE電泳方法檢測步驟(I)的上清液，其在Rm值O.208,0. 232、0· 312、O.335、O. 383、O. 405、O. 429、0. 491、0. 615、0. 85 和 / 或 O. 897 有譜帶，所述電泳的濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%。
2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於步驟(I)中，所述水為待檢樣品重量的2倍；所述離心為2000r/min離心2min。
3.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於步驟(2)中，所述上清液在Rm值O.208,0. 232,0. 312,0. 335,0. 383,0. 405,0. 429,0. 491,0. 615,0. 85 和 O. 897 有譜帶。
4.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於所述步驟(2)包含如下步驟1)將上清液加入O.Γ1倍體積樣品緩衝液，混勻，離心，得上樣液，所述樣品緩衝液是 lmol/1 Tris-HCl 緩衝液，且添加有 0.03mol/l 溴酚藍和 O. 15mol/l SDS ；2)取步驟I)的上樣液上樣，電泳，固定，染色，洗脫即可，所述電泳緩衝液為Tris-甘氨酸緩衝液。
5.根據權利要求4所述的檢測方法，其特徵在於步驟I)中，所述樣品緩衝液為上清液的O.1倍；所述上清液與樣品緩衝液混勻之後，先在沸水中加熱3min，再離心；所述離心是 4000r/min 離心 30s。
6.根據權利要求4所述的檢測方法，其特徵在於步驟I)中，所述樣品緩衝液還添加有20% (v/v)甘油和10% (ν/ν) β-巰基乙醇。
7.根據權利要求4所述的檢測方法，其特徵在於步驟2)中，所述固定採用的固定液為10%(w/w)三氯醋酸溶液；所述染色採用的染色液為考馬氏亮藍染色液；所述洗脫採用的洗脫液為考馬氏亮藍洗脫液。
8.根據權利要求7所述的檢測方法，其特徵在於所述染色是用考馬氏亮藍染色液浸泡凝膠，5(T60°C水浴加熱15min，並不斷振蕩，冷卻後傾去染色液。
全文摘要
本發明公開了一種正品半夏的檢測方法，包括如下步驟(1)取待檢樣品，加1~3倍重量的水，水溫0℃~5℃，勻漿，離心，得上清液；(2)用SDS-PAGE電泳方法檢測步驟(1)的上清液，在Rm值0.208、0.232、0.312、0.335、0.383、0.405、0.429、0.491、0.615、0.85和/或0.897有譜帶，所述電泳的濃縮膠濃度為5%，分離膠為濃度12%。本發明正品半夏的檢測方法準確度高，操作方便，成本低廉，市場應用前景良好。
文檔編號G01N27/447GK103048373SQ20131001931
公開日2013年4月17日 申請日期2013年1月18日 優先權日2013年1月18日
發明者李敏, 盧道會, 楊小豔 申請人:成都中醫藥大學