蛹蟲草抗腫瘤活性組分的提取方法及其應用的製作方法

2023-11-08 10:58:22

蛹蟲草抗腫瘤活性組分的提取方法及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供一種蛹蟲草抗腫瘤活性組分的提取方法：蛹蟲草子實體超低溫粉碎；得到超微粉水煮提取，沉澱再丙酮提取；得到沉澱溶解後過液相色譜，洗脫試劑依次為100%正己烷、25%乙酸乙酯-正己烷、100%乙酸乙酯；選取抗腫瘤活性最強組分過液相色譜，洗脫試劑依次為100%正己烷、10%乙酸乙酯-正己烷、15%乙酸乙酯-正己烷；選取抗腫瘤活性最強組分再過液相色譜，洗脫試劑為100%二氯甲烷，選取抗腫瘤活性最強組分即為本發明目的組分。該方法重複性好，得到的抗腫瘤活性組分可用於製備抗腫瘤藥物中。
【專利說明】蛹蟲草抗腫瘤活性組分的提取方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物製品加工【技術領域】，具體涉及一種蛹蟲草抗腫瘤活性組分的提取方法，以及該活性組分在製備抗腫瘤藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]腫瘤是一種基因病，但並非是遺傳的，它是指細胞在致癌因素作用下，基因發生了改變，失去對其生長的正常調控，導致單克隆性異常增生而形成的新生物。2008年，WHO發布的數據顯示，中國已經成為世界第二大癌症高發國，中國每年新增220萬名癌症患者，約佔全球癌症病人總數的20%，尤其是肝癌、胃癌和肺癌成為主要的健康殺手。研究如何消滅癌症、讓癌症病人能生活地更好，是醫藥領域中的研究重點，因此尋找高效、低毒、選擇性強的有臨床應用價值的理想的新型抗腫瘤藥物是一項長期而艱巨的任務，從藥食兩用的無毒且原料廉價易得的中藥裡尋找抗腫瘤藥物已成為抗腫瘤藥物開發的重要方向與希望所在。
[0003]冬蟲夏草是蟲草菌寄生在鱗翅目蝙蝠蛾科幼蟲中以其為載體的蟲菌複合體，含有豐富的蛋白質、脂肪、蟲草酸、核苷類物質和多種胺基酸等活性物質，味道清香，具有滋肺益氣、增精補腎、止血化痰、抑制腫瘤、止咳鎮靜、驅風、散熱、駐容美顏、延緩衰老、提高機體免疫力之功效。
[0004]蛹蟲草(Cordycepsmilitaris),在分類學上與冬蟲夏草同歸於蟲草屬，是一種珍貴的藥用真菌，其化學成分和藥理作用與冬蟲夏草相似，在臨床上常替代冬蟲夏草入藥。由於野生蛹蟲草資源極為有限，不能滿足日益增加的市場需求，人工栽培蛹蟲草成為必需。目前，人工栽培蛹蟲草已獲成功，並實現了規模化生產。
[0005]蛹蟲草具有多種與抗腫瘤作用相關的活性物質，有些活性物質如蟲草素、蟲草多糖等的抗腫瘤作用已研究得比較深入；而有些活性物質如類胡蘿蔔素、蛋白質等在抗腫瘤方面的研究則較少。蛹蟲草活性物質未能最大程度地得到開發與利用，所以研究具有抗腫瘤作用的新的活性物質，不斷開拓現有活性物質的新的生理活性和藥理作用具有重要意義，能為進一步研究和開發蛹蟲草在醫藥方面的應用提供理論基礎和產業化背景。
[0006]傳統的蛹蟲草抗腫瘤活性組分的提取方法，如杜秀菊等發表的「蛹蟲草抗腫瘤和免疫活性部位的體外篩選」(食用菌學報.2011.18(1):41-45)中公開了一種蛹蟲草子實體提取物製備方法:蛹蟲草子實體粉過60目篩後，用氯仿提取2小時，過濾，濾渣風乾後用乙酸乙酯提取2小時，過濾，濾渣風乾後用95%乙醇提取2小時，過濾，濾渣風乾後用30倍100°C蒸餾水提取2小時，400g離心20min後沉澱用15倍100°C 3%草酸銨溶液提取2小時，400g離心20min後沉澱用10倍100°C 5%Na0H溶液提取2小時，400g離心20min後上清液繼續用lmol/L鹽酸4°C中和，400g離心20min，對各步得到的濾液或上清液真空濃縮，冷凍乾燥，得到各提取物組分。