Il-21變體的製作方法

2023-12-09 00:13:46 3

專利名稱：Il-21變體的製作方法
技術領域：
本發明涉及IL-21的新變體，所述變體對於治療有用。
背景技術：
IL-21肽在W0 00/53761中作為SEQ ID No: 2首次/>開。前肽是 161個胺基酸殘基的肽。為了方便起見，該序列在本申請中複述為SEQ ID No: 1。最初認為成熟肽是由SEQ ID No: 1的第33 - 162個胺基酸 組成的肽；然而最近(WO 2004/112703 )已提出成熟肽實際上是第30 -162個胺基酸，其如本申請中SEQ IDNo: ll所公開的，含有另外的 N末端甲硫氨酸。
IL-21是細胞因子。細胞因子一般刺激造血譜系的細胞增殖、分 化和/或激活，或參與機體的免疫和炎症應答機制。白介素是通過產生 各種細胞因子介導免疫應答的細胞因子家族，並且它們產生針對抗原 的適應性免疫。成熟T細胞可以;故激活，即通過抗原或其他刺激物， 以產生例如進一步影響T細胞群命運的細胞因子、生物化學信號分子、 或受體。
由T細胞產生的細胞因子已分類為1型和2型(Kelso， A. Immun. Cell Biol. 76: 300-317, 1998 )。 1型細胞因子包括IL-2、 IFN-y、 LT-a，並且它們參與炎症應答、病毒免疫、細胞內寄生物免疫和同種 異體移植物排斥。2型細胞因子包括IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13, 並且它們參與體液應答、蠕蟲免疫和過敏應答。1型和2型之間共有 的細胞因子包括IL-3、 GM-CSF和TNF-a 。有一些證據暗示產生1型 和2型的T細胞群優先移動到不同類型的發炎組織中。
成熟T細胞可以:被激活，即通過抗原或其他刺激物，以產生例如 進一步影響T細胞群命運的細胞因子、生物化學信號分子、或受體。
B細胞可以經由其細胞表面上的受體包括B細胞受體和其他輔助
分子激活以執行輔助細胞功能，例如產生細胞因子和抗體。
天然殺傷(NK)細胞與T細胞和B細胞具有共同的祖細胞，並且 在免疫監督中起作用。佔至多15%血液淋巴細胞的NK細胞不表達抗 原受體，並且因此不使用MHC識別作為結合靶細胞的必要條件。NK細 胞參與某些腫瘤細胞和病毒感染細胞的識別和殺死。在體內，NK細胞 被認為需要激活，然而，在體外，NK細胞已顯示經由KIR配體依賴性 激活殺死某些類型的腫瘤細胞。
儘管IL-21在各種疾病的治療中顯示了功效，但仍需要具有改善 或替代特性的IL-21變體以滿足醫學需要，所述特性例如活性、選擇 性、穩定性和循環時間或生物學半衰期。
發明概述
本發明人已驚奇地發現當區域66 - 98中的胺基酸被刪除和/或置 換時，IL-21的活性大部分維持或甚至改善。在本上下文中，胺基酸 編號就成熟的133個胺基酸的肽(前肽的第30 - 162個胺基酸，SEQ ID No: l)而論。這個序列作為SEQ ID No: 11給出，包括另外的N末端 曱硫氨酸，得到134個胺基酸的肽。SEQ ID No: 2是前肽SEQ ID No: 1 的第30 - 162個胺基酸，不含另外的N末端甲硫氨酸，得到133個氨 基酸的肽。因此，在一個實施方案中，本發明涉及肽，其包括
a) 通過刪除和/或置換由SEQ ID No: 2的第65個胺基酸-第96 個胺基酸組成的區域中的一個或多個胺基酸獲得的第一個序列；
或
b) 通過保守置換所述第一個序列中的至多IO個胺基酸獲得的序列。
在一個實施方案中，本發明提供了本發明的肽在治療中的用途。 在一個實施方案中，本發明涉及包括本發明的肽的藥物組合物。 在一個實施方案中，本發明提供了治療方法，該方法包括給有此 需要的患者施用治療有效量的本發明的肽。
在一個實施方案中，本發明涉及本發明的肽在藥物製備中的用途。 在一個實施方案中，本發明涉及編碼本發明的肽的核酸構建體；
包括所述構建體的載體；以及包括所述載體的宿主細胞。
在一個實施方案中，本發明涉及針對本發明的肽的特異性抗體。 附圖


圖1: IL-21變體的Baf3/hlL-21R/Stat-Luc分析。 來自用所示的IL-21構建體轉染的HEK293-FS細胞的上清液在
BAf3-hlL-21R/Stat-Luc報導分子測定法中進行分析。蛋白質含量通
過ELISA評估。
■野生型IL-21; ▲——IL-21缺失型突變體[A83 - R86] ( SEQ ID No: 3 );和A其中序列[K77 - T92]已置換的IL-21變體(SEQ ID No: 7)。
圖2:關於hIL-WT和ChimIL-21/4的劑量應答曲線。 純化的蛋白質在報導分子測定法中使用Baf3/hlL-21Ra細胞進行 分析。曲線代表全部一式三份進行的獨立實驗(n = 4)的總計。活性 表示為最大應答的百分比。呈現了獲得的EC50值± S.E.M.。 Chim-IL21是IL-21 sub [K77 — T92]。 定義
在本上下文中，"a"意指一個或多個。
在本上下文中，術語"肽"意指通過肽鍵鍵合的2個或多個氨基 酸。所述胺基酸可以是可編碼的或不可編碼的，並且該術語還包括肽 衍生物，其中肽的一個或多個胺基酸已例如通過PEG或親脂性基團進 行化學取代。術語"肽"和"多肽，，可互換使用並且意指同一事物。
在本上下文中，術語"藥學可接受的鹽"意指對患者無害的鹽。 此類鹽包括藥學可接受的酸加成鹽、藥學可接受的金屬鹽、銨和烷基 化銨鹽。酸加成鹽包括無機酸以及有機酸的鹽。合適的無機酸的代表 性例子包括鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、磷酸、硫酸、硝酸等。合適的有 機酸的代表性例子包括甲酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、丙酸、苯 曱酸、肉桂酸、檸檬酸、富馬酸、羥乙酸、乳酸、馬來酸、蘋果酸、 丙二酸、扁桃酸、草酸、苦味酸、丙酮酸、水楊酸、琥珀酸、曱磺酸、 乙磺酸、酒石酸、抗壞血酸、雙幾萘酸、雙亞曱基水楊酸、乙二磺酸、 酸、硬脂酸、棕櫚酸、EDTA、乙醇酸、對 氨基苯甲酸、穀氨酸、苯磺酸、對甲苯磺酸等。藥學可接受的無機或 有機酸加成鹽的進一步例子包括J. Pharm. Sci. 1977， 66， 2中列出 的藥學可接受的鹽，其引入本文作為參考。金屬鹽的例子包括鋰、鈉、 鉀、鎂鹽等。銨和烷基化銨鹽的例子包括銨、甲銨、二曱銨、三曱銨、 乙銨、羥乙銨、二乙銨、丁銨、四甲銨鹽等。
如本文所使用的肽的"治療有效量"指足以治癒、減輕或部分阻 止給定疾病及其併發症的臨床表現的量。足夠實現這點的量被定義為 "治療有效量"。關於每個目的的有效量將取決於疾病或損傷的類型 和嚴重度以及受試者的重量和一般狀況。應當理解合適劑量的確定可 以使用常規實驗法通過構建值的矩陣並測試矩陣中的不同點來完成， 這都在受過訓練的醫師或獸醫的普通技術範圍內。
如本文所使用的術語"療法"和"治療，，指為了抗擊病狀例如疾 病或病症的目的處理和照顧患者。該術語意欲包括關於患者患有的給 定病症的全部治療範圍，例如施用活性化合物以減輕症狀或併發症， 延遲疾病、病症或病狀的進展，減輕或緩解症狀和併發症，和/或治癒 或消除疾病、病症或病狀以及預防病狀，其中預防應當理解為為了抗 擊疾病、病狀或病症的目的處理和照顧患者，並包括施用活性肽以預 防症狀或併發症發作。待治療的患者優選是哺乳動物，特別是人類， 但它也可包括動物，例如狗、貓、牛、羊和豬。應當理解治療和預防 (預防性)方案代表本發明的分開方面。
發明描述
在一個實施方案中，本發明涉及肽，其包括
a) 通過刪除和/或置換由SEQ ID No: 2的第65個胺基酸-第96 個胺基酸組成的區域中的一個或多個胺基酸獲得的第一個序列；
或
b) 通過保守置換所述第一個序列中的至多IO個胺基酸獲得的序 列。4爭別地至少2個、例如至少3個、例如至少4個、例如至少5個、 例如至少6個胺基酸已在所述第一個序列中刪除和/或置換。
本發明還涉及在下文描述的本發明肽的更具體實施方案中通過保 守置換獲得的肽。
特別地，至多10個，例如l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10個 胺基酸可以進行保守置換。在本上下文中，當一個胺基酸殘基由來自 同 一組中的另 一個胺基酸殘基置換，即由具有相似特性的另 一個氨基 酸殘基置換時，該置換是保守的。胺基酸基於其特性可以方便地分為 下列組鹼性胺基酸(例如精氨酸和賴氨酸)、酸性胺基酸(例如谷 氨酸和天冬氨酸)、極性胺基酸(例如穀氨醯胺、組氨酸、曱硫氨酸 和天冬醯胺)、脂肪族或疏水性胺基酸(例如丙氨酸、亮氨酸、異亮 氨酸、纈氨酸)、芳香族胺基酸(例如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸) 和小胺基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)。
在一個實施方案中，本發明涉及肽，其包含通過刪除和/或置換由 SEQ ID No: 2的第83個胺基酸-第86個胺基酸組成的區域中的一個
或多個胺基酸獲得的序列。
在一個實施方案中，本發明涉及肽，其包含通過刪除和/或置換由 SEQ ID No: 2的第83個胺基酸-第88個胺基酸組成的區域中的一個
或多個胺基酸獲得的序列。
在一個實施方案中，本發明涉及肽，其包含通過刪除和/或置換由 SEQ ID No: 2的第83個胺基酸-第90個胺基酸組成的區域中的一個
或多個胺基酸獲得的序列。
在一個實施方案中，本發明涉及肽，其包含通過刪除和/或置換由 SEQ ID No: 2的第82個胺基酸-第88個胺基酸組成的區域中的一個
或多個胺基酸獲得的序列。
在一個實施方案中，本發明涉及肽，其包含通過刪除和/或置換由 SEQ ID No: 2的第77個胺基酸-第92個胺基酸組成的區域中的一個
或多個胺基酸獲得的序列。
在一個實施方案中，本發明涉及肽，其包含通過刪除和/或置換由 SEQ ID No: 2的第71個胺基酸-第92個胺基酸組成的區域中的一個 或多個胺基酸獲得的序列。
在一個實施方案中，本發明涉及肽，其包含通過刪除和/或置換由
SEQ ID No: 2的第65個胺基酸-第92個胺基酸組成的區域中的一個 或多個胺基酸獲得的序列。
在一個實施方案中，本發明涉及肽，其包含通過刪除和/或置換由 SEQ ID No: 2的第77個胺基酸-第96個胺基酸組成的區域中的一個 或多個胺基酸獲得的序列。
在一個實施方案中，本發明涉及肽，其包含通過刪除由SEQ ID No: 2的第83個胺基酸-第86個胺基酸組成的區域中的一個或多個氨 基酸獲得的序列。
在一個實施方案中，本發明涉及肽，其包含通過刪除由SEQ ID No: 2的第83個胺基酸-第88個胺基酸組成的區域中的一個或多個氨 基酸獲得的序列。
在一個實施方案中，本發明涉及肽，其包含通過刪除由SEQ ID No: 2的第83個胺基酸-第90個胺基酸組成的區域中的一個或多個氨 基酸獲得的序列。
在一個實施方案中，本發明涉及肽，其包含通過刪除由SEQ ID No: 2的第82個胺基酸-第88個胺基酸組成的區域中的一個或多個氨 基酸獲得的序列。
在一個實施方案中，本發明涉及肽，其包含通過置換和刪除由SEQ ID No: 2的第77個胺基酸-第92個胺基酸組成的區域中的2個或多
個胺基酸獲得的序列。
在一個實施方案中，本發明涉及肽，其包含通過置換和刪除由SEQ ID No: 2的第71個胺基酸-第92個胺基酸組成的區域中的2個或多 個胺基酸獲得的序列。
在一個實施方案中，本發明涉及肽，其包含通過置換和刪除由SEQ ID No: 2的第65個胺基酸-第92個胺基酸組成的區域中的2個或多 個胺基酸獲得的序列。
在一個實施方案中，本發明涉及肽，其包含通過置換和刪除由SEQ ID No: 2的第77個胺基酸-第96個胺基酸組成的區域中的2個或多
個胺基酸獲得的序列。
在一個實施方案中，本發明涉及肽，其通過刪除和/或置換由SEQ ID No: 2的第83個胺基酸-第86個胺基酸組成的區域中的一個或多 個胺基酸獲得。
在一個實施方案中，本發明涉及肽，其通過刪除和/或置換由SEQ ID No: 2的第83個胺基酸-第88個胺基酸組成的區域中的一個或多 個胺基酸獲得。
在一個實施方案中，本發明涉及肽，其通過刪除和/或置換由SEQ ID No: 2的第83個胺基酸-第90個胺基酸組成的區域中的一個或多 個胺基酸獲得。
在一個實施方案中，本發明涉及肽，其通過刪除和/或置換由SEQ ID No: 2的第82個胺基酸-第88個胺基酸組成的區域中的一個或多 個胺基酸獲得。
在一個實施方案中，本發明涉及肽，其通過刪除和/或置換由SEQ ID No: 2的第77個胺基酸-第92個胺基酸組成的區域中的一個或多 個胺基酸獲得。
在一個實施方案中，本發明涉及肽，其通過刪除和/或置換由SEQ ID No: 2的第71個胺基酸-第92個胺基酸組成的區域中的一個或多 個胺基酸獲得。
在一個實施方案中，本發明涉及肽，其通過刪除和/或置換由SEQ ID No: 2的笫65個胺基酸-第92個胺基酸組成的區域中的一個或多 個胺基酸獲得。
在一個實施方案中，本發明涉及肽，其通過刪除和/或置換由SEQ ID No: 2的第77個胺基酸-第96個胺基酸組成的區域中的一個或多 個胺基酸獲得。
