膠陀螺或其菌絲體人工培育方法及應用的製作方法

2023-12-08 18:12:56 4

專利名稱：膠陀螺或其菌絲體人工培育方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及蘑菇栽培技術領域。
自然界有野生膠陀螺，但國內外均未見有關於將其用於臨床醫療的報導，也未見有用人工方法培育栽培膠陀螺的報導，也沒有對其進行過人工分離訓化工作。由於發現膠陀螺有很高的臨床醫療價值，而目前自然界的野生及膠陀螺又很少，故解決其人工分離訓化栽培技術問題具有重要的應用價值。
本發明的任務是提供一種膠陀螺或其菌絲體人工培育方法及應用，它很好地解決了膠陀螺或其菌絲體人工分離訓化栽培的問題，可人為提高重量，而且可用膠陀螺作為治療皮膚病的特效藥物，用於治療銀屑病、白癜風、皮炎或溼疹等皮膚病。
本發明目的之一是這樣實現的a、進行菌種分離，從膠陀螺科真菌膠陀螺的整個子實體中分離出膠陀螺菌絲體，作為膠陀螺母種原種；b、進行一級菌種母種培養，採用加富培養基進行母種分離後轉接，菌種萌發後沿培養基表面生長，形成明顯菌落，菌落至少生長10天以上，作為膠陀螺菌種，上述加富培養基的重量份數配比為薯類 100-300葡萄糖或蔗糖 10-30維生素B1 5-15 瓊脂10-30 水1000方法是將薯類切成小條或薄片，放於鍋中加水煮沸至著條熟而不爛，過濾，加維生素B1於濾液中，將濾液入於鍋中，加糖和瓊脂，用文火加熱，攪拌，使瓊脂溶化，加熱水補足水分，趁熱分裝於培養器中；c、膠陀螺二級及三級培養，先製作培養基，滅菌後接種，培養溫度為15-35℃，待長勢良好，即可。
以上二級及三級培養方法同，三級培養結果是長出子實體。
上述培養基可用玉米粒培養基，其重量份數配比為蒸熟玉米60-95，米糠10-30，石膏0．5-1．5，料水比為1∶1．5-2．0，滅菌。
培養基也可用木屑培養基，其重量份數配比為硬雜木屑60-90，米糠或麥皮10-30，蔗糖0．5-1．5，碳酸鈣或石膏粉0．1-1．5，料水比為1∶1．5-2．0，按配比稱取原料，把糖加入水中，其他原料混勻，加入糖水。
培養基也可用玉米芯培養基，其重量份數配比為玉米芯60-95，米糖10-30，石膏0．5-1．5，料水比為1∶1．5-2．0，滅菌。
本發明目的之二是一種膠陀螺或其菌絲體的應用，將膠陀螺或其菌絲體藥材用常規中藥乙醇浸泡法提取其有效成分，回收乙醇，將該有效成分用於製作治療銀屑病、皮炎、白癜風或溼疹皮膚病的口服藥物。
本發明之一的優點是，設計的人工分離馴化培養技術合理，可達到預定的目的，生長快，產量高，適合大量栽培，採用人工方法首次解決了膠陀螺或其菌絲體人工分離馴化的難題，具有較高的實際應用價值。利用膠陀螺或其菌絲體的有效成分，製作治療銀屑病、皮炎、白癜風或溼疹等皮膚病的藥物，具有很好的治療效果。
以下通過實施例作詳細說明，但不作為對本發明的限定。
實施例1一、膠陀螺來源及生物學特徵。
(1)來源膠陀螺為膠陀螺科真菌膠陀螺的整個子實體。
(2)產地吉林省長白山區。
(3)形態特徵未成熟子囊盤中間凹陷，上粗，下稍細，呈圓錐形子囊背面土褐色，上部色淺，下部色深，盤面為黑褐色。子實體單生或叢生，叢生多者6-9個，也有3-4個的，成熟子囊盤平展，子囊盤背面成黑褐色，顏色較深，有黑色粉狀物為擔孢子，多單生，叢生較少，有的子囊盤面不平整，邊緣呈波浪形，開傘後彈射出大量黑色子囊孢子，粉狀，黑色柄呈短圓錐形，子囊盤如同傘菌平展菌蓋狀。未成熟子實體高1．93cm，備用面寬1．34cm，成熟開傘子實體，高2．13cm，盤面寬3．95cm，柄長1．12cm。
二、菌種分離採用樹皮(長有菌絲體)，茹木、菌肉組織和孢子彈射四種方式，在子實體中間分離膠陀螺菌絲體，其中採用菌肉組織法並採用嚴格無菌操作，20天長滿管的膠陀螺母種原種。
三、母種培養(一級菌種)採用加富培養基進行母種分離後轉接，菌種萌發後沿培養基表面有水珠的地方生長，該菌萌發快，菌種接後3-5天內形成以水珠點為基點的明顯菌落。菌落大小不一，以接種點處最明顯，且菌落較大，菌落點片狀發生，表面有白灰色菌絲體，從菌落背面看菌落底部成褐色班塊，班塊大小與菌落大小相近，且老菌落色深，小菌落色淺，老菌落在生成後期有少數較大班塊聯合，而小菌落獨立成點狀，大約20天左右菌落長滿管，但不是在培養基表面平展覆蓋全部培養基，仍有較多空白處不長菌落，菌落生長初期發育速度快，後期生長速度變慢，可能與培養基表面水份逐漸減少有關。通過茹木及子實體分離母種進行相互鑑別，確定為膠陀螺菌種，菌種對PH值不敏感，通過對母種的馴化，現已能進行保藏及繁育。
