人抗狂犬病抗體及其用途的製作方法

2023-12-08 22:00:26

專利名稱：人抗狂犬病抗體及其用途的製作方法
人抗狂犬病抗體及其用途本申請是中國發明專利申請No. 200680007172. 5的分案申請。相關信肩、本申請要求2005年2月2日提交的美國臨時專利申請60/649，512的優先權，該專利申請的全部內容引入本文作為參考。在本說明書全文中引用的任何專利、專利申請和參考文獻的內容均全文弓I入本文作為參考。
背景技術：
狂犬病是一種由彈狀病毒科(狂犬病毒屬(lyssavirus))的RNA病毒感染引起的急性進行性腦炎。儘管在發達國家中人類狂犬病死亡極少(在美國每年通常不到5例死亡)，但是在(例如)印度報告了相當多的死亡例數，在印度有50，000人死於該病，並且有超過500，000人得到治療。甚至在美國，每年也有15，000到40，000人接受抗狂犬病治療。一般來說，狗是該病的主要宿主，但是其他哺乳動物如浣熊、臭鼬、蝙蝠和狐狸也是常見的宿主。該病毒從動物宿主向人的傳播通常是通過咬傷或抓傷穿過皮膚而發生的。由於狂犬病在人類中幾乎總是致命的，甚至懷疑感染也必須用積極的接觸後治療方案來治療。人類狂犬病的接觸後治療包括適當的傷口處理、抗狂犬病血清免疫球蛋白浸潤到傷口內和傷口周圍的局部給藥、以及通常在幾天和幾周內給予多劑量的狂犬病疫苗(關於狂犬病預防的綜述，參見，例如，Rupprecht和Gibbons等人,N Engl J Med 351 :25(2004))。適當的傷口處理可以減少存活的進入患者的病毒量。抗狂犬病血清免疫球蛋白浸潤該區域可以與狂犬病病毒結合，並且有助於清除狂犬病病毒，由此減少病毒載量(通過被動免疫)。給予多劑量的狂犬病疫苗(主動免疫)的方式通常是在第一次給藥後進行加強免疫，可使患者產生有效的主動免疫，包括體液和細胞應答。當前抗狂犬病血清免疫球蛋白的來源是從被接種的人類供體的血液中獲得的。抗狂犬病血清免疫球蛋白的其他來源，例如馬或鼠，被認為是不可接受的。當前狂犬病疫苗的來源是在細胞系中產生以及化學滅活並凍幹。儘管這些藥劑如果及時施用是非常有效的，但是仍然存在一定的障礙。例如，這些抗狂犬病藥劑的生產廠家極少，而且它們仍然較昂貴，特別是在最需要它們的發展中國家。另外，人抗狂犬病血清免疫球蛋白由於是從人類供體的血清中獲得的，因此必須高度純化以防止任何偶然物質的傳播。而且，抗狂犬病疫苗需要勞動密集的細胞培養和大量的滅活和純化步驟。因此，需要改進的治療和預防狂犬病感染的免疫療法。

發明內容
本發明通過提供特異性結合廣泛多種狂犬病病毒分離株並且抑制該病毒感染細胞的能力的重組完全人類的抗狂犬病單克隆抗體解決了上述問題。在一個實施方案中，這通過所述抗體在體外中和(即抑制或阻斷)狂犬病病毒的能力(例如通過RFFIT測定)得到了證明。在另一實施方案中，這通過抗體在受試者如動物或人體內抑制狂犬病病毒感染力的能力得到了證明。
本發明的人單克隆抗體可以以實際上不受限制的量並且以高度純化的形式高效製備。因此，這些抗體適合預測、診斷和/或治療接觸或懷疑已經接觸狂犬病的個體。本發明的抗體特別有利於狂犬病的接觸後預防(PEP)，因為它們不需要人抗狂犬病血清免疫球蛋白的供體來源。這些抗 體可以用本領域公知的用於製備人抗體的多種技術生產。例如，如在本文中例舉的，這些抗體可以在表達人免疫球蛋白基因片段的轉基因動物例如含有人Ig基因座的轉基因小鼠中產生。而且，這些抗體可以單獨施用，或者(例如)與抗狂犬病疫苗或其他抗體聯合施用，以提高感染狂犬病病毒的受試者(例如動物和人)的存活率。因此，本發明提供了幾個優點，包括但不限於如下幾點-完全人類重組抗狂犬病抗體，用於預測、診斷和/或治療受試者中的狂犬病病毒或進行狂犬病病毒接觸後預防(PEP)，例如防止或抑制受試者中由狂犬病病毒介導的發病率或死亡率；-組合物(例如藥物)和/或試劑盒，其中包含一種或多種完全人類重組抗狂犬病抗體，該抗體可以單獨使用或者與商售疫苗聯合使用，以治療受試者的狂犬病感染和/或進行PEP ;和-改進的被動免疫治療方法，用於治療感染狂犬病病毒(例如需要狂犬病病毒接觸後預防(PEP))的受試者，該方法可以單獨使用或者與主動免疫療法(狂犬病疫苗)聯合使用。在一個實施方案中，本發明的人單克隆抗體或其抗原結合部分與狂犬病病毒G糖蛋白特異性結合。特定抗體或其抗原結合部分與狂犬病病毒G糖蛋白N末端一半內的表位特異性結合。其他一些特定抗體或其抗原結合部分與狂犬病病毒C末端結構域內的表位特異性結合。這些表位可以存在於例如狂犬病病毒G糖蛋白的胺基酸1-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-524 內，或其任意間隔、部分或範圍內。在一個實施方案中，該抗體或其抗原結合部分特異性結合狂犬病病毒G糖蛋白的N末端一半內的表位，即大約在胺基酸殘基19-422之間。在另一實施方案中，狂犬病G糖蛋白的表位包含胺基酸殘基336-442。在一個實施方案中，狂犬病G糖蛋白包含胺基酸殘基336以及其變化，如取代或缺失。在一個相關實施方案中，狂犬病G糖蛋白的表位包含線性表位、構象表位、不連續表位或這些表位的組合。在另一相關實施方案中，狂犬病G糖蛋白的表位由抗原位點I、抗原位點II、抗原位點III、抗原位點次要A、或這些抗原位點的組合例如抗原位點III和次要位點A組成。在另外一些實施方案中，人單克隆抗體或其抗原結合部分的特徵為以小於約IOxlO-6M的Kd與狂犬病病毒特異性結合。在一個具體實施方案中，該抗體或其抗原結合部分以至少約10χ1(Γ7Μ、至少約10χ1(Γ8Μ、至少約10χ1(Γ9Μ、至少約ΙΟχΙΟ,Μ、至少約10χ1(ΓηΜ或至少約IOxlO-12M的Kd或甚至更有利的Kd與狂犬病病毒(例如，狂犬病病毒G糖蛋白)特異性結合。在各種其他實施方案中，該抗體或其抗原結合部分包含可變重鏈區，該可變重鏈區包含與克隆 17C7(SEQ ID NO :1)、6G11 (SEQ ID NO :15)、5G5、2B10 或 1E5產生的抗體的可變重鏈區胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或99%以上相同的胺基酸序列。
在另外一些實施方案中，該抗體或其抗原結合部分包含可變輕鏈區，該可變輕鏈區包含與克隆 17C7(SEQ ID NO :2)、6G11 (SEQ ID NO :16)、5G5、2B10 或 1E5產生的抗體的可變輕鏈區胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或99%以上相同的胺基酸序列。在再另外一些實施方案中，該抗體或其抗原結合部分包含可變重鏈區和可變輕鏈
區，該可變重鏈區包含與克隆 17C7 (SEQ ID NO :1)、6G11 (SEQ ID NO : 15)、5G5、2B10 或 1E5產生的抗體的可變重鏈區胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或99%以上相同的胺基酸序列，該可變輕鏈區包含與克隆17C7 (SEQ ID NO :2)、6G11 (SEQ ID NO :16)、5G5、2B10或1E5產生的抗體的可變輕鏈區胺基酸序列至少80 %、85 %、90 %、95 %、98 %、99 %或99 %以上相同的胺基酸序列。在某些其他實施方案中，該抗體或其抗原結合部分特異性結合與被克隆17C7、6G11、5G5、2B10或1E5產生的抗體結合的表位重疊的表位，和/或與克隆17C7、6G11、5G5、2B10或1E5產生的抗體競爭結合狂犬病病毒或其部分。該抗體或其抗原結合部分的可變重鏈和輕鏈區一般包括一個或多個互補決定區(⑶R)。這些⑶R包括⑶R1、⑶R2和⑶R3區。在特定實施方案中，可變重鏈⑶R與克隆17C7(SEQ ID NOs :3，4，5)、6G11 (SEQ ID NO s : 17，18，19)、5G5、2B10 或 1E5 產生的抗體的⑶R(也示於表I中)至少80%、85%、90%、95%或99%或99%以上相同。在另外一些特定實施方案中，可變輕鏈 CDR 與克隆 17C7 (SEQ ID NOs :6，7，8)、6G11 (SEQ ID NOs =20,21,22)、5G5、2B10或1E5產生的抗體的可變輕鏈區CDR(也示於表2中)至少80%、85%、90%、95%或99%或99%以上相同。