能夠產生嘌呤物質的細菌和用於產生嘌呤物質的方法

2023-12-09 07:21:01

專利名稱：能夠產生嘌呤物質的細菌和用於產生嘌呤物質的方法
技術領域：
本發明涉及用於產生。票呤衍生物質的方法，所述噤呤衍生物質如噪呤核
苷酸(其通常包括5'-肌苷酸和5'-鳥苷酸)和嘌呤核苷(如M^苷和鳥苷)，它們作 為合成嘌呤核苷酸的起始材料是重要的物質，等等，以及用於所述方法的屬 於芽孢桿菌屬的細菌。噤呤衍生物質用作調味品(seasoning)、藥物(drug)、它
們的原料等。
背景技術：
已知通過發酵來產生肌苷和鳥苷的方法，其使用芽孢桿菌屬CSa"7/us)細 菌的腺噪呤營養缺陷型菌抹和其進一步被賦予對多種藥物(如噪呤類似物)的 抗性的衍生株(derivative)(專利文件1至8)，和短桿菌屬(genus BreWk/c&n'wm) 這樣的微生物(專利文件9和10、非專利文件l),等。
通常通過如下獲得這樣的突變菌抹用紫外照射或亞硝基胍(N-曱基-N'-硝基-N-亞硝基胍)處理微生物，和使用合適的選擇培養基選擇目標突變體。
此外，還使用遺傳工程技術在芽孢桿菌屬細菌(專利文件11至20)、短杆 菌屬細菌(專利文件21)和埃希氏菌屬(五"/zen'c/2^)細菌(專利文件22)中培育產 生。票呤衍生物質的菌抹。具體地，例如，公開了用芽孢桿菌屬細菌有效地產 生核酸衍生化合物如次黃嘌呤(hypoxanthine)、尿嘧咬(uracil)、鳥噪呤(guanine) 和腺噪呤(adenine)的方法，所述細菌中將編碼嘌呤操縱子阻抑物的基因 破壞(專利文件23)。
在枯草芽孢桿菌(萬ac/〃w ^to'to)中，已知如上所述的噪呤操縱子阻抑物 調節，除嘌呤操縱子(purineoperon)的基因之外，/wM基因，其涉及AMP生 物合成(非專利文件2); g/j^4基因，其涉及曱醯四氫葉酸(formyltetrahydrofolic acid)生物合成(非專利文件3); p6wG基因，其編碼次黃嘌呤/鳥。票呤的轉運物 (transporter)(非專利文件4);等。
此外，已公開了有效產生肌香的微生物和使用該微生物產生肌苷的方法， 所述微生物是通過除破壞pMW基因之外破壞琥珀醯-AMP合酶基因(/ MM)來賦予腺。票呤營養缺陷型，和通過破壞嘌呤核苷磷酸化酶基因(cfeoD)來抑制肌
苷分解成次黃嘌呤，從而衍生的(專利文件8)。
果糖二磷酸酶是糖異生酶(gluconeogenic enzyme)中的一種，其催化從果 糖-1,6-二磷酸產生果糖-6-磷酸的反應。關於此酶和嘌呤衍生物質的生物合成 途徑之間的關係只知曉很少，且已嘗試通過降低此酶的活性來培育產生嘌呤 衍生物質的細菌。
專利文件1:特公昭(KOKOKU) No. 38-23099
專利文件2:特公昭No. 54-17033
專利文件3:特公昭No. 55-2956
專利文件4:特公昭No. 55-45199
專利文件5:特公昭No. 57-14160
專利文件6:特公昭No. 57-41915
專利文件7:特開昭(KOKAI) No. 59-42895
專利文件8:特開No. 2004-242610
專利文件9:特公昭No. 51-5075
專利文件10:特公昭No. 58-17592
專利文件11:特開昭No. 58-158197
專利文件12:特開昭No. 58-175493
專利文件13:特開昭No. 59-28470
專利文件14:特開昭No. 60-156388
專利文件15:特開平No. 1-27477
專利文件16:特開平No. 1-174385
專利文件17:特開平No. 3-58787
專利文件18:特開平No. 3-164185
專利文件19:特開平No. 5-84067
專利文件20:特開平No. 5-192164
專利文件21:特開昭No. 63-248394
專利文件22:國際專利公開WO99/03988
專利文件23:美國專利No. 6,284,495
非專利文件1: Agric. Biol. Chem" 1978， 42, 399-405非專利文件2: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92， 7455-7459 非專利文件3: J. Bacteriol.， 2001, 183, 6175-6183 非專利文件4: J. Bacteriol.， 2003， 185， 5200-5209

發明內容
待通過本發明實現的目的
本發明的目的是構建適用於發酵產生噤呤衍生物質(如噪呤核苷和/或嘌 呤核普酸)的芽孢桿菌屬細菌，和提供使用這樣的細菌產生噤呤衍生物質的方
實現所述目的的手段
本發明的發明人進行了多項研究以實現上述目的。結果，他們發現如果 在芽孢桿菌屬細菌中減少糖異生途徑的果糖二磷酸酶的酶活性，則該細菌產 生噪呤核苷或噪呤核苷酸的能力得到改進，並完成了本發明。
由此本發明提供如下。
(1) 屬於芽孢桿菌屬的細菌，其具有產生嘌呤衍生物質的能力，其中所述 細菌已被修飾使得果糖二磷酸酶的酶活性減少。
(2) 如上所述的屬於芽孢桿菌屬的細菌，其中所述嘌呤衍生物質是選自下 組的一種或多種噤呤核苷肌苷、黃苷、鳥苦和腺苷。
(3) 如上所述的屬於芽孢桿菌屬的細菌，其中所述嘌呤衍生物質是選自下 組的一種或多種噪呤核苷酸肌苷酸、黃苷酸、烏芬酸和腺苷酸。
(4) 如上所述的屬於芽孢桿菌屬的細菌，其中通過破壞編碼果糖二磷酸酶 的基因或減少編碼果糖二磷酸酶的基因的表達量來減少所述果糖二磷酸酶活性。
(5) 如上所述的屬於芽孢桿菌屬的細菌，其中編碼果糖二磷酸酶的基因是 編碼下列(A)或(B)的蛋白質的基因
(A) 包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的蛋白質，
(B) 包含SEQIDNO: 1的胺基酸序列的蛋白質，其包括一個或幾個氨基 酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒位並具有果糖二磷酸酶活性。
(6) 如上所述的屬於芽孢桿菌屬的細菌，其已被進一步修飾使得磷酸核糖 焦石粦酸合成酶活性增加。(7) 如上所述的屬於芽孢桿菌屬的細菌，其已被進一步修飾使得噤呤操縱 子的表達量增加。
(8) 如上所述的屬於芽孢桿菌屬的細菌，其中通過破壞/ z^ 基因來增加
噤呤操縱子的表達量，所述基因是編碼。票呤操縱子的阻抑物的基因。
(9) 如上所述的屬於芽孢桿菌屬的細菌，其已被進一步修飾使得嘌呤核苷 磷酸化酶活性減少。
(10) 如上所述的屬於芽孢桿菌屬的細菌，其已被進一步修飾使得IMP脫 氫酶活性減少。
(11) 如上所述的屬於芽孢桿菌屬的細菌，其為枯草芽孢桿菌。
(12) 產生嘌呤衍生物質的方法，其包括在培養基中培養如上所述的屬於 芽孢桿菌屬的細菌以在細菌的細胞或培養基中引起嘌呤衍生物質的積累，和 從所述細胞或培養基中收集所述。票呤衍生物質。
(13) 如上所述的方法，其中所述噤呤衍生物質是嘌呤核苷或噪呤核苷酸。
(14) 如上所述的方法，其中所述。票呤^i汙生物質是選自下組的一種或多種 噤呤核苷肌苷、黃苦、鳥苷和腺苷。
(15) 如上所述的方法，其中所述噤呤衍生物質是選自下組的一種或多種 嘌呤核苷酸肌苷酸、黃苷酸、鳥苷酸和腺苷酸。
