抗體疫苗綴合物及其用途的製作方法

2023-12-08 22:07:51

專利名稱：抗體疫苗綴合物及其用途的製作方法
相關申請本申請要求2003年1月31日申請的美國臨時專利申請第60/443,979號的優先權。上述申請的全部內容通過引用結合到本文中。
背景技術：
免疫應答起始於專職抗原呈遞細胞(APC)水平，此類細胞包括存在於機體組織中的樹突細胞(DC)和巨噬細胞(Mg)。DC表達高水平的細胞表面分子和與T淋巴細胞相互作用的補體受體，從而誘導有效的免疫應答。DC也分泌細胞因子、趨化因子和蛋白酶，這些物質啟動免疫應答並使細胞和體液兩種免疫的擴增達到頂點。
DC在其表面表達結合抗原片段的主要組織相容性複合體(MHC)分子。表達識別這類抗原-MHC複合體的T細胞受體(TCR)的T細胞成為活化的並啟動免疫級聯。一般而言，有兩種類型的MHC分子，MHC I類和MHC II類分子。MHC I類分子將抗原呈遞給特異性分化群(CD)8+T細胞，MHC II類分子將抗原呈遞給特異性CD4+T細胞。
為有效治療許多疾病，特別是癌，疫苗必須引發有效的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)應答，亦稱細胞毒性T細胞應答。細胞毒性T細胞主要包括在MHC I類情況下識別抗原的CD8+T細胞。與MHC I類分子有關的抗原加工明顯與MHC II類分子的不同。外源性遞送到APC的抗原主要與MHC II類分子一起加工。與此相對，由於MHC I類分子位於細胞內，內源性遞送到APC的抗原主要與MHC I類分子一起加工。這不僅對APC成立，對所有表達MHC I類分子，並在它們的表面連續展示與MHC I類分子相關的內源產生的抗原的有核細胞也成立。
由於這個原因，當病毒或腫瘤抗原作為結合在MHC I類分子上的肽被展示時，表達獨特蛋白的感染病毒的細胞或腫瘤細胞可被CTL靶向。然而，在特定條件下，DC也能使外源抗原進入內部區室結合到MHC I類分子上，致使它們經由MHC I類和II類兩種途徑呈遞給T細胞。此過程稱為交叉敏化或交叉呈遞。
因此，儘管抗體介導應答已經證明對具體疾病的給人留下深刻印象的預防或治療功效，但當針對具體分泌的或細胞表面抗原時，許多疾病的最有效免疫療法看來都要求T細胞介導免疫應答，尤其是CTL應答。由於有效的CTL應答並不限於細胞外抗原，所以有可能開發不為有效抗體靶的基於抗原的治療疫苗。因此，響應疾病相關抗原而發生的CTL新的產生方法具有重大意義，因為，一般認為這些細胞對許多疫苗是至關重要的，並對大多數治療性癌疫苗是必不可少的。
至今，一種已經過測試的接種方法使用抗原肽進行免疫。此免疫方法繞過抗原攝取和加工的需求，並依賴所述肽直接結合到已經表達在APC表面的MHC I類分子的能力。儘管此方法已經清楚地顯示出患者體內CTL誘導的證據，但是該方法有一些限制。所述抗原肽一定要預先建立，不同的肽要求具有不同MHC單元型的個體，並且肽在體內存活期短。
另一種已經過測試的接種方法使用抗體-抗原複合物。Paul等(62)表明，特異性針對所給抗原的抗體會增加小鼠針對所述抗原的體液免疫應答，大概通過將免疫複合物傳遞給表達在APC上的IgG的Fc受體(FcγR)。Wernersson及其同事(63)用免疫複合物研究個體FcγR在增強體內免疫應答中的作用。他們的研究證明FcγRI足以介導增強的免疫應答。然而，這類免疫複合物並不特異性靶向APC，雖然它們也在許多與抗原呈遞無關細胞上結合Fc受體，由此降低抗原遞送的效率。
後來的研究已經使用了將抗原選擇性地靶向APC上的各種受體的抗體，並且已經證明這類選擇性給予能夠誘導體液應答(66，67)。此外，在MHC I類情況下，已經表明結合到DC上FcR上的免疫複合物被加工並呈遞(64，65)。此外，許多這類FcR-靶向方法是受限制的，因為FcR被表達在許多非APC例如血小板和嗜中性白細胞上。理想條件下，特異性靶向APC並能夠誘導有效MHC I類限制性CTL應答，以及誘導有效MHC II類-限制性TH應答的疫苗可在治療某些疾病上提供增強的功效。
類似地，甘露糖基化抗原已經表現出誘導體液免疫應答和T細胞介導免疫應答，例如CTL應答。然而，甘露糖基化抗原不特異性靶向APC，原因在於其它甘露糖結合蛋白非常豐富。而且，甘露糖基化蛋白由未成熟DC通過大胞飲機制內化。因此，通過抗原的甘露糖基化產生的機制和免疫應答的性質與通過用抗體將抗原特異性靶向甘露糖受體所產生的截然不同。
由於現有方法並沒有有效和特異地靶向APC，許多治療用疫苗要求從患者中純化DC，接觸抗原後再回輸給同一患者。
因此，存在能夠有效靶向APC和產生抗原特異性T細胞介導免疫應答(包括抗原特異性CTL應答，其為有效治療許多疾病所必需的)改進疫苗的需要。
發明概述本發明提供基於抗體的疫苗和產生有效治療許多疾病所必需的抗原特異性T細胞介導免疫應答的方法。具體地說，有效抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)應答通過用結合到表達於APC的特定受體上的抗體，將一種或多種蛋白抗原靶向抗原呈遞細胞(APC)來誘導。優選的受體包括C-凝集素，尤其是表達於樹突細胞(DC)和巨噬細胞兩者上的人甘露糖受體。如本發明的方法所證明，用抗體-抗原綴合物靶向甘露糖受體導致經由MHC I類和II類兩種途徑加工抗原。因此，抗原特異性CTL(例如CD8+T細胞)被誘導，其它重要的效應T細胞，包括輔助T細胞(例如CD4+T細胞)也被誘導。
因此，一方面，本發明通過形成抗原和結合到人APC上的單克隆抗體(例如結合到表達於人APC上的人甘露糖受體上的單克隆抗體)的綴合物，提供一種誘導或增強針對抗原的CTL應答的方法。然後，使綴合物在體內或活體外與APC接觸，致使抗原以誘導或增強針對抗原的CTL應答(例如CD8+細胞毒性T細胞介導的應答)的方式被內化、加工並呈遞給T細胞。在一個優選實施方案中，這也用來誘導針對抗原的輔助T細胞應答(例如CD4+輔助T細胞介導的應答)。因此，免疫應答經由MHC I類和MHC II類兩種途徑誘導。APC也可與佐劑、刺激樹突細胞增殖的細胞因子和/或免疫刺激劑接觸以進一步增強免疫應答。
不少合適的抗體可用於本發明綴合物中，包括但不限於來源於任何物種(例如人、鼠、兔等)的抗體和/或基因工程和重組表達的抗體(例如嵌合抗體、人源化抗體和人抗體)。優選的抗體包括人單克隆抗體。用於本發明的抗體也可包括任何抗體同種型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD或IgE，儘管優選的抗體為IgG同種型。抗體可為全抗體或其抗原結合片段，包括例如Fab、F(ab′)2、Fv和單鏈Fv片段。
用於本發明的優選抗體包括結合到人甘露糖受體上的人單克隆抗體。在一個實施方案中，抗體由人重鏈和人κ輕鏈核酸編碼，該核酸在其可變區中包含分別示於SEQ ID NO3和SEQ ID NO7的核苷酸序列，或者與SEQ ID NO3或SEQ ID NO7同源性足夠高的核苷酸序列，致使抗體保持結合到樹突細胞上的能力。
另一些優選的人抗體包括以結合到人甘露糖受體上並具有人重鏈可變區和人κ輕鏈可變區為特徵的抗體，可變區包含分別示於SEQID NO4和SEQ ID NO8的胺基酸序列，或者與SEQ ID NO4或SEQID NO8同源性足夠高的胺基酸序列，致使抗體保持結合到樹突細胞上的能力。
另一些本發明具體人抗體包括包含互補決定區(CDR)的抗體，互補決定區具有人重鏈和輕鏈CDR1區、人重鏈和輕鏈CDR2區及人重鏈和輕鏈CDR1區，其中(a)人重鏈CDR1、CDR2和CDR3區包含選自圖8中顯示的CDR1、CDR2和CDR3區的胺基酸序列(SEQ ID NO13、14、15)，及其保守序列修飾(conservative sequence modifications)；和(b)人輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區包含選自圖9中顯示的CDR1、CDR2和CDR3區的胺基酸序列(SEQ ID NO16、17、18)，及其保守序列修飾。
得自具體種系序列的抗體，例如，用人免疫球蛋白序列從系統中獲得的抗體，如通過免疫攜帶人免疫球蛋白基因的轉基因小鼠或通過篩選人免疫球蛋白基因文庫獲得的抗體，也包括在本發明中。
用於本發明的人抗體可在宿主細胞中重組產生，例如含有抗體重鏈和輕鏈編碼核酸的轉染瘤(例如由無限增殖化CHO細胞或淋巴細胞組成的轉染瘤)，或者直接得自表達抗體的雜交瘤(例如其包括得自轉基因非人類動物如轉基因小鼠的B細胞，其基因組包含編碼抗體的人重鏈轉基因和人輕鏈轉基因，並且與無限增殖化細胞融合)。在一個具體實施方案中，抗體由雜交瘤產生，或者由含有人重鏈和人輕鏈核酸的宿主細胞(例如CHO細胞)轉染瘤產生，所述人重鏈和人輕鏈核酸分別包含核苷酸序列SEQ ID NO3和7，及其保守修飾。
用於本發明的合適抗原包括任何抗原或其抗原部分，其為保護性或治療性免疫應答所必需的，包括例如各種腫瘤和感染性疾病。具體的抗原其中可選自人絨毛膜促性腺激素β亞單位(βhCG)、Gp100、前列腺相關抗原(PSA)、Pmel-17、來源於結腸、肺、胰腺、乳腺、卵巢和生殖細胞的腫瘤細胞抗原、病毒蛋白、細菌蛋白、糖類和真菌蛋白。根據本發明，這類抗原結合抗體以形成高度有效的抗體疫苗綴合物。
另一方面，本發明提供具體包括與結合人甘露糖受體的抗體連接的βhCG的抗體疫苗綴合物。在一個實施方案中，所述綴合物包含與βhCG連接的人重鏈，例如本文所述的其重鏈包含SEQ ID NO10中所示的胺基酸序列的B11-βhCG綴合物。也提供單鏈形式的B11-βhCG綴合物，其包含SEQ ID NO12中所示的胺基酸序列。
本發明還提供含有一種或多種本發明抗體疫苗綴合物的組合物(例如藥物組合物)。
所述組合物可額外包括一種或多種佐劑或其它已知增強免疫應答和/或增加APC活性的試劑。
根據下文的發明詳述和所附權利要求書，本發明其它特徵和優點將會是顯而易見的。
附圖簡述

圖1顯示分子綴合物(SEQ ID NO11和12)圖譜，該綴合物編碼含有與βhCG抗原連接的單鏈B11抗體的融合蛋白(pB11sfv-βhCG)。
圖2顯示分子綴合物(SEQ ID NO9和10)圖譜，該綴合物編碼含有與βhCG抗原連接的全B11抗體的融合蛋白(βhCG-B11構建體)。
圖3是分子綴合物的示意圖。抗原與完整抗體的重鏈發生遺傳性融合。
圖4是流式細胞術研究的圖，顯示βhCG-B11構建體特異性結合表達MR的培養的人DC。
圖5是一幅曲線圖，顯示βhCG-B11構建體誘導βhCG特異性細胞毒性T細胞。
圖6是一幅柱狀圖，顯示βhCG-B11構建體誘導βhCG特異性細胞毒性T細胞。
圖7是一幅柱狀圖，顯示βhCG-B11構建體誘導T輔助應答。
圖8顯示帶有指定CDR區(SEQ ID NO13、14和15)的人單克隆抗體B11的重鏈V區核苷酸序列(SEQ ID NO3)和相應的胺基酸序列(SEQ ID NO4)。
圖9顯示帶有指定CDR區(SEQ ID NO16、17和18)的人單克隆抗體B11的輕(κ)鏈V區核苷酸序列(SEQ ID NO7)和相應的胺基酸序列(SEQ ID NO8)。
圖10是根據運用基於網絡的預測算法(BIMAS SYFPEITHI)分析，顯示βhCG-B11構建體的預測T細胞表位的示意圖。發現T細胞表位潛在結合HLA-A2、HLA-B7和HLA-DR分子。根據βhCG-B11的B11區段，也預測了一些表位。在長37個胺基酸的C端肽中沒有鑑定出T細胞表位。
圖11是一幅曲線圖，顯示對βhCG-B11構建體特異性的CTL識別由DC呈遞的scFv形式的抗原，B11sfv-βhCG。
圖12顯示人單克隆抗體B11重鏈V區的胺基酸序列(SEQ IDNO4)和種系序列(SEQ ID NO30)即VH5-51種系，並將其進行比較。
圖13顯示人單克隆抗體B11重鏈V區的核苷酸序列(SEQ IDNO3)和種系序列(SEQ ID NO29)即VH5-51種系，並將其進行比較。
圖14顯示帶有指定CDR區的人單克隆抗體B11輕(κ)鏈V區的胺基酸序列(SEQ ID NO8)和種系序列(SEQ ID NO32)即Vκ5-L15種系，並將其進行比較。
圖15顯示帶有指定CDR區的人單克隆抗體B11輕(κ)鏈V區的核苷酸序列(SEQ ID NO7)和種系序列(SEQ ID NO31)即Vκ5-L15種系，並將其進行比較。
發明詳述本發明基於這樣的發現用針對特定細胞受體的抗體將抗原靶向抗原呈遞細胞(APC)，可以產生重要的T細胞介導的免疫應答。準確地說，為了有效治療癌症和感染性疾病等多種疾病，疫苗必須誘發有效的抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)應答，在MHC I類情況下主要由識別抗原的CD8+T細胞所介導。為了優化免疫，優選伴有其它重要的效應T細胞功能，包括誘導抗原特異性輔助T細胞，例如在MHC II類途徑情況下識別抗原的CD4+T細胞。因此，有效的疫苗應當誘導抗原特異性CTL，優選與其它T細胞介導免疫應答一道經由多種MHC途徑誘導抗原特異性CTL。