因此，本發明的特定抗體或部分包含可變重鏈區和可變輕鏈區，該可變重鏈區包含與克隆 17C7(SEQ ID NO s :3，4，5)、6G11 (SEQ ID NOs : 17，18，19)、5G5、2B10 或 1E5 產生的抗體的可變重鏈區⑶R至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或99%以上相同的一個或多個互補決定區(CDR)，該可變輕鏈區包含與克隆17C7 (SEQ ID NOs :6，7，8)、6G11 (SEQID NOs :20, 21,22)、5G5、2B10或1E5產生的抗體的可變輕鏈區CDR至少80%、85%、90%、95 %、98 %、99 %或99 %以上相同的一個或多個⑶R。該抗體或其抗原結合部分的可變重鏈區也可以包括與克隆17C7 (SEQ ID NOs :3，4，5)、6G11(SEQ ID NO s : 17，18，19)、5G5、2B10 或 1E5 產生的抗體的可變重鏈區的 CDR 至少80%、85%、90%、95%或99%或99%以上相同的全部三個CDR，和/或與克隆17C7(SEQID NOs :6，7，8)、6G11(SEQ ID NOs :20，21，22)、5G5、2B10 或 1E5 產生的抗體的可變輕鏈區的CDR至少80%、85%、90%、95%或99%或99%以上相同的全部三個CDR。在本發明的另一實施方案中，人抗體或其抗原結合部分(a)包括由人VH3-30-3或VH3-33基因編碼(即，是其產物)或衍生的重鏈可變區；和/或(b)包括由選自VkL6、Vk L11、Vk L13、Vk L15或Vk L19的人Vk基因編碼或衍生的輕鏈可變區。本發明的人單克隆抗體包括全長抗體，例如包含效應結構域(例如Fe結構域)，以及抗體部分或片段，如單鏈抗體和Fab片段。該抗體還可以與多種治療劑(例如抗病毒藥或毒素)和/或標記物連接。在另一方面，本發明提供了包含雜交瘤克隆17C7、6G11、5G5、2B10或1E5產生的抗體(在此也稱作「17C7」，「6G11」，「5G5」，「2B10」和「1E5」)的抗原結合部分的分離的多肽。
在另一方面，本發明提供了如下分離的核酸，其包括編碼與SEQ ID N0s:13或23至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或99%以上相同的抗體重鏈可變區的序列。本發明也提供了如下分離的核酸，其包括編碼與SEQ ID NO s :14或24至少75%、80%、85%、90^^95^^99%或99%以上相同的抗體輕鏈可變區的序列。本發明還提供了包括單獨(例如從一個或多個載體表達)的任意上述核酸或其組合的表達載體，以及包含這種表達載體的宿主細胞。適合表達本發明的抗體的宿主細胞包括多種真核細胞，例如酵母細胞、哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NSO細胞、骨髓瘤細胞或植物細胞。在另一方面，本發明提供了組合物和試劑盒，其包括一種或多種如本文所述的分離的人單克隆抗體或其抗原結合部分，該抗體或其抗原結合部分與狂犬病病毒特異性結合併且抑制該病毒感染哺乳動物細胞的能力。該組合物或試劑盒還可以包括一種或多種與狂犬病病毒特異性結合的抗體(例如人單克隆或多克隆抗體)或其抗原結合部分。在一個實施方案中，多克隆抗體或其抗原結合部分與狂犬病病毒G糖蛋白特異性結合。在一個特定 實施方案中，該組合物或試劑盒包括以下兩者(a)與第一種狂犬病病毒分離株特異性結合的分離的人單克隆抗體；和(b)與第二種狂犬病病毒分離株特異性結合的分離的人單克隆抗體。本發明還提供治療受試者的狂犬病病毒病的方法，包括以有效抑制狂犬病病毒病例如狂犬病病毒介導的症狀或發病率的量，給受試者施用如本文所述的(即，與狂犬病病毒特異性結合的)分離的人單克隆抗體或其抗原結合部分。本發明的人單克隆抗體或其部分(和包含該抗體或其部分的組合物)可以通過多種合適的方式給受試者給藥，例如靜脈內(IV)、皮下(SC)、優選肌肉內(IM)。該抗體或其抗原結合部分可以單獨給藥或與另外一種治療劑例如第二種人單克隆抗體或其抗原結合部分聯合給藥。在一個實例中，該第二種人單克隆抗體或其抗原結合部分與第二種狂犬病病毒分離株特異性結合，該第二種狂犬病病毒分離株不同於與第一種抗體結合的分離株。在另一實例中，該抗體與另外一種藥物如抗病毒劑一起給藥。在另一實例中，該抗體與多克隆Y-球蛋白(例如人Y-球蛋白)一起給藥。在另一實例中，該抗體在狂犬病病毒疫苗之前、之後或同時給藥。另一方面，本發明提供了製備與狂犬病病毒特異性結合的抗體或其抗原結合部分的方法。在一個實施方案中，該方法包括用包含狂犬病病毒例如活的或滅活的病毒的組合物免疫具有包含人重鏈轉基因和人輕鏈轉基因的基因組的轉基因非人動物，以及從該動物中分離抗體、抗體產生細胞或抗體編碼核酸。狂犬病病毒可以通過(例如)化學處理和/或凍幹來滅活。該方法可以進一步包括評價該抗體與狂犬病病毒或狂犬病病毒G糖蛋白的
彡口口 本發明也提供了通過在宿主細胞中表達編碼人抗體的核酸(例如編碼抗體的抗原結合區部分的核酸)製備抗體或其抗原結合部分的方法。在另一方面，本發明提供了包含上述核酸的雜交瘤或轉染瘤。本發明還提供了一種製備表達與狂犬病病毒特異性結合的抗體的雜交瘤的方法，包括用包含狂犬病病毒或狂犬病病毒G糖蛋白的組合物免疫具有包含人重鏈轉基因和人輕鏈轉基因的基因組的轉基因非人動物；從該動物中分離脾細胞；由該脾細胞產生雜交瘤；以及選擇產生與狂犬病病毒或其狂犬病病毒蛋白質特異性結合的抗體的雜交瘤。用人單克隆抗體治療人類具有幾個優點。例如，這些抗體在人體中比非人抗體免疫原性更低。治療也很迅速，因為該抗體一到達感染部位並直接中和致病的狂犬病病毒，即可發生狂犬病病毒滅活。人抗體也比非人抗體更有效地定位於人體肉的適當部位。此外，該治療對於狂犬病病毒是特異性的，是重組和高度純化的，並且與傳統療法不同，避免了汙染偶發物質的潛在可能性。本發明涉及下述內容第I項.一種分離的人單克隆抗體或其抗原結合部分，它與狂犬病病毒特異性結合併且抑制該病毒感染細胞的能力。第2項.第I項的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分在快速螢光灶抑制試驗(RFFIT)中中和狂犬病病毒。 第3項.第I項的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體在受試者體內抑制狂犬
病病毒。第4項.第I項的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分防止或抑制受試者中狂犬病病毒介導的神經元病理狀況；防止或抑制受試者中狂犬病病毒介導的腦脊髓炎；或防止或抑制受試者中狂犬病病毒介導的麻痺。第5項.第I項的抗體或其抗原結合部分，其中所述狂犬病病毒是選自下組的分尚株CVS_11分尚株、ERA分尚株、Pasteur病毒分尚株、灰狐(德克薩斯州)分尚株、灰狐(亞利桑那州)分離株、北極狐(阿肯色州)分離株、臭鼬(北方中部)分離株、臭鼬(南方中部)分離株、浣熊分離株、叢林狼(德克薩斯州)分離株、狗(德克薩斯州)分離株、蝙蝠(赤蓬毛蝠；田納西州)分離株、蝙蝠(大棕蝠-鼠耳蝠；科羅拉多州)分離株、蝙蝠(鼠耳蝠；華盛頓)分離株、蝙蝠(灰蓬毛蝠；亞利桑那州)分離株、蝙蝠(東美油蝠；阿拉巴馬州)分離株、蝙蝠(巴西犬吻蝠；阿拉巴馬州)分離株、蝙蝠(銀毛蝠；華盛頓)分離株、蝙蝠(大棕蝠；賓夕法尼亞州)分離株、貓鼬(紐約/波多黎各)分離株、狗(阿根廷)分離株、狗(Sonora)分離株、狗(加彭)分離株、狗(泰國)分離株、及其組合。第6項.第I項的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體與狂犬病病毒G蛋白或其片段內的一個或多個表位特異性結合。第7項.第6項的抗體或其抗原結合部分，其中所述表位位於狂犬病病毒G蛋白的胺基酸 19-524、19-439、19-422 或 336-342 之間。第8項.第6項的抗體或其抗原結合部分，其中所述表位包括選自抗原位點I、抗原位點II、抗原位點III、抗原位點次要A及其組合的抗原位點。第9項.第6項的抗體或其抗原結合部分，其中所述表位選自線性表位、構象表位、不連續表位及其組合。第10項.第I項的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分以至少約 ΙχΚΓΜ'ΙχΙΟ Μ'ΙχΚ^Μ'ΙχΙΟ,Μ'ΙχΙΟΑΜ'ΙχΚΓ12。M 或更好的 Kd 與狂犬病病毒的 G蛋白或其片段特異性結合。第11項.第I項的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分包含可變重鏈區，該可變重鏈區包含與SEQ ID NO :1(17C7)或SEQ ID NO :15 (6G11)的可變重鏈區胺基酸序列至少80%相同的胺基酸序列。第12項.