在一個實施方案中，本發明涉及肽，其通過刪除由SEQ ID No: 2 的第83個胺基酸-第86個胺基酸組成的區域中的一個或多個胺基酸 獲得。
在一個實施方案中，本發明涉及肽，其通過刪除由SEQ ID No: 2
的第83個胺基酸-第88個胺基酸組成的區域中的一個或多個胺基酸 獲得。
在一個實施方案中，本發明涉及肽，其通過刪除由SEQ ID No: 2 的第83個胺基酸-第90個胺基酸組成的區域中的一個或多個胺基酸 獲得。
在一個實施方案中，本發明涉及肽，其通過刪除由SEQ ID No: 2 的第82個胺基酸-第88個胺基酸組成的區域中的一個或多個胺基酸 獲得。
在一個實施方案中，本發明涉及肽，其通過置換和刪除由SEQ ID No: 2的第77個胺基酸-笫92個胺基酸組成的區域中的兩個或多個氨 基酸獲得。
在一個實施方案中，本發明涉及肽，其通過置換和刪除由SEQ ID No: 2的第71個胺基酸-第92個胺基酸組成的區域中的兩個或多個氨 基酸獲得。
在一個實施方案中，本發明涉及肽，其通過置換和刪除由SEQ ID No: 2的第65個胺基酸-第92個胺基酸組成的區域中的兩個或多個氨 基酸獲得。
在一個實施方案中，本發明涉及肽，其通過置換和刪除由SEQ ID No: 2的第77個胺基酸-第96個胺基酸組成的區域中的兩個或多個氨 基酸獲得。
如上文討論的，IL-21表達為161個胺基酸的肽，但通過去除笫1 -29個胺基酸或通過去除第1 - 31個胺基酸進行翻譯後加工。本發明 因此希望還包括肽，其包括通過去除和/或刪除由第65個-笫96個氨 基酸組成的區域中的一個或多個胺基酸獲得的序列，其中N末端已通 過來自SEQ ID No: 1的N末端29個胺基酸或使用來自SEQ ID No: 1 的N末端31個胺基酸延伸。
當肽在哺乳動物細胞例如CH0細胞中表達時，N末端信號肽通常 通過所謂的信號肽酶去除，產生成熟肽。在原核細胞例如大腸桿菌中 表達同樣的異源肽通常必需(經由本領域技術人員眾所周知的重組技
術)將另外的N末端曱硫氨酸引入成熟肽的序列中，這是本領域眾所 周知的。本發明因此意欲包括含有或不含N末端曱硫氨酸的上述肽。 在一個實施方案中，本發明涉及肽，其選自
A) SEQ ID No: 3 (刪除A83-R86 ) 、 SEQ ID No: 4 (刪除A83-K88 )、 SEQ ID No: 5 (刪除A83-R90)和SEQ ID No: 6 (刪除N82-K88);和 B )含有額外的N末端Met的A )的肽
C) A) -B)的肽，其中至多IO個胺基酸已進行保守置換。 在一個實施方案中，本發明涉及肽，其選自
D) SEQ ID No: 7 (K77-T92置換)、SEQ ID No: 8 ( I71-T92置 換)、SEQ ID No: 9 (R65-T92置換)和SEQ ID No: 10 (K77-C96) 置換；和
E )含有額外的N末端Met的D )的肽；和 F) D-E)的肽，其中至多10個胺基酸已進行保守置換。 在一個實施方案中，本發明涉及上述肽的藥學可接受的鹽。 本發明的肽可以通過附著基團進一步衍生，所述基團將導致血漿 中的循環時間和/或生物學半衰期延長或將減少任何免疫原性。此類效 應可以通過附著某些基團來獲得，這是本領域眾所周知的，所述基團 例如聚乙二醇(PEG);親脂性基團，例如脂肪酸；血漿蛋白質，例如 白蛋白；或白蛋白結合部分。對於來自本領域的例子，參見例如W0 01/79271、 US 5，739，208和W0 03/44056。
如本文所使用的，術語"核酸構建體"意指cDM、基因組DNA、 合成DNA或RNA來源的任何核酸分子。術語"構建體"意指核酸區段， 其可以是單鏈或雙鏈的，並且其可以基於完全或部分的天然存在的編 碼目的蛋白質的核苷酸序列。構建體可以非必需地包含其他核酸區段。 編碼本發明蛋白質的本發明核酸構建體可以適當地是基因組或 cDNA來源的，例如通過製備基因組或cDNA文庫並通過使用合成寡核 苷酸探針依據標準技術雜交來篩選編碼全部或部分蛋白質的DNA序列 獲得(參見Sambrook等人，H)。為了本目的，編碼蛋白質的DNA 序列優選是人來源的，即來源於人基因組DM或cDNA文庫。特別地，
DNA序列可以是人來源的，例如來自特定人器官或細胞類型的cDM或 來源於人基因組DNA的基因。
編碼肽的本發明的核酸構建體還可通過已建立的標準方法合成制 備,例如，由Beaucage和Caruthers, Tetrahedron Letters 22( 1981 )， 1859 - 1869描述的亞磷醯胺(phosphoamidite)方法，或由Matthes 等人，EMB0 Journal 3 ( 1984 ) ， 801 - 805描述的方法。才艮據亞磷醯 胺方法，寡核苷酸例如在DNA自動合成儀中合成、純化、退火、連接 並克隆到合適的載體中。
此外，核酸構建體可以是依照標準技術通過連接合成、基因組或 cDNA來源(適當時)的片段(該片段對應完整核酸構建體的各個部分) 製備的合成和基因組混合的、合成和cDNA混合的、或基因組和cDM 來源混合的。
核酸構建體還可通過聚合酶鏈式反應使用特異性引物來製備，例 如如US 4， 683， 202或Saiki等人，Science 239 ( 1988 ) ， 487 - 491 中所述。
核酸構建體優選是DM構建體，這個術語將在下文中專有地使用。 重組載體
在一個進一步的方面，本發明涉及包括本發明的DNA構建體的重 組載體。本發明的DNA構建體插入其中的重組載體可以是對其可以方 便地實施重組DNA操作的任何載體，並且載體的選擇通常將取決於它 將引入其中的宿主細胞。因此，栽體可以是自主複製載體，即作為染 色體外的實體存在的載體，其複製不依賴於染色體複製，例如質粒。 可替代地，栽體可以是引入宿主細胞時整合到宿主細胞基因組並連同 其已整合的染色體一起複製的載體。
載體優選是表達載體，其中編碼本發明蛋白質的DNA序列可操作 地連接至DM轉錄所需的另外區段。 一般而言，表達栽體來源於質粒 或病毒DNA，或可以包含這兩者的元件。術語"可操作地連接"指區 段被這樣安排，使得它們為了它們預期的目的一致發揮作用，例如轉 錄在啟動子處開始並通過編碼蛋白質的DM序列繼續進行。
啟動子可以是在選擇的宿主細胞中顯示轉錄活性的任何DNA序 列，並且可以來源於編碼與宿主細胞同源或異源的蛋白質的基因。
用於指導編碼本發明蛋白質的DNA在哺乳動物細胞中轉錄的合適 啟動子的例子是SV40啟動子(Subramani等人，Mol. Cell Biol.上 (1981 ) , 854 -864 ) 、 MT-1 (金屬硫蛋白基因)啟動子(Palmiter 等人，Science 222 ( 1983 ) ， 809 - 814 )或腺病毒2主要晚期啟動
10 一 、 一 ，、—、， …
(US 4， 745， 051; Vasuvedan等人，FEBSLett. 311， ( 1992 ) 7 - 11 )、 PIO啟動子(J.M. Vlak等人，J. Gen. Virology 69， 1988，第765-776 頁)、苜蓿4艮紋夜蛾(JWo^ra; 力a cah'/ow/ca)多角體病毒鹼性蛋 白啟動子(EP 397 485 )、杆狀病毒立即早期基因1啟動子(US 5,155, 037; US 5,162, 222 )或杆狀病毒39K延遲早期基因啟動子(US 5， 155， 037; US 5，162， 222 )。
用於在酵母宿主細胞中使用的合適啟動子的例子包括來自酵母糖 酵解基因(Hitzeman等人，J. Biol. Chem. 255( 1980 )， 12073 - 12080; Alber和Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen, i ( 1982 ) ， 419 - 434 ) 或醇脫氫酶基因 (Young 等人，Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals ( Hoi laender等人,eds. ) ， Plenum Press, NewYork， 1982 )的啟動子，或TPIl( US 4， 599， 311 )或ADH2-4c
(Russell等人，Nature堅(1983 ) ， 652 - 654 )啟動子。
用於在絲狀真菌宿主細胞中使用的合適啟動子的例子是，例如 ADH3啟動子(McKnight等人，The EMBO J. 4 ( 1985 ) ， 2093 - 2099 ) 或組A啟動子。其他有用的啟動子的例子是來源於編碼下列酶的基因 的那些米麴黴(丄OTyzae) TAKA澱粉酶、米赫根毛黴(^/zoM/cor /z /e力e/)天冬氨酸蛋白酶、黑麴黴(丄中性cc-澱粉酶、黑曲 黴酸穩定性澱粉酶、黑麴黴或泡盛麴黴(A 葡萄糖澱粉酶
(gluA)、米赫根毛黴脂肪酶、米麴黴鹼性蛋白酶、米麴黴磷酸丙糖 異構酶或構巢麴黴(A /72'c^/a/^)乙醯胺酶。優選的是TAKA-澱粉酶
和gluA啟動子。
用於在細菌宿主細胞中使用的合適啟動子的例子包括嗜熱脂肪芽 孢桿菌(^2c/"^ "earo^r卿力27^)麥芽糖澱粉酶基因、地衣 芽孢桿菌(//cAe/7//oi7Z h) ot-澱粉酶基因、解澱粉芽孢杆 菌("ac/7/ws輝/o/一e屍ac/e/ 50 BAN澱粉酶基因、枯草芽孢桿菌 (Jffac//7"< ;yy6〃//<y)鹼性蛋白酶基因、或短小芽孢桿菌(^9C277iaj 木糖苷酶基因的啟動子，或噬菌體入Pk或P^啟動子，或大腸 桿菌J^、 trp或tac啟動子o
編碼本發明蛋白質的DNA序列必要時還可以可操作地連接至合適 的終止子，例如人生長激素終止子(Palmiter等人，、或 (對於真菌宿主)TPI1 ( Alber和Kawasaki ， i cit.)或ADH3 (McKnight等人，op. cit.)終止子。載體可以進一步包括元件例如 多腺苷酸化信號(例如來自SV40或腺病毒5Elb區域)、轉錄增強子 序列(例如SV40增強子)和翻譯增強子序列(例如編碼腺病毒VARNA 的序列)。
本發明的重組載體可以進一步包括使得載體能夠在所討論的宿主 細胞中複製的DM序列。此類序列的例子(當宿主細胞是哺乳動物細 胞時)是SV40複製起點。
當宿主細胞是酵母細胞時，使得載體能夠複製的合適序列是酵母 質粒2jLt複製基因REP 1-3和複製起點。
當宿主細胞是細菌細胞時，使得載體能夠複製的序列是DNA聚合 酶III複合物編碼基因和複製起點。
載體還可包括選擇標記，例如其產物彌補宿主細胞中的缺陷的基 因，例如編碼二氫葉酸還原酶(DHFR)的基因或粟酒裂殖酵母 (Sc力/zosacc力aro/z77ces/70/z 6e) TPI基因(由P. R. Russell， Gene 40， 1985,第125-1 30頁描述)，或賦予藥物抗性的基因，所述藥物例如 氨節西林、卡那黴素、四環素、氯黴素、新黴素、潮黴素或曱氨蝶呤。 對於絲狀真菌，選擇標記包括amdS、 pyrG、 argB、 niaD和sC。
為了將本發明的蛋白質導入宿主細胞的分泌途徑中，可以在重組載體中提供分泌信號序列(也稱為前導序列、前原(prepro)序列或 前序列)。分泌信號序列在正確閱讀框中連接至編碼蛋白質的DNA序 列。分泌信號序列通常位於編碼蛋白質的DNA序列的5'。分泌信號序 列可以是通常與該蛋白質關聯的那種或可以來自編碼另一種分泌性蛋 白的基因。
對於來自酵母細胞的分泌，分泌信號序列可以編碼任何信號肽， 其確保表達的蛋白質有效導入細胞的分泌途徑中。信號肽可以是天然 存在的信號肽，或其功能性部分，或者它可以是合成肽。合適的信號 肽已發現是a-因子信號肽(參見US 4, 870, 008 )、小鼠唾液澱粉酶 的信號肽(參見O. Hagenbuchle等人，Nature 289, 1981，第643-646 頁)、修飾的羧肽酶信號肽(參見L. A. Valls等人，^iii^， 1987， 第887-897頁)、酵母BAR1信號肽(參見W0 87/02670 )、或酵母天 冬氨酸蛋白酶3(YAR3)信號肽(參見M. Ege卜Mitani等人，Yeast 6, 1990,第127-1 37頁)。
為了在酵母中有效分泌，編碼前導肽的序列還可插入信號序列的 下遊和編碼蛋白質的DNA序列的上遊。前導肽的功能是允許表達的蛋 白質從內質網導向高爾基體並進一步導向分泌小泡用於分泌到培養基 中(即蛋白質穿過細胞壁或至少通過細胞膜輸出到酵母細胞的周質間 隙中)。前導肽可以是酵母oc-因子引導區(其使用在例如US 4，546，082、 EP 16 201、 EP 123 294、 EP 123 544和EP 163 529中 描述)。可替代地，前導肽可以是合成前導肽，這說的是在自然界中 未發現的前導肽。合成前導肽可以例如如W0 89/02463或WO 92/11378 中所述進行構建。
對於在絲狀真菌中的使用，信號肽可以方便地來源於編碼麴黴 (hperg27/wssp.)澱粉酶或葡萄糖澱粉酶的基因，編碼米赫根毛黴 脂肪酶或蛋白酶或柔毛腐質黴7咖/co/a h/7i^//70^ )脂肪酶的基因。 信號肽優選來源於編碼米麴黴TAKA澱粉酶、黑麴黴中性oc-澱粉酶、 黑麴黴酸穩定性澱粉酶或黑麴黴葡萄糖澱粉酶的基因。