因此，本發明提供新型基於抗體的疫苗綴合物和誘導或增強抗原特異性細胞毒性T細胞(CTL)應答的方法。本發明療法使用包含抗體的分子綴合物，所述抗體結合到帶有抗原的抗原呈遞細胞(APC)上，例如樹突細胞(DC)和巨噬細胞。
靶向APC的抗體是本領域已知的，並且包括例如靶向APC上I類或II類主要組織相容性(MHC)決定簇的抗體(78，79，81，83)。其它抗體包括靶向APC上Fc受體的抗體(77，79，80，81，82，83)，以及B細胞上的表面免疫球蛋白(84)。
在一個本文示例性的具體實施方案中，分子綴合物包括結合到人DC上甘露糖受體(MR)上的與βhCG抗原連接的抗體。這類綴合物可與APC在體內或活體外接觸以產生所需的CTL應答。
為使本發明更易於理解，首先定義某些術語。其它的定義在發明詳述中給出。
本文所用的術語「抗原呈遞細胞(APC)」是指一類免疫細胞，該細胞能夠以能被免疫系統識別的方式內化並加工抗原，致使抗原決定簇作為MHC相關複合體呈遞在細胞表面(例如MHC I類限制性細胞毒性T淋巴細胞和/或MHC II類限制性輔助T淋巴細胞)。使得細胞起APC作用的兩個必要性質為加工吞入細胞的抗原的能力和表達MHC基因產物的能力。APC的實例包括樹突細胞(DC)、單核吞噬細胞(例如巨噬細胞)、B淋巴細胞、皮膚朗格漢斯細胞(Langerhans cells)和人體中的內皮細胞。
本文所用的術語「樹突細胞(DC)」，包括未成熟DC和成熟DC和能夠分化成DC的相關骨髓樣祖細胞或相關抗原呈遞細胞(例如單核細胞和巨噬細胞)。DC表達高水平的細胞表面分子和與T淋巴細胞相互作用的補體受體(例如C型凝集素，諸如甘露糖受體)，因此能夠誘導有效的免疫應答。DC也分泌細胞因子、趨化因子和蛋白酶，這些物質能夠啟動免疫應答並使細胞免疫和體液免疫的擴增達到頂點。DC也在其表面表達結合抗原片段的主要組織相容性複合體(MHC)分子。識別這些抗原-MHC複合體的T細胞成為活化的並啟動免疫級聯。在一個優選實施方案中，本發明分子綴合物的抗體部分結合到樹突細胞上，導致樹突細胞內化所述綴合物。
術語「巨噬細胞甘露糖受體」或「MR」是指C型凝集素受體家族成員，其特徵在於胞外部分重複的糖識別域(CDR)和含有兩種推定網格蛋白打靶序列的短胞質尾區(34，35，37)。此外，MR含有N端豐富的半胱氨酸和纖連蛋白域。甘露糖受體的不同域具有特異性結合各種配體的能力，包括溶酶體酶、微生物、垂體激素、糖胺聚糖和硫酸化血型抗原(38-40)。
「MHC分子」包括兩類分子，MHC I類和MHC II類。MHC I類分子將抗原呈遞給特異性CD8+T細胞，MHC II類分子將抗原呈遞給特異性CD4+T細胞。外源性遞送到APC的抗原主要與MHC II類分子一起加工。與此相對，內源性遞送到APC的抗原主要與MHCI類分子一起加工。但是，在特殊情況下，除MHC II類分子以外，DC具有獨特的能力使外源抗原進入內部區室以結合到MHC I類分子上。這一過程稱為「交叉敏化」或「交叉呈遞」。
本文所用的術語抗原「交叉呈遞」是指經由APC上的MHC I類和II類兩種分子將外源蛋白抗原呈遞給T細胞。
本文所用的術語「T細胞介導的應答」是指所有由T細胞，包括效應T細胞(例如CD8+細胞)和輔助T細胞(例如CD4+細胞)介導的應答。T細胞介導的應答包括例如T細胞細胞毒性和增殖。
本文所用的術語「細胞毒性T淋巴細胞(CTL)應答」是指由細胞毒性T細胞誘導的免疫應答。CTL應答主要由CD8+T細胞介導。
本文所用的術語「抗體」包括全抗體或其抗原結合片段(包括例如Fab、F(ab′)2、Fv和單鏈Fv片段。合適的抗體包括任何形式的抗體，例如鼠抗體、人抗體、嵌合抗體或人源化抗體和任何類型的抗體同種型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD或IgE同種型。本文所用「同種型」是指由重鏈恆定區基因編碼的抗體類別。
全抗體含有通過二硫鍵相互連接的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈。每條重鏈由重鏈可變區(在本文縮寫為HCVR或VH)和重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由CH1、CH2和CH3三個區組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(在本文縮寫為LCVR或VL)和輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個CL區組成。VH區和VL區可進一步細分為高變區，稱為「互補決定區(CDR)」，該區散在更保守的區域中，所述保守區稱為構架區(FR)。每個VH和VL由三個CDR和四個FR組成，按照以下順序從氨基端到羧基端排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈可變區和輕鏈可變區含有與抗原相互作用的結合域。抗體恆定區可介導免疫球蛋白結合到宿主組織或因子上，包括免疫系統的各種細胞(例如效應細胞)和經典補體系統的第一組分(Clq)。
優選的本發明抗體包括人抗體，例如具有IgG1(例如IgG1k)重鏈和κ輕鏈的人抗體。其它優選的本發明抗體結合人DC，例如結合人DC上C型凝集素受體的抗體，如人DC上的MR。在一個具體實施方案中，所述抗體為人單克隆抗體，該抗體結合到經SDS-PAGE測定分子量約為180kD的人巨噬細胞甘露糖受體(在本文亦稱「人B11抗原」)上。產生這類抗體的方案描述於WO 01/085798，其所述內容通過引用結合到本文中。具體人抗體包括包含分別如SEQ ID NO2和SEQ ID NO6中所示的重鏈可變區和輕鏈可變區胺基酸序列的抗體，或者與SEQ ID NO2或SEQ ID NO6同源性足夠高的胺基酸序列，致使所述抗體保持結合到樹突細胞上的能力。
本文所用的術語抗體的「抗原結合部分」(或簡稱「抗體部分」)，是指一種或多種保持特異性結合到抗原(例如樹突細胞上的抗原)上能力的抗體片段。已經證明，抗體的抗原結合功能可由全長抗體片段執行。包括在術語抗體的「抗原結合部分」之內的結合片段的實例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1區組成的單價片段；(ii)F(ab′)2片段，包含由二硫橋在鉸鏈區連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH和CH1區組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的VL區和VH區組成的Fv片段，(v)由VH區組成的dAb片段(Ward等，(1989)Nature341544-546)；和(vi)分離的互補決定區(CDR)。而且，儘管Fv片段的VL和VH兩個區由獨立的基因編碼，但是它們可以連接在一起，方式為用重組方法，通過合成接頭使它們以單一蛋白鏈形式產生，其中VL區和VH區配對形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如Bird等(1988)Science242423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA855879-5883)。這類單鏈抗體也意指包括在術語抗體的「抗原結合部分」之內。這些抗體片段用本領域技術人員已知的常規技術獲得，並且以與完整抗體相同方式篩選所述片段的實用性。
本文所用術語「人抗體」，是用來包括具有來源於人種系免疫球蛋白序列的可變區和恆定區的抗體。本發明的人抗體可包括不為人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如隨機或體外定點誘變或由體內體細胞突變引入的突變)。然而，本文所用的術語「人抗體」，不是用來包括抗體中來源於另一哺乳動物種系(例如小鼠)的CDR序列例如已經移植到人構架序列中的抗體。
本文所用的術語「單克隆抗體」或「單克隆抗體組合物」是指單分子組合物的抗體分子製劑。單克隆抗體組合物對特定表位表現出單一結合特異性和結合親和性。因此，術語「人單克隆抗體」是指表現出單一結合特異性的抗體，其可變區和恆定區來源於人種系免疫球蛋白序列。在一個實施方案中，人單克隆抗體由雜交瘤產生，該雜交瘤包括與無限增殖化細胞融合的得自轉基因非人類動物(例如轉基因鼠，其基因組包含人重鏈轉基因和輕鏈轉基因)的B細胞。
本文所用的術語「重組人抗體」，包括所有由重組方法製備、表達、創建或分離的人抗體，例如(a)從轉移了人免疫球蛋白基因的轉基因或轉染色體動物(例如鼠)或由其製備的雜交瘤分離的抗體，(b)從經轉化可表達所述抗體的宿主細胞分離的抗體，例如，從轉染瘤分離的抗體，(c)從重組、組合人抗體文庫分離的抗體，和(d)通過任何涉及剪接人免疫球蛋白基因序列到其它DNA序列上的其它方法製備、表達、創建或分離的抗體。這類重組人抗體具有來源於人種系免疫球蛋白序列的可變區和恆定區。然而，在某些實施方案中，可對這類重組人抗體進行體外誘變(或當使用人Ig序列的轉基因動物時，進行體內體細胞誘變)，因此，當得自人種系VH和VL序列並與其相關時，重組抗體的VH區和VL區的胺基酸序列可以不是天然存在於體內人抗體種系庫中的序列。
本文所用的「特異性結合」是指結合到預定抗原上的抗體。典型地，所述抗體以解離常數(KD)10-7M或更少結合，並且結合到預定抗原上的KD比其結合到非特異性抗原(例如BSA、酪蛋白)而不是預定抗原或密切相關抗原上的KD值至少低兩倍。短語「識別抗原的抗體」和「抗原特異性抗體」在本文與術語「特異性結合抗原的抗體」可互換使用。
本文所用的術語「高親和性」，對於IgG抗體而言，是指抗體KD為10-8M或更小，更優選為10-9M或更小，甚至更優選為10-10M或更小。然而，「高親和性」結合可因其它抗體同種型而變化。例如，「高親和性」結合，對於IgM同種型而言，是指抗體KD為10-7M或更小，更優選為10-8M或更小。
本文所用的術語「K締合」或「Ka」，是指具體抗體-抗原相互作用的締合率，而本文所用術語「K解離」或「Kd」，是指具體抗體-抗原相互作用的解離率。本文所用術語「KD」，是指解離常數，其得自Kd與Ka之比值(即Kd/Ka)並表示為摩爾濃度(M)。
本文所用的術語「βhCG」是指人絨毛膜促性腺激素的β亞單位，並且包括任何得自βhCG序列(SEQ ID NO20)的全抗原、其抗原性片段、其等位變異體和任何多態變異體。βhCG為建立成功妊娠所必需的激素。除妊娠之外，這種抗原的表達主要限於生殖細胞腫瘤，以及大量的腺癌。
本文所用的術語「核酸分子」，包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可為單鏈或雙鏈，但優選為雙鏈DNA。
本文所用的術語「分離的核酸分子」，是指編碼本發明分子綴合物或其部分(例如SEQ ID NO9和11或其部分，諸如抗原或抗體部分(即VH、VL或CDR))的核酸。分離的核酸分子是指編碼分子綴合物的核苷酸序列中不含其它汙染核苷酸序列(例如不編碼任何部分分子綴合物的核苷酸序列)的核酸分子。
如本文所公開和所要求，SEQ ID NO1-28中所示的序列可包括「保守序列修飾」，即核苷酸和胺基酸序列修飾，其不顯著影響或改變由核苷酸序列編碼或含有胺基酸序列的分子綴合物的功能特徵，例如構建體抗體部分的結合性質或抗原部分的免疫原性。這類保守序列修飾包括核苷酸和胺基酸取代、添加和缺失。修飾可通過本領域已知標準技術引入SEQ ID NO1-28中，例如定點誘變和PCR介導誘變。保守胺基酸取代包括胺基酸殘基由具有類似側鏈的胺基酸殘基替代的取代。具有類似側鏈的胺基酸殘基家族已在本領域定義。這些家族包括帶鹼性側鏈胺基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、帶酸性側鏈胺基酸(例如天冬氨酸、穀氨酸)、不帶電荷極性側鏈胺基酸(例如甘氨酸、天冬醯胺、谷胺醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側鏈胺基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分枝側鏈胺基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側鏈胺基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，預測的非必需胺基酸殘基在人抗DC抗體中優選用相同側鏈家族的另一胺基酸殘基替代。
或者，在另一個實施方案中，在所有或部分分子綴合物編碼序列中隨機引入突變，例如通過飽和誘變，並且所得修飾的分子綴合物可用來篩選合適的功能活性。
因此，本文公開的由核苷酸序列編碼的分子綴合物，和/或含有本文公開的胺基酸序列的分子綴合物(即SEQ ID NO1-28)，包括由經過保守修飾的類似序列編碼或含有所述類似序列核苷酸序列的基本類似的綴合物。具體地說，至於可產生何等基本類似抗體用於基於部分(即重鏈可變區和輕鏈可變區)序列(即SEQ ID NO3、4、7或8)的分子綴合物的討論提供如下。