該蛹蟲草子實體有效成分的提取分離方法步驟繁雜，而且提取出的活性成分少。另外，採用這種傳統的溶劑萃取法進行有效活性組分的提取，批次之間不具有重複性，即無法保證第一批萃取得到的物質組分與第二批萃取得到的物質組分之間的一致性。[0007]又如朱麗娜等發表的「蛹蟲草子實體中N6- (2-羥乙基)_腺苷的分離純化及抗腫瘤作用」(食用菌學報.2013.20(1):62-65)中公開了一種目標化合物的分離純化方法，它將蛹蟲草子實體粉末加入蒸餾水中100°C提取2小時，重複提取2次，合併提取液，然後以該提取液進行後續目標成分的提取。該方法屬於傳統的中藥有效成分的提取方法，即以水提的上清進行有效成分的提取，而對水提的沉澱卻沒有進行深入的研究，這有可能導致大量活性組分的丟失，從而阻礙了蛹蟲草在抗腫瘤藥物開發方面的進展。

【發明內容】

[0008]本發明所要解決的技術問題是針對以上現有技術的不足，突破現有中藥有效組分提取的限制，提供一種蛹蟲草抗腫瘤活性組分的提取方法，該方法以在細胞水平上沒有抗腫瘤活性的蛹蟲草子實體水提沉澱為原料，經丙酮浸提後再用製備液相色譜技術活性導向分離出強活性抗腫瘤活性組分。
[0009]本發明所採用的技術方案為:
[0010]一種蛹蟲草中抗腫瘤活性組分的提取方法，該方法包括以下步驟:
[0011]1、超低溫粉碎:
[0012]取烘乾的蛹蟲草子實體為原料，放入超微粉碎機中進行超微粉碎，同時粉碎全過程用2~10°C的水作為超微破碎機內部冷卻液，超微粉碎時間為5-20min，得到超微粉。
[0013]上述粉碎時間優選為12min。
[0014]2、溶劑提取:
[0015]2.1水煮:在超微粉中加入超純水，超純水的加入量為超微粉質量的8~10倍，100°C加熱3~10小時進行提取，離心取沉澱，然後重複I~3次，將得到的沉澱合併，乾燥，得到粗品A。
[0016]該步是與目前傳統的中藥有效組分或有效成分提取的最大不同。傳統的中藥中活性組分或活性成分的提取方法都是以水提的上清為中間原料進行有效成分的提取，中醫學上中藥飲用也是如此，水煮後取上清液為患者飲用，因為按常規理解，沸水煎煮後藥材中的有效成分便溶於液體中，故上清液中包含了所需的有效組分。而恰恰是這種認識的局限性，限制了目前物種中活性組分或活性成分的開發，使得很多有效組分或有效成分被當做廢渣倒掉、沒有進一步被發現和開發利用。這也並非是因為大多數研究者忽視了廢渣中有效組分或有效成分存在的可能性，而是因為廢渣在體外可能不具有抗腫瘤活性或活性很弱，如該步得到的粗品A經檢測在細胞水平上是沒有抗腫瘤活性的，這樣的檢測結果使得大多數研究者放棄了對其進行進一步分析和研究，從而導致了大量活性組分的丟失。本發明通過 申請人:的深入研究、分析和實驗，發現在細胞水平上沒有抗腫瘤活性的水提沉澱具有目的有效組分存在的可能性，從而從水提沉澱、出發，通過大量的實驗探索和工藝優化，最後總結出一套即本發明所述的蛹蟲草抗腫瘤活性組分的提取方法，最終成功提取到目的有效活性組分。
[0017]2.2丙酮沉澱:在粗品A中加入丙酮，丙酮的加入量為粗品A質量的2~4倍，室溫下浸提12~36小時，離心後取沉澱，然後重複I~3次，將得到的沉澱合併，乾燥，得到粗品B。
[0018]上述離心的轉速優選為6000rpm。[0019]上述乾燥優選為在60°C鼓風乾燥箱內進行。
[0020]3、色譜分離:
[0021]3.1取粗品B用50%乙酸乙酯-正己烷溶液(即乙酸乙酯與正己烷以1:1的體積比配比而成)溶解至濃度為50mg/ml，S0.45y m有機微孔濾膜，然後通過製備液相色譜進行分離，洗脫方式為100%正己烷等度洗脫10min，25%乙酸乙酯-正己烷溶液(即乙酸乙酯與正己烷以1:3的體積比配比而成)等度洗脫25min，100%乙酸乙酯等度洗脫15min，檢測波長為260nm，得到各組分經體外抗腫瘤活性篩選後，選取活性最強的組分旋蒸濃縮後真空乾燥，得到組分A。
[0022]該步溶劑的選擇非常重要，經過試驗，50%乙酸乙酯-正己烷溶液中乙酸乙酯對粗品B能全部溶解，正己烷對粗品B為部分溶解，而選用50%乙酸乙酯-正己烷溶液可以做到使粗品B溶解至50mg/ml，洗脫時採用100%正己烷、25%乙酸乙酯-正己烷溶液、100%乙酸乙酯的洗脫順序，使粗品B中物質組分被儘量分開，有利於目的有效組分的提取，提高提取率。
[0023]3.2取組分A用100% 乙酸乙酯50度超聲至剛好溶解至濃度為50mg/ml，過0.45 μm有機微孔濾膜，然後通過製備液相色譜進行分離，洗脫方式為100%正己烷等度洗脫lOmin，10%乙酸乙酯-正己烷溶液(即乙酸乙酯與正己烷以1:9的體積比配比而成)等度洗脫50min，15%乙酸乙酯-正己烷溶液(即乙酸乙酯與正己烷以3:17的體積比配比而成)等度洗脫20min，檢測波長為260nm，得到各組分經體外抗腫瘤活性篩選後，選取活性最強的組分旋蒸濃縮後真空乾燥，得到組分B。
[0024]該步洗脫採用的洗脫劑(10%乙酸乙酯-正己烷溶液、15%乙酸乙酯-正己烷溶液)不同於3.1中，通過洗脫率的不同，將原本被一個濃度洗脫下來的組分進行分開洗脫，有利於後續有效組分的獲得。
[0025]3.3取組分B用100% 二氯甲烷50度超聲至剛好溶解至濃度為50mg/ml，過0.45 μm有機微孔濾膜，然後通過製備液相色譜進行分離，洗脫方式為100% 二氯甲烷等度洗脫40min,檢測波長為260nm，得到各組分經體外抗腫瘤活性篩選後，選取活性最強的組分，旋蒸濃縮後真空乾燥，即為本發明目的抗腫瘤活性組分。
[0026]該步只採用二氯甲烷一種洗脫劑進行洗脫就可以完成組分分離目的，因為在實驗中我們發現二氯甲烷對組分B的溶解能力不是很強，所以使用該一種洗脫劑就可以把物質組分分離開，這不僅節省了試劑使用，而且更為重要的是，使用單種試劑使在大規模生產過程中單物質循環使用成為可能，這將大大節省製備成本。
[0027]上述製備液相色譜的填料優選為粒徑10 μ m的矽膠、大小為150 X 250mm。
[0028]上述體外抗腫瘤活性篩選是指採用實時無標記動態細胞分析技術實時檢測加藥後人肺癌A549細胞和人肝癌Hep-G2細胞的生長情況，同時可獲得藥物介導的細胞效應曲線，通過該曲線判斷該藥物是否抑制癌細胞的生長。與傳統方法(MTT)對比優勢在於，實驗操作簡單，步驟少，人為誤差小。採用無標記方法，不存在標記效率問題，並且對細胞無損傷，細胞在最接近生理狀態下進行檢測，結果準確度高。實驗結果客觀，重複性好，不需設置重複孔。該方法可以很好地判斷待測組分的抗腫瘤活性，因為在實驗中我們發現，各待測組分對這兩種細胞的抑制基本是同步的，即不存在第I號組分對人肺癌A549細胞抑制作用最好而第2組分對人肝癌Hep-G2細胞抑制作用最好的情況，基本上選取的目的組分要麼對兩種細胞的抑制作用都是最好的，要麼對其中一種細胞抑制作用最好、而另一種細胞所有的組分抑制效果都比較差。
[0029]本發明還進一步提供上述蛹蟲草抗腫瘤活性組分在製備抗腫瘤藥物中的應用。該活性組分作為有效成分按常規方法與藥學上可接受的任何載體製成各類藥用製劑。
[0030]與現有技術相比，本發明具有以下顯著優點和有益效果:
[0031]1、本發明採用超微粉碎機進行低溫超微粉碎，以破除蛹蟲草子實體堅硬的細胞壁，有利於內容物的溶出，有效提高了蛹蟲草子實體中抗腫瘤活性組分的提取率；