(16) 產生噪呤核芬酸的方法，其包括通過如上所述的方法產生嘌呤核苷， 將所述嘌呤核苷與磷酸鹽供體，及樣麼生物或酸性磷酸酶進行反應以產生嘌呤 核苷酸，所述磷酸鹽供體是選自下組的一種或多種聚磷酸(polyphosphoric acid)、磷酸苯酯(phenylphosphate)和氨曱醯石舞酸(carbamyl phosphate),所述《效 生物具有產生核苷-5'-磷酸酯的能力，和收集所述嘌呤核苷酸。
實施本發明的最佳方式 本發明的芽孢桿菌屬細菌 (I)賦予產生。票呤衍生物質的能力
在本發明中，短語"活性減少，，包括所述活性低於在未修飾的菌抹如野 生型芽孢桿菌屬細菌中的活性的狀態，和所述活性基本上消除的狀態。
本發明的芽孢桿菌屬細菌是具有產生嘌呤衍生物質的能力且已被修飾使 得果糖二磷酸酶的酶活性減少的芽孢桿菌屬細菌。
術語"噪呤衍生物質"(purine-derived substance)指具有嘌呤骨架(purineskeleton)的物質，且其實例包括噤呤核芬、噤呤核芬酸，等。噤呤核苷包括肌 苷、黃苷、鳥苷、腺苷等，而嘌呤核苷酸包括嘌呤核苷的5'-磷酸酯，例如， 肌芬酸(肌魯-5'-磷酸，此後也稱為"IMP")、黃苷酸(黃香-5'-磷酸，此後也稱為 "XMP")、鳥苷酸(鳥香-5'-單磷酸，此後也稱為"GMP")、腺苷酸(腺苷-5'-單磷 酸，此後也稱為"AMP"),等。
短語"產生。票呤衍生物質的能力"指本發明的芽孢桿菌屬細菌在培養基中 培養時，所述細菌在細菌細胞或培養基中產生、分泌。票呤衍生物質或引起噪 呤衍生物質積累，其程度使得可從細胞或培養基中收集所述嘌呤衍生物質的 能力。本發明的芽孢桿菌屬細菌可具有產生兩種或更多種前述嘌呤衍生物質 的能力。
具有產生嘌呤衍生物質的能力的芽孢桿菌屬細菌可為內在具有產生噤呤 衍生物質的能力的細菌，或通過如下方法可得到的細菌使用誘變或重組 DNA技術修飾如下所述的芽孢桿菌屬細菌使得它們具有產生嘌呤衍生物質 的能力。而且，它可為賦予了產生嘌呤衍生物質的能力的芽孢桿菌屬細菌或 以如稍後描述的方式通過修飾所述細菌使得果糖二磷酸酶的酶活性減少來增 強其產生噤呤衍生物質的能力的細菌。
在本發明中，短語"酶活性減少"包括上述果糖二磷酸酶或稍後描述的 分解噤呤衍生物質的酶(如肌苷單磷酸(IMP)脫氫酶)等的酶活性低於在未修飾 的菌抹，例如芽孢桿菌屬細菌的野生型菌抹中的酶活性的狀態，和所述活性 基本上消除的狀態。這也適用於稍後描述的嘌呤操縱子阻抑物的活性。
用於獲得本發明的芽孢桿菌屬細菌的芽孢桿菌屬細菌的實例包括枯草芽 孑包桿菌、解澱粉芽孢桿菌(5acz'〃w aw^/o/z々Me/ac&ra)、短小芽孢桿菌CBac/〃ws jo謂z7—等。
枯草芽孢桿菌的實例包括枯草芽孢桿菌168 Marburg (ATCC 6051)、枯草 芽孢桿菌PY79 (Plasmid， 1984, 12, l-9)等，而解澱粉芽孢桿菌的實例包括解澱 粉芽孢桿菌T(ATCC23842)、解澱粉芽孢桿菌N (ATCC 23845)等。短小芽孢 桿菌的實例包括短小芽孢桿菌Gottheil No. 3218 (ATCC No. 21005,美國專利 No. 3,616,206)，等。這些菌抹可由美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)(地址P.O. Box 1549， Manassas, VA 20108, United States of America)獲得。
可通過如下獲得具有產生嘌呤衍生物質的能力的芽孢桿菌屬細菌將例如，嘌呤核苷營養缺陷型或對藥物(如噪呤類似物)的抗性賦予如上所述的芽孢
桿菌屬細菌(特公昭Nos. 38-23099, 54-17033, 55-45199, 57-14160， 57-41915和 59-42895)。可通過如下獲得具有營養缺陷型或藥物抗性的芽孢桿菌屬細菌 以用於常規誘變的誘變劑(mutagen),如N-曱基-N'-硝基-N-亞硝基胍(NTG)或 EMS (曱磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate))處理細菌。 產生噤呤核苷的芽孢桿菌屬細菌的實例包括如下。
作為屬於芽孢桿菌屬的產生肌苷的菌抹的具體實例，可使用枯草芽孢杆 菌KMBS16菌抹。該菌林源自已知的枯草芽孢桿菌trpC2菌抹(168 Marburg)， 其中破壞了編碼嘌呤操縱子阻抑物的jwW基因(purR::spc)、編碼琥珀醯-AMP 合酶的pi/n4基因(purA::erm)、和編碼噪呤核普磷酸化酶的^feoD基因 (deoD::kan)(特開昭No. 2004-242610， US2004166575A1)。還可使用枯草芽孢 桿菌AJ3772菌抹(FERM P-2555,特開昭No. 62-014794)等。
具有產生鳥苷的能力的芽孢桿菌屬細菌的實例包括具有增加的IMP脫氫 酶活性的芽孢桿菌屬細菌(特開昭No. 3-58787)、通過將包含如下基因的載體 導入腺噪呤營養缺陷的突變體而獲得的芽孢桿菌屬細菌，所述基因賦予對嘌 呤類似物或德誇菌素(decoyinine)的抗性(特公昭No. 4-28357),等。
產生嘌呤核苷酸的芽孢桿菌屬細菌的實例包括如下。
作為產生肌苷酸的芽孢桿菌屬細菌，已報導了枯草芽孢桿菌的產生肌苷 的菌抹，其具有減弱的磷酸酶活性(Uchida， K.等，Agr. Biol. Chem., 1961， 25, 804-805; Fujimoto, M., Uchida， K.， Agr. Biol. Chem., 1965, 29, 249-259)。產生鳥 苷酸的芽孢桿菌屬細菌的實例包括芽孢桿菌屬細菌的如下突變體，其具有腺 嘌呤營養缺陷型、對德誇菌素或蛋氨酸亞碸(methiomne sulfoxide)的抗性和產 生5'-鳥苷酸(烏苷-5'-單磷酸，此後稱為"GMP")的能力(特公昭No. 56-12438)。
此外，可通過用於培育棒狀桿菌型細菌(通常包括產氨棒桿菌 (C。o^"e6acferz'ww amwo"/age"as))的方法構建產生黃普酸的糹田菌。例如,可通 過獲得PRPP醯胺轉移酶增強的菌抹(特開昭No. 8-168383)、脂肪族胺基酸抗 性菌抹(特開昭No. 4-262790)或脫氫脯氨酸(dehydroproline)抗性菌林(韓國專 利Unexamined Publication No. 2003-56490)來構建產生黃苷酸的細菌。
而且，用於培育具有產生嘌呤衍生物質的能力的芽孢桿菌屬細菌的方法 實例還包括增強涉及噪呤生物合成的酶的活性，所述酶是在細菌細胞中嘌呤 核苷和。票呤核苷酸的生物合成所共有的，即，嘌呤生物合成酶。細胞中所述酶的活性優選增加至大於芽孢桿菌屬細菌的未修飾菌抹(例如，野生型芽孢杆 菌屬細菌)的酶活性的水平。短語"活性增加"包括，例如，每個細胞的酶分子 的數目增加的情況，和每個酶分子的比活性增加的情況，等。例如，可通過 增加酶的基因的表達量來增加活性。
涉及。票呤生物合成的酶的實例包括，例如，磷酸核糖基焦磷酸醯胺轉移
酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRPP合成酶[EC: 2.7.6.1])，等。
通過糖源(如流入戊糖磷酸途徑的葡萄糖)的代謝產生的一些代謝物經由 核酮糖-5-磷酸(ribulose-5-phosphate)轉變為核糖-5-磷酸。由生物合成的核糖-5-磷酸，產生PRPP，其是用於嘌呤核苷、組氨酸和色氨酸生物合成不可缺少的 前體。具體地，核糖-5-磷酸通過磷酸核糖焦磷酸合成酶轉變為PRPP。因此， 可通過修飾以使其PRPP合成酶的活性增加將產生噪呤衍生物質的能力賦予 芽孢桿菌屬細菌。