就核酸而言，術語「基本同源」表示兩個核酸或其明確序列，當任選比對和比較時是相同的，在至少約80％的所述核苷酸中，通常至少約90％-95％，更優選至少約98％-99.5％的核苷酸中帶有適當的核苷酸插入或缺失。
兩個序列間的百分同一性為由所述序列共享的相同位置數的函數(即％同源性＝相同位置數/總位置數×100)，考慮到空位數，以及每個空位的長度等，兩個序列最佳比對需要引入的空位。序列比較和兩個序列間百分同一性的確定可用數學算法完成，如以下非限制實例所述。
兩個核苷酸序列間的百分同一性可用GCG軟體包中GAP程序(在http//www.gcg.com上提供)確定，該軟體包使用NWSgapdna.CMP矩陣和40、50、60、70或80的空位加權以及1、2、3、4、5或6的長度加權。兩個核苷酸序列間的百分同一性也可用E.Meyers和W.Miller算法(Comput.Appl.Biosci.，411-17(1988))確定，該算法已經結合到用PAM120權重殘基表、空位長度12罰分和4空位罰分的ALIGN程序(2.0版)中。此外，兩個胺基酸序列間的百分同一性可用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48444-453(1970))算法確定，該算法已結合到GCG軟體包中GAP程序(在http//www.gcg.com上提供)確定，該軟體包使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣，16、14、12、10、8、6或4的空位加權以及1、2、3、4、5或6的長度加權。
例如，本發明核酸序列和蛋白質序列還可用作「查詢序列」搜索公共資料庫，以鑑定相關序列。這類搜索可用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)進行。BLAST核苷酸搜索可用NBLAST程序，分值＝100、字長＝12進行，以獲得與本發明核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質搜索可用XBLAST程序，分值＝50、字長＝3進行，以獲得與本發明蛋白分子同源的胺基酸序列。為了獲得以比較為目的的空位比對，可如Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)3389-3402所述利用Gapped BALST。當利用BLAST和Gapped BLAST程序時，可使用各自程序的預設參數(例如XBLAST和NBLAST)。參見http//www.ncbi.nlm.nih.gov。
所述核酸可存在於完整細胞、細胞裂解物或部分純化的或基本純的形式中。當用標準技術，包括鹼/SDS處理、CsCl分帶、柱色譜、瓊脂糖凝膠電泳和其它本領域眾所周知的方法，從其它細胞組分或其它汙染物如其它細胞核酸或蛋白中純化出核酸，所述核酸為「分離的」或「提煉的基本純的」。參見F.Ausubel等編輯Current Protocolsin Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，NewYork(1987)。
當將核酸置於與另一核酸序列功能性關係中時，核酸為「有效連接」。例如，如果啟動子或增強子影響序列的轉錄，則它有效連接於編碼序列。就轉錄調節序列而言，有效連接是指被連接的DNA序列為相鄰的，並當有必要連接兩個蛋白編碼區時為閱讀框內相鄰。就開關序列而言，有效連接是指所述序列能夠有效開關重組本文所用術語「載體」是指能夠轉運與其連接的另一核酸的核酸分子。一種類型的載體為「質粒」，其為環狀雙鏈DNA環，其中可接入額外DNA區段。另一類型載體為病毒載體，其中額外DNA區段可接入病毒基因組中。某些載體能夠在其被導入的宿主細胞中自我複製(例如具有細菌複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其它載體(例如非附加型哺乳動物載體)在導入宿主細胞後，可整合到宿主細胞基因組中，並因此與宿主基因組一起複製。不僅如此，某些載體能夠指導與其有效連接的基因的表達。這類載體本文稱為「重組表達載體」(或簡稱「表達載體」)。一般而言，重組DNA技術中有用的表達載體通常為質粒形式。在本說明書中，「質粒」和「載體」可互換使用，因為質粒是最常用的載體形式。然而，本發明包括這類其它形式的表達載體，例如病毒載體(例如複製缺陷逆轉錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)，其發揮等價功能。
本文所用的術語「重組宿主細胞」(或簡稱「宿主細胞」)，是指重組表達載體已經引入其中的細胞。應當理解，這類術語不僅指具體研究的細胞，也指這類細胞的子代。因為某些修飾可由於突變或環境影響而發生於後代中，實際上，這類子代可能與親代細胞不同，但仍包括與本文所用的術語「宿主細胞」的範圍內。重組宿主細胞包括例如CHO細胞和淋巴細胞。
本文所用的術語「受試者」包括任何人或非人類動物。術語「非人類動物」包括所有脊椎動物如哺乳動物和非哺乳動物，例如非人靈長類、綿羊、狗、牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。
本發明的各個方面在以下小節作更詳細的描述。
I.抗原例如，用於本發明的合適抗原包括保護性或治療性免疫應答所必需的感染性疾病抗原和腫瘤抗原，例如腫瘤細胞或病原生物體表達的抗原或感染性疾病抗原。例如，合適的抗原包括用於預防或治療癌的腫瘤相關抗原。腫瘤相關抗原的實例包括但不限於βhCG、gp100或Pmel17、HER2/neu、CEA、gp100、MART1、TRP-2、melan-A、NY-ESO-1、MN(gp250)、獨特型、MAGE-1、MAGE-3、酪氨酸酶、端粒酶、MUC-1抗原和生殖細胞來源的腫瘤抗原。腫瘤相關抗原也包括血型抗原例如Lea、Leb、LeX、LeY、H-2、B-1、B-2抗原。或者，不止一種抗原可包括在本發明抗原-抗體構建體中。例如，MAGE抗原可與其它抗原(例如黑色素A、酪氨酸酶和gp100)以及綴合物(例如粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)或IL-12)組合，並連接到抗APC抗體上。
其它合適的抗原包括用於預防或治療病毒疾病的病毒抗原。病毒抗原的實例包括但不限於HIV-1 gag、HIV-1 env、HIV-1 nef、HBVcore、FAS、HSV-1、HSV-2、p17、ORF2和ORF3抗原。細菌抗原的實例包括但不限於鼠弓形體(Toxoplasma gondii)或蒼白密螺旋體(Treponema pallidum)。本發明抗體-細菌抗原綴合物可用於治療或預防各種細菌疾病，例如炭疽、肉毒中毒、破傷風、衣原體病、霍亂、白喉、萊姆病、梅毒和結核。
在一個本文示例性的具體實施方案中，本發明使用包含βhCG的抗原。該抗原包括完整βhCG序列(SEQ ID NO20)或該序列的任何免疫原性(例如含T細胞表位)部分。如下所述，這類免疫原性部分可用本領域已知T細胞表位作圖技術鑑定，包括算法和已知T細胞表位作圖技術。來自βhCG的免疫原性肽的具體實例包括包含SEQ IDNO21、22、23、24、25、26、27或28的肽，及其保守修飾(conservativemodifications)。來自βhCG的另外的免疫原性肽，以及這類肽的鑑定方法描述於美國專利號US 6,096,318和6,146,633中，其內容通過引用結合到本文中。
蛋白的抗原肽(即含有T細胞表位的肽)可以各種本領域眾所周知的方式鑑定。例如，可用基於網絡的預測算法(BIMAS SYFPEITHI)，通過分析所述蛋白質序列，預測T細胞表位，來產生潛在MHC I類和II類結合肽，該肽與10000個此前由CTL定義的完全鑑定的MHC結合肽的內部資料庫匹配。高打分肽可根據與給出的MHC分子的高親和性進行排列並選擇為「有意義」。如圖10所示，並用βhCG綴合物的序列(SEQ ID NO10)，所有算法用於鑑定來自βhCG部分(芥子)的抗原肽，合成型可由其形成，並可檢測它們體外引發T細胞應答的能力。因此，尋找潛在結合到HLA-A2、HLA-B7和HLA-DR分子上的T細胞表位。一些表位也由βhCG-B11綴合物的抗體(B11)片段預測(結果未顯示)。此外，在長37個胺基酸的C端肽(CTP)中沒有鑑定出T細胞。
鑑定含有T細胞表位抗原肽的另一種方法為將蛋白分成所需長度的非重疊肽，或者所需長度的重疊肽，其可通過重組、合成或在某些限制性位點用化學裂解蛋白並測試免疫原性質(例如引發T應答，即增殖或淋巴因子分泌)產生。
例如，為用精細作圖技術精確確定所述蛋白的T細胞表位，具有T細胞刺激活性並因此包含至少一個T細胞表位的肽(如T細胞生物學技術所確定)，可通過在所述肽的氨基或羧基端添加或缺失胺基酸殘基而修飾，並測試以確定相對於所修飾的肽的T細胞中的變化。如果發現在天然蛋白質序列中重疊區共享的兩種或更多種肽具有人T細胞刺激活性(如T細胞生物學技術所確定)，可以產生包含全部或部分這類肽的額外肽，並且可以通過類似的方法對這些額外多肽進行測試。根據這一技術，對肽進行選擇並用重組或合成方法來生產。根據包括對所述肽的T細胞應答強度(例如刺激指數)在內的多種因素對肽進行選擇。隨後對這些所選肽的理化性質(例如溶解性、穩定性)進行檢測以確定該肽是否適合用於治療性組合物中，或者是否需要進行修飾。
II.抗體疫苗綴合物本發明提供各種治療性疫苗綴合物，其中包括抗原如腫瘤抗原或病毒抗原，所述抗原經甘露糖受體(MR)連接在與APC結合的抗體上。這使得抗原被靶向到APC(例如樹突細胞)，以增強加工、呈遞並最終增強針對所述抗原的免疫應答，例如CTL應答。
本發明抗體-抗原疫苗綴合物可通過基因方法或化學方法製備。在這兩種情況下，綴合物的抗體部分都可由全抗體或部分抗體，例如Fab片段或單鏈Fv組成。此外，不止一種抗原可加入到單鏈抗體構建體中。
遺傳構建的抗樹突抗體-抗原綴合物(例如作為單一重組融合蛋白表達的綴合物)可通過將所選的抗原結合到抗體的不同位置上而製備。具體的基因方法產生的本發明綴合物(融合構建體)包括例如βhCG-B11構建體，如圖2所示。βhCG-B11構建體包含人抗樹突細胞抗體B11，其與腫瘤相關抗原βhCG融合。編碼該構建體的核苷酸序列示於SEQ ID NO9。
例如，如βhCG-B11遺傳融合構建體所示，βhCG-B11抗原可融合到人抗體重鏈CH3區的末端。所述抗原也可融合在Fab-融合構建體中抗體重鏈鉸鏈區，或者在單鏈融合構建體(ScFv構建體)中帶有可變輕鏈和重鏈(VH和VL)的序列。或者，所述抗原可融合到抗體輕鏈而不是抗體重鏈上。可以使用抗原和抗體間其它融合點，只要基因融合構建體可引發CTL應答。完整βhCG-B11構建體和單鏈B11構建體(pB11sfv-βhCG)的詳細圖譜分別示於表1和表2。
表1βhCG-B11特徵圖譜編碼序列(共3個)BUsfr-bHCG開始921結束2153neo開始3375結束4169新黴素抗性基因Amp開始5671結束6531(互補)氨苄青黴素抗性基因其他特徵(共5個)啟動子開始863結束882啟動子信號序列開始921結束977 B11 VL開始978結束1296 B11 VH
開始1344 結束1691βHCG開始1712 結束2164聚腺苷酸化信號(共2個)聚腺苷酸開始2267結束2491聚腺苷酸聚腺苷酸開始4343結束4473SV40聚腺苷酸化信號真核啟動子(共1個)啟動子開始232結束819真核啟動子原核啟動子(共1個)啟動子開始6566結束6572(互補)啟動子複製起點(共3個)SV40啟動子和起點開始1結束1複製起點F1起點開始2537結束2965複製起點pUC起點開始4856結束5526(互補)起點表2pB11sfv-βhCG特徵圖譜編碼序列(共4個)輕鏈開始735結束1433 B11輕鏈Cκ開始1113結束1433AMP開始7810結束8670(互補)amp
起始位點說明互補的1..6871)DHFR開始8921結束9484dhfr起始位點說明7122-7685其他特徵(共9個)B11VL開始792結束1112SV40啟動子/Ori開始2298結束2622SV40啟動子和複製起點Neo開始2658結束3452新黴素抗性基因βHCG開始4015結束4467(互補)bHCGCHS開始4470結束4790(互補)重鏈恆定區3CH2開始4791結束5120(互補)重鏈恆定區2CH1開始5166結束5459(互補)重鏈恆定區1B11VH開始5460結束5807(互補)啟動子開始5905結束6559(互補)聚腺苷酸化信號(共3個)聚腺苷酸開始1526結束1757聚腺苷酸開始3744結束3975(互補)聚腺苷酸化信號2開始10282結束10411SV40聚腺苷酸起始位點說明8483..8612真核啟動子(共1個)
啟動子開始9結束655化學構建的抗體-抗原綴合物可用各種熟知和易於獲得的交聯試劑製備。這些交聯試劑可為同官能化合物或雜官能化合物，例如SPDP、SATA、SMCC、DTNB，該化合物與抗樹突抗體和所選抗原上不同反應性胺基酸或糖側鏈形成共價鍵。
