誘導產生十八碳四烯酸的方法

2023-12-08 15:56:06 3

專利名稱：誘導產生十八碳四烯酸的方法
亞油酸(182)(LA)經Δ6-去飽和酶的作用轉變成γ亞麻酸(183)(GLA)。當Δ6-去飽和酶或者是編碼這種酶的核酸被轉入到產LA的細胞中後即可產生GLA。本發明提供了含有Δ6-去飽和酶基因的核酸。更具體地說，本發明的核酸包括Δ6-去飽和酶基因的啟動子、編碼區和終止區。本發明進一步還涉及含有與異源調節順序進行功能性結合的Δ6-去飽和酶編碼區的重組構建體。本發明的核酸和重組體構建體可用在轉基因生物體中生產GLA。
不飽和脂肪酸，如亞油酸(C18Δ9，12)和α-亞麻酸(C18Δ9，12，15)是每日食物攝入的必需成分，它不能被脊椎動物自身合成，因為脊椎動物細胞只能在脂肪酸的Δ9位置引入雙鍵，但不能在Δ9雙鍵和脂肪酸邊的甲基末端之間引入另外雙鍵。亞油酸和α-亞麻酸是其它產物的前體，所以它們是必需脂肪酸，並且通常是從植物中獲取。亞油酸可以由哺乳動物轉變為γ-亞麻酸(GLA，C18Δ6，9，12)，再轉變為花生四烯酸(204)。花生四烯酸是一種相當重要的脂肪酸，因為它是大多數前列腺素必不可少的前體。
通過轉變為GLA和花生四烯酸，亞油酸食品中滿足了食物中的GLA和花生四烯酸的需要。然而，已經證明了飽和脂肪酸的消耗和疾病的發生如高膽固醇血症、粥樣硬化以及與冠脈疾病易感性相關的化學物質紊亂之間的關係。而消耗不飽和脂肪與血膽固醇的降低有關，患粥樣硬化的危險性就減小。GLA飲食的治療性優點來自於GLA可作為花生四烯酸的前體，繼而有助於前列腺素的合成。因此，更多的不飽和的GLA而不是亞油酸將益於健康，但是，在任何商業性生產的穀類植物中實際上都不存在GLA。
亞油酸在Δ6-去飽和酶的作用下轉變為GLA。Δ6-去飽和酶具有約359個胺基酸，有一個膜結合區和一個脂肪酸去飽和作用的活化位點。當Δ6-去飽和酶轉入一個本身只產生亞油酸而不產生GLA的細胞中時，該細胞就可以產生GLA。本發明通過提供Δ6-去飽和酶的基因編碼，產生含有功能性Δ6-去飽和酶並產生GLA的轉基因生物體。除了產生大量的GLA外，本發明還提供了新的GLA飲食來源。
本發明涉及一種被分離的Δ6-去飽和酶基因，具體地說，這種被分離的基因含有Δ6-去飽和酶啟動子、編碼區和終止密碼區。
本發明還涉及含有Δ6-去飽和酶啟動子、編碼區、終止密碼區的表達載體。
本發明還涉及包括Δ6-去飽和酶編碼區與外源調節區即非源於Δ6-去飽和酶基因的單元進行功能性結合的表達載體。
本發明還提供含有本發明載體的細胞和生物體以及這類生物體的子代。
本發明還提供了被分離的細菌性Δ6-去飽和酶，進一步還涉及被分離的編碼細菌性Δ6-去飽和酶的核酸。
本發明提供了產生增高γ-亞麻酸(GLA)含量的植物的方法，通過用本發明的分離的核酸轉化植物細胞，以及用上述高GLA含量的植物細胞再生植物。
本發明提供了一種產生耐寒植物的方法。


圖1描繪了集胞藻屬菌(synechocystis)Δ6-去飽和酶(圖1A)和Δ12-去飽和酶(圖1B)的推測胺基酸順序的水療法圖。用實線表示推測的膜距區(membrane spanning regions)。用19個胺基酸殘基窗格大小計算疏水指數(kyte，et al，1982，J.Molec.Biol.157)。
圖2表示野生型魚腥藻屬細菌(圖2A)和轉基因魚腥藻屬細菌(圖2B)的氣液色譜圖。
圖3是帶有重疊區和亞克隆的粘性質粒cSy75、cSy13和cSy7的簡圖。cSy75、cSy75-3.5和cSy7的亞克隆的起始點用帶斜條的框線表示。還末被活化的限制性位點寫在括號內。
圖4表示野生型(圖A)和轉移基因型菸草(圖B)的氣液色譜圖。