對於在昆蟲細胞中的使用，信號肽可以方便地來源於昆蟲基因(參 見W0 90/05783 )，例如鱗翅類菸草天蛾(#a/7^/ca seWa )激脂激素 前體信號肽(參見US 5， 023， 328 )。
用於分別連接編碼蛋白質的DNA序列、啟動子和非必需的終止子 和/或分泌信號序列，並將它們插入到包含複製必需信息的合適載體中 的操作是本領域技術人員眾所周知的(參見，例如Sambrook等人， op, ci t.)。
宿主細胞
本發明的DNA構建體或重組載體引入其中的宿主細胞可以是能夠 生產本發明蛋白質的任何細胞，並且包括細菌、酵母、真菌和高等真 核細胞。
在培養中能夠生產本發明蛋白質的細菌宿主細胞的例子是革蘭氏
陽性菌例如芽孢桿菌(i5"27/M)菌抹，例如枯草芽孢桿菌(A
yi/W///; )、地衣芽孢桿菌(A //c力e/3/屍oi7Z/")、遲緩芽孢桿菌(及 /e/^"s)、短芽孢桿菌(A 6reWs)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(及 1y^Le<2rofAer/z7o/^//w(y)、嗜械芽孑包軒菌(及 a/i:a/o/ 力2'/i/s)、解〉定 粉芽孢桿菌(及ayz^/oh'^e/acie/^h凝結芽孢桿菌(及coagw7a/^)、 環狀芽孢桿菌(及"'rc"/a"s)、炒爛芽孢桿菌(及7a"M)、巨大 芽孢桿菌(及/Z7e^2f力er/wz )或蘇雲金芽孢桿菌(及M"r//^/e/^/s) 菌林，或鏈黴菌屬(57reJp^iz//ces)菌林，例如淺青紫鏈黴菌(& hV/cfs/^)或鼠灰鏈黴菌(義/77耵//7^)，或革蘭氏陰性菌例如埃希 氏大腸桿菌(fc力er/c力/a co7/)。細菌轉化可以通過原生質體轉化或 通過使用感受態細胞以其本身已知的方式完成(參見Sambrook等人， 同上)。
當在細菌例如大腸桿菌中表達蛋白質時，蛋白質可以通常作為不 溶性顆粒(稱為內含體)保留在細胞質中，或可以通過細菌分泌序列 導入周質間隙。在前一種情況下，細胞被裂解並且顆粒被回收並變性， 這之後蛋白質通過稀釋變性劑重摺疊。在後一種情況下，蛋白質可以 通過破裂細胞從周質間隙中回收，例如通過超聲處理或滲透壓休克以 釋放周質間隙的內容物並回收蛋白質。
合適的哺乳動物細胞系的例子是C0S( ATCC CRL 1650 ) 、 BHK( ATCC CRL 1632、 ATCC CCL 10 ) 、 CHL ( ATCC CCL39 )或CH0 ( ATCC CCL 61) 細胞系。轉染哺乳動物細胞並表達引入細胞中的DNA序列的方法在例 如Kaufman和Sharp, J. Mol. Biol. 159 ( 1982 ) ， 601 - 621; Southern 和Berg, J. Mol. Appl. Genet.丄(1982 ) ， 327 - 341; Loyter等 人，Proc. Natl. Acad. ScL USA 2i ( 1982 ) ， 422 - 426; Wigler 等人，Cell 14 ( 1978 ) ， 725; Corsaro和Pearson, Somatic Cell Genetics 7( 1981 ) ， 603, Graham和van der Eb， Virology 52 ( 1973 ), 456;和Neumann等人，EMB0 J. i ( 1982 ) ， 841 - 845中描述。
合適的酵母細胞的例子包括糖酵母屬(Sacc力ar0邁7ces spp.)或 裂歹直酵母屬(夕cA/zosaccAai"o/z yces spp.)的細月包，特另寸是酉良酒酵母 (5acc力aT(M7/ce51 cere7/^7'ae)或i^ccAarcwyces ir/w77er/菌林。 關於用異源DNA轉化酵母細胞並從其中生產異源蛋白質的方法例如在 US 4,599,311 、 US 4，931，373 、 US 4, 870, 008 、 5, 037, 743和US 4， 845， 075中描述，所有這些引入本文作為參考。轉化細胞通過由選 擇標記決定的表型進行選擇，通常是藥物抗性或在特定營養物例如亮 氨酸缺乏下生長的能力。用於在酵母中使用的優選載體是US 4， 931， 373中公開的P0T1載體。信號序列和非必需的前導序列可以位 於編碼本發明蛋白質的DM序列之前，例如如上所述。合適的酵母細 胞的進一步例子是克魯維氏酵母屬(A7i/;^erM7j^^)例如乳酸克魯維 氏酵母7ac〃s)，漢遜酵母屬(^a/2se/2Zi7a)例如多形漢森酵母 (j!7o7，o/77力a )、或畢赤酵母屬(屍ic力/a )例如巴斯德畢赤酵母(戶. / a"or/s)菌林(參見Gleeson等人，J. Gen. Microbiol. 132， 1986， 第3459-3465頁；US 4, 882, 279 )。
其他真菌細胞的例子是絲狀真菌細胞，例如麴黴屬(J^ei^///^ spp.)、脈孢菌屬(WewTos/ ora spp.)、鐮刀菌屬(FwsaWw邁spp.) 或木黴菌屬(rWc/^cTeivz/a spp.)，特別是米麴黴、構巢麴黴或黑曲 黴菌林。麴黴屬用於表達蛋白質的用途在例如EP 272 277和EP 230 023 中描述。尖孢鐮孢(屍.^r;^por咖)的轉化可以例如如Malardier等
人，1989， Gene 78: 147-156所述進行。
當絲狀真菌用作宿主細胞時，它可以用本發明的DNA構建體轉化， 方便地通過將DNA構建體整合到宿主染色體中以獲得重組宿主細胞。 整合一般視為優點，因為DNA序列更可能在細胞中穩定地維持。DM 構建體到宿主染色體中的整合可以根據常規方法進行，例如通過同源 或異源重組。
昆蟲細胞的轉化以及在其中異源蛋白質的生產可以如US 4， 745， 051; US 4,879, 236; US 5， 155， 037; 5，162， 222; EP 397, 485 ) 中所述進行，所有這些引入本文作為參考。用作宿主的昆蟲細胞系可 以適當地是鱗翅類(Zep/do/^era )細胞系，例如草地貪夜蛾 (5^o麵tera /"riig/perda )細胞或粉紋夜蛾(7Wc力op7,'a "/)細 胞(參見US 5,077, 214 )。培養條件可以適當地如例如WO 89/01029 或WO 89/01 028，或任何前述參考文獻中所述。
上述轉化或轉染的宿主細胞隨後在合適的營養培養基中在允許本 發明蛋白質表達的條件下培養，這之後從培養基中回收所得到的蛋白 質。
用於培養細胞的培養基可以是適合用於培養宿主細胞的任何常規 培養基，例如包含合適補充物的基本或複合培養基。合適的培養基從 商業供應者可獲得或可以根據公布的配方(例如在美國典型培養物保 藏中心的目錄中)製備。由細胞生產的蛋白質隨後可以通過常規操作 從培養基中回收，包括通過離心或過濾從培養基中分離宿主細胞，通 過鹽例如硫酸銨沉澱上清液或過濾液中蛋白質性質的組分，通過各種 色鐠操作純化，例如離子交換色鐠法、凝膠過濾色譜法、親和色譜法 等等，取決於所討論的蛋白質的類型。
本發明的肽可以用於產生特異性結合本發明的肽的抗體。在本上 下文中，"抗體"包括單克隆和多克隆抗體，及其抗原結合片段，例 如F (ab， ) 2和Fab片段，包括基因改造抗體和人源化抗體。如果抗 體結合本發明的肽的L大於或等於107 NT1，那麼它們可以說是特異性 的。用於製備抗體的方法在例如Hurrell J. G. R. (Ed. ) #o/20c7o/ a/ i^F6r/f/oiz s J/7^/6odf/es.. rec力/zi《wes a/ d J/^Z/cat/o/7S， CRC Press, Boca Raton, Florida, 1982 和 Sambrok, #o/eci//ar C/on/w 爿 Za6or"or/#a/7i/s/， Cold Spring Harbour, New York, 1989中描述。
IL-21已涉及病毒性疾病的治療，例如B型肝炎病毒、C型肝炎 病毒、人免疫缺陷病毒、呼吸道合胞病毒、EB病毒、流感病毒、細胞 巨化病毒、皰滲病毒和嚴重急性呼吸器官症候群；過敏性疾病，例如 譯喘、過敏性鼻炎或皮膚中的過敏性疾病；寄生蟲病，例如蠕蟲感染， 自身免疫性疾病，例如同種異體移植物排斥和糖尿病；以及癌症。
在本上下文中，"癌症"指任何腫瘤性疾病，包括此類細胞病症 例如肉瘤，癌瘤，黑素瘤，白血病，淋巴瘤，乳腺、頭和頸、卵巢、 膀胱、肺、咽、喉、食管、胃、小腸、肝、胰腺、結腸、女性生殖道、 男性生殖道、前列腺、腎和中樞神經系統中的癌症。特別地，"癌症" 意指非轉移性和轉移性腫瘤性病症，例如惡性黑素瘤、非黑素瘤皮膚
癌、腎細胞癌、頭和頸癌、內分泌系統癌、卵巢癌、小細胞肺癌、非 小細胞肺癌、乳腺癌、食管癌、上胃腸癌、結腸直腸癌、肝和膽管癌、 胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、睪丸癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、骨和 軟組織肉瘤、中樞神經系統癌、淋巴瘤、白血病和最初起源未知的癌。 在本發明更具體的方面，術語"腫瘤性病症"、"癌"或"腫瘤 生長"應當理解為指所有形式的贅生性細胞生長，包括嚢性瘤和實體 瘤、骨和軟組織瘤，包括良性和惡性腫瘤，包括肛門組織、膽管、膀 胱、血細胞、骨、骨(繼發性)、腸(結腸和直腸)、腦、腦(繼發 性)、乳腺、乳腺(繼發性)、類癌瘤、子宮頸、兒童癌症、眼、咽 喉(食管)、頭和頸、卡波西肉瘤、腎、喉、白血病(急性成淋巴細 胞性)、白血病(急性髓性)、白血病(慢性淋巴細胞性)、白血病 (慢性髓性)、白血病(其他)、肝、肝(繼發性)、肺、肺(繼發 性)、淋巴結(繼發性)、淋巴瘤(何杰金氏)、淋巴瘤(非何杰金 氏)、黑素瘤、間皮瘤、骨髓瘤、卵巢、胰腺、陰莖、前列腺、皮膚、 軟組織肉瘤、胃、睪丸、曱狀腺、未知的原發性腫瘤、陰道、陰戶、 子宮(子宮)中的腫瘤。
軟組織腫瘤包括良性單體性神經鞘瘤(Benign schwannoma Monosomy)、韌帶樣纖維瘤、成脂細胞瘤、脂肪瘤、子宮平滑肌瘤、 明細胞肉瘤、皮膚纖維肉瘤、尤文肉瘤、骨外粘液樣軟骨肉瘤 (Extraskeletal myxoid chondrosarcoma)、津佔液才羊月旨肪肉瘤、月旨 肪肉瘤、高分化的腺泡狀橫紋肌肉瘤和滑膜肉瘤。
具體的骨腫瘤包括非骨化性纖維瘤、單房性骨嚢腫、內生軟骨瘤、 動脈瘤樣骨性嚢腫、成骨細胞瘤、成軟骨細胞瘤、軟骨粘液樣纖維瘤、 骨化纖維瘤和釉質瘤、巨細胞瘤、纖維性結構不良、尤文氏肉瘤、嗜 酸性肉芽腫、骨肉瘤、軟骨瘤、軟骨肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤和轉 移癌。
白血病指通過骨髓產生的白細胞的癌症。這包括但不限於4種主 要類型的白血病急性成淋巴細胞性(ALL)、急性成髓細胞性(AML)、 慢性淋巴細胞性(CLL)和慢性髓性(CML)。
在一個實施方案中，本發明涉及治療病毒感染、過敏性疾病、自 身免疫性疾病和如上文列出的癌症的方法，該方法包括給有此需要的 患者施用有效量的本發明的肽。
在一個實施方案中，本發明涉及本發明的肽用於製備用於治療病 毒感染、過敏性疾病、自身免疫性疾病和如上文列出的癌症的藥物的 用途。
本領域眾所周知的是癌症治療方案通常包括超過一種藥物或治療 形式。在一個實施方案中，本發明因此提供了用於治療癌症的方法， 該方法包括施用與有效量的下列I至VI中一種或多種組合的有效量的 本發明肽。在本發明中，"與……組合，，指本發明的肽在使用下列I 至VI中的一種或多種治療U)之前、(ii)同時和/或(Hi)之後 施用。
I.誘導腫瘤細胞死亡或病毒感染細胞死亡的試劑
a) 常規化學治療
b) 放射治療
c) 單克隆抗體 d) 細胞周期控制/凋亡調節劑
e) 生長因子和信號轉導調節劑
f) 腫瘤血管形成抑制劑(血管生成抑制劑、抗血管生成藥物)
g) 病毒靶向作用(使用重組病毒破壞腫瘤細胞)
h) 抗病毒劑
i) 激素試劑
II. 增強針對肺瘤細胞或病毒感染細胞的免疫應答的試劑 j)免疫系統激活劑
k )免疫系統抑制劑(例如抑制下調免疫應答的免疫信號的試劑)， 包括抗無變應性試劑 1)治療性疫苗
III. 幹擾腫瘤生長、轉移或病毒感染細胞傳播的試劑 m)整合素，細胞粘附分子調節劑
n)抗轉移藥
o)內皮細胞調節劑
IV. 內部疫苗接種。
V. 影響凝血級聯的組織因子拮抗劑和其他因子 p)抗因子Xa、抗因子IIa抑制劑、抗纖維蛋白原試劑 q)戊多糖等。
VI. 免疫抑制劑/免疫調節劑
r )影響T淋巴細胞歸巢的試劑，例如FTY-720 s)鈣依賴磷酸酶抑制劑 t ) TOR抑制劑
下文提供了某些可能的藥物組合的更詳細描述 I:誘導腫瘤細胞死亡或病毒感染細胞死亡的試劑 a)常規化學治療劑
在本發明的一個實施方案中，組合治療通過施用本發明的肽和常 規化學治療劑進行。化學治療劑具有不同的作用方式例如通過影響 a ) DNA t]c平
b ) RNA水平