短語"磷酸核糖焦磷酸合成酶的活性增加"指磷酸核糖焦磷酸合成酶的活 性與未修飾的菌抹如野生型菌抹或親本菌抹的活性相比增加。可通過例如， Switzer等(Methods Enzymol., 1978， 51， 3誦11)或Roth等(Methods Enzymol., 1978, 51， 12-17)的方法測量磷酸核糖焦磷酸合成酶的活性。可通過如下方法來 產生磷酸核糖焦磷酸合成酶的活性增加的芽孢桿菌屬細菌，例如，根據使用 含有基因的質粒或將基因整合入染色體的方法在芽孢桿菌屬細菌中增加編碼 磷酸核糖焦磷酸合成酶的基因的表達，其可以以與在特開昭No. 2004-242610 所述方法相同的方式進行。儘管源自芽孢桿菌屬細菌的SEQ ID NO: 3的pra 基因(Genbank登錄號X16518)可作為可用於本發明的編碼磷酸核糖焦磷酸合 成酶的基因提及，但可以使用源自其它細菌、動物或植物的編碼具有磷酸核 糖焦磷S吏合成酶活性的蛋白質的任何基因。
此外，當用於噪呤核苷、組氨酸和色氨酸生物合成所不可缺少的前體 PRPP —旦產生時，其中一些通過涉及嘌呤生物合成的酶轉變為嘌呤核苷酸和 噤呤核苦。編碼這些酶的基因的實例包括來自枯草芽孢桿菌的嘌呤操縱子的 基因，具體地，purEKB-purC(orf) QLF-purMNH(J)-purD操縱子的基因(Ebbole D丄和Zalkin H.， J. Biol. Chem.， 1987， 262， 17, 8274-87)(目前,也稱為 purEKBCSQLFMNHD， Bac/〃ws w6"to and Its Closest Relatives,主編A.L. Sonenshein, ASM Press, Washington D.C., 2002, Genbank登錄號NC—000964), 和來自大腸桿菌(EscAen'c/z/a co//)的pur調節子的基因C&c/zen'c/n'o andSa/mo"e〃fl，第二版，主編F.C Neidhardt， ASM Press, Washington D.C., 1996)。 因此，增強這些基因的表達賦予或增強產生噤呤衍生物質的能力。此外，
可用於本發明的嘌呤操縱子的基因不限於這些，並且還可使用源自其它微生
物、動物和植物的基因。
用於增加噤呤操縱子的表達量的方法的實例包括通過使用含有基因的質
粒或將基因整合入染色體等的方法在芽孢桿菌屬細菌中增加。票呤操縱子的基
因的表達。
用於增加嘌呤操縱子的表達量的第二種方法包括用更強的啟動子代替嘌 呤操縱子的啟動子，和用共有序列代替天然啟動子的-35或-10區。
例如，在枯草芽孢桿菌(枯草芽孢桿菌168 Marburg菌抹,ATCC6051)中， 。票呤操縱子的-35序列是共有序歹^(TTGACA)，但-10序列是TAAGAT，其不 同於共有序列TATAAT (Ebbole, D丄和H. Zalikn, J. Biol. Chem.， 1987， 262, 8274-8287)。因此，通過將-10序歹'j(TAAGAT)改變為類似的共有序列TATAAT、 TATGAT或TAAAAT，可增加噤呤操縱子的轉錄活性。可通過下述與基因取 代的方法相同的方法代替啟動子序列。
用於增加噤呤搡縱子的表達量的第三種方法包括降低噤呤操縱子阻抑物 的表達量(美國專利No. 6,284,495)。短語"嘌呤操縱子阻抑物的表達"包括嘌呤 操縱子基因的轉錄和轉錄產物的翻譯二者。此外，"表達量減少"包括表達量 低於未修飾的菌抹如野生型芽孢桿菌屬細菌中的表達量的情況，和表達已基 本上消除的情況。
可通過如下方法來減少噪呤操縱子阻抑物(噪呤阻抑物)的表達量例如， 可採用以紫外線照射或用於常規誘變處理的誘變劑如NTG或EMS處理芽孢 桿菌屬細菌並選擇顯示噪呤阻抑物的表達量減少的突變體。
此外，顯示噪呤阻抑物的表達量減少的芽孢桿菌屬細菌也可通過如下方 法獲得例如，除誘變處理之外，通過使用基因重組技術的同源重組用相應 的不正常發揮功能的基因(此後，也稱為"破壞型基因，，)代替在染色體上編碼嘌 呤阻抑物的基因(pwi , GenBank登錄號NC一000964,編碼區對應於核苷酸號 54439至55293, SEQ ID NO: 5) (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1972); Matsuyama, S.和Mizushima, S,， J. Bacteriol., 1985, 162, 1196-1202)。
例如，可用破壞型基因以如下所述的方式代替宿主染色體上的正常基因。在下文中，解釋了 ； wri 基因的破壞。可類似地破壞其它基因，如；wM、 c/eoD、 評薛*基因。
將具有與染色體上的序列同源的序列且不能在芽孢桿菌屬細菌的細胞中 複製的質粒等導入細胞中時，導致在具有同源性的序列的位點以一定頻率的 重組。然後將整個質粒重組入染色體中。其後，如果重組又在染色體上具有 同源性的序列的位點發生，則將質粒從染色體中去除。此時，依賴於重組發 生的位點，可將破壞型基因保留在染色體上，且可將原始的正常基因與質粒 一起從染色體去除。通過選擇這樣的菌抹，可能獲得其染色體上正常的pw^ 基因已被破壞型pwW基因代替的菌抹。
已經建立了這樣的基於同源重組的基因破壞技術，且其包括使用線性 DNA的方法、使用溫度敏感型質粒的方法等。此外，還可通過使用如下質粒 來破壞/ wW基因，所述質粒含有其中已插入標記基因(如藥物抗性基因)的 /^M基因且其不能在目標細菌細胞中複製。即，在已用如上所述的質粒轉化 的轉化體中，將標記基因併入染色體DNA並賦予藥物抗性。由於通過將質粒 上把標記基因夾在中間的pwW基因序列與染色體上的pwri 基因進行同源重 組將標記基因以高比率(high rate)併入染色體，因此可有效地選擇pz^ 基因破 壞的菌抹。
可通過如下獲得用於基因破壞的破壞型pw^基因具體地，通過用限制 酶消化和再連接(re-ligation)來缺失基因的某個區域，將另一個DNA片 段(標記基因等)插入/ wri 基因中，或在pwW基因的編碼區、啟動子區等的核 苷酸序列中引起一個或多個核苷酸的取代、缺失、插入、添加或倒位，其通 過4立點特異性i秀變(Kramer， W.和Frits, H丄，Methods in Enzymology, 1987, 154, 350-367)或通過重組PCR (PCR Technology, Stockton Press (1989))或通過用化 學試劑(如硫代硫酸鈉(sodium hyposulfite)或羥胺(hydroxylamine))處理(Shortle: D.和Nathans, D., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1978, 75, 2170國2174)來進行，然 後是選擇其中由戶W基因編碼的阻抑物的活性減少或基因的轉錄減少的菌 抹。在這些方法中，考慮到可靠性和穩定性，通過用限制酶消化和再連接來 缺失pwi 基因的某個區域或另一個DNA片段插入jwW 基因中是優選的。
列。然而，如果該區域佔/ wi 基因全長的90%以上，更優選95%以上，特別 是97%以上，則阻抑物活性降低的確定性增加。此外，當； zW 基因的編碼區中核普酸的缺失或插入引起移碼突變時，考慮到確定地降低阻抑物活性，優 選的是引起核苷酸在多個位點的缺失或插入和引起核香酸在3，端側上的缺失 或插入。