本發明提供了一種分離的編碼Δ6-去飽和酶的核酸，為了鑑定編碼Δ6-去飽和酶的核酸，從能產生GLA的生物體中分離DNA。例如，所說的生物體可以是動物細胞、某些真菌(如被孢黴屬)，某些細菌(例如集胞藻屬)或某些植物(琉璃苣、月見草屬、茶蔗子屬植物)。基因DNA的分離可以用本領域普通技術人員已知的各種方法進行，例如用Sambrook等人舉證的方法(Molecular CloningA laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY.1989)。用物理方法或酶消化作用將分離的DNA裂解，然後再通過參考文獻中的(例如Sambrook et al，1989)各種已知方法把裂解片段克隆到合適的載體中，如噬菌體或粘性質粒載體。本文特別設計了含有本發明DNA的表達載體。通過獲得的功能性分析結果鑑定編碼Δ6-去飽和酶的DNA。含有裂解的DNA片段的載體通過感染、轉結合和轉染等方式轉移到產亞油酸但不產GLA的宿主生物體中。本文所說的「轉化」通常指的是將外源DNA摻入到宿主細胞中，將重組DNA導入宿主生物體中的方法是本領域普通技術人員已知的。例如可以參考的文獻有Sambrook et al.，1989。這些有機體的GLA的生產(如功能的獲得)諸如氣液色譜圖或其它普通技術人員所熟悉的方法鑑定。
經誘導產生GLA的生物體，亦即通過載體的導入而獲得上述功能的生物體被證明為表達了編碼Δ6-去飽和酶的DNA，再從生物體中回收所說的DNA。回收的DNA可再次裂解，用表達載體進行克隆，並用上述過程進行功能性評估，以便更為精確地弄清楚編碼Δ6-去飽和酶的DNA。
本發明的一個例子是從藍藻細菌集胞藻屬菌(Pasteur CultureCollection，(PCC)6803，American Type Culture Collection，(ATCC)27184)中分離隨機的DNA，克隆到粘性質粒載體中，並通過轉結合作用導入到GLA缺陷的藍藻細菌魚腥藻屬菌菌株PCC7120，ATCC 27893中。用氣相色譜監測從魚腥藻屬菌的亞油酸生成GLA，並分離相應的DNA片段。
用本領域普通技術人員已知的方法，例如Sam brook等人(1989)描述的方法對分離的DNA排序。
根據本發明，已經分離了含有Δ6-去飽和酶基因的DNA。更具體是說，一段含有Δ6-去飽和酶基因的3.588kb的DNA已從藍藻細菌集胞藻屬菌中分離出來。測定3.588kb DNA的核苷酸順序並示於SEQID NO.1中。表明有效編碼區的開放讀碼存在於核苷酸317-1507和核苷酸2002-3081。為了明確負責編碼Δ6-去飽和酶的核苷酸，把提供Δ6-去飽和酶活性的3.588kb片段裂解為二個亞片段。其中的每一個亞片段都僅含有一個開放讀碼。片段ORF1含有核苷酸1-1704，片段ORF2含有核苷酸1705-3588。每一個片段都以向前和逆向兩種方向亞克隆到結合的表達載體中(AM542，Wolk et al，1984 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，1561)，該載體含有一種藍藻細菌羧化酶啟動子。所得到的構建體[即ORF1(F)，ORF1(R)，ORF2(F)和ORF2(R)]通過標準方法(例如參見Wolk，et al，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，1561)結合到野生型魚腥藻屬菌PCC7120中。在選擇性培養基(含有30μg/ml新黴素的標準無機培養基BG11N，參見Rippka et al，1979，J.Gen Microbiol.111，1)生長二周後，從死亡的非結合性細胞的棕色背景中被結合的魚腥藻屬細胞為NeoR綠色菌落。篩選出綠色菌落，並在選擇性液體培養基(含有15μg/ml新黴素的BG11N)中生長。用標準方法(例如Dahmeret al，1989，Joumal of American Oil Chemical Society 66，543)從所得的含有向前和逆向定位的ORF1和ORF2構建體的轉結合體中提取脂類，作為對比，同樣也從魚腥藻屬菌和集胞藻屬菌的野生型培養物中提取脂類。通過氣液色譜(GLC)，例如用裝有氫火焰電離檢測器和毛細管柱的Tracor-560氣液色譜分析脂肪酸甲基酯。GLC分析結果示於表1中。