第I項的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分包含可變輕鏈區，該可變輕鏈區包含與SEQ ID NO :2(17C7)或SEQ ID NO :16 (6G11)的可變輕鏈區胺基酸序列至少80%相同的胺基酸序列。第13項.第I項的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分包含可變重鏈區，該可變重鏈區包含與SEQ ID NO :1(17C7)或SEQ ID NO :15 (6G11)的可變重鏈區胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。第14項.第I項的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分包含可變輕鏈區，該可變輕鏈區包含與SEQ ID NO :2(17C7)或SEQ ID NO :16 (6G11)的可變輕鏈 區胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。第15項.第13項的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分還包含可變輕鏈區，該可變輕鏈區包含與SEQ ID NO :2(17C7)或SEQ ID NO 16(6G11)的可變輕鏈區胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。第16項.一種分離的人抗體或其抗原結合部分,它與狂犬病病毒G糖蛋白上的表位特異性結合，該表位與被克隆17C7、6G11、5G5、2B10或1E5產生的抗體結合的表位重疊。第17項.一種分離的人抗體或其抗原結合部分，它與狂犬病病毒G糖蛋白上的表位特異性結合，該表位與被人血清免疫球蛋白或鼠單克隆抗體MAb 1112-1 (A. T. C. C.登記號HB 10751)結合的表位重疊。第18項.第17項的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分與人血清免疫球蛋白或鼠單克隆抗體MAb 1112-1 (A.T.C.C.登記號HB 10751)競爭結合狂犬病病毒G蛋白。第19項.第I項的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分的可變重鏈區包含與SEQ ID NOs :3-5 (17C7)中的一個或多個或與SEQ ID NOs :17_19(6G11)中的一個或多個至少80%相同的一個或多個互補決定區(OTR)。第20項.第I項的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分的可變輕鏈區包含與SEQ ID NOs :6-8 (17C7)中的一個或多個或與SEQ ID NOs :20-22 (6G11)的一個或多個至少80%相同的一個或多個互補決定區(OTR)。第21項.第I項的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分的可變重鏈區包含與SEQ ID NOs :3-5 (17C7)中的一個或多個或與SEQ ID NOs :17_19(6G11)中的一個或多個至少95%相同的一個或多個互補決定區(OTR)。第22項.第I項的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分的可變輕鏈區包含與SEQ ID NOs :6-8 (17C7)中的一個或多個或與SEQ ID NOs :20-22 (6G11)中的一個或多個至少95%相同的一個或多個互補決定區(OTR)。第23項.第I項的抗體或其抗原結合部分，其中可變重鏈區包含與SEQ ID NOs 3-5(17C7)中的一個或多個或與SEQ ID NOs :17-19 (6G11)中的一個或多個的可變重鏈區⑶R至少80%相同的三個⑶R。第24項.第I項的抗體或其抗原結合部分，其中可變輕鏈區包含與SEQ ID NOs 6-8(17C7)中的一個或多個或與SEQ ID NOs :22-22 (6G11)中的一個或多個的可變重鏈區⑶R至少80%相同的三個⑶R。
第25項.一種與狂犬病病毒特異性結合的分離的人單克隆抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其抗原結合部分(a)包含由人VH3-30基因或VH3-33基因編碼或衍生的重鏈可變區；且(b)包含由選自Vk L6、Vk L11、V κ L13、V κ L15、或V κ L19的人Vk基因編碼或衍生的輕鏈可 變區。第26項.第25項的抗體，其中重鏈可變區由VH3-33基因編碼或衍生，並且輕鏈可變區由Vk L13編碼或衍生。第27項.第I項的抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其抗原結合部分抑制狂犬病病毒與哺乳動物細胞的結合。第28項.第I項的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分抑制狂犬病病毒G蛋白與哺乳動物細胞的結合。第29項.第I項的抗體，其中所述抗體是全長抗體。第30項.一種分離的多肽，其包含上述任一項的抗體的抗原結合部分。第31項.第I項的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分包含效應結構域。第32項.第I項的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分包含Fe結構域。第33項.第I項的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分是單鏈抗體。第34項.第I項的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分是Fab片段。第35項.第I項的抗體或其抗原結合部分，其還包含標記或毒素。第36項.一種組合物，其包含在藥學上可接受的載體中的上述任一項的抗體或其抗原結合部分。第37項.一種組合物，其包含兩種或多種上述任一項的抗體，其中所述抗體與狂犬病病毒的不同表位結合。第38項.一種分離的核酸，其編碼與狂犬病病毒結合的人抗體的可變區，包含與SEQ ID Ν0:13 或 SEQ ID NO 14, SEQ ID NO :25 或 SEQ ID NO :27 至少 90%相同的序列。第39項.一種表達載體，其包含第38項的核酸。第40項.一種宿主細胞，其包含第38項的核酸。第41項.一種狂犬病疫苗，其包含分離的狂犬病G糖蛋白或其片段。第42項.一種試劑盒，其包括一種或多種如第I項所述的分離的人單克隆抗體或其抗原結合部分，和用於治療狂犬病病毒介導的疾病的說明。第43項.一種治療受試者的狂犬病病毒疾病的方法，該方法包括以有效抑制狂犬病病毒疾病症狀的量給受試者施用上述任一項的分離的人單克隆抗體或其抗原結合部分。第44項.第43項的方法，其中所述受試者是人。第45項.第43項的方法，其中給受試者靜脈內、肌肉內或皮下施用所述抗體或其抗原結合部分。
第46項.第43項的方法，其中所述抗體或其抗原結合部分與第二治療劑聯合施用。第47項.第46項的方法，其中所述第二治療劑是第二種人抗體或其抗原結合部分。第48項.第46項的方法，其中所述第二治療劑是抗病毒劑。第49項.第46項的方法，其中所述第二治療劑是狂犬病病毒疫苗。第50項.第49項的方法，其中所述狂犬病病毒疫苗是狂犬病病毒G蛋白或其片段。 第51項.一種適合治療哺乳動物中狂犬病病毒相關疾病或紊亂的組合物，其包含在藥學上可接受的載體中的第I項的人抗體或其抗原結合片段。第52項.第51項的組合物，其中該組合物還包含第二種與狂犬病病毒結合的人抗體。第53項.一種治療哺乳動物中狂犬病病毒相關疾病或紊亂的方法，包括給該哺乳動物施用兩種或多種與狂犬病病毒結合的抗體或其片段，使狂犬病病毒對細胞的感染力受到抑制。第54項.第53項的方法，其中所述與狂犬病病毒結合的抗體或其片段是選自17C7、6G11、5G5、2B10或1E5的人單克隆抗體。第55項.一種鑑定與狂犬病病毒或其糖蛋白特異性結合的抗體或其片段的方法，包括使該抗體接觸上述任一項的狂犬病G蛋白。第56項.第55項的方法，其中所述抗體是人抗體血清、多克隆抗體或單克隆抗體。第57項.第55項的方法，其中所述抗體與線性表位、構象表位或其組合特異性結