四、膠陀螺二級菌種培養設計3種配方配方1為玉米粒培養基，配方2為雜木屑培養基，配方3為玉米芯培養基(見附錄)，PH值設計為5、6、7三個數值常壓滅菌冷卻後接種，培養溫度為22-25℃或15℃-35℃。可看出配方1生長速度快，菌絲強壯，500ml罐頭瓶一般生長45天左右，配方2配方3菌絲較弱，但生長速度快，一般35-40天可長滿全瓶，發現膠陀螺菌絲對PH值不敏感，5、6、7三個數值無明顯生長培養。
上述4種配方實施例如下，其配製方法可按上述操作。
加富培養基組分
注馬鈴薯可用紅薯、白薯、山藥等代替。
玉米培養基配方
木屑培養基配方
玉米芯培養基配方
五、三極培養。即膠陀螺的栽培篩選3個配方分別進行瓶栽和袋栽。方法同二級，生長發育良好。
實施例2提取工藝取膠陀螺或其真菌絲體粉碎(3-5目)，依次用5倍量乙醇回流提取3次(2h，1h，1h)，濾過，合併濾液，減壓加收乙醇，取藥液1份，輔料1．5份混合，攪勻，乾燥(約60℃)粉碎過80目篩，裝膠囊或製成片劑、丸劑、衝劑、口服液等。
本品微苦，微酸，歸肺肝心經，可清熱解毒，活血祛瘀，用於治療銀屑病、皮炎、白癜風、溼疹等皮膚病。
以下是本發明用於治療皮膚病的動物學試驗資料某醫科大學試驗結論膠囊對表皮細胞增生模型(小鼠雌激素期陰道上皮細胞有絲分裂)具有抑制作用；對表皮細胞角化不全模型(小鼠尾部表皮顆粒細胞形成)具有促進角化作用；並對間接發顯示錶皮細胞DNA合成的淋巴細胞3H-TdR摻入具有抑制作用；說明可減輕或可逆轉銀屑病病理改變。本膠囊可明顯提高豚鼠磷酸細胺致癢閾；對大鼠角叉菜足蹠腫脹急性炎症模型及棉球肉芽腫慢性炎症模型，均具有明顯拮抗作用；對小鼠耳廓微血管可使細動脈、細靜脈口徑顯著增加，毛細血管開放數量明顯增多，並在血瘀模型大鼠可明顯減輕血液流變學的異常改變；表明具有明顯止癢、抗炎及活血化瘀作用。免疫學試驗表明對反映非特異免疫功能的網內系統吞噬功能及反映T細胞特異免疫功能的皮膚遲髮型超敏反應無明顯影響，但可使反映體液免疫的血清免疫球蛋白IgG和IgA明顯增加，IgM無明顯影響。
1、對銀屑病動物模型的影響目的銀屑病的基本病理特點為皮損部位表皮細胞過度增殖和角化不全。某種藥物如能抑制表皮細胞過快增生或誘導表皮顆粒細胞生成，促進皮膚角化，則可能具有治療銀屑病的藥理作用。處於雌激素期小鼠的陰道上皮細胞增殖活躍，上皮細胞轉換加快。小鼠尾部表皮的角化形成與人類銀屑病者相似，缺少顆粒細胞。因此，國內外學者，以其做為銀屑病動物模型，評價治療銀屑病藥物的作用。另外，淋巴細胞DNA合成在一定程度上反映皮膚角朊細胞DNA合成和細胞增殖，間接顯示對表皮和真皮細胞增殖的影響。為此，選取上述三種試驗觀察本膠囊對銀屑病的藥效。
(1)對小鼠雌激素期陰道上皮細胞有絲分裂的影響方法昆明種小鼠60隻，20-30g。腹腔注射乙烯雌酚0．2mg／只，每日1次，連續3日，使其處於雌激素期。第4日隨機分為5組，每組12隻。每日灌胃給藥1次，灌胃容積0．25ml／10g，連續3日。末次藥後2小時腹腔注射秋水仙鹼2mg／kg4小時後處死小鼠取陰道，10％福馬林固定，石蠟包埋常規製片，HE染色。光鏡下計數300個陰道上皮基底細胞的有絲分裂數，其百分率為有絲分裂指數。
結果本發明膠囊0．28、0．56g／kg(相當臨床日用量7、14倍，下同)。對小鼠雌激素陰道上皮細胞有絲分裂具有明顯的抑制作用(P＜0．05、0．01)。
(2)對小鼠尾部表皮顆粒細胞生成的影響方法昆明種小鼠60隻，20-30g。按表2隨機分為6組，每組10隻，雌雄各半。每日灌胃給藥1次，灌胃容積為0．25ml／10g，連續給藥20日。末次給藥後2小時處死全部小鼠，取距鼠尾根部1．8cm處背側皮膚一長條，用10％福馬林固定，石蠟包埋常規製片，HE染色。於光鏡下(400X)觀察並計數鱗片(10個)中目鏡測微尺範圍(132μm)內顆粒細胞數。