任何可被克隆和表達或純化的抗原可選擇用於本發明。獲得這類抗原的技術是本領域眾所周知的。例如，腫瘤相關抗原可從癌細胞直接純化，並由理化技術例如串聯質譜鑑定。或者，可用腫瘤特異性T細胞克隆測試抗原陰性細胞，該細胞已經通過用質粒DNA克隆轉染獲得抗原，來分離表達所述抗原的克隆。然後可構建合成肽以精確鑑定抗原位點或表位。
在一個具體實施方案中，疫苗構建體的部分抗體序列可用於表達完整抗體。包括在本發明疫苗綴合物中的抗體如抗APC抗體(如B11)，主要通過位於六個重鏈和輕鏈互補決定區(CDR)的胺基酸殘基，與靶抗原(例如C型凝集素受體，例如MR)相互作用。為此，CDR中的胺基酸序列在個體抗原間比CDR外的序列更為多樣化。因為CDR序列負責大多數抗體-抗原相互作用，所以有可能通過構建表達載體而表達模擬特異性天然存在抗體性質的重組抗體，所述表達載體包括從不同性質的不同抗體上移植到構架序列上的來自特異性天然存在抗體的CDR序列(參見例如Riechmann，L.等(1998)Nature 332323-327；Jones，P.等(1986)Nature 321522-525；和Queen，C.等(1989)Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.8610029-10033)。這類構架序列可由包括種系抗體基因序列的公共DNA資料庫獲得。這些種系序列會不同於成熟抗體基因序列，因為它們將不包括完整裝配的可變基因，該基因在B細胞成熟期間由V(D)J連接形成。種系基因序列在也將不同於個體中高親和性第二抗體所有組成成分的序列，該序列均勻分布於可變區。例如，體細胞突變在構架區氨基端部分相對少見。例如，體細胞突變在構架區1氨基端部分和構架區4羧基端部分相對少見。此外，許多體細胞突變不顯著改變抗體的結合性質。為此，沒有必要獲得具體抗體的完整DNA序列，以重建具有與原始抗體結合性質類似的完整重組抗體(參見WO 99/45962，其通過引用結合到本文中，用於所有的目的)。跨越CDR區的部分重鏈和輕鏈序列一般足以滿足此目的。所述部分重鏈和輕鏈序列用於確定哪個種系可變和J基因區段有助於重組抗體可變基因。然後，種系序列用來填補可變區的缺少部分。重鏈和輕鏈前導序列在蛋白成熟期間被切割，並且無助於最終抗體的性質。為此，有必要使用相應的表達構建體的種系前導序列。為了添加缺少序列，克隆cDNA序列可與合成寡核苷酸通過連接或PCR擴增結合。或者，完整可變區可合成為一套短的、重疊寡核苷酸，並由PCR擴增結合以創建完整合成可變區克隆。這一過程具有某些優點如消除或包含或具體限制位點，或者優化具體密碼子。
雜交瘤的重鏈和輕鏈轉錄物的核苷酸序列用來設計一套重疊合成寡核苷酸，以創建合成帶有胺基酸編碼能力與天然序列相同的V序列。所述合成的重鏈和κ鏈序列可在三方面與天然序列不同間插成串重複核苷酸鹼基以促進關核苷酸合成和PCR擴增；最優翻譯起始位點根據Kozak規則(Kozak(1991)J.Biol.Chem.26619867-19870)加入；並且HindIII位點裝在翻譯起始位點的上遊。
就重鏈可變區和輕鏈可變區兩者而言，優化的編碼鏈和相應的非編碼鏈序列被斷裂成相應的30-50個核苷酸左右的中位非編碼寡核苷酸。因此，對於每個側鏈來說，所述寡核苷酸可裝配成跨距為150-400核苷酸的重疊雙鏈組。然後，所述庫用作模板來產生150-400核苷酸區段的PCR擴增產物。典型地，將一組可變區寡核苷酸組分成兩個庫，該庫獨立地擴增以產生兩個重疊PCR產物。這些重疊產物接著通過PCR擴增結合形成完全可變區。也可期望在PCR擴增中包括重鏈可變區或輕鏈可變區重疊片段(包括κ輕鏈的BbsI位點，或者γ重鏈的AgeI位點)，以產生可容易地克隆到表達載體構建體中的片段。
然後，重建的重鏈可變區和輕鏈可變區與克隆的啟動子、翻譯起點、恆定區、3』非翻譯聚腺苷酸化和轉錄終止序列結合，形成表達載體構建體。所述重鏈和輕鍊表達載體構建體可結合到單一載體中，共同轉染、依次轉染或獨立轉染到宿主細胞中，然後融合產生表達兩條鏈的宿主細胞。
用於構建人IgGκ的表達載體的質粒描述如下。構建所述質粒以使得PCR擴增的V重鏈和Vκ輕鏈cDNA序列可用來重建完全重鏈和輕鏈小基因。這些質粒可用來表達完全人或嵌合IgG1κ和IgG4κ抗體。類似的質粒可構建來表達其它重鏈同種型，或者表達包含λ輕鏈的抗體。
因此，在本發明另一方面，本文所述疫苗綴合物抗體部分的結構特徵如B11，用來創建保留至少一種本發明B11抗體功能性質(例如結合APC)的結構相關抗體。更具體地說，B11的一個或多個CDR區可與已知構架區和CDR重組結合，來創建用於本發明疫苗綴合物的額外、重組工程的、抗APC抗體。
因此，在另一個實施方案中，本發明提供製備包含抗DC抗體的疫苗綴合物的方法，所述方法包括製備包含以下的抗體(1)人重鏈構架區和人重鏈CDR，其中至少一種人重鏈CDR包含選自圖8中所示CDR胺基酸序列(SEQ ID NO13、14或15)的胺基酸序列；和(2)人輕鏈構架區和人輕鏈CDR，其中至少一種人輕鏈CDR包含選自圖9中所示CDR胺基酸序列(SEQ ID NO16、17或18)的胺基酸序列；其中所述抗體保留結合到APC上的能力。
抗體結合到APC上的能力可用標準結合試驗如實施例中所述(如ELILSA)試驗測定。因為，本領域眾所周知，抗體重鏈和輕鏈CDR3區在抗體特異性/親和力結合抗原上起特別重要的作用，本發明如上述製備的重組抗體優選包含B11的重鏈和輕鏈CDR3。所述抗體還包含B11的CDR2。所述抗體還可包含B11的CDR1。因此，本發明還提供包含以下的抗APC抗體(1)人重鏈構架區、人重鏈CDR1區、人重鏈CDR2區、人重鏈CDR3區，其中人重鏈CDR3區為圖8中所示的B11的CDR3(SEQ ID NO15)；和(2)人輕鏈構架區、人輕鏈CDR1區，人輕鏈CDR2區，人輕鏈CDR3區，其中人輕鏈CDR3區為圖9中所示的B11的CDR3(SEQ ID NO18)，其中所述抗體結合DC。所述抗體還包含B11的重鏈CDR2和/或輕鏈CDR2。所述抗體還可包含B11的重鏈CDR1和/或輕鏈CDR1。
優選地，上述基因工程抗體的CDR1、CDR2和/或CDR3包含本文公開的B11的恰切胺基酸序列。然而，普通技術人員將會認識到，在仍保留抗體有效結合DC的能力的同時，B11的恰切CDR序列的改變是可行的(例如保守取代)。因此，在另一個實施方案中，所述基因工程抗體可由一種或多種CDR組成，該CDR例如至少90％、95％、98％或99.5％等同於B11的一種或多種CDR。
除了或撇開簡單結合APC外，基因工程抗體如上述抗體可以根據其保留本發明抗體的其它功能性質進行選擇，例如(1)結合APC上的高親和性；(2)結合到APC上的獨特表位上(當用於結合時，來消除由補體活性的單克隆抗體會競爭結合同一抗原表位的可能性)；(3)誘導針對所述抗原而產生的T細胞介導的免疫應答；和/或(4)誘導包含CD4+和CD8+T細胞介導應答的T細胞應答。
在另一個實施方案中，轉化表達目標抗原如βhCG的全細胞，來表達抗APC抗體如抗MR抗體，致使抗原和抗體由細胞共表達。例如，通過用編碼含有跨膜域和抗APC抗體的融合蛋白的核酸轉染靶細胞的方式，可以做到這一點。表達疫苗綴合物的細胞可接著用於靶向APC如DC，以誘導CTL應答。
產生這類核酸、融合蛋白和表達這類融合蛋白的細胞的方法描述於美國專利申請第09/203,958號，該文獻通過引用整體結合到本文中。
或者，所述抗體可通過使用化學接頭、脂質標籤或其它相關方法連接到細胞或病原體上(deKruif，J.等(2000)Nat.Med.6223-227；Nizard，P.等(1998)FEBS Lett.43383-88)。表達目標抗原和表面錨定抗體的細胞可用於誘導特異性免疫應答如CTL應答，以對抗細胞如腫瘤細胞或微生物病原體。
III.藥物組合物另一方面，本發明提供治療性組合物如藥物組合物，其含有一種或組合的與藥物可接受載體一起配製的本發明疫苗綴合物。為遞入受試者血流與受試者T細胞相互作用，而給予本發明疫苗綴合物。這類T細胞的靶向可在體內或活體外直接用所述綴合物或用已經事先用疫苗綴合物靶向的細胞來完成。
本發明組合物可額外包括其它治療試劑如其它抗體、細胞毒素或藥物(例如免疫抑制劑)，並可單獨給予或與其它療法如放療聯合給予。例如，由APC快速內化的疫苗綴合物可與增強樹突細胞抗原呈遞細胞活性(例如釋放免疫刺激性細胞因子)的單克隆抗體結合。
本文所用的「藥物可接受的載體」包括任何和所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延緩劑等生理相容物質。優選的載體適用於靜脈內、肌內、皮下、胃腸外、脊柱或表皮給予(例如注射或輸注)。根據給藥途徑，所述疫苗綴合物可包在材料中以保護所述化合物免受酸和其它可使所述化合物失活的自然條件的作用。
「藥物可接受的鹽」是指保留母體化合物所需生物活性並且不產生任何不良毒性效應的鹽(參見例如Berge，S.M.等(1977)J.Pharm.Sci.661-19)。這類鹽的實例包括酸加成鹽和鹼加成鹽。酸加成鹽包括得自無毒無機酸的鹽，例如鹽酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、亞磷酸鹽等，以及得自無毒有機酸的鹽，例如脂肪族一和二羧酸鹽、苯基取代的烷酸鹽、羥基烷酸鹽、芳族酸鹽、脂族和芳族磺酸鹽等。鹼加成鹽包括得自鹼土金屬的鹽，例如鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽等，以及得自無毒有機胺的鹽，例如N，N′-二苯甲基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因、膽鹼、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因等。
本發明組合物可通過本領域已知的各種方法給予。本領域技術人員將會認識到，給藥途徑和/或模式將取決於所需結果。活性化合物可與防止所述化合物快速釋放的載體一起製備，例如控釋製劑，包括植入物和微囊化遞藥系統。可使用生物可降解的、生物相容性多聚物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐類、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。這類製劑的許多製備方法申請了專利或為本領域技術人員公知。參見例如Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems，J.R.Robinson編輯，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
為通過某些給藥途徑給予本發明疫苗綴合物，可能有必要用材料包住化合物或與將化合物與材料一起給予以防止其失活。例如，所述化合物可在合適的載體中給予受試者，例如脂質體或稀釋劑。藥物可接受的稀釋劑包括鹽水和水性緩衝溶液。脂質體包括水包油包水CGF乳劑，以及常規脂質體(Strejan等(1984)J.Neuroimmunol.727)。
藥物可接受的載體包括無菌水溶液或分散體和用於臨時配製成無菌注射液或分散液的無菌粉末。這類介質和藥物活性物質的用途是本領域已知的。除任何與所述活性化合物不相容的常規介質或藥物的情況外，考慮了其在本發明藥物組合物中的用途。補充活性化合物也可加入到所述組合物中。
治療性組合物一般必須無菌並在生產和儲存條件下穩定。所述組合物可製備成溶液劑、微乳劑、脂質體或其它適合於高藥物濃度的有序結構。載體可為含有例如水、醇、多元醇(例如乙二醇、丙二醇和液體聚乙二醇等)和其合適的混合物的溶劑或分散介質。可保持合適的流動性，例如，通過使用包衣例如卵磷脂，通過在分散體的情況下保持所需的顆粒大小，以及通過使用表面活性劑等。在許多情況下，會在組合物中優選包括等滲劑，例如糖、糖醇例如甘露糖醇、山梨糖醇或氯化鈉。注射組合物的延長吸收可通過在組合物包括延遲吸收劑，例如單硬脂酸鹽和明膠引起。
無菌注射液可通過將活性化合物以所需量加入到上述帶有一種或組合成分的合適溶劑中製備，如果需要，再進行無菌微濾。一般而言，分散體通過將活性化合物加入到無菌溶媒中製備，該無菌溶媒含有基本分散介質和來自上述所需其它成分。在用於製備無菌注射液的無菌粉末的情況下，優選的製備方法為真空乾燥和凍幹(冷凍乾燥)，可得到活性成分的粉末外加任何來自其此前無菌過濾溶液的額外所需成分。
調整劑量方案以提供最優所需反應(例如治療反應)。例如，可給予一次大劑量，可在某時間段內給予幾個分劑量或根據治療情況的急迫性的指示按比例減少或增加劑量。尤其有利地是，為了簡便給藥和同一劑量，以劑量單位形式配製胃腸外組合物。本文所用劑量單位形式是指適於用作要治療受試者單一劑量的物理分離單位；每個單位含有經計算與所需藥用載體一起產生所需療效的預定量的活性化合物。本發明劑量單位形式的規格按照和直接根據(a)所述活性化合物的獨特的特徵和要達到的具體療效，和(b)配製這類治療個體中敏感性活性化合物的本領域固有的限制。