也可通過如下得到噤呤阻抑物活性的降低除前述的基因破壞之外，基 於常規的誘變方法將降低胞內噤呤阻抑物活性的突變導入染色體上的 基因。例如，可通過導入胺基酸取代(錯義突變)、終止密碼子(無義突變)或添 加或缺失一個或兩個核苷酸的移碼突變，或通過部分地或全部地缺失基因來 得到。此外，也可通過將轉座子插入染色體上的pw/^基因來減少阻抑物的活 性。
還可通過如下得到噤呤阻抑物活性的降低用較弱的表達控制序列代替 pwi 基因的表達控制序列，如染色體DNA上的啟動子。通過RNA合成的起 始作用(initiation act)的頻率來定義啟動子的強度。Goldstein等的文章 (Prokaryotic promoters in biotechnology, Biotechnol. Annu. Rev" 1995， 1, 105-128)等中描述了用於評價啟動子強度的方法及強啟動子的實例。此外，還
待弱化的(tobeweakened)啟動子，如國際專利公開WOOO/18935中所披露的。 此外，已知核糖體結合位點(RBS)和起始密碼子之間的間隔區(spacer)，尤其 是起始密碼子緊鄰上遊的序列中幾個核苷酸的取代極大地影響了 mRNA的翻 譯效率。可將RBS的此修飾與減少目標基因的轉錄進行組合。
此外，可製備重組DNA並將其轉化入宿主芽孢桿菌屬細菌，在所述重組 DNA中導入使由； zW 基因轉錄的信使RNA不穩定的突變。
也可以與上述相同的方式減少由稍後描述的pwM、 &oD、 和yz，p基 因編碼的酶的活性。
可使用基於/7Wi 基因的已知核苷^列製備的寡核苷酸作為引物通過 PCR由具有噪呤操縱子的微生物的染色體DNA獲得基因。還可使用基 於戶W基因的已知核香酸序列製備的寡核芬酸作為探針通過雜交由具有嘌 呤操縱子的微生物的染色體DNA文庫獲得基因。已報導了枯草芽孢杆 菌168 Marburg菌抹的pwW 基因的核苷酸序列(GenBank登錄號D26185 (編碼 區對應於核苷酸號118041至118898)，或NC—000964 (編碼區對應於核苷酸 號54439至55296))。pw^基因的核苷i^列和由該基因編碼的胺基酸序列示 於序列表的SEQ IDNOS: 5和6 (特開昭No. 2004-242610)。用於獲得/7Wi 基因的用於PCR的引物可為能夠擴增基因的部分或
全長的任何引物，而具體實例包括具有示於SEQ ID NO: 15 (GAAGTTGATGATCAAAA)和SEQ ID NO: 16 (ACATATTGTTGACGATAAT) 的核香酸序列的寡核苷酸。
上述標記基因的實例包括藥物抗性基因，如大觀黴素(spectinomycin)抗性 基因和卡那黴素抗性基因。可通過由大腸桿菌ECEIOI菌抹(從芽孢桿菌屬遺 傳原種中心(萬acz'〃w Genetic Stock Center) (BGSC)商業上可得到的)製備質粒 pDG1726並從質粒中作為盒(as a cassette)去除抗性基因來獲得糞腸球菌 C&7teracoccw /^c"/Z力的大觀黴素抗性基因。可通過由大腸桿菌ECE91菌抹 (從芽孢桿菌屬遺傳原種中心(BGSC)商業上可得到的)製備質粒pDG646並從 質粒中作為盒去除抗性基因來獲得金黃色葡萄球菌OStop/^/ococcw aWMM"的 紅黴素抗性基因。可通過由大腸桿菌ECE94菌株(從芽孢桿菌屬遺傳原種中 心(BGSC)商業上可得到的)製備質粒pDG783並從質粒中作為盒去除抗性基 因來獲得源自糞鏈球菌(5^ptococcm/aeca/^)的卡那黴素抗性基因。此外，可 通過由枯草芽孢桿菌1E17菌抹(從芽孢桿菌屬遺傳原種中心(BGSC)商業上可 得到的)製備質粒pC194並使用該質粒作為模板進行PCR以擴增該質粒來獲 得金黃色葡萄球菌的氯黴素抗性基因。
將藥物抗性基因用作標記基因時，可通過如下來獲得基因破壞的菌 林將藥物抗性基因在適當的位點插入質粒中的/w;^基因，用得到的質粒轉 化微生物和選擇變成藥物抗性的轉化體。可通過使用Southern印跡或PCR分 析染色體上的標記基因或戶W基因來確認染色體上的，W基因的破壞。可 使用能夠擴增這些基因的引物通過PCR來確認將前述的大觀黴素抗性基因、 紅黴素抗性基因或卡那黴素抗性基因併入染色體DNA。
還已知通過^[立於啟動子下遊的終止子畫抗終止子(terminator-antiterminator) 序列(此後稱為弱化子(attenuator)序列)調節噪呤操縱子的表達(Ebbole, D丄和 Zalkin, H., J. Biol. Chem., 1987， 262, 8274-8287; Ebbole D丄和Zalkin H., J. Biol. Chem.， 1988, 263, 10894-10902; Ebbole, D丄和Zalkin, H.， J. Bacteriol., 1989, 171, 2136-2141)。因此，可通過將弱化子序列缺失來增加。票呤操縱子的表達量。 可通過與用於破壞戶W的方法相同的方法得到弱化子序列的缺失。
為了進一步增加噪呤操縱子的轉錄，可將上述方法進行組合。例如，可 將pw^基因破壞，並進一步，可使用質粒擴增其中弱化子序列缺失的噪呤操縱子或可將這樣的噤呤操縱子的多個拷貝導入染色體。
也可通過如下方法來增強涉及嘌呤生物合成的酶的活性使涉及噤呤生
物合成的酶對其調節脫敏，例如，根據使酶對反饋抑制脫敏的前述方法
(WO99/03988)進行。
此外，還可通過減弱細胞對嘌呤衍生物質的攝取來增強產生噤呤衍生物 質的能力。例如，可通過將涉及細胞對噪呤核苷的攝取的反應阻斷來減弱細 胞對噤呤核苦的攝取。涉及細胞對噪呤核苷的攝取的反應的實例包括通過核 苦通透酶(nucleoside permease)4崔4b的反應。
此外，當產生嘌呤核苷時，可減少分解嘌呤核苷的酶的活性以增強產生 嘌呤核普的能力。這樣的酶的實例包括噤呤核苷磷酸化酶。
將通過涉及噪呤生物合成的酶由PRPP生物合成的噪呤核苦酸脫磷酸化 (dephosphorylate)並由此轉變為。票呤核苷。為了有效地引起嘌呤核苷的積累， 優選降低噤呤核香磷酸化酶的活性，所述酶進一步將噤呤核苷降解為次黃。票 呤等。即，優選減弱或消除利用嘌呤核苷(如肌苷)作為底物的嘌呤核苷磷酸化 酶的活性。
具體地，可通過在芽孢桿菌屬細菌中破壞編碼。票呤核苷磷酸化酶的t/eoD 和pw; ( 基因來減少嘌呤核苷磷酸化酶活性。可通過破壞和/7W戶G基因 中的一種或兩者來修飾本發明的芽孢桿菌屬細菌。作為^oD和pwpG基因， 例如，可使用源自芽孢桿菌屬細菌的那些基因(yeoZ): Genbank登錄號 NC—000964 (SEQ ID NO: 7), / w/ G: Genbank登錄號NC—000964 (SEQ ID NO: 9)),並且可以以與用於前述破壞wi 基因相同的方式獲得基因破壞的菌抹。
也可通過減少琥珀醯-AMP合酶的活性來增強產生噪呤衍生物質的能力。 編碼琥珀醯-AMP合酶的基因的實例包括基因。； w^基因的實例包括， 例如，具有登記為GenBank登錄號NC—000964 (編碼區對應於互補鏈的核苷 酸號4153460至4155749, SEQ ID NO: ll)的核普酸序列的那些。