在DNA水平或RNA水平上的常規化學治療劑的非限制性例子是抗 代謝物(例如硫唑嘌呤、阿糖胞苷、磷酸氟達拉濱、氟達拉濱、吉西 他濱、阿糖胞苷、克拉屈濱、卡培他濱6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、甲 氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和幾基脲)、烷化劑(例如美法侖、白消安、順 鉑、卡鉑、環磷醯胺、異環磷醯胺、達卡巴溱、丙卡巴肼、苯丁酸氮 芥、噻替派、洛莫司汀、替莫唑胺)、抗有絲分裂劑(例如長春瑞濱、 長春新鹼、長春鹼、多西他賽、紫杉醇)、拓樸異構酶抑制劑(例如 多柔比星、安吖啶、依立替康、柔紅黴素、表柔比星、絲裂黴素、米 託蒽醌、依達比星、替尼泊苷、依託泊苷、託泊替康)、抗生素(例 如放線菌素和博來黴素)天冬醯胺酶、或蒽環類抗生素或紫杉烷類。
在本發明的一個實施方案中，組合治療通過施用本發明的肽和達 卡巴"秦(DTIC)進行。
b) 放射治療
某些腫瘤可以用放射線或放射性藥物治療。輻射源可以在待治療 患者外部或內部。當來源在患者外部時，治療稱為外部射束放射治療 (EBRT)。當輻射源在患者內部時，治療稱為近距離放射療法(BT)。 已使用的一般放射性原子包括鐳、銫-137、銥-192、鋂-241、金-198、 鈷-57、銅-67、鎝-99、石典-123、多典-131和錮-111。
放射治療是控制不能切除或不能動手術的腫瘤和/或腫瘤轉移灶 的標準治療。當放射治療與其他治療組合時已看到改善的結果。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與放射治療組合施用。
c) 單克隆抗體(單克隆；MAbs)
MAbs已開發用於治療白血病和淋巴瘤以及實體瘤，並且其獲得增 加的關注。這些抗體通過抑制對腫瘤細胞存活重要的功能，通過遞送 毒性有敢負載，通過阻斷關鍵信號傳導事件，或通過誘導針對腫瘤細 胞的抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(ADCC)或補體指導的細胞毒 作用(CDC)起作用。肺瘤細胞的死亡隨後可以導致腫瘤抗原的釋放， 這使免疫系統"疫苗接種"並刺激其隨後產生靶向腫瘤細胞的二次應
答(即如下文所述的'內部疫苗接種，)。過度表達的致癌基因和腫
瘤特異性抗原是開發中的許多mAbs的關鍵靶。
腫瘤抗原在例如Stauss H， Kawakami Y和Parmiani G: Tumor
antigens recognized by T cells and antibodies. Taylor和Frances (2003 )中描述。本發明涵蓋了針對這些靶產生的抗體。本發明還涵
蓋了針對病毒抗原產生的抗體。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與抗體組合，所述抗體
例如利妥普單抗、阿侖單抗、曲妥單抗、吉姆單抗、吉姆單抗-奧佐米
星(Myelotarg ， Wyeth)、西妥昔單抗(Erbitux )、貝伐單抗、
腿ax-CD20、腿ax-EGFr、 Zamyl和Pertuz腿b。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與利妥普單抗組合。 在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與西妥昔單抗組合。 在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與貝伐單抗組合。 在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與貝伐單抗和西妥昔單
抗組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與貝伐單抗和西妥昔單 抗組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與Panitumumab組合。 在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與貝伐單抗和
Pani tumumab組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與針對組織因子、殺傷
IG樣受體(KIR)、層粘連蛋白-5、 EGF-R、 VEGF-R、 PDGF-R、 HER-2/neu
的抗體，或針對腫瘤抗原例如PSA、 PSCA、 CEA、 CA125、 KSA等的抗體組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽連同治療抗體例如上述 的那些一起施用，並且進一步與另外的ADCC-增強化合物組合，所述 化合物例如封閉性抗-KIR抗體、NKG2D激動劑、NKG2A拮抗劑、IL-2、 IL-12、 IL-15、 IL-18或IL-21。
在本發明的另一實施方案中，本發明的肽與針對病毒抗原的抗體
組合施用。
d) 細胞周期控制/凋亡調節劑
一系列調節劑參與正常細胞周期的維持。靶向調節劑的化合物例 如(i) cdc-25 (有NSC 663284作為非限制性例子(Pu等人(2003 ) J Biol Chem 278, 46877 ) ) ， (ii)過度刺激細胞周期的周期蛋白 依賴性蛋白激酶(有下列非限制性例子flavopiridol (L868275， 腿1275; Aventis)、 7-羥基十字孢鹼(hydroxystaurosporine ) (UCN-Ol ， KW-2術；Kyowa Hakko Kogyo ) 和 roscovitine (R-roscovitine ，CYC202 ;Cyclacel )-如 Fischer 和 Gianella-Borradori (2003) Exp Op Invest Drugs 12， 955-970綜 述)，和(iii)端粒酶，該酶幫助癌細胞重建其端粒，在本發明內， 例如下列非限制性例子BIBR1532 (Damm等人(2001 ) EMBO J 20， 6958-6968 )和SOT-095 ( Tauchi等人(2003 ) Oncogene 22, 5338-5347 )。此外，幹擾凋亡途徑的藥物在本發明內，例如下列非限 制性例子TNF相關凋亡誘導配體(TRAIL) /凋亡-2配體(APo-2L )、 激活TRAIL受體的抗體、IFN- oc和反義Bcl-2。(參見Igney和Krammer (2002) Nature Rev. Cancer 2， 277-288; Makin和Dive (2003) Trends Mol Med 9, 2519; Smyth等人(2003 ) Immunity 18， 1-6; Panaretakis等人(2003 ) Oncogene 22， 4543-4556以及其中的參考 文獻)。在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與一種或多種細胞
周期調節劑和/或凋亡誘導劑組合。
在上文的本發明的一個實施方案中，化合物選自cdc-25、 NSC 663284、 flavopiridol、 7—幾基十字孢鹼、roscovitine 、 BIBR1532 SOT-095、 TNF相關凋亡誘導配體(TRAIL) /凋亡-2配體(Apo-2L )、 激活TRAIL受體的抗體、IFN-a和反義Bcl-2。
e) 生長因子抑制劑
針對生長因子和生長因子受體的許多mAbs已開發用於治療癌症。 因此，作為非限制性例子，表皮生長因子受體(EGF-R)家族的成員在 許多上皮腫瘤中被異常激活，這通常與更激化的臨床過程相關。針對
這些受
的低分子量分子在晚期臨床開發中或批准作為單一試劑或與其他癌症 藥物組合用於治療癌症。非限制性例子是曲妥單抗(單克隆抗體)、
西妥昔單抗(單克隆抗體)、Tarceva (低分子量抑制劑)和Iressa (低分子量抑制劑)。另外，配體在結合受體之前可以被中和。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與生長因子抑制劑組合。 在本發明的一個實施方案中，生長因子抑制劑選自曲妥單抗(單 克隆抗體)、西妥昔單抗(單克隆抗體)、Tarceva (低分子量抑制劑) 和Iressa (低分子量抑制劑)，
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與曲妥單抗組合。 f)腫瘤血管形成抑制劑(抗血管發生藥物和抗轉移劑) 腫瘤生長依賴於充分的血液供應和因此的新血管發生。實體瘤的 這個一般特徵從治療觀點看來是吸引人的，即當用抗血管發生藥物治 療患有癌症的患者時期望腫瘤生長減少和腫瘤消退。當前超過60種抗 血管發生藥物在臨床試驗中，包括天然存在的內皮生長抑素和血管生 長抑素(在Marx ( 2003 ) Science 301， 452-454中綜述)。還有以前 的化學治療藥物，其他藥物和放射治療具有抗血管生成效應。在本發 明的一種類型的實施方案中，組合治療使用IL-21、其類似物或衍生 物以及一種或多種抗血管生成劑，例如下列非限制性例子內皮生長抑 素、血管生長抑素、封閉起始血管發生的因子的抗體(例如抗-VEGF -Avast in)、通過抑制相關信號轉導途徑中的關鍵元件來抑制血管發 生的低分子化合物。
攻擊腫瘤維管系統和細胞外基質已吸引越來越多的注意。迄今為 止已發展了下列原則封閉內皮細胞、使用血管生長抑素和內皮生長 抑素、VEGF靶向作用和細胞外基質。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與抗血管發生藥物組合。 在本發明的一個實施方案中，抗血管發生藥物選自Avastin、新 伐司他、沙利度胺、PTK787、 ZK222584、 ZD-6474、 SU6668、 PD547， 632、 VEGF—Trap、 CEP-7055、 NM-3、 SU11248。
g)病毒靶向作用
病毒靶向作用使用重組病毒-通常是不能複製的_以直接破壞腫 瘤。實際上，至少一輪複製在病毒無能力之前發生。因此，胂瘤被裂 解，這通常導致具有所得到的保護的全身免疫接種。這個方法已使用
基因修飾進一步改進以增強免疫應答。例如，已使用人GM-CSF基因遺 傳插入到2型單純皰滲病毒栽體中改善疫苗功效。在本發明的一個實 施方案中，組合治療通過施用IL-21、其類似物或衍生物和病毒靶向 作用進行。
i)激素試劑。
激素試劑最初在激素依賴性癌症例如卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌 治療例如抗雄激素和抗雌激素治療中了解。激素和抗激素是化合物例 如磷酸雌莫司汀、聚磷酸雌二醇、雌二醇、阿那曲唑、依西美坦、來 曲唑、它莫西芬、醋酸甲地孕酮、醋酸甲羥孕酮、奧曲肽、醋酸環丙 孕酮、比卡魯胺、氟他胺、Tritorelin、亮丙瑞林、布舍瑞林或戈舍 瑞林。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與激素治療組合。 II:增強針對腫瘤細胞或病毒感染細胞的免疫應答的試劑 j)免疫系統激活劑
通過增強免疫系統功效在癌症和病毒感染的組合治療中可以連同 本發明的肽一起使用的組分或試劑的下述列表不希望以任何方式限制 本發明的範圍
佐劑
免疫治療由特異性和非特異性形式組成。作為非特異性免疫治療 的例子是主要充當用於起始免疫應答的催化劑的佐劑。此類疫苗佐劑 的非限制性例子是QS21、 GM-CSF和CpG寡脫氧核苷酸、脂多糖和聚肌胞苷酸。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與一種或多種佐劑組合。 在本發明的一個實施方案中，佐劑選自QS21、 GM-CSF和CpG寡 聚脫氧核苷酸、脂多糖和聚肌胞苷酸、a-半乳糖基神經醯胺或其類似
物、二鹽酸組胺或氫氧化鋁。
細胞因子
細胞因子的非限制性例子是IFN-a 、 IFN-P IFN-y、 IL-2、 PEG-IL-2、 IL-4、 IL-6、 IL-7、 IL-12、 IL-13、 IL-15、 IL-18、 IL-21、 IL-23、 IL-27、 IL-28a、 IL-28b、 IL-29、 GM-CSF、 Flt3配 體或幹細胞因子。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與一種或多種細胞因子 組合。
在本發明的一個實施方案中，IL-21與選自下列的一種或多種化 合物組合IFN-a、 IFN-P、 IFN-y、 IL-2、 PEG-IL-2、 IL-4、 IL-6、 IL-7、 IL-12、 IL-13、 IL-15、 IL-18、 IL-21、 IL-23、 IL-27、 IL-28a、 IL-28b、 IL-29、 GM-CSF、 Flt3配體或幹細胞因子，或這些中任何一 種的類似物或4汙生物。