藥物可接受的抗氧化劑的實例包括(1)水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸、半胱氨酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，例如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁羥茴醚(BHA)、丁羥甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金屬螯合劑，例如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
就治療性組合物而言，本發明製劑包括適用於口服和/或胃腸外給藥的製劑。所述製劑可以適當的單位劑型存在，並可由藥學領域任何已知方法製備。可與載體物質混合以產生單一劑型的活性成分的量，會根據要治療受試者和具體的給藥模式而變動。可與載體物質混合以產生單一劑型的活性成分的量，一般會是產生療效的組合物的量。一般而言，在百分之百外，此量的範圍為約0.01％至約99％的活性成分，優選約0.1％至約70％，最優選約1％至約30％。
本文所用的短語「胃腸外給藥」和「胃腸外給予」是指不是腸道和局部給藥的給藥模式，通常通過注射，包括並不限於靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、真皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬膜外和胸骨內的注射和輸注。
可用於本發明藥物組合物中的合適的水和非水載體包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合適的混合物，植物油如橄欖油，和注射用有機酯如油酸乙酯。可通過例如使用包衣材料如卵磷脂，通過在分散體情況下保持所需顆粒大小，以及通過使用表面活性劑保持適當的流動性。
這些組合物也可含有輔料例如防腐劑、潤溼劑、乳化劑和分散劑。可通過滅菌程序，見上，以及通過包括各種抗細菌劑和抗真菌劑如對羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚山梨酸等確保防止微生物的存在。將等滲劑，例如糖、氯化鈉等包括進組合物中也是可取的。此外，注射用藥物形式吸收的延長，可通過包括延長吸收劑如單硬脂酸鋁和明膠產生。
當本發明化合物作為藥物給予人和動物時，可單獨給予或作為含有例如與藥物可接受載體混合的0.01-99.5％(更優選0.1-90％)的活性成分的藥物組合物給予。
不管所選的給藥途徑，通過本領域技術人員已知的常規方法，將可在合適的水合形式中使用的本發明化合物，和/或本發明藥物組合物，配製成藥物可接受的劑型。
本發明藥物組合物中的活性成分的實際劑量水平可變動，以獲得適量的針對具體患者的有效取得所需治療反應的活性成分、組合物和給藥模式，而不引起患者毒性。所選的劑量水平將取決於各種藥代動力學因素，包括本發明所用具體組合物或其酯、鹽或醯胺的活性、給藥途徑、給藥時間、所用具體化合物的排洩率、療程、與所述具體組合物聯用的其它藥物、組合物和/或材料、待治療患者的年齡、性別、體重、病情、一般健康狀況和先前就醫史和醫療領域熟知的類似因素。
具有本領域普通技能的執業醫師或獸醫可輕易的確定有效量的所需藥物組合物並開出處方。例如，執業醫師或獸醫可以低於所需量的用於所述藥物組合物中的本發明化合物開始，以取得所需療效並逐漸增加劑量直到取得所需效果。一般而言，合適的本發明組合物的日劑量會是有效產生療效的所述化合物的最低劑量。這類有效劑量通常會取決於上述因素。優選給藥途徑為靜脈內、肌內、腹膜內或皮下，優選在靶部位附近給藥。如果需要，治療組合物的有效日劑量可在全天的適當的時間間隔內以獨立給藥的2、3、4、5、6或更多分劑量給予，任選以單位劑型給予。雖然由可能單獨給予本發明化合物，但優選以藥物製劑(組合物)給予所述化合物。
治療組合物可以用本領域已知醫療裝置給予。例如，在一個優選實施方案中，本發明治療組合物可用無針皮下注射裝置給予，例如公布於美國專利第5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556號的裝置。用於本發明的眾所周知的植入物和模塊的實例包括美國專利第4,487,603號，該專利公開以可控速率分配藥物的可植入微量輸液泵；美國專利第4,486,194號，該專利公開通過皮膚給藥的治療裝置；美國專利第4,447,233號，該專利公開以精確輸注速率遞藥的醫用輸液泵；美國專利第4,447,224號，該專利公開連續遞藥用流速可變可移植輸液裝置；美國專利第4,439,196號，該專利公開具有多室隔間的滲透遞藥系統；和美國專利第4,475,196號，該專利公開滲透遞藥系統。這些專利通過引用結合到本文中。許多其它這類植入物、遞藥系統和模塊是本領域技術人員已知的。
所述組合物必須是無菌的，流動性要滿足組合物用注射器遞送的要求。除了水以外，所述載體可為等滲緩衝鹽溶液、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)及其合適的混合物。可通過例如使用包衣材料如卵磷脂，通過在分散體情況下保持所需顆粒大小，以及通過使用表面活性劑保持適當的流動性。在許多情況下，在所述組合物中優選包括等滲劑如糖、糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇和氯化鈉。可通過在所述組合物中包括延遲吸收劑如單硬脂酸鋁和明膠等產生注射用組合物的長時間吸收。
當所述活性化合物如上所述得到適當保護時，所述化合物可與例如惰性稀釋劑或可吸收的食用載體一起口服給予。
IV.本發明的用途和方法本發明疫苗綴合物可用於治療和/或預防(例如免疫針對)各種疾病和病症。
主要的疾病適應症之一為癌。這包括但不限於結腸癌、黑素瘤、淋巴瘤、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤、肥大細胞瘤、乳腺癌、白血病或類風溼成纖維細胞瘤。另一主要的疾病適應症為感染性疾病，包括但不限於HIV、肝炎(例如甲型、乙型、丙型)、流行性感冒、皰疹、賈第蟲病、瘧疾、利什曼原蟲病、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus Aureus)病、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)病。另一種主要的疾病適應症為自身免疫病。
在一個具體的實施方案中，所述疫苗綴合物用於治療或預防由βhCG或表達βhCG的細胞介導的疾病和病症，其為半胱氨酸環生長因子超家族的成員。有證據表明，βhCG作為生長因子、血管生成和/或轉移促進因子，或者作為免疫功能抑制劑在癌的建立或發展中起作用(73)。因此，本發明可用於治療癌和其它涉及血管生成的疾病的發展。本發明也可通過抑制βhCG或表達βhCG的細胞在妊娠中的作用而用於預防或終止意外妊娠。
就治療用途而言，可以將本發明的疫苗綴合物直接給予受試者(即體內)。或者，可以將所述綴合物間接給予受試者，即首先通過使所述綴合物與APC例如樹突細胞接觸(例如通過培養或孵育)，然後將所述細胞給予受試者(即體外)。所述綴合物的接觸與遞送到APC，致使它們被在給藥前由APC加工並呈遞，亦稱抗原或細胞「負載」。將抗原加載到APC的技術是本領域眾所周知的，並且包括例如Gunzer和Grabbe，Crit Rev Immunol 21(1-3)133-45(2001)和Steinman，ExpHematol 24(8)859-62(1996)。
在所有情況下，所述疫苗綴合物都以有效量給予以發揮其所需要的療效。術語「有效量」是指必需或足以實現所需生物效應的量。例如，有效量可為消除腫瘤、癌或細菌、病毒或真菌感染的必需量。任何具體應用的有效量可根據待治療疾病或病症、待給予的具體綴合物、受試者體型或疾病或病症的嚴重程度等各種因素而變化。本領域普通技術人員無需進行過多的實驗，憑經驗就可確定具體多特異性分子的有效量。
所述疫苗綴合物的優選給藥途徑包括例如注射(例如皮下、靜脈內、胃腸外、腹膜內、鞘內)。所述注射可為快速濃注或連續輸注。其它給藥途徑包括口服給藥。
本發明疫苗綴合物也可與輔料和其它治療劑例如免疫刺激劑共同給予。所述綴合物通常單獨配製在藥物可接受的載體中，或者與這類藥物混合配製。這類載體的實例包括溶液、溶劑、分散介質、延遲劑、乳劑等。藥物活性物質的這類介質的用途是本領域眾所周知的。任何其它適合與所述分子聯用的常規載體在本發明範圍之內。
與所述疫苗綴合物共同給予的合適的治療劑包括其它抗體、細胞毒素和/或藥物。在一個實施方案中，所述治療劑為已知幫助或誘導免疫應答的抗溶細胞性T淋巴細胞相關抗原-4(CTLA-4)抗體。在另一個實施方案中，所述治療劑為化療藥。所述疫苗綴合物也可與放療一同給予。
通過以下實施例進一步描述本發明，以下實施例不得解釋為對本發明的進一步限制。本申請全篇中所引用的所有數字和所有參考文獻、專利和公布的專利申請的內容，全都通過引用結合到本文中。
實施例方法與材料從全血或leukopak產生DC通過將肝素化全血或帶有Ficoll-Paque的單採血液成分製劑進行密度梯度離心，獲得人外周血單核細胞(PBMC)。然後，通過粘附塑料培養皿或淘析分離單核細胞，並通過向培養基中添加細胞因子(10ng/ml GM-CSF和2ng/ml IL-4)使其分化成未成熟DC。在第5天和第7天之間收穫DC，用流式細胞儀進行分析。以這種方式製備的DC為CD14-、HLA-DR+、CD11c+甘露糖受體+和高水平表達的MHC I類和II類、CD80和CD86。
腫瘤抗原βhCG的選擇βhCG是人絨毛膜促性腺激素(成功建立妊娠所必需的激素)的亞單位。此糖蛋白亞單位具有若干特點使其成為癌免疫治療中值得關注的抗原(有關綜述參見Triozzi P.L.和StevensV.(1999)Oncology Reports 67-17)。首先，除妊娠外，此抗原的表達主要限於生殖細胞腫瘤，以及大量腺癌(表3)。其次，hCG為半胱氨酸環生長因子超家族的成員，並可作為生長因子、血管生成和/或轉移促進劑，或者作為免疫功能抑制劑在癌的建立或發展中起作用。因此，限制功能性hCG表達的免疫療法可提供額外的治療益處。
表3通過免疫組織化學對βhCG呈陽性的腫瘤百分率(Triozzi P.L.和Stevens V.(1999))
增殖試驗在96孔平底微量板中，效應T細胞(5×104)與有或沒有荷載抗原(MDX-1307或其它)的自身DC(5×103)共同培養，終體積為0.2ml。所述混合物於37℃共同培養。第4天，培養物用3H-胸苷(1μCi/孔)進行脈衝，18小時後，直接在濾器(Millipore)上收穫細胞。濾器用水洗滌三次，然後用乙醇洗滌一次，並在通風櫥中乾燥5-10分鐘。隨後將閃爍液(Packard，20μl/孔)加入到濾器中。在Wallacβ計數器上通過計數來確定濾器結合的放射性。結果表示為用抗原刺激的對未用抗原或用對照抗原刺激的CTL的刺激指數(S.I.)值(cpm)。就MHC阻斷分析而言，標記的靶與HLA-特異性mAb一起在室溫下預孵育30分鐘，W6/32用於阻斷所有I類，L243用於阻斷所有II類HLA分子(20μg/ml)。通過離心除去未結合的mAb。
流式細胞術通過在GM-CSF和IL-4中培養5天，由單核細胞製備人DC。將DC與10μg/ml的βhCG抗原/抗MR抗體疫苗綴合物或同種型對照一起在冰上孵育。疫苗綴合物直接用FITC-標記或用FITC-標記的抗βhCG第二單克隆抗體進行檢測。用LSR流式細胞儀測定結合螢光的細胞。
細胞毒性試驗靶細胞(3×106)、對照和荷載抗原(βhCG-B11)用RPMI培養基洗滌兩次，將沉澱重懸於200μl培養基中並用100μCi51Na2CrO4於37℃標記60分鐘。標記的靶用RPMI培養基洗滌三次，將沉澱重懸浮以使細胞濃度為3×104細胞/ml。抗原特異性CTL在96孔V-形底板中滴定，以得出100∶1(效應T細胞，E靶，T)直到12.5∶1或更低的比值。加入恆定數目的標記靶(100μl/孔或3,000靶細胞/孔)，將板以低速(180xg)離心並於37℃孵育。4小時後，收穫100-120μl上清液，用γ-計數器(Wallac Instruments，Perkin-Elmer)測定釋放的放射性。CTL活性用以下方程計算並表示為％特異性裂解(殺傷) 其中實驗性釋放(cpm)，是指含有CTL(E)和靶(T)的孔中的放射性(釋放的鉻)；自發釋放(cpm)，是指在0.1ml培養基中只有靶(即沒有添加CTL)的孔中的放射性；而最大釋放，是指在0.1ml去汙劑溶液(Igepal CA 630；syn.NP-40；RPMI培養基中的5％溶液)中有靶的孔中的放射性。在孔-控制的實驗條件下，自發釋放值應為最大釋放的10％或以下。就MHC阻斷分析而言，將標記的靶與HLA-特異性mAb一起在室溫下預孵育30分鐘，W6/32用於阻斷所有I類，L243用於阻斷所有II類HLA分子(20μg/ml)。通過離心除去未結合的mAb，將mAb-包被的靶加到CTL上。用同種型匹配的mAb作為對照。
還有另一種方法來檢查細胞介導的免疫應答，該方法對抗原-驅動的T細胞的增殖能力進行研究。當事先暴露的抗原存在於MHC II類和程度較低的I類分子時，抗原敏化的T細胞往往優先增殖。因此，分裂細胞攝取放射性示蹤劑的計數提供了刺激的度量。