結果本膠囊0．28、0．56g／kg對小鼠尾部顆粒細胞的生成具有明顯促進作用(P＜0．05、0．01)。0．56g／kg加光照組顆粒細胞增多，而且皮膚角化層也明顯增厚。
(3)對小鼠T淋巴細胞DNA合成的影響方法昆明種小鼠70隻，20-22g，雌雄各半。按性別、體重隨機分為7組。空白對照組(同容積蒸餾水灌胃)，陽性藥對照組(環磷酸胺15mg／kg腹腔注射)光照對照組*(同容積蒸餾水灌胃，並於2小時後接受日光照射20分鐘，光照劑量8焦耳／cm2)，本膠囊小、大劑量加光照組*(膠囊劑量及光照條件同前)，每組10隻。每日灌胃給藥1次，灌胃容積為0．25ml／10g)，連續給藥7日。末次給藥並光處死，取脾臟。按ConA淋轉試驗3H-TdR摻入法測定摻入放射性強度(cpm)，以此反映DNA合成速率。
本膠囊用於臨床治療時，患者除服用藥物外，還於服藥後12小時接受日光照射20分鐘，故在本試驗中增設光照組及膠囊加光照組。
結果本膠囊0．56g／kg及0．28、0．56g／kg加光照者均可明顯抑制ConA所致淋巴細胞DNA合成(P＜0．01或0．001)。加光照組其抑制作用有所增強。
結論本膠囊對表皮細胞增生模型(小鼠雌激素期陰道上皮細胞有絲分裂)具有抑制增生作用；對表皮細胞角化不全模型(小鼠尾表皮顆粒細胞生成)，具有促進角化作用；並對間接顯示錶皮細胞DNA合成的淋巴細胞3H-TdR摻入具有抑制作用，藥後光照可增強其抑制作用。綜上，本膠囊可減輕或可逆轉銀屑病病理改變。
權利要求
1.一種膠陀螺或其菌絲體人工培育方法，其特徵在於a、進行菌種分離，從膠陀螺科真菌膠陀螺的整個子實體中分離出膠陀螺菌絲體，作為膠陀螺母種原種；b、進行一級菌種母種培養，採用加富培養基進行母種分離後轉接，菌種萌發後沿培養基表面生長，形成明顯菌落，菌落至少生長10天以上，作為膠陀螺菌種，上述加富培養基的重量份數配比為薯類 100-300 葡萄糖或蔗糖10-30維生素B1 5-15瓊脂10-30水 1000方法是將薯類切成小條或薄片，放於鍋中加水煮沸至著條熟而不爛，過濾，加維生素B1於濾液中，將濾液入於鍋中，加糖和瓊脂，用文火加熱，攪拌，使瓊脂溶化，加熱水補足水分，趁熱分裝於培養器中；c、膠陀螺二級及三級培養，先製作培養基，滅菌後接種，培養溫度為15-35℃，待長勢良好，即可。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於培養基用玉米粒培養基，其重量份數配比為蒸熟玉米60-95，米糠10-30，石膏0．5-1．5，料水比為1∶1．5-2．0，滅菌。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於培養基用木屑培養基，其重量份數配比為硬雜木屑60-90，米糠或麥皮10-30，蔗糖0．5-1．5，碳酸鈣或石膏粉0．1-1．5，料水比為1∶1．5-2．0，按配比稱取原料，把糖加入水中，其他原料混勻，加入糖水。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於培養基用玉米芯培養基，其重量份數配比為玉米芯60-95，米糖10-30，石膏0．5-1．5，料水比為1∶1．5-2．0，滅菌。
5.一種膠陀螺或其菌絲體的應用，其特徵是將膠陀螺或其菌絲體藥材用乙醇浸泡法提取其有效成分，回收乙醇，將該有效成分用於製作治療銀屑病、皮炎、白癜風或溼疹皮膚病的口服藥物。
全文摘要
本發明涉及膠陀螺或其菌絲體人工培育方法及應用,首先從膠陀螺真菌膠陀螺子實體中分離出膠陀螺菌絲體,再採用加富培養基進行一級菌種因體培養;再在培養基上進行二級及三級培養,培養溫度為15—35℃。其培養基可用馬鈴薯培養基、玉米粒培養基、木屑培養基及玉米芯培養基等。其培養工藝合理、生長快、產量高,首次解決了膠陀螺人工分離馴化栽培的難題。其膠陀螺或其菌絲體有效成分可用於製作治療銀屑病、皮炎、白癜風或溼疹等皮膚病的口服藥物。
文檔編號C12N1/14GK1279005SQ0012219
公開日2001年1月10日 申請日期2000年8月4日 優先權日2000年8月4日
發明者馬哲, 劉宏偉, 宋華斌 申請人:河北萬歲藥業有限公司