也可通過減少肌苷單磷酸(IMP)脫氫酶的活性來增強產生嘌呤衍生物質 的能力。編碼IMP脫氫酶的基因的實例包括g船萬基因。g"aS基因的實例包 括，例如，具有登記為GenBank登錄號NC—000964 (編碼區對應於核普酸號 15913至17376, SEQ ID NO: 13)的核苷酸序列的那些。
而且，作為增強產生嘌呤衍生物質的能力的方法，可預期的是擴增編碼 如下蛋白質的基因，所述蛋白質具有分泌嘌呤衍生物質的活性。其中這樣的基因已得到擴增的細菌的實例包括，其中a"基因得到擴增的芽孢桿菌屬細
菌(特開昭No. 2003-219876)。
如上所述待破壞的/ wW 、 cfeoD、 /w; G、 pwv4和gwa萬基因和其表達待增 強的pw基因可為保守的變體，例如，編碼分別具有SEQIDNOS:6、 8、 10、 12、 14、 16和4的胺基酸序列的蛋白質的DNA，其包括一個或幾個胺基酸殘 基的取代、缺失、插入、添加或倒位，且分別具有噪呤阻抑物、嘌呤核苦磷 酸化酶、琥珀醯-AMP合酶、IMP脫氬酶或磷酸核糖焦磷酸合成酶的活性。 前述術語"幾個"所指的數目為，例如2至50,優選2至30，更優選2至 10。
如上所述的胺基酸序列的這種變化通常是保守的變化，其保持蛋白質的 活性。保守胺基酸取代的實例包括用Ser或Thr取代Ala;用Gln、 His或 Lys取代Arg;用Glu、 Gln、 Lys、 His或Asp取代Asn;用Asn、 Glu或Gin 耳又4戈Asp;用Ser或Ala取代Cys;用Asn、 Glu、 Lys、 His、 Asp或Arg取代 Gln;用Asn、 Gln、 Lys或Asp取代Glu;用Pro取代Gly;用Asn、 Lys、 Gln、 Arg或Tyr取代His;用Leu、 Met、 Val或Phe取代lie;用Ile、 Met、 Val或 Phe取代Leu;用Asn、 Glu、 Gln、 His或Arg取代Lys;用Ile、 Leu、 Val或 Phe取代Met;用Trp、 Tyr、 Met、 Ile或Leu取代Phe;用Thr或Ala取代Ser; 用Ser或Ala取代Thr;用Phe或Tyr取代Tip;用His、 Phe或Tip取代Tyr; 和用Met、 Ile或Leu取代Val。
上述pwi 、 fifeoD、 jto; G、屍wM、 和/Zj/ 基因和pns基因的保守變體
的具體實例包括分別與具有SEQIDNOS: 5、 7、 9、 11、 13、 15和3的核苷 酸序列的DNA顯示例如，70%以上，優選80%以上，更優選90%以上，特別 優選95%以上的同源性的DNA。更具體地，保守變體的實例包括在嚴格條件 下能夠與具有與SEQ ID NOS: 5、 7、 9、 11、 13、 15和3的核芬酸序列互補 的核香酸序列的DNA雜交的DNA。嚴格條件的實例包括在60°C和lxSSC、 0.1%SDS,優選0.1xSSC、 0.1%SDS的鹽濃度洗滌一次或多次，優選兩次或 三次的條件。
可通過BLAST檢索、FASTA檢索、CrustalW的計算方法等評價DNA的
同源性。
BLAST (基本局部比對檢索工具(basic local alignment search tool))是程序 blastp、 blastn、 blastx、 megablast、 tblastn和tblastx所使用的探索式的檢索算法(heuristic search algorithm),而且在使用Karlin、 Samuel和Stephen F. Altschul 的糹克"i十方法("Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-68; "Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993， 90:5873畫7)的基礎上 通過這些程序獲得的結果被認為是顯著的。W.R. Pearson描述了 FASTA檢索 方法("Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology， 1990 183:63-98)。 Thompson J.D.、 Higgins D.G.和 Gibson T丄描述了 Clustal W方法("CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice", Nucleic Acids Res,, 1994, 22:4673-4680)。
而且，用於製備破壞型基因的DNA也可為pwi 、 cfeoD、 pwpG、 pwM或 gwa^基因的保守變體。
可以與稍後描述的用於編碼果糖二磷酸酶的基因相同的方式將目標基因 併入芽孢桿菌屬細菌的染色體DNA 。
(II)用於減少果糖二磷酸酶的酶活性的修飾
可通過如下獲得本發明的芽孢桿菌屬細菌修飾具有產生嘌呤衍生物質 的能力的菌抹(如上述的那些)使得果糖二磷酸酶的酶活性減少。對修飾的次序 沒有限制，且在修飾細菌使得其果糖二磷酸酶的酶活性減少之後，可將產生 噪呤核苷酸的能力賦予細菌。
果糖二磷酸酶是催化由果糖-l,6-二磷酸產生果糖-6-磷酸的反應的酶，且 此反應是糖異生途徑的反應中的一個。"糖異生途徑"指如下途徑其中胞內 的草醯乙酸通過由蜂醇丙酉同酸石舞酸羧;敫酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase) (EC: 4丄1.49)催化的脫羧和磷酸化轉變為磷酸烯醇丙酮酸，磷酸烯醇丙酮酸 通過糖酵解酶的逆反應轉變為果糖-l,6-二磷酸，果糖-l，6-二磷酸進一步通過 果糖二磷酸酶(EC: 3丄3.11)轉變為果糖-6-磷酸，及通過葡萄糖-6-磷酸異構酶 和葡萄糖-6-磷酸酶(EC: 3.1.3.9)從果糖-6-磷酸生物合成葡萄糖。
可通過如下方法測量果糖二磷酸酶的酶活性。例如，可通過將產生的果 糖-6-磷酸通過葡糖磷酸異構酶(phosphoglucoisomerase)和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶轉變為NADPH,並測量NADPH來測量活性。
果糖二磷酸酶的酶活性減少的這樣的修飾可通過如下得到例如，如上
面用於破壞； wri 基因所說明的，通過同源重組用不正常發揮功能的相應基因 (例如，通過將標記基因(如藥物抗性基因)插入果糖二磷酸酶基因所獲得的破 壞型基因)取代染色體上的果糖二磷酸酶基因。此外，如用於pw^基因所述， 可通過常規誘變方法將降低胞內果糖二磷酸酶的酶活性的突變導入染色體上 的果糖二磷酸酶基因。
枯草芽孢桿菌的果糖二磷酸酶的實例包括由如SEQ ID NO: 2所示的671 個胺基酸組成的蛋白質，並可將編碼該蛋白質的基因，優選具有SEQIDNO: 1的核苷酸序列的基因(/Z^基因，Genbank登錄號NC—000964的核苷酸號 4127053至4129065)用於修飾。》/ 基因位於枯草芽孢桿菌染色體上大約323°處。
編碼基本上與果糖二磷酸酶相同的蛋白質的DNA的實例包括，具體地， 編碼如下蛋白質的DNA，所述蛋白質與SEQ ID NO: 2中所示的胺基酸序列 顯示50%以上，優選70°/。以上，更優選80°/。以上，特別優選90%以上，最優 選95%以上的同源性，並具有果糖二磷酸酶的酶活性。