口 ο第58項.第55項的方法，其中確定所述抗體與一種以上的狂犬病病毒株具有交叉反應性。第59項.一種根據第54項的方法鑑定的抗體或其片段。第60項.一種重組狂犬病G蛋白，其包含是線性表位、構象表位或其組合的表位，並且在導入哺乳動物體內時能夠誘導中和抗體。第61項.第60項的糖蛋白，其中所述哺乳動物是人、靈長類動物或小鼠。第62項.第61項的糖蛋白，其中所述小鼠是含有人免疫球蛋白序列的轉基因小鼠。通過下面的詳述和權利要求書，本發明的其他特徵和優點將是顯而易見的。


圖I顯示重組抗狂犬病人抗體(即克隆17C7)的重鏈和輕鏈可變區的胺基酸序列。這些序列分別對應於SEQ ID N0:1和2。標出了各鏈的互補決定區(⑶R)，其對應於SEQ ID NOs :3、4 和 5(重鏈)和 6、7 和 8(輕鏈)。圖2顯示重組抗狂犬病人抗體(即克隆6G11)的重鏈和輕鏈可變區的胺基酸序列。這些序列分別對應於SEQ ID N0:15和16。標出了各鏈的互補決定區(⑶R)，其對應於SEQ ID NOs 17U8 和 19(重鏈)和 20,21 和 22 (輕鏈)。圖3是狂犬病病毒G重組糖蛋白的示意圖，示出了為表位作圖研究而分析的片段。通過免疫沉澱和免疫印跡法測定，確定人抗體17C7與胺基酸殘基19-422內的表位結合。圖4顯示通過RFFIT測定，與人血清(hRIG)相比較，當HuMab 17C7從I : 5連續稀釋到I : 390625時，中和狂犬病病毒。圖5，ERA-N和ERA-CO糖蛋白在293T細胞中表達，在密碼子優化時容易表達(A)，在細胞表面上表達時能夠被17C7結合(B-D)。圖6顯示HuMab 17C7識別狂犬病G外功能區(A)，在非還原條件下(B)以及對於ERA株的G蛋白(C)識別。 圖7顯示根據ELISA⑷和免疫印跡法(B)，HuMab 17C7識別N336K和N336D突變ERA糖蛋白。圖8顯示HuMab 17C7中和細胞的ERA假病毒感染(A-B)，以及ERA G蛋白的各種突變在17C7結合方面的後果(C-D)。圖9顯示ERA G蛋白的各種突變在17C7結合方面的後果(A-B)。發明詳沭為了清楚地理解說明書和權利要求書，下面提供了如下定義。定義本文使用的術語「狂犬病病毒」是指由狂犬病病毒的RNA編碼的病毒體或其部分，例如蛋白質部分，如狂犬病病毒G糖蛋白。術語「抗狂犬病病毒抗體」是與狂犬病病毒或狂犬病病毒產生的或相關的蛋白質、碳水化合物、脂質或其他成分相互作用(例如結合)的抗體。「狂犬病病毒G糖蛋白抗體」是與狂犬病病毒的G糖蛋白或其片段結合的抗體。抗狂犬病病毒或G糖蛋白抗體可以結合表位，例如構象或線性表位，或該病毒或其組分的部分或片段。術語「人抗體」是具有來源於人種系免疫球蛋白序列的可變區和恆定區的抗體。本文所述的人抗體可以包含不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如，通過體外隨機或位點特異性誘變或通過體內體細胞突變引入的突變)。抗狂犬病病毒抗體或其抗原結合部分可以單獨施用或與第二種藥劑聯合施用。受試者可以是感染了或懷疑感染了狂犬病病毒或具有狂犬病病毒介導的疾病的症狀(例如神經病理狀況、腦脊髓炎、或抗狂犬病免疫球蛋白血清滴度)的患者。這種治療可以用來治癒、康復、減輕、緩解、改變、矯正、改善、緩和、好轉或影響感染和與感染有關的疾病、疾病的症狀或患該病的傾向。對於狂犬病病毒感染的臨床處理，「治療」通常被理解為在發病之前預防或防止可能產生的感染。有效治療狂犬病病毒感染的抗狂犬病病毒抗體的量或「治療有效量」是在單劑量或多劑量施用於受試者後有效抑制受試者的狂犬病病毒感染、疾病或其後遺症的抗體量。該抗體或抗體片段的治療有效量可能根據諸如疾病狀態、創傷部位、狂犬病病毒株或分尚株、狂犬病病毒的動物載體、個體的年齡、性別和體重、以及該抗體或抗體部分在個體中引發所需應答的能力等因素而不同。治療有效量也是抗體或抗體部分的治療有益效果超過任何毒性或不利效果的量。抗體抑制可測量參數的能力可以在用於預測在人體中的效力的動物模型系統中評價。例如，如實施例中所述，抗狂犬病病毒抗體保護倉鼠免遭狂犬病病毒致死性攻擊的能力可以預測其在人體中的效力。或者，也可以通過技術人員公知的試驗在體外檢測該化合物調節狂犬病病毒/細胞相互作用例如結合、感染、毒力等的能力來評價抗體或抗體組合物的這種性質。體外試驗包括結合試驗如ELISA和中和試驗。抗狂犬病病毒抗體有效預防疾病的量或該抗體的「預防有效量」是指在單劑量或多劑量施用於受試者後有效預防或延緩狂犬病病毒發病或復發或抑制其症狀的量。但是，如果需要較長的保護間期，可以施用增加的劑量或更頻繁的給藥。例如表示兩種狀態之間量的差異的術語「拮抗」、「誘導」、「抑制」、「加強」、「提高」、「增加」、「降低」等是指兩種狀態之間的差異，例如統計學或臨床顯著的差異。術語「特異性結合」或「與...特異性結合」是指抗體與狂犬病病毒或其部分以至少IxlO-6M的親和力結合的能力，和/或與狂犬病病毒或其部分以至少兩倍於對非特異性抗原的親和力的親和力結合的能力。「抗體」是包含至少一個或兩個重(H)鏈可變區(在此縮寫為VH)和至少一個·或兩個輕(L)鏈可變區(在此縮寫為VL)的蛋白質。VH和VL區可以進一步再分為高變區，稱為「互補決定區」(CDR)，高變區散布在被稱為「構架區」(FR)的更加保守的區域中。構架區和⑶R的範圍已經準確定義(參見，Kabat, E. A.等，Sequences of Proteinsof Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department ofHealth and HumanServices, NIH Publication No. 91-3242，1991，和 Chothia，C.等，J. Mol. Biol. 196 :901-917，1987，引入本文作為參考)。優選地，每個VH和VL由三個CDR和四個FR組成，它們從氨基端到羧基端以如下順序排列FR1，CDRl，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。抗體的VH或VL區還可包括全部或部分重鏈或輕鏈恆定區。在一個實施方案中，該抗體是兩條免疫球蛋白重鏈和兩條免疫球蛋白輕鏈的四聚體，其中免疫球蛋白重鏈和輕鏈例如通過二硫鍵鏈間連接。重鏈恆定區包括三個結構域CH1、CH2和CH3。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。重鏈和輕鏈的可變區包含與抗體相互作用的結合結構域。抗體的恆定區一般介導該抗體與宿主組織或因子(包括免疫系統的各種細胞(例如效應細胞)和經典補體系統第一成分(Clq))的結合。術語「抗體」包括IgA, IgG, IgE, IgD, IgM型(以及它們的亞型)的完整免疫球蛋白，其中免疫球蛋白的輕鏈可以是K或λ型。術語「免疫球蛋白」是指由基本由免疫球蛋白基因編碼的一個或多個多肽組成的蛋白質。公認的人免疫球蛋白基因包括 K、λ、a (IgAl 和 IgA2)、Y (IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)、δ (IgD)、ε (IgE)和μ (IgM)恆定區基因，以及眾多的免疫球蛋白可變區基因。全長免疫球蛋白「輕鏈」(約25Kd和214個胺基酸)的NH2-末端(約110個胺基酸)由可變區基因編碼，C00H-末端由K或λ恆定區基因編碼。全長免疫球蛋白「重鏈」(約50KD和446個胺基酸)類似地由可變區基因(約116個胺基酸)和上述其他恆定區基因之一如Y (編碼約330個胺基酸)編碼。術語「免疫球蛋白」包括具有來自人或非人來源的CDR的免疫球蛋白。免疫球蛋白的構架可以是人、人源化或非人的構架，例如經修飾降低了在人體中的抗原性的鼠構架，或合成構架例如共有序列。成熟的免疫球蛋白/抗體可變區一般不含前導序列。免疫球蛋白/抗體根據它們的恆定區可以進一步區別為不同類別(例如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)和亞類或同種型(例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)。本文使用的術語抗體的「抗原結合部分」(或簡稱為「抗體部分」或「部分」)是指與狂犬病病毒或其組分(例如G糖蛋白)特異性結合的抗體的一部分，例如這樣一種分子其中一條或多條免疫球蛋白鏈不是全長的，但是其與狂犬病病毒或其組分特異性結合。術語抗體的「抗原結合部分」中所包括的結合部分的例子包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CHl結構域組成的單價片段；(ii)F(ab』 )2片段，即包含在鉸鏈區處通過二硫鍵連接的兩條Fab片段的雙價片段；(iii)由VH和CHl結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的VL和VH結構域組成的Fv片段；(V)由VH結構域組成的dAb片段(Ward等(1989)Nature 341 544-546,1989);和(vi)分離的互補決定區(CDR)，其具有足以特異性結合(例如)可變區的抗原結合部分的構架。