在本發明的一個實施方案中，化合物選自IFN-a、 IFN-P 、 IFN-y、 PEG-IL-2、 IL-18、 IL-23、 IL-27、 IL-28a、 IL-28b、 IL-29。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與下列中的一種組合 IL-2、 PEG-IL-2、 IL-7、 IL-12、 IL-15、 IL-18和IFN-a。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與IL-12組合。在本發 明的一個實施方案中，本發明的肽與IFN-oc組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與PEG-IL-2組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與下列中的超過一種組 合IL-2、 PEG-IL-2、 IL-7、 IL-12、 IL-15、 IL-18和IFN-ot 。在本
發明的一個實施方案中，本發明的肽與下列中的至少一種和一種另外 的活性組分組合IL-2、 PEG-IL-2、 IL-7、 IL-12、 IL-15、 IL-18和 IFN-a。在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與下列中的至少一 種和來自上文列出的一種另外的細胞因子組合IL-2、PEG-IL-2、 IL-7、 IL-12、 IL-15、 IL-18和IFN-a。在本發明的一個實施方案中，本發 明的肽與IFN-a和GM-CSF組合。在本發明的一個實施方案中，本發明 的肽與IFN-a和胸腺噴丁組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與IFN-Y組合。 在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與自體的TILs和IFN-a 組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與IFN-a和IL-12組合。 在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與順鉑和IFN-a組合。 在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與順柏、它莫西芬和 IFN-a組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與順鉑、DTIC、它莫西 芬和IFN-a組合。
在本發明的一個實施方案中 芬和GM-CSF組合。
在本發明的一個實施方案中 和IFN-a組合。
在本發明的一個實施方案中 它莫西芬和IFN-a組合。
在本發明的一個實施方案中 卡鉑、它莫西芬和IFN-a組合。
在本發明的一個實施方案中 它莫西芬和IFN-a組合。
在本發明的一個實施方案中 哇胺和IFN-a組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與順鉑、卡莫司汀、DTIC、 長春醯胺、它莫西芬和IFN-a組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與順鉑、它莫西芬和 IFN-a組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與順鉑、長春鹼、DTIC 和IFN-a組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與DTIC和IFN-a組合。 在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與DTIC、CM-CSF和IFN-a
,本發明的肽與順鉑、DTIC、它莫西 本發明的肽與順柏、卡莫司汀、DTIC 本發明的肽與順鈿、卡莫司汀、DTIC、 本發明的肽與順鉑、卡莫司汀、DTIC、 本發明的肽與順鉑、DTIC、長春鹼、 本發明的肽與順鉑、長春鹼、替莫 組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與DTIC、胸腺素-a和 IFN-a組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與長春鹼和IFN-a組合。 在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與5-氟尿嘧啶和IFN-a 組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與福莫司汀和IFN-a組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與奧沙利鉑和IFN-a組合。 在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與奧沙利鉑、它莫西芬 和IFN-a組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與奧沙利鉑、DTIC、它 莫西芬和IFN-a組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與奧沙利鉑、DTIC、它 莫西芬和GM-CSF組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與奧沙利鉑、卡莫司汀、 DTIC和IFN-a組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與奧沙利鉑、卡莫司汀、 DTIC、它莫西芬和IFN-a組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與奧沙利鉑、卡莫司汀、 DTIC、卡鉑、它莫西芬和IFN-a組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與奧沙利鉑、DTIC、長 春鹼、它莫西芬和IFN-a組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與奧沙利鉑、長春鹼、 替莫唑胺和IFN-a組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與奧沙利鉑、卡莫司汀、 DTIC、長春醯胺、它莫西芬和IFN-a組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與奧沙利鉑、它莫西芬
和IFN-a組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與奧沙利鉑、長春鹼、 DTIC和IFN-a組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與5-氟尿嘧啶或其口服 活性類似物組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與奧沙利鉑和5-氟尿嗜 啶或其口服活性類似物組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與奧沙利鉑、亞葉酸和 5-氟尿嘧啶或其口服活性類似物組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與依立替康組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與依立替康和奧沙利鉑 組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與依立替康和西妥昔單 抗組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與依立替康和貝伐單抗 組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與依立替康和西妥昔單 抗和貝伐單抗組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與DTIC和自體的LAK 細胞組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與吉西他濱和IFN-a組合。
上述組合中的任何一種可以進一步與IL-2組合。 細月包免疫治療
細胞免疫治療(或過繼性免疫治療)的例子包括再輸注離體擴增 的腫瘤浸潤T細胞或遺傳修飾的T細胞。
在本發明的一個實施方案中，組合治療是將本發明的肽施用和細 胞免疫治療組合。
細胞免疫治療可以包括從患者分離可以刺激或產生抗癌症應答的
細胞、將這些擴增為更大數量，並將它們再引入同一或另一患者中。
在一個方面，這可以是識別腫瘤特異性抗原或腫瘤相關抗原的CD4+或 CD8+T細胞。在另一方面，這可以是表達對腫瘤特異性抗原或胂瘤相關 抗原特異的抗體的B細胞。在另一方面，這可以是能夠殺死腫瘤細胞 的NK細胞。在一個優選方面，這可以是樹突細胞(DC),其用DC擴 增劑(例如GM-CSF或Flt3-L)離體培養，裝載腫瘤特異性抗原或腫 瘤相關抗原並再輸注到有此需要的患者中。在本發明的一個實施方案 中，組合治療是將本發明的肽的施用和細胞免疫治療或過繼性治療組 合。
在本發明的 一 個實施方案中，細胞過繼性治療包括識別肺瘤特異 性抗原或腫瘤相關抗原的CD4+或CD8+T細胞。
在本發明的一個實施方案中，細胞過繼性治療包括表達對腫瘤特 異性抗原或腫瘤相關抗原特異的抗體的B細胞。
在本發明的一個實施方案中，細胞過繼性治療包括能夠殺死腫瘤 細月包的NK細i包。
在本發明的一個實施方案中，細胞過繼性治療包括樹突細胞(DC )。 在上述的一個實施方案中，樹突細胞用DC擴增劑(例如GM-CSF
或FU3-L)體內培養，裝載肺瘤特異性抗原或腫瘤相關抗原並再引入體內。
k)阻斷免疫系統中的抑制性信號傳導的試劑。
免疫應答(包括抗肺瘤和抗病毒應答)通過在免疫系統細胞中經 由刺激性和抑制性受體的信號傳導的平衡進行調節。經由激活性受體 朝向豐富信號傳導的轉變可以導致更有效的免疫應答，而經由抑制性 受體的增強信號傳導可以導致較少生產性的應答，或甚至可能損害免 疫性。為了增強抗胂瘤或抗病毒應答，在治療上抑制性受體信號傳導 是有用的，以便轉變朝向激活的平衡。因此，阻斷抑制性受體、或抑 制性信號傳導途徑的試劑是與本發明的肽一起的組合治療的優選試 劑。阻斷抑制性受體的此類試劑的非限制性例子是對CTLA-4特異的 mAbs (抗CTLA-4 )、對KIR特異的mAbs (抗KIR )、對LIR特異的mAbs
(抗LIR )、對CD94特異的mAbs (抗CD94 )或對NKG2A特異的mAbs (抗NKG2A)。
抗過敏劑是可以破壞針對腫瘤和癌症抗原的耐受性的小化合物、 蛋白質、糖蛋白或抗體。
儘管腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)的存在與許多不同癌症形式中改 善的臨床結果相關，但由於針對腫瘤抗原的無反應性或耐受性顯然需 要改善這些TILs的活性。在大量病例中的無反應性狀況可以通過阻止 CTLA-4-誘導的無反應性或耐受性的單克隆抗體抵消。CTLA-4的阻斷 已在動物模型和人癌症患者中顯示改善癌症治療的效力，暗示CTLA-4 阻斷可以用於破壞針對癌症和腫瘤抗原的耐受性。可以用於誘導TILs 活性的單克隆抗體的非限制性例子是MDX-OIO( Phan等人(2003 )Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100: 8372 )。在本發明的一個實施方案 中，組合治療通過施用本發明的肽和破壞針對癌症、腫瘤或病毒抗原 的耐受性的一種或多種試劑來進行。在本發明的一個實施方案中，本 發明的肽與MDX-010組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與針對CTLA-4的抗體組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與針對KIR的抗體組合。 在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與針對CD94的抗體組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與針對NKG2A的抗體組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與針對NK細胞、T細胞 或NKT細胞上表達的抑制性受體的抗體組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與抑制性受體的拮抗劑 組合。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽與參與抑制性信號傳遞 的信號傳導蛋白的拮抗劑組合。 1 )治療疫苗
幾乎所有人癌症的發展涉及基因改變，並且這可以分別導致改變 的分子在肺瘤細胞中表達和正常分子過度表達。原則上，這些改變應 當導致來自宿主的免疫應答(免疫監督)。明顯地，免疫系統的這種 理論激活只在非常少的、例外的病例中導致腫瘤自發性消退。除了其 他因素，這可以歸因於缺乏"危險信號，，-已引起增加的關注的現象。 腫瘤特異性抗原已鑑別，並且用此類抗原疫苗接種可以刺激免疫