編碼果糖二磷酸酶的基因還可像前述基因一樣為y&p基因的保守的變體。 具體地，實例包括編碼如下蛋白質的DNA，所述蛋白質具有SEQ ID NO: 2 的胺基酸序列，包括一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒 位，並具有果糖二磷酸酶活性。實例還包括編碼如下蛋白質的DNA，所述蛋 白質與SEQIDNO: 2中所示的胺基酸序列顯示50%以上，優選70%以上，更 優選80%以上，特別優選卯％以上，最優選95%以上的同源性，並具有果糖 二磷酸酶的酶活性。更具體地，實例包括在嚴格條件下能夠與具有SEQ ID NO: 1的核苷酸序列的DNA雜交的DNA。嚴格條件包括在60°C和lxSSC、 0.1% SDS，優選60。C、 O.lxSSC、 0.1% SDS的鹽濃度洗滌一次或多次，優選兩次 或三次的條件。
如上所述，這樣的編碼基本上與果糖二磷酸酶相同的蛋白質的DNA可通 過如下獲得，例如，修飾編碼所述酶的核苷酸序列使得特定部分的胺基酸殘 基通過位點特異性誘變進行取代、缺失、插入、添加或倒位。如上所述，也 可通過常規已知的誘變處理獲得這種修飾的DNA。誘變處理的實例包括體外 處理DNA然後用羥胺i秀變處理，和處理含有DNA的樣i生物如埃希氏菌屬細菌然後用紫外照射或用於常規誘變處理的誘變劑(如N-曱基-N'-硝基-N-亞硝 基胍(NTG)或亞硝酸)誘變處理。
例如，可使用芽孢桿菌屬細菌的染色體DNA作為模板和基於目標基因的 核苷酸序列製備的寡核苷酸作為引物通過PCR方法(聚合酶鏈式反應 (polymerase chain reaction), White, T丄等,Trends Genet" 1989, 5, 185-189)獲得 目才示基因。可通過，例如Saito和Miura的方法(H. Saito禾口 K. Miura， Biochem. Biophys. Acta, 1963, 72, 619-629; Text for Bioengineering Experiments, Edited by the Society for Bioscience and Bioengineering, Japan, pp.97-98, Baifokan, 1992)等由作為DNA供體的細菌製備染色體DNA。用於PCR的引物可基於 芽孢桿菌屬細菌的已知基因序列，或基於有關在其序列已知的其它細菌的基 因中保守的區域的信息來製備。
用於將目標基因併入芽孢桿菌屬細菌的染色體DNA的載體的實例包括 具有溫度敏感型複製起點的載體，如pHV1248 (Prtit, M,A.,等，J. Bacteriol., 1990, 172， 6736-6740);用於大腸桿菌的載體，如pHSG398 (Takara Shuzo)和 pBluescript SK-(Stratagene); 等。
為了連接目的基因和攜帶在芽孢桿菌屬細菌中發揮功能的標記物的載體 以製備重組DNA,將載體用與目的基因的末端匹配的限制酶消化。通常使用 連才妻酶如T4 DNA連接酶進行連接。
為了將如上所述製備的重組DNA導入芽孢桿菌屬細菌，可使用到目前為 止已報導的任何公知的轉化方法。實例包括，例如，由處於生長期的細胞制 備感受態細胞，然後往其中導入DNA的方法(DubunauD.和Davidoff-Abelson, R., J. Mol. Biol., 1971， 56， 209-221)和將宿主細胞製成可容易吸收(take up)重組 DNA的原生質體或原生質球，然後將重組DNA導入DNA受體細胞的方法 (Chang, S.和Choen， S.N.， Molec. Gen. Genet" 1979, 168, 111-115)。
用於產生噪呤衍生物質的方法
技術領域：
本發明的芽孢桿菌屬細菌有效地產生嘌呤衍生物質。因此，通過在適當 的培養基中培養本發明的芽孢桿菌屬細菌，可在細菌的細胞或培養基中產生 並積累。票呤^"生物質，如嘌呤核苷和嘌呤核苷酸。
至於用於本發明的培養基，可使用常規培養基以常規方式進行培養，所
述培養基包含碳源、氮源和礦物鹽以及有機痕量營養物如胺基酸和維生素，根據需要。可使用合成培養基或天然培養基。可使用任何種類的碳源和氮源， 只要待培養的菌抹可以使用它們。
作為碳源，使用糖如葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖、 阿拉伯糖、木糖、海藻糖、核糖、澱粉水解物和糖蜜，和醇如甘油和甘露醇， 而且也可獨立地使用或與其它碳源組合使用有機酸如葡糖酸、乙酸、檸檬酸、 馬來酸、富馬酸和琥珀酸。
作為氮源，使用氨、銨鹽如硫酸銨、碳酸銨、氯化銨、磷酸銨和乙酸銨、 硝酸鹽、有機氮如大豆水解物，等。 ■
作為有機痕量營養物，使用胺基酸、維生素、脂肪酸、核酸、含有這些 物質的那些如蛋白腖、酪蛋白胺基酸、酵母提取物和大豆蛋白分解產物等。 當使用生長需要胺基酸等的營養缺陷型突變菌抹時，需要補充所需的營養物。
作為礦物鹽，使用磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽、鐵鹽、錳鹽等。
雖然培養條件可根據待使用的芽孢桿菌屬細菌的類型而變化，但將枯草
芽孢桿菌，例如，作為通氣培養物培養，同時將發酵溫度控制為20至50。C， 將pH控制為4至9。在培養過程中當pH下降時，用鹼如氨氣中和培養基。 在大約40小時至3天的如上所述方式的培養後，在培養基中積累嘌呤核苷。
培養完成後，可以常規的方式收集在培養基中積累的肌苷。例如，它可 通過沉澱、離子交換層析等來分離。
此外，如果用於本發明的微生物缺少編碼核苦酶或核苷酸酶的基因，則 可積累相應的核苷或核香酸。此外，如果賦予肌苷營養缺陷型，則可積累涉 及其生物合成途徑的相關物質或前體。
此外，通過將由本發明的方法製備的肌苷或鳥苷與噪呤核苷磷酸化酶或 磷酸核糖基轉移酶反應，可獲得5，-肌苷酸或5'-鳥苷酸。
而且，還可能通過使磷酸轉移酶與噤呤核苷反應將使用本發明的微生物 產生的噪呤核苷進行磷酸化以產生嘌呤核苷酸(核苷5'-磷酸酯)(特開昭No. 2000-295996)。例如，可使用如下方法使用埃希氏菌屬細菌產生嘌呤核苷酸 的方法，所述細菌中導入了編碼大腸桿菌的肌苷鳥苷激酶的基因 (WO91/08286),和使用產氨棒桿菌產生嘌呤核苷酸的方法，所述細菌中導入 了編碼乙醯微小桿菌(五x/gwo6acfen'i^ ace/^/z'cwm)的月幾芬鳥苷激酶的基因 (WO96鹿01)。
而且，還可能通過將使用本發明的微生物產生的嘌呤核苷與磷酸鹽供體，及微生物或酸性磷酸酶(EC 3丄3.2)反應來產生噤呤核苦酸(核芬5'-磷酸酯)， 所述磷酸鹽供體是選自下組的一種或多種聚磷酸、磷酸苯酯和氨曱醯磷酸， 所述微生物具有產生核苷5'-磷酸酯的能力。雖然對具有產生核香5'-磷酸酯 的能力的微生物沒有特別的限制，只要選擇了具有將嘌呤核苷轉變為。票呤核 苷酸的能力的微生物，實例包括，例如，國際專利公開WO96/37603中披露 的微生物。
而且，也可以使用蟑瑯埃希氏菌(Esc/^n'c/^" 6A^toe) JCM 1650 、無花果 沙雷氏菌(&rrariaATCC 33105、植生克雷伯氏菌(尺/eZm'e〃a; /a"Wco/a) IFO 14939 (ATCC 33531)、肺炎克雷伯氏菌(A7eZwW/a IFO 3318