表1野生型和轉基因藍藻細菌中C18脂肪酸
如GLC分析所確定的，當含有以向前方向定位的ORF2的構建體通過轉結合，GLA缺陷的魚腥藻屬菌便獲得了生產GLA的功能。帶有以相對於羧化酶啟動子而言相反的方向定位的ORF2或以正或反兩個方向定位的ORF1的構建體的轉結合體未顯示出GLA的生成。這一分析結果表明，位於1884bp片段中的單個開放讀碼編碼Δ6-去飽和酶。1884bp片段示於SEQ ID NO3中。這也分別由示於圖1(A)和(B)中的Δ6-去飽和酶和Δ12-去飽和酶[Wada et al，1990，Nature，347]之間水療法圖完全相似性所證實。
通過上述功能性分析，或通過用分離編碼魚腥藻菌Δ6-去飽和酶的核酸作為雜交探針的核酸雜交技術從其它的產GLA生物體鑑定分離的編碼Δ6-去飽和酶的核酸。本發明設想的基因組克隆和cDNA克隆的方法是技術人員已知的。雜交探針可以含有公開於SEQ ID NO1中的完整DNA序列或者是限制性片段或是其它的DNA片段，包括寡核苷酸探針，用交叉雜交來克隆同源基因的方法是本領域普通技術人員已知的，例如可見於Sambrook(1989)和Beltz et al，1983，Methods inEnzymology 100，266。
通過導入編碼Δ6-去飽和酶DNA而獲得生產GLA功能的轉基因生物體也獲得了產十八碳四烯酸(octadecatetraenoic acid)(184Δ6，9，12，15的功能。十八碳四烯酸(Octadecatetraeoic acid)正常存在於魚油和紫草科的一些植物種中(Craig et al，1964，J.Amer.Oil Chem.Soc.41，209-211；Gross et al；1976，Can.J.Plant Sci.56，659-664)。在本發明的轉基因生物體中，十八碳四烯酸是在Δ6-去飽和酶的作用下α-亞麻酸進一步去飽和或是在Δ15-去飽和酶作用下GLA進一步去飽和而得到的。
由ORF2編碼的359個胺基酸，即編碼Δ6-去飽和酶的開放讀碼用SEQ ID NO2表示。本發明進一步設想了編碼SEQ ID NO2的胺基酸的其它核苷酸順序。鑑定例如由遺傳密碼簡併性而產生的這類順序是普通專業技術人員已知的。而且，通過上述得到的功能性分析，本領域的普通技術人員能確定含有編碼Δ6-去飽和酶的ORF2的1884bp片段的更次一級片段。
本發明設計了任何Δ6-去飽和酶多肽片段以及保留有將LA轉變成GLA活性的核酸。
在本發明的另外一方面，含有1884bp片段的載體或含有Δ6-去飽和酶基因啟動子、編碼順序和終止區的更小的片段被轉移到一種生物體中，例如藍藻細菌中，在所說的生物體中，Δ6-去飽和酶啟動子和終止區是能發揮功能的。因此，本發明提供了生產重組的Δ6-去飽和酶的生物體。另外一方面，本發明提供了分離的Δ6-去飽和酶，它能通過標準的蛋白質純化技術(例如可參見Ausubel et al，1987，CurrentProtocols in molecular Biology，Green Publishing Associates，New York)從重組生物體中純化出來。