輕鏈可變區的抗原結合部分和重鏈可變區的抗原結合部分，例如Fv片段的兩個結構域VL和VH，可以利用重組方法通過合成連接體連接在一起，該連接體使它們能夠形成一條蛋白質鏈，其中VL和VH區配對形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv);參見，例如 Bird 等(1988) Science242 :423-426 ；和 Huston 等(1988) Proc. Natl. Acad. Sci.USA85 :5879-5883)。這樣的單鏈抗體也包括在術語抗體的「抗原結合部分」內。這些抗體部分用本領域技術人員公知的常規技 術獲得，並用與完整抗體相同的方法對這些部分進行實用性篩選。術語「單特異性抗體」是指對特定靶標例如表位表現出單一結合特異性和親和力的抗體。該術語包括「單克隆抗體」或「單克隆抗體組合物」，後者在本文使用時是指具有單一分子組成的多種抗體或其部分的製劑。本文使用的術語「重組」抗體是指通過重組方法製備、表達、產生或分離的抗體，例如用轉染到宿主細胞內的重組表達載體表達的抗體，從重組組合抗體文庫中分離的抗體，從人免疫球蛋白基因轉基因動物(例如小鼠)中分離的抗體，或通過包括將人免疫球蛋白基因序列剪接為其他DNA序列的任意其他方法製備、表達、產生或分離的抗體。這些重組抗體包括人源化、CDR移植的、嵌合、體外(例如通過噬菌體展示)產生的抗體，並且可以任選地包含來源於人種系免疫球蛋白序列的恆定區。術語「基本相同」(或「基本同源」)是指第一胺基酸或核苷酸序列含有足夠數目的與第二胺基酸或核苷酸序列相同或等同(例如具有相似的側鏈，例如保守胺基酸置換)的胺基酸殘基或核苷酸，從而該第一和第二胺基酸或核苷酸序列具有相似的活性。對於抗體來說，第二抗體與第一抗體具有相同的特異性並且具有第一抗體的至少50 %的親和力。兩個序列之間「同源性」的計算如下進行。為了最佳比較目的將這些序列進行比對(例如為了最佳比對可以在第一和第二胺基酸或核酸序列的一個或兩個中引入空位，並且為了比較目的可以忽略非同源序列)。為了比較目的而比對的參比序列的長度至少為參比序列長度的50%。然後比較相應胺基酸位點或核苷酸位點處的胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中的位點被與第二序列中相應位點處相同的胺基酸殘基或核苷酸佔據時，這些分子在該位點處相同(此處所用的胺基酸或核酸「同一性」等同於胺基酸或核酸「同源性」)。考慮為了兩個序列之間進行最佳比對所需要引入的空位的數目和每個空位的長度後，兩個序列之間的百分同一性是這兩個序列共有的相同位點的數目的函數。兩個序列之間的序列比較和百分同一性的確定可以用數學算法來實現。兩個胺基酸序列之間的百分同一性用已經整合入GCG軟體包的GAP程序中的Needleman和Wunsch,J. Mol. Biol. 48 =444-453,1970的算法進行確定，其中使用Blossum 62評分矩陣，空位罰分為12，空位延伸罰分為4，移碼空位罰分為5。本文使用的術語「在低嚴格性、中嚴格性、高嚴格性或極高嚴格性條件下雜交」描述了雜交和洗漆的條件。進行雜交反應的指南可見Current Protocols in MolecularBiology，J ohn Wiley & Sons,N. Y. 6. 3. 1-6. 3. 6，1989，在此引用作為參考。該文獻中描述了水性和非水性方法，可以使用其中任意一種。此處所指的具體雜交條件如下1)低嚴格性雜交條件約45°C下6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)，隨後至少在50°C下用O. 2X SSC, O. 1%SDS洗滌兩次(對於低嚴格性條件，洗滌溫度可以提高至55°C) ；2)中嚴格性雜交條件約45°C下6X SSC，然後在60°C下用O. 2X SSC, O. 1% SDS洗滌一次或多次；3)高嚴格性雜交條件約45°C下6X SSC，隨後在65°C下用O. 2X SSC, O. 1% SDS洗滌一次或多次；4)極高嚴格性雜交條件在65°C下O. 5M磷酸鈉，7% SDS，隨後在65°C下用O. 2X SSC, I % SDS洗滌一次或多次。應當理解，此處所述的抗體及其抗原結合部分可以具有另外的保守或非必需胺基酸置換，這對多肽功能沒有實質性影響。具體置換是否被耐受，即是否不會不利地影響需要的生物學性質如結合活性，可以如Bowie等，Science，247 :1306-1310，1990所述確定。「保守胺基酸置換」是指將胺基酸殘基替換為具有相似側鏈的胺基酸殘基。具有相似側鏈的氨
基酸殘基家族在本領域中已經定義。這些家族包括具有鹼性側鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈(例如天冬氨酸、穀氨酸)、不帶電荷極性側鏈(例如天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側鏈(例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、分支側鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的胺基酸。「非必需」胺基酸殘基是可能相對於多肽如結合劑如抗體的野生型序列而改變，但基本不改變生物活性的殘基，而「必需」胺基酸殘基則導致這樣的改變。除非另外定義，本文所用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域技術人員通常理解的同樣的含義。儘管下面描述了合適的方法與材料，但是在本發明的實踐或試驗中也可以使用與此處所述相似或等同的方法與材料。如有衝突，以本說明書包括定義為準。另外，這些材料、方法和實施例都只是說明性的，不是限制性的。概述狂犬病病毒是引起人類致死性腦炎的RNA病毒。本文提供了用於治療和預防狂犬病病毒感染的動物、特別是人類受試者、更特別的是需要接觸後狂犬病治療或接觸後預防(PEP)的人的方法和組合物。該組合物包括識別狂犬病病毒的蛋白質和其他分子組分(例如脂質、碳水化合物、核酸)的抗體，包括識別狂犬病病毒G糖蛋白的抗體或其部分。特別是提供了重組完全人類單克隆抗體。在某些實施方案中，在表達人免疫球蛋白基因區段的小鼠中產生這些人單克隆抗體(下文描述)。也提供了抗狂犬病病毒抗體的組合。新方法包括給受試者施用可與狂犬病病毒結合的抗體(及其抗原結合部分)，以抑制受試者的狂犬病病毒介導的疾病。例如，本文所述的人單克隆抗狂犬病病毒抗體能夠中和狂犬病病毒並且抑制終末期狂犬病感染和腦炎。在其他實例中，可以施用抗狂犬病病毒抗體(例如抗狂犬病病毒G糖蛋白單克隆抗體)的組合，以抑制狂犬病病毒介導的疾病。人單克隆抗體可以在狂犬病感染的創傷部位局部給藥(浸潤)，任選地隨後給予抗狂犬病疫苗。I.抗體的產生免疫原
通常,用狂犬病病毒和/或狂犬病病毒表達的抗原免疫動物，以產生抗體。為了產生抗狂犬病病毒抗體，一般用滅活的狂犬病病毒免疫動物。例如，可以通過化學處理和/或凍幹來滅活狂犬病病毒，幾種狂犬病病毒疫苗可以購買到。結合和中和狂犬病病毒的抗狂犬病病毒抗體能夠與狂犬病病毒的特定表位例如狂犬病病毒G糖蛋白相互作用。例如，抗狂犬病病毒G糖蛋白抗體能夠結合狂犬病病毒G糖蛋白的N末端區或C末端區或其蛋白質或片段的內部區域內的表位(參見實施例4和圖5)或其組合。在一個實例中，結合和中和狂犬病病毒的抗體與狂犬病病毒G糖蛋白的胺基酸19-422內的表位例如線性表位結合。在另一實例中，鑑定了一種抗體，該抗體與狂犬病病毒G糖蛋白的胺基酸19-422內的線性表位和/或構象表位結合。如本文所 述，這些表位也可以用來鑑定其他與狂犬病結合的抗體。在HuMAb小鼠中產生人單克隆抗體可以用無法用於多克隆抗體的方法產生單克隆抗體。多克隆抗血清在動物與動物之間不同，而單克隆製劑則表現出均一的抗原特異性。鼠系統可用於產生單克隆抗體，免疫方案、分離和融合脾細胞的技術和產生雜交瘤的方法和試劑是眾所周知的。單克隆抗體可以用多種技術產生，包括常規單克隆抗體方法，例如Kohler和Milstein，Nature, 256 :495，1975的標準體細胞雜交技術。總的參見Harlow, E.和Lane, D. Antibodies :A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1988。