(ATCC 8724)、 土生克雷伯氏菌(《/e^/e〃G te〃/ge"a) IFO 14941 (ATCC 33257)、 摩氏摩根氏菌(Mwg朋e〃a worgam7) IFO 3168、產氣腸桿菌(五"fera^"er 群og潔s) IFO 12010、產氣腸桿菌IFO 13534 (ATCC 13048)、河流色桿菌 (C7zramoZ)a"en'ww _/7wv/a^7e) IAM 13652 、 紫色色4幹菌(C/2ramoZ)Gtc&n.wm v/o/acewm) IFO 12614 、拉氏西地西菌(C"fece" /"/ age/) JCM 1684 、戴氏西地 西菌(Ceofecea davWae) JCM 1685、奈氏西地西菌(Ce&cea JCM 5909、
等，其公開於特開昭No. 07-231793。
作為酸性磷酸酶，例如，可使用特開昭No. 2002-000289中公開的酸性磷 酸酶，而且可更優選地^使用對核苷的親和性增加的酸性^疇酸酶(特開昭No. 10-201481)、核香酸酶活性減少的突變體酸性磷酸酶(W096/37603)、磷酸酯 水解活性減少的突變體酸性磷酸酶(特開昭No, 2001-245676)等。
還可能通過將使用本發明的微生物產生的噪呤核苷以化學方法進行磷酸 化來獲得噪，冷核芬酸(Bulletin of the Chemical Society of Japan, 42， 3505)。而 且，還可以使用如下方法通過將本發明的具有產生XMP的能力的微生物和 使用微生物的ATP再生系統的XMP脫氨基酶(aminase)活性偶聯來獲得GMP 的方法，和通過偶聯肌苦激酶來獲得IMP的方法(Biosci. Biotech. Biochem.， 51, 840(1997);特開昭No. 63-230094)。
通過本發明方法製備的用於前述噪呤核苷酸製備的肌苷、鳥苷或嘌呤核 苷可為純化的產物或嘌呤核苷發酵液，或含有噤呤核苷的粗產物。
實施例
此後，將參考實施例更具體地說明本發明。實施例1
<構建在編碼嘌呤核苷磷酸化酶的/W/ G和^feoD基因中有缺陷的細菌菌
抹>
如下所述，由重組菌抹KMBS310構建在噤呤核苷磷酸化酶基因(cfeoD) 中有缺陷的菌抹。源自枯草芽孢桿菌(枯草芽孢桿菌168 Marburg菌抹，ATCC 6051)的KMBS310菌抹(日本專利申請No. 2005-280186)在噤呤操縱子阻抑物 基因(pwW)、琥珀醯-AMP合酶基因(p^4)和噤呤核普磷酸化酶基因(pw/ G)中 有缺陷，並具有減弱的IMP脫氫酶基因(gwaS)，其中對PRPP合成酶基因(/ ra) 的SD序列和噤呤操縱子啟動子區進行修飾。通過分別修飾啟動子區和SD序 列增強了 。票呤操縱子和PRPP合成酶基因的表達。
將通過Fouet和Sonenshein的方法(J. Bacteriol., 19卯，172, 835國844)由 KMBS16菌抹(purR::spc purA::erm deoD::kan,特開昭No. 2004-242610)製備
1971, 56, 209-221)製備的枯草芽孢桿菌168 Marburg菌抹的感受態細胞，並獲 得在含有5 ng/ml卡那黴素的LB瓊脂平板上生長的菌落。從獲得的菌落中選 擇未變成大觀黴素抗性也不是紅黴素抗性的菌落，並將它們之中的一個菌抹 命名為KMBS5 (deoD::kan)。
將通過Fouet和Sonenshein的方法(J. Bacteriol., 1990， 172， 835-844)由 KMBS5製備的基因組DNA用於轉化通過Dubnau和Davidoff-Abelson的方法 (J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221)製備的KMBS310菌株的感受態細胞，並獲得 在含有5 ]ig/ml卡那黴素和20 pg/ml鳥嘌呤的LB瓊脂平板上生長的菌落。從 如上所述獲得的菌落中選擇幾個菌落，並將一個轉化體命名為KMBS321，所 述轉化體中可以證實用deoD::kan取代野生型AoZ)基因，且源自KMBS310 的所有突變未被野生型序列代替。
實施例2
<構建在編碼果糖二磷酸酶的yz^基因中有缺陷的細菌菌抹、其培養及評
(l)製備#p基因缺陷的菌抹
如下所述，由前述的重組菌抹KMBS321構建在果糖二磷酸酶基因(/Z，p)中有缺陷的菌抹。源自枯草芽孢桿菌(枯草芽孢桿菌168 Marburg菌抹，ATCC 6051)的KMBS321菌抹在噤呤操縱子阻抑物基因(/7wr/0、琥珀醯-AMP合酶基 因(pw^)和嘌呤核苷磷酸化酶基因(pi^G)中有缺陷，並具有減弱的IMP脫氫 酶基因(gwa^),其中對PRPP合成酶基因(pra)的SD序列和噤呤操縱子啟動子 區進行修飾。
(i) 通過PCR擴增上遊區
基於基因資料庫的信息(GenBank登錄號NC—000964和V01277)製備具有 如下核苷酸序列的28聚物(28-mer)和50聚物(50-mer) PCR引物。
cg卿tgaactaatgggtgctTTTATGAGCATGTGCATGATAAGGTGA (SEQ ID NO:
18, 以小寫字母表示的核苷酸對應於pC194中克隆的氯黴素抗性基因(c一的 啟動子上遊區)
使用枯草芽孢桿菌168 Marburg菌抹的染色體DNA作為模板和前述的引 物進行PCR(98。C IO秒、55。C30秒、72。C1.5分鐘，30個循環，Gene Amp PCR系統9600型，Perkin-Elmer)以獲得含有#/ 基因5，端區和大約1350 bp上 遊區的擴增片段。
(ii) 通過PCR擴增下遊區
基於基因資料庫的信息(GenBank登錄號NC—000964和V01277)製備具有 如下核苷酸序列的50聚物(50-mer)和27聚物(27-mer) PCR引物。
acagctccagatccatatccttcttTTTTAGAGAGTTTGCGGGAGTATCG (SEQ ID NO:
19, 以小寫字母表示的核苷酸對應於pC194中克隆的氯黴素抗性基因(caO的 結構基因的下遊區)
TAAAGGTTTTTCGGGATAAGATTGAAA (SEQ ID NO: 20)
使用枯草芽孢桿菌168 Marburg菌抹的染色體DNA作為模板和前述的引 物進行PCR (98。C 10秒、55°C 30秒、72。C 1.5分鐘，30個循環，Gene Amp PCR系統9600型，Perkin-Elmer)以獲得含有yZ^基因3，端區和大約1770 bp下遊區的擴增片段。
(iii) 通過PCR擴增cw基因
基於基因資料庫的信息(GenBank登錄號V01277和NC—000964)製備具有 如下核苷酸序列的50聚物(50-mer) PCR引物。
tcaccttatcatgcacatgctcataaaAGCACCCATTAGTTCAACAAACG (SEQ ID NO: 21，以小寫字母表示的核苷酸對應於^/Z^基因的5'端區的序列，且對它們進 行設計使其互補於SEQIDNO: 18的3'端區)
cgatactcccgcaaactctctaaaaAAGAAGGATATGGATCTGGAGCTGT (SEQ ID NO: 22,以小寫字母表示的核香酸對應於/^基因的3，端區的序列，且對它們進 行i殳計4吏其互補於SEQIDNO: 19的3'端區)
使用攜帶氯黴素抗性基因(c的的質粒pC194作為模板和前述的引物進行 PCR(98。C10秒、55。C30秒、72。C1.5分鐘，30個循環，GeneAmpPCR系 統9600型，Perkin-Elmer)以獲得含有基因的大約980 bp的擴增片段。