[0032]2、本發明採用製備液相色譜進行物質組分的分離純化，運用先進的技術對細胞水平上是沒有抗腫瘤活性的水提沉澱進行分離純化，通過對各個分離步驟的試劑選擇、工藝條件和工藝參數的優化，以及各個分離步驟之間良好的協同作用，最終成功提取到抗腫瘤活性組分，相對於傳統的溶劑萃取法，該抗腫瘤活性組分的提取方法不但穩定性好，重複性好，得到的物質組分批次之間一致性高，而且提取率高，得到的活性組分具有強抗腫瘤活性；
[0033]3、本發明通過人肺癌A549細胞生長抑制試驗和人肝癌Hep_G2細胞生長抑制試驗來判定蛹蟲草抗腫瘤活性組分的體外抗腫瘤能力，並設陽性對照，結果直觀、易判斷；
[0034]4、本發明蛹蟲草抗腫瘤活性組分的提取方法工藝簡單，易於實施，具有快速、高效、重複性好、穩定可控、分離純化製備量大、適用於工業化大規模生產等特點，所得的蛹蟲草抗腫瘤活性組分可用於研發製備抗腫瘤藥物，而由於該活性組分抗腫瘤有效成分含量高，使用該活性組分進行 製備抗腫瘤藥物時有效成分含量高，可以滿足不同製劑載體形式對有效成分含量的需求；
[0035]5、本發明拓展了抗腫瘤藥物或保健食品的原料來源，擴大了蛹蟲草子實體的應用範圍，使蛹蟲草子實體成為抗腫瘤藥物的有效組分原料，顯著提高了蛹蟲草子實體的附加值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0036]圖1所示的是實施例1 (3) Ca)步驟得到的色譜分離圖；
[0037]圖2所示的是實施例1 (3) (b)步驟得到的色譜分離圖；
[0038]圖3所示的是實施例1 (3) (c)步驟得到的色譜分離圖；
[0039]圖4所示的是實施例1製備的蛹蟲草抗腫瘤活性組分抑制人肺癌A549細胞生長的細胞實時檢測圖，其中C310-6-2為目的組分，hlxa為環磷醯胺；
[0040]圖5所示的是實施例1製備的蛹蟲草抗腫瘤活性組分抑制人肝癌Hep_G2細胞生長的的細胞實時檢測圖，其中C310-6-2為目的組分，hlxa為環磷醯胺。
【具體實施方式】
[0041]以下結合實施例對本發明作進一步具體描述。應該指出，以下具體說明都是例示性的，旨在對本發明提供進一步的說明。除非另有說明，本發明使用的所有科學和技術術語具有與本發明所屬【技術領域】人員通常理解的相同含義。
[0042]實施例1:蛹蟲草抗腫瘤活性組分的提取
[0043]1、原料、材料:[0044]蛹蟲草子實體為本實驗室生產。
[0045]2、試劑:
[0046]超純水由密立博純水儀生產；丙酮購自天津市北方天醫化學試劑廠；色譜級乙酸乙酯、正己燒、二氯甲燒購自Honeywell公司。
[0047]3、儀器設備:
[0048]超微粉碎機購自山東三清不鏽鋼設備有限公司；臺式冷凍離心機購自Thermo公司；旋轉蒸發儀購自上海亞容生化儀器廠；IOymsilica DAC150購自江蘇迪沃特儀器設備科技有限公司。
[0049]蛹蟲草子實體抗腫瘤活性組分的提取步驟如下:
[0050]( I)超低溫粉碎:
[0051]取烘乾的蛹蟲草子實體為原料，稱取150g烘乾的蛹蟲草子實體，放入超微粉碎機中進行超微粉碎，同時粉碎全過程用2~10°C的水作為超微破碎機內部冷卻液，以降低粉碎溫度，確保有效成分的釋放和生物活性的穩定，超微粉碎時間為5-20min，經過實踐摸索12min為最宜,得到超微粉。
[0052](2)溶劑提取:
[0053](a)水煮:在超微粉中加入超純水，超純水的加入量為超微粉質量的8~10倍，100°C加熱3~10小時 進行提取，6000rpm離心取沉澱，然後重複兩次，將三次得到的沉澱合併，在60°C鼓風乾燥箱內乾燥，得到粗品A。
[0054](b)丙酮沉澱:在粗品A中加入丙酮，丙酮的加入量為粗品A質量的3倍，室溫下浸提12~36小時，6000rpm離心後取沉澱，然後重複兩次，將三次得到的沉澱合併，在60°C鼓風乾燥箱內乾燥，得到粗品B。