本發明還提供了含有編碼Δ6-去飽和酶的DNA的載體。在各種生物體中構建適合的載體指導表達Δ6-去飽和酶編碼順序是本領域普通技術人員顯而易見的。特別優選的是可複製性表達載體，本文所述的可複製性表達載體指的是經過處理的用於調控目的基因即Δ6-去飽和酶基因表達的DNA或RNA的分子。優選的載體是質粒、噬菌體、粘性質粒或病毒。諸如wolk et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1561-1565和Bustos et al(1991)J.Bacteriol.174，7525-7533所述的往復性載體證實與本發明相符。一些文獻(Sambrook et al，(1989)；Goeddel，ed.(1990)Methods in Enzymology 185 Academic press；Perbal 1988，APractical Guide to Molecular Cloning，John Wiley and Sons，Inc.)對能夠插入和表達編碼所說Δ6-去飽和酶核酸的載體進行了詳細論述。這類載體還含有能有效表達編碼Δ6-去飽和酶核酸的核酸順序。能夠有效進行基因產物表達的順序單元包括啟動子、增強子成分；上遊活化順序、轉錄終止信號和多腺苷酸化位點，基本的和組織特異性的啟動子本發明都考慮到了。為了轉化植物細胞，花椰菜花葉病毒(CaMV)35s啟動子和在植物種子突變過程中被調整過的啟動子都特別值得感興趣。所有這類啟動子和轉錄調節成分的單個體或結合體用於本發明的可複製性表達載體，並為本領域普通技術人員所了解。例如Restrepo等人(Plant Cell，2，987，1990)描述過CaMV35S啟動子。還設計了經遺傳工程處理的和遺傳突變的調節順序。
普通的專業技術人員能夠決定適於在特定宿主細胞中進行表達的載體和調節成分。例如，含有來自編碼魚腥藻屬菌的羧化酶基因啟動子的載體可連接到Δ6-去飽和酶編碼區，並進一步可連接到來自集胞藻屬菌的終止信號，這些載體在藍藻細菌中適合Δ6-去飽和酶的表達。本文中的「可連接」(Operably linked)指的是啟動子和終止子順序有效地發揮調節轉錄的作用。另一個例子是適於在轉基因植物中表達Δ6-去飽和酶的載體能含有一個衍生於半日花素。napin或glycin種子特異性的啟動子順序，該啟動子可連接到Δ6-去飽和酶編碼區，並進一步可行性連接到種子終止信號或nopalme合成酶終止信號。
本發明特別考慮了將半日花素(helianthinin)調節成分作為指導本發明Δ6-去飽和酶表達的啟動子成分，調節成分在申請號為628、354申請日為1991，4，8的美國末決申請中公開，該申請併入本文作為參考。
對本文公開的核苷酸順序或具有所設計功能的調節成分的修飾也包括在本發明範圍內。這類修飾作用包括插入、替代和缺失以及反映遺傳密碼簡併性的特異性替代。
構建這種雜交載體的標準技術是本領域普通技術人員已知的，並可參見文獻，如Sambrook et al，1989或大量可隨處可得的關於重組DNA技術的實驗室手冊。多種設計可用於DNA片段的連接，所做的選擇取決於DNA片段的末端性質，根據本發明，雜交載體包括便於克隆、表達或加工的其它核苷酸順序成分，例如編碼信號肽的順序，編碼使蛋白質在內質網中滯留所要求的KDEL的順序，或是編碼引導Δ6-去飽和酶進入葉綠體的轉運肽的順序。這些順序是本領域普通專業人員已知的。例如，Van den Broeck等人(Nature 313，358，1985)已描述過比較理想的轉運肽。又如，Michaelis等人(Ann.Rev.Microbiol，36，425，1982)公開了原核的和真核的信號順序。
本發明的另外一個方面是提供了含有編碼本發明的Δ6-去飽和酶DNA的生物體而不是藍藻細菌。根據本發明的設計，轉基因生物體包括細菌、藍藻細菌、真菌、植物和動物。本發明分離的DNA可以通過現有技術已知的方法，如感染、轉染、轉化或轉結合而導入宿主細胞中。將本發明的DNA轉移到上述生物體中的技術是普遍知曉的，可見於參考文獻中，如Sambrook et al，1989。