(iv) 通過重組PCR擴增包含插入有基因的/Z，p區的片段
使用MicroSpin Column S-400 (Amersham Pharmacia Biotech)純化上述(i) 至(iii)中擴增的DNA片段，然後將它們的混合物以適當的量用作模板，連同 SEQ ID NOS: 17和20的序列以進行PCR (98°C 10秒、55。C 30秒、72°C 4.5 分鐘，30個循環，Gene Amp PCR系統9600型，Perkin-Elmer)，並由此獲得包 含插入有基因的區的片段。 '
(v) 製備/bp破壞的產生肌苷的菌抹
將(iv)中獲得的包含其中已插入cw基因的區的DNA片段(fbp::cat)進 行瓊脂糖凝膠電泳，並從該凝膠提取目標片段。將如上所述純化的DNA片段 用於轉化通過Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221)製備的枯草芽孢桿菌KMBS321菌抹的感受態細胞，並獲得在含有 2.5嗎/ml氯黴素和20嗎/ml鳥噤呤的LB瓊脂平板上生長的菌落。從這些菌 落製備染色體DNA，通過(iv)所述的PCR方法鑑定如下菌抹，其中通過雙重組用其內部序列被氯黴素抗性基因代替的#p區(fbp::c^)代替染色體上的 區，並將這些菌抹中的一個命名為TABS133。
(2)通過在#p基因中有缺陷的產生肌苷的菌抹產生嘌呤核苷。 yZ^基因缺陷菌抹TABS133和對照菌抹KMBS321各自均勻地塗布於含 有20 mg/L鳥噪呤的LB培養基平板上，並在34°C培養過夜。將對應於平板 的1/8的細胞接種入500-ml容積坂口燒瓶(Sakaguchi flask)中所含的20 ml發 酵培養基中，然後將50 g/L碳酸鉤加入培養基，並在34。C搖動培養細胞。培 養開始後72小時，對培養基取樣，並通過已知方法測量培養基中所含的肌香 和次黃噤呤的量。以^p基因缺陷菌株TABS133觀察到的積累的肌苷量高於 以KMBS321菌抹作為對照菌抹觀察到的肌苷量。
葡萄糖30g/L
KH2P04lg/L
NH4Cl32g/L
豆濃(Mameno) (T-N)*1.35 g/L
DL-曱硫氨酸0.4 g/L
L-色氨酸0.02 g/L
腺嘌呤0.1 g/L
鳥苷0.075 g/L
MgS040.4 g/L
FeS040.01 g/L
MnS040.01 g/L
Adekanol (消泡劑)0.5 ml/L
(用KOH調節至pH7.0)
碳酸4丐50g/L
*:大豆蛋白水解物
表1__
枯草芽孢桿菌菌才朱~~I肌苷(g/L)KMBS3215.3
TABS 1335.8
SEQIDNO:l: yZp基因的核苦酸序列
SEQ ID NO: 2:果糖二磷酸酶的胺基酸序列
SEQIDNO:3: ; ra基因的核芬S^列
SEQ ID NO: 4:磷酸核糖焦磷酸合成酶的胺基酸序列
SEQ ID NO: 5: pw/ 基因的核苷斷列
SEQ ID NO: 6:噪呤阻抑物的胺基酸序列
SEQ ID NO: 7: &oD基因的核苷酸序列
SEQ ID NO: 8: ^oD基因產物(噤呤核普磷酸化酶)的胺基酸序列 SEQ ID NO: 9: pwpG基因的核普酸序列
SEQ ID NO: 10: 基因產物(。票呤核苦磷酸化酶)的胺基酸序列
SEQ ID NO: 11: 基因的核苷酸序列
SEQ ID NO: 12:琥珀醯-AMP合酶的胺基酸序列
SEQ ID NO: 13: gwa5基因的核苷酸序列
SEQ ID NO: 14: IMP脫氫酶的胺基酸序列
SEQIDNO:15:用於pwW基因擴增的引物
SEQIDNO:16:用於/^W基因擴增的引物
SEQ ID NO: 17:用於/Z)/ 基因上遊區擴增的引物
SEQ ID NO: 18:用於#/ 基因上遊區擴增的引物
SEQ ID NO: 19:用於#/ 基因下遊區擴增的引物
SEQ ID NO: 20:用於/Z^基因下遊區擴增的引物
SEQ ID NO: 21:用於cW基因擴增的引物
SEQ ID NO: 22:用於cW基因擴增的引物
工業實用性
通過使用本發明的芽孢桿菌屬細菌，可改進噤呤核苷和/或噤呤核苷酸的 生產效率。
權利要求
1. 屬於芽孢桿菌屬的細菌，其具有產生嘌呤衍生物質的能力，其中所述細菌已被修飾使得果糖二磷酸酶的酶活性減少。
2. 根據權利要求1的屬於芽孢桿菌屬的細菌，其中所述噪呤衍生物質是 選自下組的一種或多種噪呤核苷肌苷、黃苷、烏苷和腺苦。
3. 根據權利要求1的屬於芽孢桿菌屬的細菌，其中所述噪呤衍生物質是 選自下組的一種或多種噪呤核芬酸肌香酸、黃芬酸、鳥普酸和腺香酸。
4. 根據權利要求1至3中任一項的屬於芽孢桿菌屬的細菌，其中通過破 壞編碼果糖二磷酸酶的基因或減少編碼果糖二磷酸酶的基因的表達量來減少 所述果糖二磷酸酶活性。
5. 根據權利要求4的屬於芽孢桿菌屬的細菌，其中編碼果糖二磷酸酶的 基因是編碼下列(A)或(B)的蛋白質的基因(A) 包含SEQIDNO: 1的胺基酸序列的蛋白質，(B) 包含SEQIDNO: 1的胺基酸序列的蛋白質，其包括一個或幾個氨基 酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒位並具有果糖二磷酸酶活性。
6. 根據權利要求1至5中任一項的屬於芽孢桿菌屬的細菌，其已被進一 步修飾使得磷g臾核糖焦磷酸合成酶活性增加。
7. 根據權利要求1至6中任一項的屬於芽孢桿菌屬的細菌，其已被進一 步修飾使得噪呤操縱子的表達量增加。
8. 根據權利要求7的屬於芽孢桿菌屬的細菌，其中通過破壞pw^基因 來增加噤呤操縱子的表達量，所述基因是編碼噪呤搡縱子的阻抑物的基 因。
9. 根據權利要求1至8中任一項的屬於芽孢桿菌屬的細菌，其已被進一 步修飾使得噪呤核苷磷酸化酶活性減少。
10. 根據權利要求1至9中任一項的屬於芽孢桿菌屬的細菌，其已被進 一步修飾使得IMP脫氬酶活性減少。
11. 根據權利要求1至10中任一項的屬於芽孢桿菌屬的細菌，其為枯草 芽孢桿菌。
12. 產生噤呤衍生物質的方法，其包括在培養基中培養根據權利要求1至11中任一項的屬於芽孢桿菌屬的細菌以在細菌的細胞或培養基中引起噤呤衍生物質的積累，和 從所述細胞或培養基中收集所述噤呤衍生物質。
13. 根據權利要求12的方法，其中所述嘌呤衍生物質是嘌呤核苷或嘌呤核苷酸。
14. 根據權利要求13的方法，其中所述噪呤衍生物質是選自下組的一種 或多種噪呤核苷肌苷、黃苷、鳥苷和腺苷。
15. 根據權利要求13的方法，其中所述嘌呤衍生物質是選自下組的一種 或多種。票呤核苦酸肌苷酸、黃苦酸、鳥苷酸和腺苷酸。
16. 產生嘌呤核苷酸的方法，其包括 通過根據權利要求14的方法產生嘌呤核苷，將所述噤呤核苷與磷酸鹽供體，及微生物或酸性磷酸酶進行反應以產生 噪呤核普酸，所述磷酸鹽供體是選自下組的一種或多種聚磷酸、磷酸苯酯 和氨曱醯磷酸，所述微生物具有產生核苷-5'-磷酸酯的能力，和收集所述嘌呤核苷酸。
全文摘要
嘌呤物質可如下生產在培養基中培養芽孢桿菌屬的細菌，其能夠產生嘌呤物質且具有減少的果糖二磷酸酶的酶活性從而在培養基或細菌的細胞中產生並積累嘌呤物質，和從所述培養基或細胞中收集嘌呤物質。
文檔編號C12N9/16GK101432417SQ200780014810
公開日2009年5月13日 申請日期2007年4月17日 優先權日2006年4月24日
發明者松野潔, 森由起子, 淺原貴之 申請人:味之素株式會社