系統以消滅腫瘤。腫瘤特異性抗原(TSAs)是相對小群的抗原，例如 癌症-睪丸抗原。這些基因在正常組織中是沉默的但由癌性細胞表達。 它們是疾病的高度特異性標記並且包括在黑素瘤中發現的MAGE(黑素 瘤抗原基因)。
腫瘤相關抗原(TAAs)通常是由正常細胞表達的分化抗原但在癌 性組織中大量地過度表達。最初認為對特定癌症特異的靶事實上在許 多腫瘤中是相當普遍的，例如神經節苷脂和粘蛋白抗原。 一般的分化 抗原包括來自黑素瘤的MART-1 (由T細胞識別的黑素瘤抗原)和gp 100、酪氨酸酶、癌胚抗原(CEA)和gp75。
突變抗原點突變在許多癌症中是常見的，並且通常發生在類似 位置中，例如P53或ras致癌基因的共同突變。已報告了體外誘導人 細胞毒性T淋巴細胞(CTL)應答以針對突變體和野生型p53的肽。在 小鼠模型中，突變體p53脈衝的樹突細胞能夠誘導p53特異性CTL並 抑制已建立的腫瘤的生長。
病毒抗原某些病毒是致癌的並且由這些病毒編碼的基因產物可 以i秀髮免疫應答並因此充當癌症抗原。例子是來自人乳頭瘤病毒16 型的E6和E7蛋白質，其已顯示在體外誘導細胞毒性T淋巴細胞應答。
腫瘤特異性抗原、腫瘤相關抗原和/或突變抗原和病毒抗原可以用 作肽，重組純化的單一試劑抗原、重組純化抗原和/或純化或從癌細胞 或腫瘤細胞中分離的抗原庫的組合作為疫苗以誘發抗腫瘤免疫應答。 類似地，肽、重組純化的單一試劑抗原、重組抗原和/或純化或從病毒 感染細胞中分離的抗原庫的組合可以在疫苗中用於誘發針對病毒感染 細胞的應答。治療疫苗還可以是自體腫瘤細胞的裂解物或提取物，或
異源腫瘤細胞系的裂解物或提取物的形式。治療疫苗還可以是DNA疫 苗的形式以誘發針對癌症和病毒感染細胞的免疫應答。所述DNA疫苗 可以由編碼單獨的抗原或編碼抗原連同細胞因子(例如，GM-CSF、IL-2、 IL-12或IL-21 )的表達載體組成，所述細胞因子可以增強針對癌症和 病毒感染細胞的免疫應答。所述DNA疫苗還可以由修飾的病毒(例如， 禽痘病毒、痘苗病毒或腺病毒)組成，所述修飾的病毒包含編碼單獨 的抗原或編碼抗原連同細胞因子的DM序列。治療疫苗還可以是抗獨 特型抗體的形式以誘發針對癌症和病毒感染細胞的免疫應答。治療疫 苗還可以是自體樹突細胞的形式，所述樹突細胞裝載所述抗原或其衍 生的肽連同DC修飾劑，例如細胞因子、toll樣受體(TLR)激動劑， CpG寡聚脫氧核苷酸、GM-CSF或熱休克蛋白。
所述疫苗介導的抗胂瘤應答或針對病毒感染細胞的應答的誘發可 以通過施用佐劑、細胞因子、toll樣受體(TLR)激動劑，CpG寡聚脫 氧核苷酸、樹突細胞、GM-CSF或熱休克蛋白來增強。在本發明的一個 實施方案中，組合治療通過施用本發明的肽與一種或多種治療疫苗來 進行，所述治療疫苗含有或不含佐劑、細胞因子、toll樣受體(TLR) 激動劑，CpG寡聚脫氧核苷酸、樹突細胞、GM-CSF或熱休克蛋白。
n)抗專f移藥
轉移癌細胞滲透細胞外基質(ECM)和血管的基底膜以轉移至靶器 官(異位位點)。EMC由碳水化合物複合物(硫酸乙醯肝素肽聚糖) 中嵌入的蛋白質組成，並且圍繞腫瘤的蛋白酶是能破壞宿主組織。抗 轉移劑拮抗此類蛋白酶的效應(例如金屬蛋白酶抑制劑XCoussens等 人Science 2002; 295:2387-2392 )。在本發明的一個實施方案中， 組合治療使用本發明的肽和一種或多種抗轉移劑，例如金屬蛋白酶抑 製劑。
IV:內部疫苗接種 "內部疫苗接種"和"內部疫苗接種治療"指腫瘤細胞的藥物或 放射誘導的細胞死亡，其導致誘發針對下列的免疫應答(i )就整體 而言的所述腫瘤細胞或(ii )所述腫瘤細胞的一部分，-包括(a)分泌
性蛋白、糖蛋白或其他產物，(b)膜相關蛋白或與膜相關或在膜中插 入的糖蛋白或其他組分和(c)細胞內蛋白質或其他細胞內組分。免疫 應答可以是體液的(即抗體-補體-介導的)或細胞介導的，包括但不 限於產生識別所述腫瘤細胞或其一部分的細胞毒性T淋巴細胞。內部
的許多或所有相同細胞組分，具有免疫原或抗原成分是內源性的並因 此代表所述腫瘤細胞的抗原庫的優點。內部疫苗接種因此可以考慮為 個體化疫苗接種，其通過使用用於癌症治療的一般操作誘發導致胂瘤 細胞死亡。除了放射治療外，可以用於誘導所述腫瘤細胞死亡和內部 疫苗接種的藥物和試劑的非限制性例子是常規化學治療劑、細胞周期 抑制劑、抗血管發生藥物、單克隆抗體、凋亡誘導劑和信號轉導抑制 劑。
"本發明的肽和內部疫苗接種組合治療"指其中本發明的肽施用 於用內部疫苗接種治療、患有癌症的患者的組合治療。本發明的肽可 以在進行內部疫苗接種之前、同時或之後施用。
在本發明的一個實施方案中，本發明的肽包括在內部疫苗接種治 療中。
基因治療包括將遺傳材料轉移到細胞中以暫時或永久地改變細胞 表型。研究了不同方法用於遞送細胞因子、腫瘤抗原和另外的刺激分 子。在本發明的上下文中，本發明的肽可以是被遞送的試劑或共同施 用。在本發明的一個實施方案中，本發明的肽可以作為多核苷酸施用。 多核苷酸在W0 00/53761中描述。
VI:免疫抑制劑/免疫調節劑
r)影響T淋巴細胞歸巢的試劑，例如FTY-720
s)鈣依賴磷酸酶抑制劑
鈣依賴磷酸酶抑制劑例如伐司樸達、PSC 833，由於對MDR-1和 p-糖蛋白的抑制效應在防止針對細胞毒性劑的抗性發展中是有效的。 t ) T0R抑制劑
TOR抑制劑通過阻斷絲氨酸-蘇氨酸激酶哺乳動物TOR (raT0R)起
作用。化合物例如西羅莫司、依維莫司和雷帕黴素是抗增殖劑。它們 參與下遊信號傳導級聯並因此在所有腫瘤類型的治療中相關(例如抗 血管生成特性)
在一個實施方案中，上述癌症治療形式以與本發明的肽例示相同
的方式與SEQIDNo: 2組合。在一個實施方案中，本發明提供了如下 文討論的藥物組合物，其包4舌SEQIDNo: 2的肽和一種或多種如上所 述的癌症治療形式。 藥物組合物
本發明的另一目的是提供包括本發明的肽的藥物製劑，所述本發 明的肽以10—15 mg/ml - 200 mg/ml的濃度存在，例如10_1° mg/ml - 5 mg/ml，並且其中所述製劑具有2. 0-10. 0的pH。可選地，所述製劑可 以包括一種或多種如上所述的其它癌症製劑。製劑可以進一步包括緩 衝系統、防腐劑、張度劑、螯合劑、穩定劑和表面活性劑。在本發明 的一個實施方案中，藥物製劑是含水製劑，即包括水的製劑。此類制 劑一般是溶液或懸浮液。在本發明的一個進一步的實施方案中，藥物 製劑是水溶液。術語"含水製劑"定義為包括至少5(T/。wAv水的製劑。 同樣地，術語"水溶液"定義為包括至少50。/。w/w水的溶液，並且術語 "含水懸浮液"定義為包括至少50 % w/w水的懸浮液。
在另一實施方案中，藥物製劑是冷凍乾燥製劑，在使用之前醫師 或患者向其中添加溶劑和/或稀釋劑。
在另一實施方案中，藥物製劑是乾燥製劑(如冷凍乾燥或噴霧幹 燥)，無需任何預先溶解即可使用。
在一個進一步的方面，本發明涉及藥物製劑，其包括本發明肽的 水溶液和緩衝劑，其中所述OGP蛋白質以0. 1 - 100mg/ml的濃度存在， 並且其中所述製劑具有約2. 0-約10. 0的pH。
在本發明的另一實施方案中，製劑的pH選自下列2. 0、 2. 1、 2. 2、 2.3、 2.4、 2.5、 2.6、 2.7、 2.8、 2.9、 3.0、 3.1、 3.2、 3.3、 3.4、 3.5、 3.6、 3.7、 3.8、 3.9、 4.0、 4.1、 4.2、 4.3、 4.4、 4.5、 4.6、 4.7、 4.8、 4.9、 5.0、 5.1、 5.2、 5.3、 5.4、 5.5、 5.6、 5.7、 5.8、
5.9、 6.0、 6.1、 6.2、 6.3、 6.4、 6.5、 6.6、 6.7、 6.8、 6.9、 7.0、 7.1、 7.2、 7.3、 7.4、 7.5、 7.6、 7.7、 7.8、 7.9、 8.0、 8.1、 8.2、 8.3、 8.4、 8.5、 8.6、 8.7、 8.8、 8.9、 9.0、 9.1、 9.2、 9.3、 9.4、 9. 5、 9. 6、 9. 7、 9. 8、 9. 9和10. 0。
在本發明的一個進一步的實施方案中，緩沖劑選自乙酸鈉、碳酸 鈉、檸檬酸鹽、甘氨醯甘氨酸、組氨酸、甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、 磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉、和三(羥曱基)-氨基曱烷、N-二(羥乙基)甘氨酸、曲辛、蘋果酸、琥珀酸鹽、馬來酸、富馬酸、 酒石酸、天冬氨酸或其混合物。這些具體緩衝劑中的每一種構成本發 明的一個可替代的實施方案。
在本發明的一個進一步的實施方案中，製劑進一步包括藥學可接 受的防腐劑。在本發明的一個進一步的實施方案中，防腐劑選自苯酚、 鄰曱酚、間甲酚、對甲酚、對羥基苯曱酸曱酯、對羥基苯曱酸丙酯、 2-苯氧乙醇、對羥基苯曱酸丁酯、2-苯基乙醇、苯甲醇、氯丁醇、和 硫柳汞、溴硝丙二醇、苯甲酸、咪脲、氯己啶、脫氫乙酸鈉、氯甲酚、 對羥苯曱酸乙酯、千索氯胺、氯苯甘醚(3p-氯苯氧基丙烷-l， 2-二醇) 或其混合物。在本發明的一個進一步的實施方案中，防腐劑以0.1 mg/ml - 20 mg/ml的濃度存在。在本發明的一個進一步的實施方案中， 防腐劑以0. 1 mg/ml - 5 mg/ml的濃度存在。在本發明的一個進一步的 實施方案中，防腐劑以5 mg/ml-10 mg/ml的濃度存在。在本發明的 一個進一步的實施方案中，防腐劑以10 mg/ml-20 mg/ml的濃度存在。 這些具體防腐劑中的每一種構成本發明的一個可替代的實施方案。防 腐劑在藥物組合物中的使用是技術人員眾所周知的。為了方便起見， 參,瞎、Remington: 夕c/e/zce a/7d i^racf/ce Z^sr/Z7ac/， 20th
edition, 2000。
在本發明的一個進一步的實施方案中，製劑進一步包括等滲劑。 在本發明的一個進一步的實施方案中，等滲劑選自鹽(例如氯化鈉)、 糖或糖醇、胺基酸(例如L-甘氨酸、L-組氨酸、精氨酸、賴氨酸、異 亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、蘇氨酸)、醛醇(例如丙三醇(甘油)、
1， 2-丙二醇(丙二醇)、1， 3-丙二醇、1， 3-丁二醇)、聚乙二醇(例 如PEG400 )，或其混合物。可以使用任何糖例如單糖、二糖或多糖、 或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、 麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖苷、支鏈澱粉、糊精、環糊精、 可溶澱粉、羥乙基澱粉和羧甲基纖維素鈉。在一個實施方案中，糖添 加劑是蔗糖。糖醇定義為具有至少一個-OH基團的C4-C8碳氫化合物， 並且包括例如甘露醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、衛矛醇、木糖醇 和阿拉伯糖醇。在一個實施方案中，糖醇添加劑是甘露醇。上述糖或 糖醇可以單獨或組合使用。對於使用的量沒有固定限制，只要糖或糖 醇在液體製劑中是可溶的並且不會不利地影響使用本發明方法達到的 穩定效應。在一個實施方案中，糖或糖醇濃度是約1 mg/ml-約150 mg/ml。在本發明的一個進一步的實施方案中，等滲劑以1 mg/ml - 50 rag/ml的濃度存在。在本發明的一個進一步的實施方案中，等滲劑以1 mg/ml-7 mg/ml的濃度存在。在本發明的一個進一步的實施方案中， 等滲劑以8 mg/ml-24 mg/ml的濃度存在。在本發明的一個進一步的 實施方案中，等滲劑以25 mg/ml - 50 mg/ml的濃度存在。這些具體等 滲劑中的每一種構成本發明的一個可替代的實施方案。等滲劑在藥物 組合物中的使用是技術人員眾所周知的。為了方便起見，參照 Remington: 7%e 5We/7ce 屍rac〃ce o屍戶Aa/"邁ac7， 20th edition, 2000。
在本發明的一個進一步的實施方案中，製劑進一步包括螯合劑。 在本發明的一個進一步的實施方案中，螯合劑選自乙二胺四乙酸 (EDTA)、檸檬酸和天冬氨酸，及其混合物。在本發明的一個進一步 的實施方案中，螯合劑以0. lmg/ml - 5rag/ml的濃度存在。在本發明的 一個進一步的實施方案中，螯合劑以0. lmg/ral - 2mg/ml的濃度存在。 在本發明的一個進一步的實施方案中，螯合劑以2mg/ml - 5mg/ml的濃 度存在。這些具體螯合劑中的每一種構成本發明的一個可替代的實施 方案。螯合劑在藥物組合物中的使用是技術人員眾所周知的。為了方 便起見，參照Remington: r力e iWe/ ce a/ ^Z rac〃ce 屍力a頂ac/，20th edition, 2000。