已知多種植物轉化方法。根據Horsch等人(Science 227，1229，1985)描述的葉花盤轉化一再生方法可將Δ6-去飽和酶基因導入到植物中。其它的轉化方法，如原生質體培養(Horsch et al，1984，Science 223，496；De Block et al(1984)EMBO J.2，2143，Barton et al，(1983)Cell 32，(1033)也可以應用，且包括於本發明的範圍內，在一個優選的實施方案中，用土壤桿菌衍生的載體轉化植物。而且，其它的方法可用來將本發明的Δ6-去飽和酶基因插入到植物細胞中。這類可選擇的方法包括biolistic方法(Klein et al，1987，Nature 327，70)、電穿孔、化學誘導DNA攝入以及用病毒或花粉作為載體的應用。
當轉化的方法需要時，本發明的Δ6-去飽和酶基因可以插入到植物轉化載體中，例如Bevan(1984，Nucleic Acids Res.12，8111)描述過的二元載體。植物轉化載體可以通過修飾根癌土壤桿菌的天然基因轉移系統進行衍生，天然系統包括含有稱作T-DNA的大片段的大Ti(腫瘤誘生性)質粒，它可被轉移到轉化的植物中。Ti質粒的另外一個片段Vir區是負責T-DNA轉移的。T-DNA區是由末端重複區接界的。在經修飾的二元載體中，缺失了腫瘤誘導基因，並利用Vir區的功能轉移由T-DNA邊界順序接界的外源DNA。T區還含有一個用於抗生素抗性的可選擇性標記和一個作為轉移的插入順序的多克隆位點。這種工程菌被稱為「去武裝」根癌土壤桿菌菌株，並且允許由T-區接界的順序的有效轉化到植物的核基因組中。表面無菌的葉花盤與去武裝的含外源DNA的根癌土壤桿菌一起孵育，培養2天，然後轉移到含抗生素的培養基中。當培養物在含有合適的抗生素的培養基中生根之後，篩選被轉化的嫩芽，再轉移到泥土中進行再生。
本發明的另一方面是提供了含有本發明分離的DNA的轉基因植物或這些植物的子代，單子葉和雙子葉植物都考慮到了。藉助上述任何一種植物轉化方法分離的編碼Δ6-去飽和酶的DNA轉化植物細胞。被轉化的植物細胞通常是在胼胝體培養物或葉花盤中，通過本領域技術人員已知的方法(例如，Horsch et al，1985，Science，227，1129)再生成一個完全的轉基因植物。在一個優選的實施例方案中，轉基因植物是向日葵、油籽油菜、玉米、菸草、花生或大豆。因為轉基因值物的子代遺傳編碼Δ6-去飽和酶DNA，得自被轉化植物的種子或插枝常用於保持轉基因的植物系。
本發明進一步提供了生產GLA含量提高了的轉基因植物的方法。該方法包括將編碼Δ6-去飽和酶的DNA導入缺乏GLA或GLA水平較低但含有LA的植物細胞中，和從轉基因細胞再生提高了GLA含量的植物。特別考慮了商業性生產的農作物植物作為轉基因生物體，它包括但不限於向日葵、大豆、油籽油菜、玉米、花生和菸草。
本發明進一步提供了生產含有GLA轉基因生物體的方法。該方法包括將編碼Δ6-去飽和酶DNA導入缺乏GLA或具有低水平GLA但含有LA的生物體中，在另一個實施方案中，該方法包括將含有編碼Δ6-去飽和酶和Δ6-去飽和酶DNA的一種或多種表達載體導入缺乏GLA和LA的生物體中。因此，通過表達Δ12-去飽和酶，在缺乏LA和GLA的生物體中誘導LA的產生，然後因Δ6-去飽和酶的表達而產生GLA。通過本領域技術人員已知的重組技術方法(Sambrook，etal，1989)和已公開的Δ12-去飽和酶順序(Wada et al，1990，Nature 347，200-203)可以構建含有編碼Δ12-去飽和酶或是含有編碼Δ12-去飽和酶和Δ6-去飽和酶的DNA的表達載體。