[0055](3)色譜分離:
[0056](a)取粗品B用50%乙酸乙酯-正己烷溶液溶解至濃度為50mg/ml，過0.45 μ m有機微孔濾膜，然後通過製備液相色譜進行分離，製備液相色譜的填料為粒徑10 μ m的矽膠(silica)、大小為150X 250mm，檢測波長為260nm，流速為700ml/min ;洗脫方式為100%正己烷等度洗脫10min，25%乙酸乙酯-正己烷溶液25min，100%乙酸乙酯15min，結果如圖1所示，得到各組分經體外抗腫瘤活性篩選後，選取活性最強的組分旋蒸濃縮後真空乾燥，得到組分C3-10做下一步分離純化。
[0057](b)取組分C3-10用100%乙酸乙酯50度超聲至剛好溶解至濃度為50mg/ml，過0.45 μ m有機微孔濾膜，然後通過製備液相色譜進行分離，製備液相色譜的填料粒徑10 μ m的矽膠(silica)、大小為150X250mm,檢測波長為260nm,流速為700ml/min ;洗脫方式為100%正己烷等度洗脫lOmin，10%乙酸乙酯-正己烷溶液50min，15%乙酸乙酯-正己烷溶液20min，結果如圖2所示，得到各組分經體外抗腫瘤活性篩選後，選取活性最強的組分蒸濃縮後真空乾燥，得到組分C310-6做下一步分離純化。
[0058](c)取組分C310-6用100% 二氯甲烷50度超聲至剛好溶解至濃度為50mg/ml，過0.45 μ m有機微孔濾膜，然後通過製備液相色譜進行分離，製備液相色譜的填料為粒徑10 μ m的矽膠(silica)、大小為150X250mm,檢測波長為260nm,流速為600ml/min ;洗脫方式為100% 二氯甲烷等度洗脫40min，結果如圖3所示，得到各組分經體外抗腫瘤活性篩選後，選取活性最強的組分，蒸濃縮後真空乾燥，得到組分C310-6-2，共21g，即為本發明目的抗腫瘤活性組分。
[0059]經NMR氫譜、NMR碳譜、質譜等鑑定，C310_6_2主要含有麥角留醇及其他未知物。
[0060]實施例2:抑制人肺癌A549細胞生長試驗
[0061]主要材料與試劑:
[0062]人肺癌A549細胞由艾森生物(杭州)有限公司贈送；F_12K培養基由Gibco公司贈送；環磷醯胺購自天津金世製藥有限公司。
[0063]空白對照孔:不加藥物；
[0064]陽性對照孔:加環磷醯胺；
[0065]實驗孔:加實施例1所得的抗腫瘤活性組分C310-6-2。
[0066]細胞培養:
[0067]在5%C02，37 °C，飽和溼度下，用F-12K (10%FBS+1%PS)培養基培養人肺癌A549細胞，選取對數期生長的細胞作為實驗細胞。 細胞計數後用培養基稀釋為約5.7萬/mL的細胞懸液。
[0068]細胞生長情況監測:
[0069]將細胞實時監測儀放入5%C02，37°C飽和溼度培養箱中。取8孔板，每孔加入150 μ LF-12K培養基，放入細胞實時監測儀中走基線，走完基線後取出八孔板，每孔加入稀釋好的Α549細胞懸液345 μ L，至每孔細胞數約2萬，靜置3min，在倒置顯微鏡下觀察細胞是否均勻。每孔加入5 μ L稀釋好的藥物至終濃度為所需藥物濃度，用相同濃度的環磷醯胺作為陽性對照組，含0.1%DMS0的培養基作為空白對照組，放入細胞實時監測儀中檢測，檢測完畢時拍照記錄。實驗結果如圖4所示，結果表明:本發明提取得到的蛹蟲草抗腫瘤活性組分C310-6-2在12.5 μ g/ml時能達到近100%抑制人肺癌細胞A549的生長。
[0070]實施例3:抑制人肝癌Hep_G2細胞生長試驗
[0071]主要材料與試劑:
[0072]人肝癌H印-G2細胞由天大科技園贈送；MEM培養基由Gibco公司贈送；環磷醯胺購自天津金世製藥有限公司。
[0073]空白對照孔:不加藥物；
[0074]陽性對照孔:加環磷醯胺；
[0075]實驗孔:加實施例1所得的抗腫瘤活性組分C310-6-2。
[0076]細胞培養:
[0077]在5%C02，37°C，飽和溼度下，用MEM (10%FBS、1%PS)培養基人肺癌H印-G2細胞，選取生長狀態良好的細胞作為實驗細胞。細胞計數後用培養基稀釋為約5.7萬/mL的細胞懸液。
[0078]細胞生長情況監測:
[0079]將細胞實時監測儀放入5%C02，37°C飽和溼度培養箱中。取8孔板，每孔加入150 μ LMEM培養基，放入細胞實時監測儀中走基線，走完基線後取出八孔板，每孔加入稀釋好的ifep-G2細胞懸液345 μ L，至每孔細胞數約4萬，靜置3min，在倒置顯微鏡下觀察細胞是否均勻。每孔加入5 μ L稀釋好的藥物至終濃度為所需要藥物濃度，用相同濃度的環磷醯胺作為陽性對照組，含0.1%DMS0的培養基作為空白對照組，放入細胞實時監測儀中檢測，檢測完畢時拍照記錄。實驗結果如圖5所示，結果表明:本發明提取得到的蛹蟲草抗腫瘤活性組分C310-6-2在12.5 μ g/ml時能達到近100%抑制人肝癌細胞!fep-G2生長。
[0080]實施例4:C310-6-2抗Lewis腫瘤實驗
[0081]主要材料與試劑:
[0082]lewis肺癌瘤株(第6代)購自中國典型培養物保藏中心(武漢大學保藏中心)；環磷醯胺片購自天津金世製藥有限公司；C57BL/6小鼠(18~22g)(動物許可證號:SCXK (京)2012-0001，合格證號:11400700020779)購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心；吐溫80由北京博潤萊特科技有限公司分裝。
[0083]本實施例擬在採用lewis荷瘤小鼠模型考察C310-6-2抗肺癌腫瘤作用。具體步驟如下:
[0084]1、小鼠Lewis肺癌荷瘤模型建立
[0085]取接種腫瘤8-13天狀態良好的荷瘤小鼠脫曰處死，體表酒精消毒，在無菌(超淨臺)環境下剝離小鼠腫瘤至盛有生理鹽水的無菌平皿，剪至小塊，將小塊腫瘤放入組織勻漿器，按體積比1:3左右加入生理鹽水勻漿，勻漿液倒入50ml無菌離心管，備用。用Iml注射器在C57小鼠右腋下注射接種0.2ml，腫瘤細胞混懸液的製備均在無菌條件下(超淨工作檯中)完成。從取出腫瘤腹水至腫瘤接種完畢在60分鐘內完成。
[0086]2、藥物製備方法
[0087]C310-6 -2灌胃劑:稱取一定重量的C310-6-2樣品至研缽中，加入所需溶劑體積2%吐溫-80，充分研磨後再加入所需體積的生理鹽水，混勻，備用。
[0088]環磷醯胺灌胃劑:去掉環磷醯胺片的薄膜衣後進行稱取，稱取一定重量至研缽中，加入所需體積的生理鹽水，充分研磨、混勻，備用。
[0089]3、分組及給藥方法
[0090]將60隻實驗小鼠共分為6組，每組10隻，雌雄各半，分為①混合物低劑量(27mg/kg)組、②混合物中劑量(80mg/kg)組、③混合物高劑量(240mg/kg)組、④環磷醯胺組、⑤模型組、⑥空白組，以上除空白組及模型組外，其餘各組在注射腫瘤混懸液後，均每日給藥一次，每次每隻0.2ml，連續給藥10天，空白組及模型組在相同給藥時間及給藥時長灌胃給予2%吐溫-80水溶液，連續灌胃10天。
[0091]4、觀察指標
[0092]4.1大體狀態
[0093]每日對小鼠進行體重、飲食量的稱定並記錄，於最後一次計算小鼠除瘤後的體重淨重。
[0094]4.2瘤重及腫瘤抑制率
[0095]每日對小鼠右腋下進行觀察，於最後一次給藥24h後，解剖並取出腫瘤組織，稱取腫瘤重量，按下述公式計算腫瘤生長抑制率。