實施例1βhCG-B11的產生疫苗綴合物的設計通過將βhCG抗原與B11即結合樹突細胞上的人巨噬細胞甘露糖受體上的完全人抗體連接，產生該構建體。通過基因融合方法，使所述抗原與所述抗體的重鏈通過共價結合完成鍵合，如圖3所示。
βhCG-B11疫苗綴合物的重組表達如圖2所示，產生含有新黴素基因和二氫葉酸還原酶基因的質粒，其含有與抗體B11在重鏈CH3區融合的βhCG編碼序列(SEQ ID NO9和10)。採用標準化方案(QiagenInc，Valencia，CA)，將所得質粒構建體轉染到CHO細胞中。將轉染細胞在含有抗生素G418的培養基中進行選擇。讓細胞在濃度逐漸增高的氨甲蝶呤中生長來進一步擴增表達。擴增後，通過有限稀釋克隆細胞，穩定的克隆系用來產生細胞庫供進一步研究用。為確證βhCG-B11構建體的表達，在還原性條件下，通過SDS-PAGE對蛋白質進行蛋白質印跡分析。觀察到該融合蛋白具有預期分子量並適當裝配(即既含有重鏈融合物又含有輕鏈)。準確地說，所述疫苗綴合物和所述抗體單獨通過SDS-PAGE用變性條件進行分析，用蛋白質印跡分析進行檢測。然後所述印跡分別用山羊抗人IgG重鏈和輕鏈和βhCG C端肽特異性的mAb(Sigma)進行探測。結果證明，轉化的CHO細胞特異性表達B11-βhCG疫苗綴合物，證據為融合產物的合適的大小和組成。
實施例2B11scfv-βhCG的產生疫苗綴合物的設計通過使βhCG抗原與B11單鏈融合體(ScFv)連接產生第二構建體，B11單鏈融合體(ScFv)為結合樹突細胞上的人巨噬細胞甘露糖受體並且含有完全人B11抗體VL和VH片段的單鏈抗體。通過基因融合方法，使所述抗原與B11ScFv的羧基端通過共價結合完成鍵合，如圖1所示(稱為B11sfv-βhCG構建體)。
B11sfv-βhCG疫苗綴合物的重組表達如圖1所示，產生含有B11sfv-βhCG構建體(SEQ ID NO11和12)的質粒。採用標準化方案(Qiagen Inc，Valencia，CA)，將所得質粒構建體轉染到哺乳動物細胞中。將轉染細胞在含有抗生素G418的培養基中進行選擇。進行ELISA以證實B11sfv-βhCG構建體的表達。
實施例3疫苗綴合物的功能特徵抗體-靶向疫苗對其在APC表面的關聯受體的識別是此遞藥平臺的第一步。用流式血細胞計數研究來證實βhCG-B11和B11sfv-βhCG構建體與表達MR的培養的人DC特異性結合(圖4)。
用抗MR抗體作為探針，檢查人皮膚DC和各種人體組織切片中巨噬細胞上MR的原位染色。人體組織冷凍切片用抗MR人抗體B11染色。存在於皮膚表皮層的DC用B11抗體清楚地標記(數據未顯示)。注意到在皮膚表皮層有與DC的結合。而且，用所有組織中的抗MR B11 HuMAb染色的樹突細胞進行的免疫組織化學實驗，檢驗並顯示沒有意外的交叉反應性(結果未顯示)。這些研究已經用βhCG-B11重複進行，得到相同的結果。
實施例4將βhCG抗原/抗MR抗體疫苗綴合物交叉呈遞給T細胞評價了βhCG-B11構建體被DC加工以將βhCG抗原經由DC上的MHC I類和II類分子呈遞給T細胞(交叉呈遞)的能力。具體地說，通過將正常T細胞庫與暴露於所述疫苗的DC一起培養，用βhCG-B11構建體引發抗原特異性T細胞(應答)。然後，分析所得「敏化」T細胞的活性(增殖和殺傷)和特異性。通過將具有βhCG抗原的靶細胞產生的T細胞活性與抗原陰性對照進行比較，可以證明T細胞的特異性。細胞毒性T細胞(CTL)，如果存在，應當只殺傷呈遞βhCG相關抗原的那些靶，而放過缺乏所述抗原或呈遞無關抗原的對照靶。因為CTL介導的抗原識別總是發生在帶有所述肽的給定MHC分子的情況下，阻斷MHC肽-CTL與MHC特異性mAb的相互作用，從而證實I類或II類呈遞。
抗原特異性效應T細胞的誘導通過將貼壁單核細胞與25ng/ml重組人GM-CSF(RD systems，MN)和100ng/ml重組人IL-4一起培養5天，由正常供體外周血單核細胞(PBMC)產生樹突細胞。第5天，收穫DC(未成熟)並將其重懸於AIM-V(無血清)培養基中。將βhCG-B11免疫綴合物(20μg/ml)加入到1.2×106DC中並於37℃孵育45分鐘。使荷載抗原的DC在CD40L(Peprotech，NJ；20ng/ml)存在下成熟至少24小時。洗滌成熟的DC(1×106)一次，並以1×106細胞/ml(DC∶T細胞比值，20)加入到預先接種到24孔板的T細胞(2×107；總量)中。使用下述培養條件首先在第0天，加入10ng/ml IL-7，其次在第1天，加入10ng/ml IL-10(在24小時)，最後在第2天，加入20U/mlIL-2(在48小時)。在第7、14和21天如上所述重新刺激，只是βhCG-B11的濃度減半(分別為10μg/ml、5μg/ml和2.5μg/ml)。檢驗T細胞(以大量或用純化T細胞亞群)對51Cr標記的DC、荷載βhCG-B11、B11sfv-βhCG或B11的51Cr標記的DC的反應性。在HLA-特異性mAb存在下確定MHC-特異性。
如圖5所示，βhCG-B11構建體誘導βhCG-特異性細胞毒性T細胞。如果T細胞用不呈遞βhCG的靶培養，則不能保證殺傷。用在這些實驗中的靶細靶為用βhCG-B11構建體或對照抗原處理的HLA-匹配的DC。只用抗MR抗體(B11)處理的靶細胞對細胞毒活性不敏感，證實只有所述疫苗的抗原部分能夠引起CTL活性。這些結果表明βhCG-B11構建體誘導有效的CTL活性，準確地說，CTL活性針對βhCG抗原而不是靶向抗體(B11)。
而且，呈遞βhCG抗原的靶的有效殺傷用純化的CD8+T細胞再現，在抗MHC I類抗體存在下，該殺傷被阻斷(圖6)。具體地說，βhCG-B11構建體用來由兩個供體的外周血單核細胞產生βhCG-特異性T細胞。用免疫磁珠從大量培養物中純化CD8+和CD4+T細胞。細胞毒性試驗如上所述進行，效應物∶靶比值設在40∶1。靶細胞(未成熟DC)未處理(對照)或負載βhCG-B11構建體。為證明MHC I類特異性，通過用HLA特異性抗體預孵育阻斷靶細胞殺傷(W6/32)。
總起來說，這些數據(圖6和圖7)證實βhCG-B11構建體誘導有效的βhCG-特異性CTL的能力，也證實CTL活性由CD8+T細胞以HLA-依賴性方式介導。用純化的CD4+T細胞沒有觀察到殺傷活性。
如圖7所示，βhCG-B11構建體引起的T細胞在響應靶向DC的βhCG-B11構建體時增殖。具體地說，用βhCG-B11構建體處理DC，由外周血單核細胞產生βhCG-特異性T細胞。檢測來自大量培養物T細胞(CD4+和CD8T細胞)在響應抗原刺激時的增殖。T細胞與未處理DC(對照)或荷載βhCG-B11構建體的DC在有或沒有HLA阻斷抗體存在下共同培養。為測量增殖，培養5天後，用3H-胸苷分析DNA合成。數據表示為相對於對照的增殖的倍數增長(刺激指數)。就CTL活性來看，當T細胞由DC單獨刺激(即無抗原)，沒有發現合適的應答。只用未綴合的抗體(抗MR B11 mAb)靶向的DC不能誘導由βhCG-B11構建體引起的T細胞的增殖。T細胞的增殖能力在抗MHCI類以及II類-特異性mAb存在下被有效阻斷，證明CD4+和CD8+T細胞是感應的。這些數據顯示由DC對βhCG-B11構建體的攝取使得疫苗可以進入MHC I類和II類的加工途徑，該途徑與帶有MHC區室的MR的共區域化一致。
實施例5DC對抗MR抗體B11的內化較之於DC對甘露糖基化抗原的內化(對網格蛋白介導的內化的抑制)未成熟DC可通過胞飲或受體介導的胞吞機制吸收可溶性抗原(55)。抗原內化機制決定其細胞內命運並可影響對它的免疫應答的質量(54，55，56)。通過MR的內化被描述為快速、網格蛋白介導的內化事件(57，58)。MR本身在其胞質尾區內具有兩個推定的網絡蛋白靶向序列，甘露糖基化金顆粒的內化已經被EM定位到披網格蛋白小窩(58，59)。網格蛋白依賴型內吞可通過短暫高滲休克或K+排除特異性中斷(61)。為了確定甘露糖基化抗原或B11結合到甘露糖受體上是否經披網格蛋白小窩內化，在B11mAb或甘露糖基化BSA存在下，將未成熟DC在含有或不含400nM蔗糖的AIM5培養基中在冰上培養30分鐘。細胞隨後加熱到37℃並使其內化20分鐘。洗滌並固定後，細胞用共焦顯微鏡法進行分析(數據未顯示)。當B11結合到MR時，其攝取被高滲休克抑制，表明其內化機制是通過披網格蛋白小窩。甘露糖基化BSA的攝取相反，不被高滲休克抑制，表明其內化機制不依賴於披網格蛋白小窩的形成。甚至在比B11濃度高20倍的情況下，甘露糖基化BSA FITC的表面染色相對較弱。其後的研究揭示出內化的甘露糖基化BSA FITC與非特異性、液相示蹤劑共定位，其中作為含有內化B11的小囊泡排除非特異性示蹤劑(數據未顯示)。與B11-FITC相反，甘露糖基化的BSA-FITC和液相示蹤劑的攝取，通過用PI3K抑制劑渥曼青黴素預處理，而大半被阻(數據未顯示)。這些結果表明絕大多數甘露糖基化BSA，通過未成熟樹突細胞經非特異性大胞飲機制吸收，提示對甘露糖基化抗原的免疫應答質量可能與特異性靶向MR的抗原相差甚遠。
實施例6B11sfv-βhCG與DC的結合將單核細胞驅動的DC暴露於PBS-BSA緩衝液中的B11sfv-βhCG或βhCG-B11中，於37℃持續45分鐘，並在CD40L存在下，使其成熟過夜。收穫的DC隨後洗滌並先後用小鼠抗βhCG、山羊抗hu IgG(Fc)-PE綴合物染色。染色的細胞在流式細胞儀(BD-LSR)上進行分析。每個樣品大約收集10,000個事例。背景自動螢光和同種型匹配的抗體染色用作對照。根據平均螢光強度(MFI)(數據未顯示)，B11sfv-βhCG的與表達於DC上的MR的結合類似於βhCG-B11的。
實施例7對βhCG-B11構建體有特異性的CTL識別由DC呈遞的抗原(B11sfv-βhCG)的scFv形式針對抗DC-呈遞的βhCG-B11產生的CTL，要測試其暴露於βhCG-B11和B11sfv-βhCG的自體DC靶，同時未處理DC或暴露於B11的DC用作對照。抗原暴露後，靶用51鉻標記並在一個4小時的試驗中與CTL混合，該試驗測量上清液中放射性的釋放。在該實驗中，βhCG-B11-特異性T細胞識別呈遞MHC I類分子上抗原的4個靶中的2個。當DC缺少抗原時，不發生靶的殺傷(圖11)。因此，DC對βhCG-B 11的攝取導致βhCG-來源的T細胞表位被CTL識別。等同實施方案僅用常規實驗，本領域技術人員就會認識或者能夠確定本文所述發明的具體實施方案的許多等同實施方案。這些等同實施方案包括在所附權利要求書中。
文獻引用本文引用的所有專利、待審批的專利申請和其它出版物，全都通過引用整體結合到本文中。
參考文獻1.Steinman，R.M.1991.The dendritic cell system and its role in immunogenicity.Annu Rev Immunol.9271.
2.Hart，D.N.1997.Dendritic cellsunique leukocyte populations which control theprimary immune response.Blood.903245.
3.Banchereau，J.，and R.M.Steinman.1998.Dendritic cells and the control ofimmunity.Nature.392245.
4.Thery C.，and S.Amigorena.2001.The cell biology of antigen presentation indendritic cells.Curr Opin Immunol.1345.
5.Hsu F.J.，C.Benike，F.Fagnoni，T.M.Liles，D.Czerwinski，B.Taidi，E.G.Engleman，and R.Levy.1996.Vaccination ofpatients with B-cell lymphoma usingautologous antigen-pulsed dendritic cells.Nat Med.252.
6.Kirk C.J.，and J.J.Mule.2000.Gene-modified dendritic cells for use in tumorvaccines.Hum Gene Ther.11797.
7.Thurner B.，I.Haendle，C.Roder，D.Dieckmann，P.Keikavoussi，H.Jonuleit，Bender，C.Maczek，D.Schreiner，P.von den Driesch，E.B.Brocker，R.M.Steinman，A.Enk，E.Kampgen，and G.Schuler.1999.Vaccination with mage-3A1peptide-pulsed mature，monocyte-derived dendritic cells expands specific cytotoxic Tcells and induces regression of some metastases in advanced stage IV melanoma.J ExpMed.1901669.