此外，根據本發明，已發現SEQ ID NO1的核苷酸2002-3081編碼藍藻細菌的Δ12-去飽和酶，據此。該順序能用於構建有關本題的表達載體。特別考慮於商業性生產的農作物植物的作為轉基因生物體，它包括但不限於向日葵、大豆、油籽菜油、玉米、花生和菸草。
本發明進一步涉及一種在植物中誘導抗寒力的方法。寒冷敏感性可能產生於細胞膜中脂質的相變。膜脂中相變溫度取決於脂肪酸的不飽和度。因此，通過導入Δ6-去飽和酶使LA轉變成GLA以增加不飽和度即可誘生或改善抗寒能力。鑑此，本發明的方法包括將編碼Δ6-去飽和酶的DNA導入植物細胞，並從所說的被轉化植物細胞再生改善了抗寒力的植物，在一個優選的實施方案中，所說的植物是向日葵、大豆、油籽油菜、玉米、花生或菸草。
下面的實施例將進一步說明本發明。
實施例1菌株和培養條件集胞藻屬菌(PCC 6803，ATCC 27184)、魚腥藻屬菌(PCC 7120，ATCC 27893)和聚胞藻屬菌(Synechococcus)(PCC 7942，ATCC 33912)置BG11N+培養基(Rippka et al，1979，J.Gen.Microbiol.111，1-610中在白熾燈照明條件下(60μE·m-2·s-1)於30℃行光能自養性生長。選擇粘性質粒和質粒並使之在Maniatis et al，(1982)[Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold spring Harbor laboratory，Cold Spring，NewYork]等人所描述的在標準濃度的含抗生素的LB介質的大腸桿菌菌株DH5 α中生長。
實施例2集胞藻屬菌粘性質粒基因組文庫的構建用Sau 3A部分消化得自集胞藻屬菌(PCC 6803)的總的基因組DNA，並在蔗糖梯度上進行分離(Austubel et al，1987，Current protocolsin molecular Biology，Greene publishing Associates and Wiley Inter scinec，New York)。篩選含有30-40kbDNA片段的餾份，並連接到粘性質粒載體的脫磷酸BamHI位點PDUCA7(Buikema et al(1991)J.Bacteriol.183，1879-1885)。如Ausubel等人所述(1987)在體外包裝連接的DNA，並包裝的噬菌體在含有AVal和E-co4711甲基酶輔助質粒pRL528(Buikema et al.1991)的E.Col-iDH5α中繁殖。隨機分離共1152克隆，並單個維持於12個96孔微量滴定板中。
實施例3魚腥藻屬菌獲得表達GLA的功能魚腥藻屬菌(PCC 7120)是一種花絲狀藍藻細菌，缺乏GLA但含有足夠量的生成GLA的前體亞油酸(圖2；表2)。實施例2中所述的集胞藻屬菌粘性質粒文庫結合到魚腥藻屬菌(PCC 7120)中，鑑定生產GLA的轉結合體。在BG11N+液態介質中，魚腥藻屬菌細胞生長至對數中期，之後在相同介質中懸浮至終濃度約2×108細胞/ml。生長於含氨苄青黴素的LB中的E.Coli Rp4(Burkardt et al，1979，J Gen.Microbiol.114，341-348)對數中期培養物經洗滌後重懸於新鮮的LB培養基中。然後將魚腥藻屬菌與RP4混合，並均勻地分散於含有5％LB的BG11N+平板上。粘性質粒基因組文庫經平板印影培養到含50μg/ml卡那黴素和17.5μg/ml氯黴素的LB平板上，繼爾將上述培養物切成小片置於含有魚腥藻屬菌和RP4和BG11N+平板上，於30℃孵育24小時後，30μg/ml的新黴素加至平板底層於30℃繼續孵育直至出現轉結合體。