[0096]
麵_率=歷歷裡變壓.1.賴
麵麵麵量
[0097]4.3肺組織重量及癌變肺部轉移率
[0098]於最後一次給藥24h後，解剖並取出肺組織，稱取肺組織重量，並觀察肺組織是否有變化並統計有肺癌轉移的小鼠數量。[0099]5、數據統計
[0100]各組別小鼠相應數據均以表示，採用SPSS軟體進行統計，各組別採用one-wayANOVA檢驗。結果如表1所示。
[0101]由表1可知，C310-6-2在給予劑量為240mg/kg，服藥天數為10天時與Lewis肺癌腫瘤模型小鼠比較有極顯著差異(p〈0.01)，此劑量與環磷醯胺組比較無明顯差異。
[0102]在肺轉移方面，各組均出現20%_50%的肺轉移現象，但無統計學意義。
[0103]在淨體重變化方面，C310-6-2各給藥組及環磷醯胺組均出現體重下降現象，且各組與模型組及空白組比較均有極顯著差異(P〈0.0I)。
[0104]在給藥治療期間，C310-6-2各給藥組小鼠體重均出現先下降、後波動上升繼而維持平穩的狀態；環磷醯胺組則為先下降後維持在低體重狀態；模型組與空白則均為波動上升後維持在一定體重水平。
[0105]在給藥治療期間，C310-6-2各給藥組小鼠平均飲食量均表現出給藥中期較高，首尾期較低的表現；環磷醯胺組飲食量一直保持在較低水平；空白組飲食量一直保持在較高水平；模型組則表現為飲食量逐漸減少。
[0106]綜上所述，推測C310-6-2在給藥劑量為240mg/kg、服藥劑量為10天時，其對小鼠Lewis肺癌模型具有較好的療效，但服藥機體可能會出現體重下降現象，但其引起的不良反應強度要小於環磷醯胺。
[0107]實施例5:C310-6-2抗小鼠H22腫瘤實驗
[0108]主要材料與試劑:
[0109]H22肝癌瘤株(第4代)購自購自中國典型培養物保藏中心(武漢大學保藏中心)；環磷醯胺片購自天津金世製藥有限公司；KM小鼠(18~22g)(動物許可證號:SCXK (京)2012-0001，合格證號:11400700020779)購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心；吐溫80由北京博潤萊特科技有限公司分裝。
[0110]本實施例擬在採用H22荷瘤小鼠模型考察C310-6-2抗肝癌腫瘤作用。具體如下:
[0111]1、小鼠H22肝癌荷瘤模型建立
[0112]取接種腫瘤8-13天狀態良好的荷瘤小鼠脫白處死，體表酒精消毒，在無菌(超淨臺)環境下剝離小鼠腫瘤至盛有生理鹽水的無菌平皿，剪至小塊，將小塊腫瘤放入組織勻漿器，按體積比1:3左右加入生理鹽水勻漿，勻漿液倒入50ml無菌離心管，備用。用Iml注射器在KM小鼠右腋下注射接種0.2ml，腫瘤細胞混懸液的製備均在無菌條件下(超淨工作檯中)完成。從取出腫瘤至腫瘤接種完畢在60分鐘內完成。
[0113]2、藥物製備方法
[0114]C310-6-2灌胃劑:稱取一定重量的C310-6-2樣品至研缽中，加入所需溶劑體積2%吐溫-80，充分研磨後再加入所需體積的生理鹽水，混勻，備用。
[0115]環磷醯胺灌胃劑:去掉環磷醯胺片的薄膜衣後進行稱取，稱取一定重量至研缽中，加入所需體積的生理鹽水，充分研磨、混勻，，備用。
[0116]3、分組及給藥方法
[0117]將60隻試驗小鼠共分為6組，每組10隻，雌雄各半，分為①C310-6-2低劑量(27mg/kg)組、② C310-6-2 中劑量(80mg/kg)組、③ C310-6-2 高劑量(240mg/kg)組、④環磷醯胺組、⑤模型組、⑥空白組，以上各組除模型組及空白組外在注射腫瘤混懸液後，均每日給藥一次，每次每隻0.3ml，連續給藥10天；模型組與空白組每日灌胃等體積2%吐溫80水溶液，連續10天。