8.Dallal R.M.，and M.T.Lotze.2000.The dendritic cell and human cancer vaccines.Curr Opin Immunol.12583.
9.Nair S.，J.S.Babu，R.G.Dunham，P.Kanda，R.L.Burke，and B.T.Rouse.1993.Induction of primary，antiviral cytotoxic，and proliferative responses with antigensadministered via dendritic cells.J Virol.674062.
10.Gilboa E.1999.The makings of a tumor rejection antigen.Immunity.11263.
11.Fields R.C.，K.Shimizu，J.J.Mule.1998.Murine dendritic cells pulsed withwhole tumor lysates mediate potent antitumor immune responses in vitro and in vivo.Proc Natl Acad Sci USA.959482.
12.Carayanniotis G.，and B.H.Barber.1987.Adjuvant-free IgG responses inducedwith antigen coupled to antibodies against class II MHC.Nature.32759.
13.Snider D.P.and D.M.Segal.1987.Targeted antigen presentation using crosslinkedantibody heteroaggregates.J.Immunol.1391609.
14.Wang H.，M.N.Griffiths，D.R.Burton，and P.Ghazal.2000.Rapid antibodyresponses by low-dose，single-step，DCs-targeted immunization.Proc NatlAcad SciUSA.97847.
15.Jiang W.，W.J.Swiggard，C.Heufler，M.Peng，A.Mirza，R.M.Steinman，andM.C.Nussenzweig.1995.The receptor DEC-205 expressed by DCss and thymicepithelial cells is involved in antigen processing.Nature.375151.
16.Keler，T.，P.M.Guyre，L.A.Vitale，K.Sundarapandiyan，J.G.J.van de Winkel，Y.M.Deo，and R.F.Graziano.2000.Targeting weak antigens to CD64 elicits potenthumoral responses in human CD64 transgenic mice.J.Immunol.1656738.
17.Regnault，A.，D.Lankar，V.Lacabanne，A.Rodriguez，C.Théry，M.Rescigno，T.Saito，S.Verbeek，C.Bonnerot，P.Ricciardi-Castagnoli，and S.Amigorena.1999.FcγReceptor-mediated induction of dendritic cell maturation and majorhistocompatibility complex classl-restricted antigen presentation after immune complexinternalization.J.Exp.Med.189371.
18.Wallace P.K.，K.Y.Tsang，J.Goldstein，P.Correale，T.M.Jarry，J.Schlom，P.M.Guyre，M.S.Emstoff，and M.W.Fanger.2001.Exogenous antigen targeted toFcgammaRI on myeloid cells is presented in association with MHC class I.J ImmunolMethods.248183.
19.Berlyn K.A.，B.Schultes，B.Leveugle，A.A.Noujaim，R.B.Alexander，and D.L.Mann.2001.Generation of CD4(+)and CD8(+)T lymphocyte responses bydendritic cells armed with PSA/anti-PSA(antigen/antibody)complexes.Clin Immunol.101276.
20.Dhodapkar K.M.，J.Krasovsky，B.Williamson，and M.V.Dhodapkar.2002.Antitumor monoclonal antibodies enhance cross-presentation of cellular antigens and thegeneration of myeloma-specific killer T cells by dendritic cells.J Exp Med.195125.
21.Lonberg N.，L.D.Taylor，F.A.Harding，M.Trounstine，K.M.Higgins，S.R.Schramm，C.C.Kuo，R.Mashayekh，K.Wymore，J.G.McCabe，et al.1994.Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct geneticmodifications.Nature.368856.
22.Fishwild D.M.，S.L.O′Donnell，T.Bengoechea，D.V.Hudson，F.Harding，S.L.Bernhard，D.Jones，R.M.Kay，K.M.Higgins，S.R.Schramm，and N.Lonberg.1996.High-avidity human IgG kappa monoclonal antibodies from a novel strain ofminilocus transgenic mice.Nat Biotechnol.14845.
23.Kohler G.，and C.Milstein.1975.Continuous cultures of fused cells secretingantibody of predefined specificity.Nature.256495.
24.Fanger，N.A.，D.Voigtlaender，C.Liu，S.Swink，K.Wardwell，J.Fisher，R.F.Graziano，L.C.Pfefferkorn，and P.M.Guyre.1997.Characterization of expression，cytokine regulation，and effector function of the high affinity IgG receptor FcγRI(CD64)expressed on human blood DCss.J.Immunol.1583090.
25.Gosselin，E.J.，K.Wardwell，D.R.Gosselin，N.Alter，J.L.Fisher，and P.M.Guyre.1992.Enhanced antigen presentation using human Fcγreceptor(monocyte/macrophage)-specific immunogens.J.Immunol.1493477.
26.Stahl P.D.1992.The mannose receptor and other macrophage lectins.Curr OpinImmunol.449.
27.Uccini S.，M.C.Sirianni，L.Vincenzi，S.Topino，A.Stoppacciaro，I.Lesnoni LaParola，M.Capuano，C.Masini，D.Cerimele，M.Cella，A.Lanzavecchia，P.Allavena，Mantovani，C.D.Baroni，and L.P.Ruco.1997.Kaposi′s sarcoma cellsexpress the macrophage-associated antigen mannose receptor and develop in peripheralblood cultures of Kaposi′s sarcoma patients.Am J Pathol.150929.
28.Magnusson S.，and T.Berg.1993.Endocytosis of ricin by rat liver cells in vivoand in vitro is mainly mediated by mannose receptors on sinusoidal endothelial cells.Biochem J.291749.
29.Noorman F.，E.A.Braat，M.Barrett-Bergshoeff，E.Barbe，A.van Leeuwen，J.Lindeman，and D.C.Rijken.1997.Monoclonal antibodies against the human mannosereceptor as a specific marker in flow cytometry and immunohistochemistry formacrophages.J Leukoc Biol.6163.
30.Nobes C，Marsh M.2000.Dendritic cellsnew roles for Cdc42 and Rac in antigenuptake？Curr Biol.1020.
31.Lanzavecchia A.1996.Mchanisms of antigen uptake for presentation.Curr OpinImmunol.83.
32.Harris J.，Werling D.，Hope J.C.，Taylor G.，Howard C.J.2002.Caveolea andcaveolin in immune cellsdistribution and functions.Trends Immunol.233.
33.Apostolopoulos V.，McKenzie I.F.2001.Role of the mannose receptor in theimmune response.Curr Mol Med.14.
34.East L.，Isacke C.M.2002.The mannose receptor family.Biochim Biophys Acta.15722-3.
35.Lew D.B.，Songu-Mize E.，Pontow S.E.，Stahl P.D.，Rattazzi M.C.1994.A mannosereceptor mediates mannosyl-rich glycoprotein-induced mitogenesis in bovine airwaysmooth muscle cells.J Clin Invest.945.
36.Mueller A.，Kelly E.，Stramge P.G.2002.Pathways for internalization and recyclingof the chemokine receptor CCR5.Blood.993.
37.Taylor M.E.，J.T.Conary，M.R.Lennartz，P.D.Stahl，and K.Drickamer.1990.Primary structure of the mannose receptor contains multiple motifs resemblingcarbohydrate-recognition domains.J Biol Chem.26512156.
38.Taylor M.E.2001.Structure and function of the macrophage mannose receptor.Results Probl Cell Differ.33105.
39.Simpson D.Z.，P.G.Hitchen，E.L.Elmhirst，and M.E.Taylor.1999.Multipleinteractions between pituitary hormones and the mannose receptor.Biochem J.343403.
40.Irjala H.，E.L.Johansson，R.Grenman，K.Alanen，M.Salmi，and S.Jalkanen.2001.Mannose receptor is a novel ligand for L-selectin and mediates lymphocytebinding to lymphatic endothelium.J Exp Med.1941033.
41.Lee，S.J.，S.Evers，D.Roeder，A.F.Parlow，J.Risteli，L.Risteli，Y.C.Lee，T.Feizi，H.Langen，and M.C.Nussenzweig.Mannose receptor-mediated regulation ofserum glycoprotein homeostasis.Science 2951898.
42.Condaminet B.，J.Peguet-Navarro，P.D.Stahl，C.Dalbiez-Gauthier，D.Schmitt，and O.Berthier-Vergnes.1998.Human epidermal Langerhans cells express themannose-fucose binding receptor.Eur J Immunol.283541.
43.Reis e Sousa C.，P.D.Stahl，and J.M.Austyn.1993.Phagocytosis of antigens byLangerhans cells in vitro.J Exp Med.178509.
44.Mommaas A.M.，A.A.Mulder，R.Jordens，C.Out，M.C.Tan，P.Cresswell，P.M.Kluin，and F.Koning.1999.Human epidermal Langerhans cells lack functionalmannose receptors and a fully developed endosomal/lysosomal compartment for loadingof HLA class II molecules.Eur J Immunol.29571.
45.Lohse A.W.，P.A.Knolle，K.Bilo，A.Uhrig，C.Waldmann，M.Ibe，E.Schmitt，G.Gerken，K.H.Meyer Zum Buschenfelde.1996.Antigen-presenting function andB7 expression of murine sinusoidal endothelial cells and Kupffer cells.Gastroenterology.1101175.
46.Tan M.C.，A.M.Mommaas，J.W.Drijfhout，R.Jordens，J.J.Onderwater，D.Verwoerd，A.A.Mulder，A.N.van der Heiden，D.Scheidegger，L.C.Oomen，T.H.Ottenhoff，A.Tulp，J.J.Neefjes，and F.Koning.1997.Mannose receptor-mediateduptake of antigens strongly enhances HLA class II-restricted antigen presentation bycultured DCss.Eur J Immunol.272426.
47.Engering A.J.，M.Cella，D.M.Fluitsma，E.C.Hoefsmit，A.Lanzavecchia，andJ.Pieters.1997.Mannose receptor mediated antigen uptake and presentation in humanDCss.Adv Exp Med Biol.417183.
48.Apostolopoulos V.，G.A.Pietersz，S.Gordon，L.Martinez-Pomares，and I.F.McKenzie.2000.Aldehyde-mannan antigen complexes target the MHC class Iantigen-presentation pathway.Eur J Immunol.301714.
49.Prigozy T.I.，P.A.Sieling，D.Clemens，P.L.Stewart，S.M.Behar，S.A.Porcelli，M.B.Brenner，R.L.Modlin，and M.Kronenberg.1997.The mannosereceptor delivers lipoglycan antigens to endosomes for presentation to T cells by CD1bmolecules.Immunity.6187.
50.Apostolopoulos V.，B.E.Loveland，G.A.Pietersz，and I.F.McKenzie.1995.CTL in mice immunized with human mucin 1 are MHC-restricted.J Immunol.1555089.
51.Dhodapkar M.V.，R.M.Steinman，J.Krasovsky，C.Munz，and N.Bhardwaj.2001.Antigen-specific inhibition of effector T cell function in humans after injection ofimmature dendritic cells.J Exp Med.193233.
52.Hawiger D.，K.Inaba，Y.Dorsett，M.Guo，K.Mahnke，M.Rivera，J.V.Rawtch，R.M.Steinman，and M.C.Nussenzweig.2001.Dendritic cells induce peripheral Tcell unresponsiveness under steady state conditions in vivo.J Exp Med.194769.
53.Wallace，P.K.，Romet-Lemonne，J.L.，Chokri，M.，Fanger，M.W.，and Fadul，C.E.Production of macrophage activated killer cells for in vivo targeting to glioblastomawith a bispecific antibody to FcγRI and EGF receptor，Cancer Immunol.Immunother.49493-503，2000.
54.Nobes C，Marsh M.Dendritic cellsnew roles for Cdc42 and Rac in antigen uptake？Curr Biol.2000Oct 19；10(20)R739-41.
55.Lanzavecchia A.Mechanisms of antigen uptake for presentation.Curr OpinImmunol.1996 Jun；8(3)348-54.
57.Harris J，Werling D，Hope JC，Taylor G，Howard CJ.Caveolae and caveolin inimmune cellsdistribution and functions.Trends Immunol.2002 Mar；23(3)158-6458.Apostolopoulos V，McKenzie IF Role of the mannose receptor in the immuneresponse Curr Mol Med.2001 Sep；1(4)469-74.Review PMID11899091[PubMed-indexed for MEDLINE]
59.East L，Isacke CM.The mannose receptor family Biochim Biophys Acta.2002 Sep19；1572(2-3)364-86.
60.Lew DB，Songu-Mize E，Pontow SE，Stahl PD，Rattazzi MC.A mannose receptormediates mannosyl-rich glycoprotein-induced mitogenesis in bovine airway smoothmuscle cells J Clin Invest.1994 Nov；94(5)1855-6361.Mueller A，Kelly E，Strange PG.Related Articles，Links Pathways forinternalization and recycling of the chemokine receptor CCR5 Blood.2002 Feb1；99(3)785-91.
62.Cohen，B.E.，A.S.Rosenthal，and W.E.Paul.1973.Antigen-macrophageinteraction.II.Relative roles of cytophilic antibody and other membrane sites.J.Immunol.111820.
63.Wernersson，S.，Karlsson M.C.I.，Dahlstrm J.，Mattsson R.，Verbeek J.S.，andHeyman B.1999.IgG-mediated enhancement of antibody responses is low in Fcreceptor gchain-deficient mice and increased in FcγRII-deficient mice.J.Immunol.163618.