在本發明的 一個進一 步的實施方案中，製劑進一 步包括穩定劑。 穩定劑在藥物組合物中的使用是技術人員眾所周知的。為了方便起見， 參照 Remington: r力e 5Weuce a/jtf戶ra"/ce o/*屍力ar邁ac/, 20th edition, 2000。
更具體而言，本發明的組合物是穩定的液體藥物組合物，其治療 活性組分包括在液體藥物製劑貯藏過程中可能顯示聚集物形成的多 肽。"聚集物形成"意指多肽分子之間的物理相互作用，這導致形成 可以保留可溶性的寡聚物，或從溶液中沉澱的大的可見聚集物。"在 貯藏過程中"意指液體藥物組合物或製劑一旦製備，不立即施用於受 試者。相反在製備後，它被包裝用於貯藏，以液體形式，以冷凍狀態， 或以用於隨後重構為液體形式的乾燥形式或適合於給受試者施用的其 他形式。"乾燥形式"意指液體藥物組合物或製劑通過冷凍乾燥(即 凍幹法；參見，例如Williams和Polli ( 1984 ) J. Parenteral Sci. Technol. 38: 48-59 )、噴霧乾燥(參見Masters ( 1991 ) Spray-Drying Handbook (5th ed; Longman Scientific and Technical, Essez， U.K.)，第491-676頁;Broadhead等人(1992 ) Drug Devel. Ind. Pharm. 18: 1169-1206;和M蘭nthaler等人(1994 ) Pharm. Res. 11:12-20)、或風乾(Carpenter和Crowe ( 1988 ) Cryobiology 25:459-470;和Roser (1991) Biopharm. 4:47-53 )進行乾燥。在液 體藥物組合物1^藏過程中多肽的聚集物形成可以不利地影響那種多肽 的生物學活性，導致藥物組合物的治療效果喪失。此外，聚集物形成 可能引起其他問題，例如當包含多肽的藥物組合物使用輸注系統施用 時阻塞管、膜或泵。
本發明的藥物組合物可以進一步包括胺基酸鹼，其量足以減少在 組合物Ji&藏過程中多肽的聚集物形成。"胺基酸鹼"意指胺基酸或氨 基酸組合，其中任何給定胺基酸以其游離鹼形式或其鹽形式存在。當 使用胺基酸組合時，所有胺基酸可以以其游離鹼形式存在，所有可以 以其鹽形式存在，或某些可以以其游離鹼形式存在而其他以其鹽形式
存在。在一個實施方案中，在本發明的組合物製備中使用的胺基酸是 攜帶帶電側鏈的那些，例如精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸和穀氨酸。特 定胺基酸(例如甘氨酸、曱硫氨酸、組氨酸、咪唑、精氨酸、賴氨酸、 異亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、蘇氨酸及其混合物)的任何立體異構
體(即L、 D、或其混合物)或這些立體異構體的組合可以存在於本發 明的藥物組合物中，只要特定胺基酸以其游離鹼形式或其鹽形式存在。 在一個實施方案中，使用L-立體異構體。本發明的組合物還可以用這 些胺基酸的類似物進行配製。"胺基酸類似物"意指天然存在的氨基 酸的衍生物，其產生減少在本發明的液體藥物組合物貯藏過程中多肽 的聚集物形成的預期效應。合適的精氨酸類似物包括例如氨基胍、鳥 氨酸和N-單乙基L-精氨酸，合適的甲硫氨酸類似物包括乙硫氨酸和丁 硫氨酸，並且合適的半胱氨酸類似物包括S-曱基-L半胱氨酸。如同其 他胺基酸一樣，胺基酸類似物以其游離鹼形式或其鹽形式摻入組合物 中。在本發明的一個進一步的實施方案中，胺基酸或胺基酸類似物以 足以阻止或延遲蛋白質聚集的濃度使用。
在本發明的一個進一步的實施方案中，當充當治療劑的多肽是包 括至少 一個對氧化敏感的曱石危氨酸殘基的多肽時，可以添加曱石克氨酸 (或其他含硫胺基酸或胺基酸類似物)以抑制甲硫氨酸殘基氧化為甲 硫氨酸亞碸。"抑制"意指甲硫氨酸氧化種類隨著時間只有最低限度 的積累。甲硫氨酸氧化的抑制導致多肽以其適當的分子形式更多地保 留。可以使用曱硫氨酸的任何立體異構體(L、 D或其混合物)或其組 合。添加的量應當是足以抑制甲硫氨酸殘基氧化的量，從而使得甲硫 氨酸亞碸的量對於監管機構來說是可接受的。 一般地，這指組合物包 含不超過約10% -約30 0/。的甲硫氛酸亞碸。 一般地，這可以通過添加
甲硫氨酸達到，例如使得添加的曱硫氨酸與甲硫氨酸殘基的比率為約 1: 1-約1000: 1,例如10: l-約100: 1。
在本發明的一個進一步的實施方案中，製劑進一步包括選自高分 子量聚合物或低分子化合物的穩定劑。在本發明的一個進一步的實施 方案中，穩定劑選自聚乙二醇(例如PEG 3350 )、聚乙烯醇(PVA)、
聚乙烯吡咯烷酮、羧基-/羥基纖維素或其衍生物(例如，HPC、 HPC-SL、 HPC-L和HPMC)、環糊精、含硫物質如單硫代甘油、巰基乙酸和2-甲 基硫代乙醇，和不同的鹽(例如氯化鈉)。這些具體穩定劑中的每一 種構成本發明的一個可替代的實施方案。
藥物組合物還可包括另外的穩定劑，其進一步增強在其中的治療 活性多肽的穩定性。對本發明特別感興趣的穩定劑包括但不限於，甲 硫氨酸和EDTA，其保護多肽不受甲硫氨酸氧化，和非離子型表面活性 劑，其保護多肽不受與凍融或機械剪切相關的聚集。
在本發明的一個進一步的實施方案中，製劑進一步包括表面活性 劑。在本發明的一個進一步的實施方案中，表面活性劑選自去汙劑， 乙氧基化蓖麻油，聚乙二醇化甘油酯，乙醯化甘油單酯，失水山梨糖 醇脂肪酸酯，聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物(例如泊洛姆，例如 Pluronic F68、泊洛姆188和407、 Triton X-100)，聚氧乙烯失水 山梨糖醇脂肪酸酯，聚氧乙烯和聚乙烯衍生物例如烷基化和烷氧基化 衍生物(吐溫，例如吐溫-20、吐溫-40、吐溫-80和Brij-35 ),甘油 單酯或其乙氧基化衍生物，甘油二酯或其聚氧乙烯衍生物，醇，丙三 醇，凝集素和磷脂(例如磷脂醯絲氨酸，磷脂醯膽鹼，磷脂醯乙醇胺， 磷脂醯肌醇，雙磷脂醯甘油，和神經鞘磷脂)，磷脂衍生物(例如二 棕櫚醯磷脂酸)和溶血磷脂(例如棕櫚醯溶血磷脂醯-L-絲氨酸和乙醇 胺、膽鹼、絲氨酸或蘇氨酸的l-醯基-sn-甘油基-3-磷酸酯)以及溶 血磷脂醯和磷脂醯膽鹼的烷基，烷氧基(烷基酯)，烷氧基(烷基醚) 衍生物，例如溶血磷脂醯膽鹼，二棕櫚醯磷脂醯膽鹼的月桂醯和肉豆 蔻醯衍生物，和極性頭基的修飾，即膽鹼、乙醇胺、磷脂酸、絲氨酸、 蘇氨酸、甘油、肌醇，和帶正電荷的D0DAC、 D0TMA、 DCP、 BISH0P、 溶血磷脂醯絲氨酸和溶血磷脂醯蘇氨酸，和甘油磷脂(例如腦磷脂)， 甘油糖脂(例如吡喃半乳糖苷)，神經鞘糖脂(例如神經醯胺、神經 節苷脂)，十二烷基磷酸膽鹼，雞蛋溶血卵磷脂，梭鏈孢酸衍生物(例 如牛磺酸-二氬梭鏈孢酸鈉(sodium tauro-dihydrofusidate )等)， C6-C12長鏈脂肪酸及其鹽(例如油酸和辛酸)，醯基肉毒鹼和衍生
物，賴氨酸、精氨酸或組氨酸的Na-醯化衍生物，或賴氨酸或精氨酸 的側鏈醯化衍生物，包括賴氨酸、精氨酸或組氨酸和中性或酸性氨基
酸的任何組合的二肽的Na-醯化衍生物，包括中性胺基酸和2個帶電
荷胺基酸的任何組合的三肽的Na-醯化衍生物，DSS(多庫酯鈉，CAS 登記號[577-11-7])，多庫酯鉤，CAS登記號[128-49-4])，多庫酯 鉀，CAS登記號[7491-09-0] ) , SDS (十二烷基硫酸鈉或月桂基硫酸 鈉)，辛酸鈉，膽酸或其衍生物，膽汁酸及其鹽和甘氨酸或牛磺酸的 綴合物，熊脫氧膽酸，膽酸鈉，去氧膽酸鈉，牛磺膽酸鈉，甘膽酸鈉， N-十六烷基-N， N-二曱基-3-銨基-l-丙磺酸鹽，陰離子(烷基-芳基-磺酸鹽)單價表面活性劑，兩性離子表面活性劑(例如N-烷基-N， N-二曱基銨基-l-丙磺酸鹽、3-膽醯氨基-1-丙基二甲基銨基-1-丙磺酸 鹽)，陽離子型表面活性劑(季銨鹼)(例如十六烷基三甲基溴化胺、 十六烷基氯化吡啶総)，非離子型表面活性劑(例如，十二烷基J3-D-p比喃葡萄糖苷)，poloxamines (例如Tetronic， s)，這是來源於向 乙二胺順次添加氧化丙烯和氧化乙烯的四功能嵌段共聚物，或者表面 活性劑可以選自咪唑啉衍生物，或其混合物。這些具體表面活性劑中 的每一種構成本發明的一個可替代的實施方案。表面活性劑在藥物組 合物中的使用是技術人員眾所周知的。為了方便起見，參照Remington: r/ e 5W露e a/2d戶rac〃ce o屍屍Aa廁cy， 20th edition, 2000。
本發明的肽藥物製劑中可能存在其他成分。此類其它成分可以包 括溼潤劑、乳化劑、抗氧化劑、填充劑、張度改性劑、螯合劑、金屬 離子、油性媒介物、蛋白質(例如人血清白蛋白、明膠或蛋白質)和 兩性離子(例如，胺基酸例如甜菜鹼、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、賴 氨酸和組氨酸)。此類其它成分當然不應不利地影響本發明的藥物制 劑的總穩定度。
包含本發明肽的藥物組合物可以在幾個部位施用於需要此類治療 的患者，例如在局部部位，例如皮膚和黏膜部位，不涉及吸收的部位， 例如在動脈、靜脈、心臟中施用，以及在涉及吸收的部位，例如在皮 膚、皮下、肌內或腹部內施用。
根據本發明的藥物組合物的施用可以經由幾種施用途徑至需要此 類治療的患者，所述施用途徑例如舌、舌下、口腔、口內、口部、胃 和腸內、鼻、肺例如經由細支氣管和肺泡或其組合、表皮、真皮、經 皮、陰道、直腸、眼睛例如經由結膜、輸尿管和腸胃外。
本發明組合物可以以幾種劑型施用，例如，作為溶液、懸浮液、
乳劑、孩￡乳劑、多重乳劑(multiple emulsion)、泡沫、藥膏、糊劑、 膏劑、軟膏、片劑、包衣片劑、衝洗劑、膠嚢例如硬明膠膠嚢和軟明 膠膠囊、栓劑、直腸用膠嚢、滴劑、凝膠劑、噴霧劑、粉劑、氣霧劑、 吸入劑、滴眼劑、眼用軟膏、眼衝洗劑、陰道栓劑、陰道環、陰道軟 膏、注射液、原位轉化溶液例如原位膠凝、原位凝結、原位沉澱、原 位結晶、輸注液和埋植劑。
本發明的組合物可以例如通過共價、疏水和靜電相互作用在藥物 載體、藥物遞送系統和先進的藥物遞送系統中進一步化合，或與其附 著，以便進一步增強本發明肽的穩定性、增加生物利用度、增加可溶 性、減少不利效應、達到本領域技術人員眾所周知的按時療法、並增 加患者順應性或其任何組合。載體、藥物遞送系統和先進的藥物遞送 系統的例子包括但不限於，聚合物例如纖維素和衍生物，多糖例如葡 聚糖和衍生物、澱粉和衍生物，聚(乙烯醇)，丙烯酸和曱基丙烯酸 聚合物，聚乳酸和聚乙醇酸及其嵌段共聚物，聚乙二醇，栽體蛋白例 如白蛋白，凝膠例如熱膠凝系統，例如本領域技術人員眾所周知的嵌 段共聚系統，膠束，脂質體，微球體，納米微粒，液晶及其分散系， L2相及其分散系，本領域技術人員眾所周知的脂-水系統中的相行為， 聚合膠束，多層乳劑，自身乳化，自身微乳化，環糊精及其衍生物， 和樹枝狀聚合物(dendrimer)。
本發明的組合物在使用例如定量吸入器、乾粉吸入器和噴霧器(都 是本領域技術人員眾所周知的裝置)用於肺部施用本發明肽的固體、 半固體、粉末和溶液配製中是有用的。
本發明的組合物在受控、持續、延長、延緩和緩慢釋放的藥物遞 送系統的配製中是特別有用的。更特別地，但不限於，組合物在本領
域技術人員眾所周知的腸胃外控制釋放和持續釋放系統(2個系統都 導致施用數量減少許多倍)的配製中是有用的。再更優選的是皮下施 用的控制釋放和持續釋放系統。不限制本發明的範圍，有用的控制釋 放系統和組合物的例子是水凝膠、油狀凝膠、液晶、聚合膠束、微球 體、納米^:粒。
生產對本發明組合物有用的控制釋放系統的方法包括但不限於， 結晶、濃縮、共結晶、沉澱、共沉澱、乳化、分散、高壓勻漿化、膠 嚢化、噴霧乾燥、微膠嚢化、凝聚、相分離、溶劑蒸發以生產微球體、 橋出和超臨界it體過禾呈。 一般參照Handbook of Pharmaceutical Controlled Release (Wise, D丄，ed. Marcel Dekker， New York, 2000 )和Drug and the Pharmaceutical Sciences第99巻Protein Formulation and Delivery ( MacNally, E.J. ， ed. Marcel Dekker， New York, 2000)。
腸胃外施用可以使用注射器例如筆形注射器通過皮下、肌內、腹 膜內或靜脈內注射進行。可替代地，腸胃外施用可以使用輸注泵進行。 另一個選擇是可以以鼻或肺噴霧的形式用於施用本發明肽的溶液或懸 浮液的組合物。作為再一個選擇，包含本發明肽的藥物組合物還可以 適合於經皮施用，例如通過無針注射或貼劑任選離子電滲貼劑，或經 黏膜例如口腔施用。
術語"穩定製劑，，指具有增加的物理穩定性、增加的化學穩定性 或增加的物理和化學穩定性的製劑。
如本文所使用的術語蛋白質製劑的"物理穩定性，，指，由於蛋白
質暴露於熱-機械壓力和/或與去穩定界面和表面例如疏水表面和界面
的相互作用，蛋白質形成蛋白質的生物學無活性和/或不溶性聚集物的
趨勢。含水蛋白質製劑的物理穩定性在將合適容器(例如筒或瓶)中
的製劑在各個時間段於不同溫度下暴露於機械/物理壓力(例如攪動)
後通過視覺檢查和/或濁度測量方法進行評估。製劑的視覺檢查在強烈