[0118]4、觀察指標
[0119]4.1大體狀態
[0120]每日對小鼠進行體重、飲食量的稱定並記錄，於最後一次計算小鼠除瘤後的體重淨重。
[0121]4.2瘤重及腫瘤抑制率
[0122]每日對小鼠右腋下進行觀察，於最後一次給藥24h後，解剖並取出腫瘤組織，稱取腫瘤重量，按下述公式計算腫瘤生長抑制率。
[0123]
【權利要求】
1.一種蛹蟲草抗腫瘤活性組分的提取方法，其特徵在於包括以下步驟: (1)超低溫粉碎: 取烘乾的蛹蟲草子實體為原料，放入超微粉碎機中進行超微粉碎，同時粉碎全過程用2~10°C的水作為超微破碎機內部冷卻液，超微粉碎時間為5-20min，得到超微粉； (2)溶劑提取: 水煮:在超微粉中加入超純水，超純水的加入量為超微粉質量的8~10倍，100°C加熱3~10小時進行提取，離心取沉澱，然後重複I~3次，將得到的沉澱合併，乾燥，得到粗品A ； 丙酮沉澱:在粗品A中加入丙酮，丙酮的加入量為粗品A質量的2~4倍，室溫下浸提12~36小時，離心後取沉澱，然後重複I~3次，將得到的沉澱合併，乾燥，得到粗品B ； (3)色譜分離: 取粗品B用50%乙酸乙酯-正己烷溶液溶解至濃度為50mg/ml，然後通過製備液相色譜進行分離，洗脫方式為100%正己烷等度洗脫10min，25%乙酸乙酯-正己烷溶液等度洗脫25min, 100%乙酸乙酯等度洗脫15min，檢測波長為260nm，得到各組分經體外抗腫瘤活性篩選後，選取活性最強的組分旋蒸濃縮後真空乾燥，得到組分A ； 取組分A用100%乙酸乙酯50度超聲至剛好溶解至濃度為50mg/ml,然後通過製備液相色譜進行分離，洗脫方式為100%正己烷等度洗脫lOmin，10%乙酸乙酯-正己烷溶液等度洗脫50min，15%乙酸乙酯-正己烷溶液等度洗脫20min，檢測波長為260nm，得到各組分經體外抗腫瘤活性篩選後，選取活性最強的組分旋蒸濃縮後真空乾燥，得到組分B ； 取組分B用100% 二氯甲烷50度超聲至剛好溶解至濃度為50mg/ml，然後通過製備液相色譜進行分離，洗脫方式為100% 二氯甲烷等度洗脫40min，檢測波長為260nm，得到各組分經體外抗腫瘤活性篩選後，選取活性最強的組分，旋蒸濃縮後真空乾燥，即為本發明目的抗腫瘤活性組分。
2.根據權利要求1所述的蛹蟲草抗腫瘤活性組分的提取方法，其特徵在於:所述步驟(1)中粉碎時間為12min。
3.根據權利要求1所述的蛹蟲草抗腫瘤活性組分的提取方法，其特徵在於:所述步驟(2)中離心的轉速為6000rpm。
4.根據權利要求1所述的蛹蟲草抗腫瘤活性組分的提取方法，其特徵在於:所述步驟(2)中乾燥在60°C鼓風乾燥箱內進行。
5.根據權利要求1所述的蛹蟲草抗腫瘤活性組分的提取方法，其特徵在於:所述步驟(3)中製備液相色譜的填料為粒徑IOym的矽膠、大小為150X250mm。
6.根據權利要求1所述的蛹蟲草抗腫瘤活性組分的提取方法，其特徵在於:所述步驟(3)中溶解液在進行製備液相色譜之前先用0.45 μ m有機膜抽濾。
7.根據權利要求1所述的蛹蟲草抗腫瘤活性組分的提取方法，其特徵在於:所述步驟(3)中體外抗腫瘤活性篩選是指進行抑制人肺癌A549細胞生長試驗和抑制人肝癌Hep-G2細胞生長試驗。
8.權利要求1所述的蛹蟲草抗腫瘤活性組分在製備抗腫瘤藥物中的應用。
【文檔編號】A61K36/068GK103751225SQ201410041855
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月27日 優先權日:2014年1月27日
【發明者】張耀洲, 陳玉嬌, 崔今松, 舒特俊, 陳劍清 申請人:正源堂（天津）生物科技有限公司