64.Regnault，A.，D.Lankar，V.Lacabanne，A.Rodriguez，C.Théry，M.Rescigno，T.Saito，S.Verbeek，C.Bonnerot，P.Ricciardi-Castagnoli，and S.Amigorena.1999.FcgReceptor-mediated induction of dendritic cell maturation and major histocompatibilitycomplex classl-restricted antigen presentation after immune complex internalization.J.Exp.Med.18937165.Wallace P.K.，K.Y.Tsang，J.Goldstein，P.Correale，T.M.Jarry，J.Schlom，P.M.Guyre，M.S.Ernstoff，and M.W.Fanger.2001.Exogenous antigen targeted toFcgammaRI on myeloid cells is presented in association with MHC class I.J ImmunolMethods.248183.
66.Snider D.P.and D.M.Segal.1987.Targeted antigen presentation using crosslinkedantibody heteroaggregates.J.Immunol.1391609.
67.Carayanniotis G.，and B.H.Barber.1987.Adjuvant-free IgG responses inducedwith antigen coupled to antibodies against class II MHC.Nature.32759.
68.Taylor M.E.2001.Structure and function of the macrophage mannose receptor.Results Probl Cell Differ.33105.
69.Fanger，N.A.，D.Voigtlaender，C.Liu，S.Swink，K.Wardwell，J.Fisher，R.F.Graziano，L.C.Pfefferkorn，and P.M.Guyre.1997.Characterization of expression，cytokine regulation，and effector function of the high affinity IgG receptor FcgRI(CD64)expressed on human blood DCs.J.Immunol.1583090.
70.Treml，J.F.，Deo，M.D.，Wallace，P.K.，and T.Keler.A Mannose receptor-specifichuman antibody for delivery of antigens to dendritic cells.Prepared for submission to J.Leuk.Biol.2003.
71.Keler，T.，P.M.Guyre，L.A.Vitale，K.Sundarapandiyan，J.G.J.van de Winkel，Y.M.Deo，and R.F.Graziano.2000.Targeting weak antigens to CD64 elicits potenthumoral responses in human CD64 transgenic mice.J.Immunol.1656738.
72.Guyre CA，Barreda ME，Swink SL，Fanger MW.2001.Colocalization of Fc gammaRI-targeted antigen with class I MHCimplications for antigen processing.J Immunol166(4)2469-78.
73.Triozzi，P.L.and V.Stevens.1999.Human Chorionicgonadotropin as a target forcancer vaccines(Review).Oncology reports 67-17.
74.Louchimo，J.，Carpelan-Holmstrom，M.，Alfthan，H.，Stenman，U.H.，Jarvinen，H.J.，Haghnd，C.2002.Serum hCGb，CA 72-4，and CEA are independent prognosticfactors in colorectal cancer.Int.J.Can.101545-548.
75.Hotakainen，K.，Ljungberg，B.，Paju，A.，Alfthan，H.，and U-H Stenman.2002.Thefree b-subunit of human chorionic gonadotropin as a prognostic factor in renal cellcarcinoma.British J.of Can.86185-189.
76.Heijnen，I.A.，M.J.van Vugt，N.A.Fanger，R.F.Graziano，T.P.de Wit，F.M.Hofhuis，P.M.Guyre，P.J.Capel，J.S.Verbeek，and J.G.van de Winkel.1996.Antigentargeting to myeloid-specific human FcgRI/CD64 triggers enhanced antibodyresponses in transgenic mice.J.Clin.Invest.97331.
77.WO 91/0036078.U.S.patent No.4,950,48079.Snider et al.(1990)J.of Exp.Med.1711957-1963.
80.Shen et al.J.of Immunol.137(11)3378-3382.
81.Snider and Segal(1989)J.of Immunol.143(1)59-65.
82.U.S.Patent No.4,954,61783.Snider and Segal(1987)J.Immunology 1391609-161684.Kawamura and Berzofsky(1986)J.of Immunol.136(1)58-65.
序列表110Medarex.Inc.et al.
120抗體疫苗綴合物及其用途130MXI-301PC15060/4439791512003-01-3116032170FastSEQ for Windows Version 4.021012111407212DNA213智人(Homo sapiens)4001atgggatgga gctgtatcat cctgttcctc gtggccacag caaccggtgt ccactctgag 60gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaggatctcc 120tgtaagggtt ctggagacag ttttaccacc tactggatcg gctgggtgcg ccagatgccc 180gggaaaggcc tggagtggat ggggatcatc tatcctggtg actctgatac catatacagc 240ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca gccgacaagt ccatcagcac cgcctacctg 300cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtacgag aggggaccgg 360ggcgttgact actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctcagctag caccaagggc 420ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 480ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgag ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 540ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 600agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 660aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 720actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 780ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 840gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 900gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 960gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 1020gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1080ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 1140gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1260tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1320ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1380ctgtctccgg gtaaaggctc gagctga 14072102
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1.一種包含單克隆抗體的分子綴合物，所述單克隆抗體結合在與β人絨毛膜促性腺激素(βhCG)連接的人抗原呈遞細胞(APC)上。
2.權利要求1的分子綴合物，其中所述抗體結合到表達於人樹突細胞上的C型凝集素上。
3.權利要求1或2的分子綴合物，其中所述抗體結合到人甘露糖受體上。
4.前述權利要求中任一項的分子綴合物，其中所述抗體選自人抗體、人源化抗體和嵌合抗體。
5.前述權利要求中任一項的分子綴合物，其中所述抗體選自全抗體、Fab片段和單鏈抗體。
6.權利要求1的分子綴合物，其中所述綴合物為重組融合蛋白。
7.前述權利要求中任一項的分子綴合物，其中所述抗體包含人重鏈可變區，包括構架區(FR)1、互補決定區(CDR)1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4序列；和人輕鏈可變區，包括FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4序列，其中(a)所述人重鏈可變區CDR3序列包含SEQ ID NO15，及其保守修飾；和(b)所述人輕鏈可變區CDR3序列包含SEQ ID NO18，及其保守修飾。
8.權利要求6的分子綴合物，其中所述人重鏈可變區CDR2序列包含SEQ ID NO14，及其保守修飾；所述人輕鏈可變區CDR2序列包含SEQ ID NO17，及其保守修飾。
9.權利要求7或8的分子綴合物，其中所述人重鏈可變區CDR1序列包含SEQ ID NO13，及其保守修飾；所述人輕鏈可變區CDR1序列包含SEQ ID NO16，及其保守修飾。
10.權利要求1的分子綴合物，其中所述抗體包含(a)源自人重鏈可變區(VH)5-51種系序列即SEQ ID NO30的重鏈可變區；(b)源自人輕鏈可變區κ鏈(Vκ-L)15即SEQ ID NO32種系序列的輕鏈可變區。
11.前述權利要求中任一項的分子綴合物，其中所述抗體包含人重鏈可變區和人輕鏈可變區，所述可變區包含分別示於SEQ ID NO4和SEQ ID NO8的胺基酸序列，或者與SEQ ID NO4或SEQ ID NO8同源性足夠高的胺基酸序列，致使所述抗體保持結合到人樹突細胞上的能力。
12.一種包含人抗體重鏈和人抗體輕鏈的分子綴合物，其中任一條或兩條鏈連接在βhCG上。
13.權利要求12的分子綴合物，其中所述重鏈連接在βhCG上並且包含SEQ ID NO2中所示的胺基酸序列。
14.權利要求12或13的分子綴合物，其中所述輕鏈包含SEQ IDNO6中所示的胺基酸序列。
15.一種包含單克隆抗體的分子綴合物，所述單克隆抗體結合在與β人絨毛膜促性腺激素(βhCG)連接的人抗原呈遞細胞(APC)上，其中所述抗體包含(a)源自人VH5-51種系序列即SEQ ID NO30的重鏈可變區；和(b)源自人Vκ-L15即SEQ ID NO32種系序列的輕鏈可變區。
16.一種包含人單鏈抗體的分子綴合物，所述人單鏈抗體結合到與β人絨毛膜促性腺激素(βhCG)連接的人抗原呈遞細胞(APC)上，其中所述綴合物包含SEQ ID NO12中所示的胺基酸序列。
17.前述權利要求中任一項的分子綴合物，所述綴合物由APC內化並加工，致使T細胞介導的免疫應答是針對所述抗原產生的。
18.權利要求17的分子綴合物，其中所述T細胞應答由細胞毒性T細胞介導。
19.權利要求17或18的分子綴合物，其中所述T細胞應答由CD4+和CD8+T細胞介導。
20.權利要求17-19中任一項的分子綴合物，其中所述T細胞應答經由主要組織相容性複合體(MHC)I類和MHC II類兩種途徑誘導。
21.一種組合物，所述組合物包含前述權利要求中任一項的分子綴合物和藥物可接受的載體，並任選與佐劑聯用。
22.一種誘導或增強抗βhCG的T細胞介導免疫應答的方法，所述方法包括使前述權利要求中任一項的分子綴合物與APC接觸，致使所述抗原以誘導或增強針對所述抗原的T細胞介導應答的方式被加工並呈遞給T細胞。
23.權利要求22的方法，其中所述T細胞應答由CD4+和CD8+T細胞介導。
24.前述權利要求中任一項的方法，其中所述T細胞應答由細胞毒性T細胞和/或輔助T細胞介導。
25.前述權利要求中任一項的方法，其中所述T細胞應答經由MHC I類和MHC II類兩種途徑將所述抗原交叉呈遞給T細胞而誘導。
26.前述權利要求中任一項的方法，其中所述βhCG抗原由腫瘤細胞表達。
27.權利要求26的方法，其中所述腫瘤細胞選自結腸、肺、胰腺、乳腺、卵巢和生殖細胞來源的腫瘤細胞。
28.前述權利要求中任一項的方法，其中所述分子綴合物與所述樹突細胞在體內接觸。
29.前述權利要求中任一項的方法，其中所述分子綴合物與所述樹突細胞在活體外接觸。
30.前述權利要求中任一項的方法，所述方法還包括使所述樹突細胞與刺激樹突細胞增殖的細胞因子、任選粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)或FLT3-L接觸。
31.前述權利要求中任一項的方法，所述方法還包括使所述樹突細胞與免疫刺激劑、任選抗溶細胞性T淋巴細胞相關抗原-4(CTLA-4)抗體接觸。
32.一種免疫受試者的方法，所述方法包括給予前述權利要求中任一項的分子綴合物、任選聯用的佐劑、刺激樹突細胞增殖的細胞因子和/或免疫刺激劑。
33.一種誘導或增強針對抗原的細胞毒性T細胞應答的方法，所述方法包括形成抗原與結合到抗原呈遞細胞(APC)上的單克隆抗體的綴合物；和使所述綴合物在體內或活體外與APC接觸，致使所述抗原以誘導或增強針對所述抗原的細胞毒性T細胞應答的方式被內化、加工並呈遞給T細胞。
34.權利要求33的方法，所述方法還誘導或增強針對所述抗原的輔助T細胞應答。
35.權利要求33或34的方法，其中所述T細胞應答由CD4+和CD8+T細胞介導。
36.權利要求33-35中任一項的方法，其中所述T細胞應答經由MHC I類和MHC II類兩種途徑誘導。
37.權利要求33-36中任一項的方法，其中所述抗體結合到表達於人樹突細胞的C型凝集素上。
38.權利要求33-37中任一項的方法，其中所述抗體結合到所述人甘露糖受體上。
39.權利要求33-38中任一項的方法，其中所述抗體選自人抗體、人源化抗體和嵌合抗體。
40.權利要求33-39中任一項的方法，其中所述抗體選自全抗體、Fab片段和單鏈抗體。
41.權利要求33-40中任一項的方法，其中所述抗體包含人重鏈可變區，包括FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4序列；和人輕鏈可變區，包括FRI、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4序列，其中(a)所述人重鏈可變區CDR3序列包含SEQ ID NO15，及其保守修飾；和(b)所述人輕鏈可變區CDR3序列包含SEQ ID NO18，及其保守修飾。
42.權利要求41的方法，其中所述人重鏈可變區CDR2序列包含SEQ ID NO14，及其保守修飾；所述人輕鏈可變區CDR2序列包含SEQ ID NO17，及其保守修飾。
43.權利要求41或42的方法，其中所述人重鏈可變區CDR1序列包含SEQ ID NO13，及其保守修飾；所述人輕鏈可變區CDR1序列包含SEQ ID NO16，及其保守修飾。
44.權利要求41-43中任一項的方法，其中所述抗體包含人重鏈可變區和人輕鏈可變區，所述可變區包含分別示於SEQ ID NO4和SEQ ID NO8的胺基酸序列，或者與SEQ ID NO4或SEQ ID NO8同源性足夠高的胺基酸序列，致使所述抗體保持結合到樹突細胞上的能力。
45.權利要求33-44中任一項的方法，其中所述抗原由腫瘤細胞或病原生物體表達。
46.權利要求33-45中任一項的方法，其中所述抗原選自βhCG、Gp100、前列腺相關抗原和Pmel-17。
47.權利要求33-46中任一項的方法，所述方法還包括使所述樹突細胞與佐劑、刺激樹突細胞增殖的細胞因子和/或免疫刺激劑接觸。
48.權利要求33-47中任一項的方法，其中將所述綴合物體內給予受試者。
49.權利要求48的方法，其中所述受試者獲得針對所述抗原的免疫力。
全文摘要
本發明提供了新型抗體疫苗綴合物以及用其誘導細胞毒性T細胞(CTL)應答的方法。在一個具體的實施方案中，該疫苗綴合物包括連接在抗甘露糖受體(MR)抗體上的人絨毛膜促性腺激素β亞單位(βhCG)抗原。
文檔編號C12P21/08GK1767852SQ200480008178
公開日2006年5月3日 申請日期2004年1月30日 優先權日2003年1月31日
發明者T·克勒, M·恩德雷斯, L·何, V·拉馬克裡什納 申請人:塞爾德克斯醫療公司