集中的光中使用暗背景進行。製劑的濁度通過例如在Q - 3的級別上評
傳乂\;雀仁主麼t f貧^、:5"古、:d7虔AA製劑對應視覺;f尋分0，
並且在日光中顯示可見濁度的製劑對應視覺得分3)。當其在日光中 顯示可見濁度時，製劑就蛋白質聚集物而言分類為物理不穩定的。可 替代地，製劑的濁度可以通過技術人員眾所周知的簡單濁度測量方法 進行評估。含水蛋白質製劑的物理穩定性還可以通過使用蛋白質構象 狀態的分光試劑(spectroscopic agent )或探針進行評估。探針優選 是優先結合蛋白質的非天然構象異構體的小分子。蛋白質結構的小分 子分光探針的一個例子是硫磺素T。硫磺素T是已廣泛用於檢測澱粉 狀蛋白原纖維的螢光染料。在原纖維以及可能的其他蛋白質構型的存 在下，硫磺素T在約450 nm處產生新的激發最大值並當結合原纖維蛋 白質形式時在約482 nm處產生增強的發射。未結合的硫磺素T在這些 波長上基本上是無螢光的。
其他小分子可以用作蛋白質結構從天然到非天然狀態的改變的探 針。例如"疏水斑(hydrophobic patch )"探針優先結合蛋白質的暴 露的疏水斑。疏水斑一般包埋在天然狀態的蛋白質的三級結構中，但 當蛋白質開始展開或變性時變得暴露。這些小分子的分光探針的例子 是芳香族疏水染料，例如antrhacene、吖啶、菲咯啉等。其他分光探 針是金屬-胺基酸複合物，例如疏水胺基酸的鈷金屬複合物，所述疏水 胺基酸例如苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、曱硫氨酸和纈氨酸等。
如本文所使用的術語蛋白質製劑的"化學穩定性"指蛋白質結構 中的化學共價改變，導致形成與天然蛋白質結構相比具有可能更少的 生物學效力和/或可能增加的免疫原特性的化學降解產物。取決於天然 蛋白質的類型和性質以及蛋白質暴露的環境，可以形成各種化學降解 產物。如本領域技術人員眾所周知的，化學降解的消除很可能無法完 全避免並且在蛋白質製劑的貯藏和使用過程中通常可見增加量的化學 降解產物。大多數蛋白質易於脫醯胺(其中穀氨醯胺基或天冬醯胺基 殘基中的側鏈醯胺基水解以形成游離羧酸的過程)。其他降解途徑涉 及高分子量轉化產物的形成，其中2個或多個蛋白質分子通過轉醯胺 基作用和/或二硫化物相互作用彼此共價結合，導致形成共價結合的二 聚物、寡聚物和聚合物降解產物(S"6///0^ o屍？ro"//7
^vfo辻"")。氧化(例如甲硫氨酸殘基氧化)可以作為化學降解 的另 一種變體提及。蛋白質製劑的化學穩定性可以通過暴露於不同環 境條件後(降解產物的形成通常可以通過例如增加溫度加速)在各個 時間點上測量化學降解產物的量進行評估。每種單獨的降解產物的量 通常通過使用各種色語技術(例如SEC-HPLC和/或RP-HPLC)(取決 於分子大小和/或電荷)分離降解產物來測定。
因此，如上文概述的，"穩定的製劑"指具有增加的物理穩定性、 增加的化學穩定性或增加的物理和化學穩定性的製劑。 一般而言，制 劑在使用和貯藏過程中必須是穩定的(遵照推薦的使用和貯藏條件) 直至達到失效期。
在本發明的一個實施方案中，包括本發明肽的藥物製劑對於超過 6周的使用和超過3年的貯藏是穩定的。
在本發明的另一實施方案中，包括本發明肽的藥物製劑對於超過 4周的使用和超過3年的貯藏是穩定的。
在本發明的一個進一步的實施方案中，包括本發明肽的藥物製劑 對於超過4周的使用和超過2年的貯藏是穩定的。
在本發明的一個再進一步的實施方案中，包括本發明肽的藥物制 劑對於超過2周的使用和超過2年的貯藏是穩定的。
實施例
IL-21變體的活性測試
hIL-21野生型和突變蛋白在細胞活性測定法中使用stat-調節的 螢光素酶報告系統進行分析。
測定法採用鼠類Baf3細胞系，其已穩定轉染以表達人IL-21R和 Stat-連接的營光素酶報告基因構建體。Baf3細胞內源性表達y C '共 同鏈，，該"共同鏈"構成信號傳導IL-21受體複合物的主要組分。 Baf3/hlL-21R報告基因細胞系在刺激之前在無IL-3培養基中^/L餓6 小時。隨後對細胞刺激24小時進行劑量-應答分析。
圖 1表示在HEK293 FS細胞(Stengaard-Pedersen等人
N.Engl. J.Med. ( 2003 ) 349: 554; InvUrogen)中瞬時表達的蛋白 質的分析。蛋白質以在轉染後48小時收穫的原始上清液的形式進行分析。
圖2表示作為純化蛋白質分析的野生型和突變體hlL-21蛋白質的 分析。Chim-IL21是IL-21sub[K77 - T92] ( SEQ ID No. 7 )。在這裡 製備構建體用於在大腸桿菌中表達並通過在內含體中存在的蛋白質的 重摺疊進行純化。
IL-21變體的其它活性測試法
編碼IL-21變體的cDNA通過瞬時表達隨後通過在stat-調節的淨艮 告基因系統中的活性分析進行分析。
將cDNA轉染到HEK293 FreeStyle細胞(Stengaard-Pedersen等 人N. Engl. J.Med. ( 2003 ) 349: 554; Invitrogen)中。在轉染後48 小時從無血清培養基中收集上清液並在細胞生物測定法中進行分析。 該測定法採用鼠類Baf 3細胞系，該細胞系被穩定轉染以表達人IL-21R 和Stat-連接的螢光素酶報告基因構建體。Baf 3細胞內源性表達活性 IL-21受體複合物的yc組分。Baf3/hlL-21R報告基因細胞系在刺激 之前在無IL-3培養基中飢餓18小時。使用來自HEK293-FS轉染林的 原始上清液進行劑量-應答分析。刺激持續時間為4小時。
藥理學方法
使用下列體外方法研究ADCC的增強。
血單核細胞、NK細胞、嗜中性粒細胞、巨噬細胞、單核細胞或DC — 起孵育。效應細胞可以與IL-21—起預孵育1 - 10天，或者IL-21可 以加入包含效應細胞和靼細胞的培養基中。可以增強ADCC的其他化合 物可以包括在培養基或預孵育培養基中。ADCC的功效根據從靶細胞中 釋放的特異性"Cr或根據如先前所述的LDH活性進行測量(Golay等 人，^腳"o7c^/ca 88: 1002-1012， 2003或Liu等人，C彥er/鵬回 2:13， 2002或Watanabe等人，Ar譜"露e"es 7>e" 53: 199-207， 1999 )。
ADCC的測定使用基於流式細胞法的測定法如先前所述進行 (Flieger等人，///3M7i/加^er 23: 480-486， 2000或FUeger等人， / /邁層o/淑A油180:1-13， 1995或Flieger等人， 18: 63-68， 1999 )。
ADCP的測定通過雙色螢光測定法如Watanabe等人，Area" C娜er h 7>e" 5 3: 199-207， 1999或Akewanlop等人，Ce"es 61:4061-4065， 2001中所述進行。
用於測定ADCC增強的體內方法概述如下
白血病細胞或轉化細胞靜脈內、腹腔內或皮下注射到同系動物中， 隨後用識別由白血病細胞或轉化細胞表達的抗原的治療抗體治療，伴 隨或不伴隨IL-21治療。終末點是腫瘤負荷和存活。ADCC的涉及可以 通過使用Fc yRI封閉抗體或通過使用Fc yRI缺陷小鼠進行證實。
研究朝向人來源靶細胞的ADCC增強的體內方法先前在Zhang等 人，Wood 102:284-288, 2003或Flavell 等人 ""cer 58:5787-5794， 1998中描述。根據這些模型人白血病細胞或轉化細胞 靜脈內、腹腔內或皮下注射到SCID小鼠中，隨後用識別由白血病細胞 或轉化細胞表達的抗原的治療抗體治療，伴隨或不伴隨IL-21治療。
腫瘤細胞系，例如劉易斯肺癌(LLC)細胞或B16-F10黑素瘤細胞 或腎臟腎細胞癌細胞或4T1乳腺癌細胞皮下植入同系小鼠中。當腫瘤 變得可觸知時，小鼠用IL-21與如本申請中描述的其他抗癌劑組合治 療。方法學在Palumbo等人，Ca腳r 62:6966-6972 ( 2002 );
Bove等人，萬/oc力e/z ^/opArs Co/mw/z 291: 1001—1005 ( 2002 ); Wigginton等人，/ /範邁"/ 。/ 169: 4467—4474 ( 2002 )中描述。
腫瘤細胞系，例如劉易斯肺癌(LLC)細胞或B16-F10黑素瘤細胞 皮下植入同系小鼠中。原發性腫瘤在1 -4周後去除，並且小鼠用IL-21 與如本申請中描述的其他抗癌劑組合治療。方法學在Palumbo等人， Ca/ cer 62: 6966-6972 ( 2002 )中描述。
肺瘤細胞系，例如劉易斯肺癌(LLC)細胞或B16-F10黑素瘤細胞 或腎臟腎細胞癌細胞靜脈內注射到同系小鼠中，並且小鼠用IL-21與
如本申請中描述的其他抗癌劑組合治療。方法學在Amirkhosravi等 人，r力ro歷6. ^se邁osL 87:930—936 ( 2002 ); Hosaka等人，Cs/zcerZeff 161:231—240 ( 2000 ); Maini等人，//217: 119-123 ( 2003 )中描述。
腎臟腎細胞癌細胞腎內注射到同系小鼠的一個腎內。原發性腫瘤 在1 - 4周後去除，並且小鼠用IL-21與如本申請中描述的其他抗癌劑 組合治療。方法學在Murphy等人，/T/zm/mo/ 170: 2727-2733 ( 2003 ) 中描述。
權利要求
1.一種肽，其包含a)通過刪除和/或置換由SEQ ID No2的第65個胺基酸至第96個胺基酸組成的區域中的一個或多個胺基酸獲得的第一個序列；或b)通過保守置換所述第一個序列中的至多10個胺基酸獲得的序列。
125 PRT人工的<220〉 IL-21變體 5Gin Gly Gin Asp Arg His Met lie Arg Met Arg Gin Leu lie Asp lie 15 10 15Val Asp Gin Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu 20 25 30Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser 35 40 45Cys Phe Gin Lys Ala Gin Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu 50 55 60 Arg lie lie Asn Val Ser lie Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser 65 70 75 80Thr Asn Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro 85 90 95Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu Gin Lys Met lie His 100 105 U0Gin His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu Asp Ser 115 120 125 <2I2〉 6
126 PRT 人工的<223〉 IL-21變體 <400〉 6Gin Gly Gin Asp Arg His Met lie Arg Met Arg Gin Leu lie Asp lie 15 10 15Val Asp Gin Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu 20 25 30Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser 35 40 45Cys Phe Gin Lys Ala Gin Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu 50 55 60Arg lie lie Asn Val Ser lie Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser 65 70 75 80 Thr His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro 85 90 95Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu Gin Lys Met lie 100 105 110His Gin His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu Asp Ser 115 120 125<210〉 〈211〉 <213〉7
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全文摘要
提供了IL-21變體，其中胺基酸已在由第65-96號胺基酸組成的區域中進行刪除和/或置換。
文檔編號C07K14/715GK101180315SQ200680017297
公開日2008年5月14日 申請日期2006年4月18日 優先權日2005年4月18日
發明者D·馬德森, K·博登斯加德, S·A·約爾特 申請人:諾和諾德公司