雖然這些標準技術是已知的，但是希望使用人源化或人抗體而不是鼠抗體來治療人類受試者，因為人體會對來自小鼠和其他物種的抗體產生免疫應答。對鼠抗體的免疫應答被稱為人抗鼠抗體或HAMA應答(Schroff，R.等，Cancer Res.，45，879-885，1985)，是在人體中弓I起血清病並且導致鼠抗體從個體循環中被快速清除的情況。已經證明人體中的免疫應答是針對鼠免疫球蛋白的可變區和恆定區的。對於人體施用，人單克隆抗體比來源於其他動物的抗體和人多克隆抗體更安全。產生人單克隆抗體的一種有用的動物是表達人免疫球蛋白基因而不是其自身鼠免疫球蛋白基因的轉基因小鼠。這種轉基因小鼠，例如「HuMAb 」小鼠，含有編碼非重排的人重鏈(μ和Y)和K輕鏈免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座(minilocus)，並且具有使內源μ和K鏈基因座失活的定向突變(參見，例如，Lonberg, N.等，Nature368(6474) :856_859，1994，和美國專利5，770，429)。因此，該小鼠表現為小鼠IgM或κ表達降低，而響應於免疫，引入的人重鏈和輕鏈轉基因經歷類別轉換和體細胞突變，產生高親和力的人IgGK單克隆抗體(Lonberg, N.等,見上；綜述見Lonberg, N. Handbook ofExperimental Pharmacology 113 :49-101,1994 ；Lonberg, N.和 Huszar, D. , Intern.Rev. Tmmunol.，13 :65-93,1995,和 Harding, F.和 Lonberg, N.，Ann. N. Y. Acad. Sci.，764 536-546，1995)。該轉基因小鼠的製備詳細描述於下面的文獻中Taylor, L.等，Nucleic AcidsResearch,20 :6287-6295,1992 ;Chen, J.等，International Immunology 5:647-656,1993 ；Tuaillon 等，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA90 :3720-3724,1993 ；Choi 等，NatureGenetics,4 :117-123,1993 ；Chen, J.等，EMBO J.，12 :821-830, 1993 ；Tuaillon 等，J. Tmmunol· , 152 :2912-2920,1994 ；Taylor, L.等，International Immunology,6 579-591,1994 ;和 Fishwild, D.等，Nature Biotechnology, 14 :845-851,1996。進一步參見，美國專利5，545, 806 ;美國專利5，569，825，美國專利5,625, 126，美國專利5，633，425，美國專利5，661，016，美國專利5，770，429，美國專利5，789，650，美國專利5，814，318，美國專利5，874，299和美國專利5，877，397，均屬於Lonberg和Kay，以及PCT公布WO 01/14424，WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227，和 WO 92/03918。為了產生針對一種抗原的完全人類單克隆抗體,可以如Lonberg, N.等Nature,368(6474) :856-859,1994,Fishwild, D.等，Nature Biotechnology，14 :845_851，1996 和W098/24884所述用免疫原免疫HuMAb小鼠。優選地，小鼠在第一次免疫時為6_16周齡。例如，可以用滅活狂犬病病毒的純化製劑腹膜內免疫HuMAb小鼠。為了產生針對狂犬病病毒蛋白質、脂質和/或碳水化合物分子的抗體，可以用活的、殺死的或不存活的滅活的和/或凍幹的狂犬病病毒免疫小鼠。在另一實施方案中，狂犬病病毒G糖蛋白或其一個或多個片段可以用作免疫原。當最初使用在弗氏完全佐劑中的抗原腹膜內(IP)免疫，接著隔周用在弗氏不完全佐劑中的抗原腹膜內免疫(最多共六次)時，HuMAb轉基因小鼠產生最佳應答。免疫應 答可以在免疫方案進程中用眼眶後取血獲得的血漿樣品進行監測。例如可以通過ELISA或流式細胞術篩查血漿，具有足夠效價的抗狂犬病病毒人免疫球蛋白的小鼠可用於融合。用抗原對小鼠靜脈內加強免疫，3天後處死，並且取出脾臟。預期每種抗原可能需要進行多個融合。每種抗原一般免疫數隻小鼠。分離小鼠脾細胞，按照標準程序用PEG將其與小鼠骨髓瘤細胞系融合。然後對得到的雜交瘤進行抗原特異性抗體產生的篩選。例如，使用50% PEG，將來自被免疫小鼠的脾淋巴細胞的單細胞懸液與六分之一數目的P3X63-Ag8. 653非分泌小鼠骨髓瘤細胞(ATCC，CRL1580)融合。細胞以大約2X IO5接種於平底微量滴定板中，接著在含有20%胎克隆血清、18% 「653」條件培養基、5% Origend GEN)、4mM L-穀氨醯胺、ImM丙酮酸鈉、5mMHEPES、0. 055mM 2-巰基乙醇、50單位/毫升青黴素、50mg/ml鏈黴素、50mg/ml慶大黴素和I X HAT (Sigma ;HAT在融合24小時後加入)的選擇性培養基中培養兩周。兩周後，在用HT替換了 HAT的培養基中培養細胞。然後通過ELISA對各孔的上清液進行人抗狂犬病病毒單克隆IgM和IgG抗體的篩選。將分泌抗體的雜交瘤再次平板接種，再次篩選，如果對於人IgG仍然是陽性，則通過有限稀釋將抗狂犬病病毒單克隆抗體亞克隆至少兩次。然後體外培養穩定的亞克隆，在組織培養基中產生少量抗體用於表徵。在一個實施方案中，用來產生抗狂犬病病毒人抗體的轉基因動物含有至少一個、一般2-10個、有時25-50個或更多拷貝的W098/24884實施例12所述的轉基因(例如pHCl或pHC2)，與含有一個拷貝的W098/24884實施例5、6、8或14所述輕鏈轉基因的動物繁育，其後代與W098/24884實施例10所述的JH缺失的動物繁育，所述專利的內容在此引用作為參考。對於這三種性狀中的每一個來說，這些動物培育為純合的。這些動物具有下列基因型單拷貝(每個染色體單倍體組)的未重排的人重鏈小基因座(W098/24884的實施例12描述)，單拷貝(每個染色體單倍體組)的未重排的人K輕鏈構建體(W098/24884的實施例14描述)，和除去所有功能性JH區段的每個內源小鼠重鏈基因座處的缺失(W098/24884的實施例10描述)。這些動物與對於JH區段缺失而言純合的小鼠(W098/24884的實施例10描述)繁育，產生對於JH區段缺失而言為純合的而對於人重鏈和輕鏈構建體而言為半合的後代。給產生的動物注射抗原，用於產生針對這些抗原的人單克隆抗體。
從該動物中分離的B細胞對於人重鏈和輕鏈是單特異性的，因為它們只含有一個拷貝的每種基因。此外，它們對於人或小鼠重鏈是單特異性的，因為由於如W098/24884實施例9和12所述引入的跨過JH區的缺失，兩個內源小鼠重鏈基因拷貝都無功能性。而且，大部分B細胞對於人或小鼠輕鏈是單特異性的，因為一個拷貝的重排人κ輕鏈基因的表達將等位地和同型地排除在大部分B細胞中內源小鼠κ和λ鏈基因的重排。在一個實施方案中，轉基因小鼠將表現為產生具有重要的所有組成成分(repertoire)的免疫球蛋白，理想地基本類似於原始小鼠。因此，例如，在內源Ig基因已經滅活的實施方案中，總免疫球蛋白水平將為約O. l-10mg/ml血清，例如O. 5-5mg/ml或至少約1.0mg/ml。當向轉基因小鼠中引入能夠實現從IgM到IgG的轉換的轉基因時,成年小鼠血清IgG與IgM的比例優選為約10 : I。在未成熟的小鼠中IgG與IgM的比例將更低。通常，超過約10%，例如約40-80%的脾和淋巴結B細胞將只表達人IgG蛋白質。
轉基因小鼠中的所有組成成分理想地接近於非轉基因小鼠中所顯示的，通常高達至少約10%，優選25-50%或更高。通常產生至少約一千種不同的免疫球蛋白(理想地為IgG)，優選104-106或更多種，這主要取決於引入小鼠基因組中的不同V、J、D區的數目。一般地，免疫球蛋白對預先選擇的抗原表現出至少約io_6m、io_7m、io_8m、io_9m、10_1qM、10_nM、10_12M、10_13M、10_14M或更高、例如可達10_15M或更高的親和力。HuMAb小鼠能夠產生通過轉基因內轉換重組而經歷類別轉換(順式轉換)並且表達對該狂犬病病毒具有反應性的免疫球蛋白的B細胞。該免疫球蛋白可以是人序列抗體，其中重鏈和輕鏈多肽由人轉基因序列編碼，該序列可包括通過體細胞突變和V區重組連接產生的序列，以及種系編碼序列。這些人序列免疫球蛋白可以被稱為與人VL或VH基因區段和人幾或JL區段編碼的多肽序列基本相同，儘管由於體細胞突變和不同的V-J和V-D-J重組連接而可能存在其他非種系序列。對於這些人序列抗體，每條鏈的可變區一般至少80%由人種系V、J基因區段編碼，對於重鏈，由D基因區段編碼。通常，至少85%的可變區由存在於轉基因上的人種系序列編碼。通常90%或95%或更多的可變區序列由存在於該轉基因上的人種系序列編碼。但是，由於通過體細胞突變和VJ和VDJ連接引入了非種系序列，人序列抗體通常具有一些不由人V、D或J基因區段編碼的可變區序列(較不常見地，恆定區序列)，如在小鼠種系中的人轉基因中所見到的。一般地，這些非種系序列(或各個核苷酸位點)將在CDR中或CDR附近聚簇,或者在已知體細胞突變聚集的區域中聚簇。與狂犬病病毒結合的人序列抗體可以由同種型轉換產生，從而產生含有人序列Y鏈(如Y I、Y2或Y3)和人序列輕鏈(如K)的人抗體。這些同種型轉換的人序列抗體通常含有一個或多個體細胞突變，一般位於可變區中，通常在CDR的約10個殘基之中或之內，這是抗原攻擊，特別是接著進行第二(或後續)抗原攻擊引起的B細胞親和成熟和選擇的結果。這些高親和力人序列抗體具有至少約1χ10_9Μ、一般至少5χ10_9Μ、通常高於ΙχΙΟ,Μ、有時為δχΙΟ,Μ至IxKTllM或更高的結合親和力抗狂犬病病毒抗體也能夠在包括非轉基因小鼠、人、兔和山羊的其他哺乳動物中產生。抗狂犬病病毒抗體與狂犬病病毒特異性結合的人單克隆抗體包括本文所述的克隆17C7、6G11、5G5、2B10和1E5產生的抗體(分別稱為抗體克隆17C7、6G11、5G5、2B10和1E5)。具有與17C7、6G11、5G5、2B10或1E5的可變重鏈和輕鏈區至少80%相同的可變重鏈區和可變輕鏈區的抗體也可以與狂犬病病毒結合。在有關實施方案中，抗狂犬病病毒抗體包含，例如，與17C7、6G11、5G5、2B10或1E5的可變重鏈和/或可變輕鏈的⑶R至少80%相同的互補決定區(OTR)。這些抗體克隆的可變重鏈區的⑶R在下面的表I中顯示。表I.可變重鏈⑶R胺基酸序列
抗體克隆 Γ11CDR胺基酸序列SEQ ID NO ~
~17C7HCDRl TYAMH3
~17C7HCDR2 WSYDGRTKDYADSVKG4
~17C7HCDR3 ERFSGAYFDY5
抗體克隆ICDR胺基酸序列SEQ ID NO ~
6G11HCDRl GFTFSSYG17
6G11HCDR2 VAVIL18
6G11HCDR3 ARIAPAGSAFDY19這些抗體克隆的可變輕鏈區的⑶R在下面的表2中顯示。表2.可變輕鏈⑶R胺基酸序列
克隆~Γ11 ~ CDR胺基酸序列SEQ ID NO ~
~17C7 LCDRl RASQSVSSYLA6
~17C7 LCDR2 DASNRAT7
~17C7 LCDR3 QQMNWP8
克隆 I CDR胺基酸序列SEQ ID NO ~
6G11 LCDRl QGISSV20
6G11 LCDR2 DAS21
6G11 LCDR3 QQFNSYPPT22CDR是免疫球蛋白中決定對特定抗原的特異性的部分。在某些實施方案中，具有序列變化(例如保守置換)的對應於表I和表2中CDR的CDR可以與狂犬病病毒結合。例如，與狂犬病病毒結合的抗體(或其抗原結合部分)中可以存在其中CDR中的1、2、3、4或5個殘基或少於總殘基的20%被置換或缺失的⑶R。類似地，抗狂犬病病毒抗體可以具有含有共有序列的CDR，因為在多種抗體之間保守的基序可能對於結合活性至關重要。例如，本發明提供一種或多種⑶R區或公開的⑶R的衍生物的用途。這些衍生⑶R來源於公開的CDR或其部分，任選地在一個以上的胺基酸位置處改變。改變包括一個或多個如本文所述的胺基酸添加、缺失或取代。用於改變的殘基位置的例子包括確定為比其他胺基酸位置經歷更多變異的胺基酸位置，例如，本領域公知的經歷體細胞突變的位置。或者，可以通過比較兩個或多個已知具有所需結合活性的序列，以及確定變化的CDR殘基和恆定的CDR殘基，來確定這些位置。例如，以下列出了 17C7和6G11重鏈和輕鏈可變區的比較(表3-4)，並示出了可以由此確定的CDR衍生或共有序列(表5-6)。表3.重鏈可變區的比較
權利要求
1.一種分離的人單克隆抗體或其抗原結合部分，它與狂犬病病毒G蛋白的抗原位點I、抗原位點II、抗原位點III、或抗原位點次要A內的兩個或多個非重疊表位特異性結合，其中該抗體抑制狂犬病病毒感染細胞的能力。
2.權利要求I的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分在快速螢光灶抑制試驗(RFFIT)中中和狂犬病病毒。
3.權利要求I的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體在受試者體內抑制狂犬病病毒。
4.權利要求I的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分 防止或抑制受試者中狂犬病病毒介導的神經元病理狀況； 防止或抑制受試者中狂犬病病毒介導的腦脊髓炎；或 防止或抑制受試者中狂犬病病毒介導的麻痺。
5.權利要求I的抗體或其抗原結合部分，其中所述狂犬病病毒是選自下組的分離株CVS-Il分離株、ERA分離株、Pasteur病毒分離株、灰狐(德克薩斯州)分離株、灰狐(亞利桑那州)分離株、北極狐(阿肯色州)分離株、臭鼬(北方中部)分離株、臭鼬(南方中部)分離株、浣熊分離株、叢林狼(德克薩斯州)分離株、狗(德克薩斯州)分離株、蝙蝠(赤蓬毛蝠；田納西州)分離株、蝙蝠(大棕蝠-鼠耳蝠；科羅拉多州)分離株、蝙蝠(鼠耳蝠 』華盛頓)分離株、蝙蝠(灰蓬毛蝠；亞利桑那州)分離株、蝙蝠(東美油蝠；阿拉巴馬州)分離株、蝙蝠(巴西犬吻蝠；阿拉巴馬州)分離株、蝙蝠(銀毛蝠；華盛頓)分離株、蝙蝠(大棕蝠；賓夕法尼亞州)分離株、貓鼬(紐約/波多黎各)分離株、狗(阿根廷)分離株、狗(Sonora)分離株、狗(加彭)分離株、狗(泰國)分離株、及其組合。
6.權利要求I的抗體或其抗原結合部分，其中所述表位位於狂犬病病毒G蛋白的胺基酸 19-524、19-439、19-422 或 336-342 之間。
7.權利要求I的抗體或其抗原結合部分，其中所述表位選自線性表位、構象表位、不連續表位及其組合。
8.權利要求I的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分以至少約IxlO-7M, IxlO-8M, IxlO-9M, IxlO-10M, IxlO-nM, IxKT12M 或更好的 Kd 與狂犬病病毒的 G 蛋白或其片段特異性結合。
9.權利要求I的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分包含可變重鏈區，該可變重鏈區包含與SEQ ID NO :1(17C7)或SEQ ID NO :15 (6G11)的可變重鏈區胺基酸序列至少80 %相同的胺基酸序列。
10.權利要求I的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分包含可變輕鏈區，該可變輕鏈區包含與SEQ ID NO :2(17C7)或SEQ ID NO :16 (6G11)的可變輕鏈區胺基酸序列至少80%相同的胺基酸序列。
11.權利要求I的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分包含可變重鏈區，該可變重鏈區包含與SEQ ID NO :1(17C7)或SEQ ID NO :15 (6G11)的可變重鏈區胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
12.權利要求I的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分包含可變輕鏈區，該可變輕鏈區包含與SEQ ID NO :2(17C7)或SEQ ID NO :16 (6G11)的可變輕鏈區胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
13.權利要求13的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分還包含可變輕鏈區，該可變輕鏈區包含與SEQ ID NO :2(17C7)或SEQ ID NO :16 (6G11)的可變輕鏈區胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
14.一種分離的人抗體或其抗原結合部分，它與被一種抗體識別的表位特異性結合，該抗體包含分別如SEQ ID NO 2(17C7)或SEQ ID NO 16(6G11)所示的輕鏈可變區胺基酸序列和如SEQ ID NO 1(17C7)或SEQ ID NO 15(6G11)所示的重鏈可變區胺基酸序列。
15.一種分離的人抗體或其抗原結合部分，它與狂犬病病毒G糖蛋白上的表位特異性結合，該表位與被人血清免疫球蛋白或鼠單克隆抗體MAb 1112-1 (A.T.C.C.登記號HB10751)結合的表位重疊。
16.權利要求15的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分與人血清免疫球蛋白或鼠單克隆抗體MAb 1112-1 (A.T.C.C.登記號HB 10751)競爭結合狂犬病病毒G蛋白。
17.權利要求I的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分的可變重鏈區包含與SEQ ID NOs :3-5 (17C7)中的一個或多個或與SEQ ID NOs :17_19(6G11)中的一個或多個至少80%相同的一個或多個互補決定區(OTR)。
18.權利要求I的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分的可變輕鏈區包含與SEQ ID NOs :6-8 (17C7)中的一個或多個或與SEQ ID NOs :20-22 (6G11)的一個或多個至少80%相同的一個或多個互補決定區(OTR)。
19.權利要求I的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分的可變重鏈區包含與SEQ ID NOs :3-5 (17C7)中的一個或多個或與SEQ ID NOs :17-19 (6G11)中的一個或多個至少95%相同的一個或多個互補決定區(OTR)。
20.權利要求I的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分的可變輕鏈區包含與SEQ ID NOs :6-8 (17C7)中的一個或多個或與SEQ ID NOs :20-22 (6G11)中的一個或多個至少95%相同的一個或多個互補決定區(OTR)。
21.權利要求I的抗體或其抗原結合部分，其中可變重鏈區包含與SEQID NOs 3-5(17C7)中的一個或多個或與SEQ ID NOs :17-19 (6G11)中的一個或多個的可變重鏈區⑶R至少80%相同的三個⑶R。
22.權利要求I的抗體或其抗原結合部分，其中可變輕鏈區包含與SEQID NOs 6-8(17C7)中的一個或多個或與SEQ ID NOs :20-22 (6G11)中的一個或多個的可變重鏈區⑶R至少80%相同的三個⑶R。
23.上述任一項權利要求的抗體或其抗原結合部分，其中該抗體與抗原表位III和次要A內的兩個或多個非重疊表位結合。
24.權利要求I的抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其抗原結合部分 (a)包含由人VH3-30基因或VH3-33基因編碼的重鏈可變區；且 (b)包含由選自VkL6、Vk L11、Vk L13、Vk L15、或Vk L19的人Vk基因編碼的輕鏈可變區。
25.權利要求24的抗體，其中重鏈可變區由VH3-33基因編碼或衍生，並且輕鏈可變區由Vk L13編碼或衍生。
26.權利要求I的抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其抗原結合部分抑制狂犬病病毒與哺乳動物細胞的結合。
27.權利要求I的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分抑制狂犬病病毒G蛋白與哺乳動物細胞的結合。
28.權利要求I的抗體，其中所述抗體是全長抗體。
29.一種分離的多肽，其包含上述任一項權利要求的抗體的抗原結合部分。
30.權利要求I的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分包含效應結構域。
31.權利要求I的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分包含Fe結構域。
32.權利要求I的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分是單鏈抗體。
33.權利要求I的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分是Fab片段。
34.權利要求I的抗體或其抗原結合部分，其還包含標記或毒素。
35.一種組合物，其包含在藥學上可接受的載體中的上述任一項權利要求的抗體或其抗原結合部分。
36.一種組合物，其包含兩種或多種上述任一項權利要求的抗體，其中所述抗體與狂犬病G糖蛋白的不同表位結合。
37.一種分離的核酸，其編碼與狂犬病病毒結合的人抗體的可變區，包含與SEQ ID NO:13 或 SEQ ID NO 14, SEQ ID NO :25 或 SEQ ID NO :27 至少 90%相同的序列。
38.一種表達載體,其包含權利要求37的核酸。
39.一種宿主細胞，其包含權利要求37的核酸。
40.一種狂犬病疫苗，其包含分離的狂犬病G糖蛋白或其片段。
41.一種試劑盒，其包括一種或多種如上述任一項權利要求所述的分離的人單克隆抗體或其抗原結合部分，和用於治療狂犬病病毒介導的疾病的說明。
42.—種治療受試者的狂犬病感染的方法,該方法包括 以有效治療受試者的量給受試者施用上述任一項權利要求的分離的人單克隆抗體或其抗原結合部分或組合物。
43.權利要求42的方法，其中所述受試者是人。
44.權利要求42的方法，其中給受試者靜脈內、肌肉內或皮下施用所述抗體或其抗原結合部分。
45.權利要求42的方法，其中所述抗體或其抗原結合部分與第二治療劑聯合施用。
46.權利要求45的方法，其中所述第二治療劑是第二種人抗體或其抗原結合部分。
47.權利要求45的方法，其中所述第二治療劑是抗病毒劑。
48.權利要求45的方法，其中所述第二治療劑是狂犬病病毒疫苗。
49.權利要求48的方法，其中所述狂犬病病毒疫苗是狂犬病病毒G蛋白或其片段。
50.一種鑑定與狂犬病病毒G蛋白的兩個或多個非重疊表位特異性結合的抗體或其片段的方法，該方法包括使該抗體接觸選自抗原位點I、抗原位點II、抗原位點III、或抗原位點次要A或其組合的抗原位點內的表位，並且鑑定具有所述結合活性的抗體。
51.權利要求50的方法，其中所述抗體是人抗體血清、多克隆抗體或單克隆抗體。
52.權利要求50的方法，其中所述抗體與線性表位、構象表位或其組合特異性結合。
53.權利要求50的方法,其中確定所述抗體與一種以上的狂犬病病毒株具有交叉反應性。
54.一種根據權利要求53的方法鑑定的抗體或其片段。
55.一種組合物，其包含一種或多種肽，所述肽一起包含狂犬病病毒G蛋白的抗原位點I、抗原位點II、抗原位點III、或抗原位點次要A內的兩個或多個非重疊表位，其中該組合物在導入哺乳動物體內時能夠誘導中和抗體。
56.權利要求55的組合物，其中所述哺乳動物是人、靈長類動物或小鼠。
57.權利要求55的組合物，其中所述小鼠是含有人免疫球蛋白序列的轉基因小鼠。
58.一種分離的單複製人抗體或其抗原結合部分，所述分離的單複製人抗體或其抗原結合部分 (a)與特異性結合狂犬病病毒G蛋白並且抑制所述病毒感染細胞的能力的、下述分離的單克隆抗體或其抗原結合部分競爭結合狂犬病病毒G蛋白，其中，所述分離的單克隆抗體包含如SEQ ID NO: 5所示的重鏈可變區⑶R3序列、如SEQ ID NO :8所示的輕鏈可變區CDR3序列、如SEQ ID NO 4所示的重鏈可變區CDR2序列、如SEQ ID NO 7所示的輕鏈可變區CDR2序列、如SEQ ID NO 3所示的重鏈可變區CDRl序列和如SEQ ID NO 6所示的輕鏈可變區⑶Rl序列，並且 (b)中和表8中列出的所有狂犬病病毒。
全文摘要
本發明提供了與狂犬病病毒特異性結合的人單克隆抗體，其抗原結合部分，以及製備和應用該抗體及其抗原結合部分治療受試者中狂犬病病毒的方法。
文檔編號A61K39/205GK102936284SQ201210409919
公開日2013年2月20日 申請日期2006年2月2日 優先權日2005年2月2日
發明者W·D·小託馬斯, D·安布羅西諾, R·曼德爾, S·舍恩霍夫, G·J·巴布科克, C·魯普雷希特 申請人:麻薩諸塞州大學, 美國疾病控制與預防中心