結合作用完成後分離單個的轉結合體，並置於含15μg/ml新黴素的2ml BG11N+液體培養基中生長。如下所述，從野生型培養物和含有10個轉結合體庫的培養物中製備脂肪酸甲基酯。通過離心收集野生型和轉基因型藍藻細菌培養物。用蒸餾水洗滌二次。按Dahmer等人所述方法(1989，J.Amer.Oil Chem.Soc.66，543-548)從這些培養物中提取脂肪酸甲基酯，並通過氣液色譜(GLC)用裝有氫火焰電離檢測儀和毛細管柱(30m×0.25mm，結合了FSOT Superox II，Alltech AssociateInc.，IL)的Tracor-560進行分析。以滯留時間和標樣(得自Sigma化學公司)的共同色譜分析來鑑定脂肪酸。平均脂肪酸組成通過各個C18脂肪酸峰值區與內標區的比值歸一化確定。
有代表性的GLC圖譜示於圖2中，還顯示了C18脂肪酸甲基酯。通過與已知的脂肪酸甲基酯標準物的洗脫時間進行比較鑑別出各個峰，並用氣相色譜質譜光譜測定法進行證實。圖2(A)描述了野生型魚腥藻屬菌脂肪酸的GLC分析。箭頭表示GLA的遷移時間。圖2(B)是帶有pAm542+1.8F的魚腥藻屬菌轉結合體脂肪酸的GLC圖譜。證明了2個產GLA庫(從代表250個轉結合體的25個庫中)能產生GLA。對每個GLA陽性庫的單個轉結合體進行產GLA的分析，兩個來自不同庫的獨立的轉結合體AS13和AS75被鑑定為能表達很高水平的GLA並分別含有粘性質粒cSy13和cSy75(圖3)。粘性質粒在約7.Skb長度的區域重疊。cSy75的一個3.5kb NheI片段再克隆入載體pDUCA7中，並轉移到魚腥藻屬菌中從而獲得GLA表達功能(圖2)。
cSy75-3.5的3.5kb NheI片段的兩個Nhel/Hind III亞片段(1.8和1.7kb)被亞克隆到「pBLUESCRIPT」中(Stratagene)(圖3)用於測序。按照Maniatis等人(1982)和Ausubel等人(1987)所述的方法進行標準的分子生物學技術操作。通過用Advaneed DNA Technologies Laboratory(Biology Department，Texas A M University)合成特殊的低聚核苷酸引物用「SEQUENASE」(United States Biochemical)進行pBS1.8的雙鏈雙脫氧測序(Sanger et al.1977，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，5463-5467)。用Devereux等人(1984，Nucleic Acids Res.12.387-395)描述的GCG(Madison WI)軟體進行DNA序列分析。
兩個Nhe I/Hind III片段都以相對於藍藻細菌羧化酶啟動子的向前和逆向兩個方向轉移到結合性表達載體AM542中，再經結合作用導入魚腥藻屬菌。含有向前方向定位的1.8kb片段(AM542-1.8F)的轉結合體產生大量的GLA和十八碳四烯酸，(圖2，表2)。含有其它構建體(無論是逆向定位的1.8kb片段還是向前和逆向定位的1.7kb片段)的轉結合體不能產生可檢測水平的GLA(表2)。
圖2將從野生型魚腥藻屬菌中提取的C18脂肪酸圖譜(圖2A)與含有向前方向定位的cSy75-3.5的1.8kb片段的轉基因魚腥藻屬菌提取物中的C18脂肪酸圖譜(圖2B)進行了比較。得自AM542-1.8F的脂肪酸甲基酯的GLC分析顯示了一個與可靠的GLA標準物滯留時間一致的峰。經氣相色譜質譜光譜測定法進行的有關該峰的分析證實，它的質譜裂解方式與GLA參照樣品的相同。改變了多不飽和脂肪酸含量的轉基因魚腥藻屬菌在生長速度和形態學方面與野生型魚腥藻屬菌相似。
表2野生型和轉基因藍藻細菌中C18脂肪酸的比較菌株脂肪酸180 181 182 183(α) 183(γ) 184野生型集胞藻屬菌(PCC 6803) 13.6 4.5 54.5 - 273 -魚腥藻屬菌(PCC 7120) 2.9 24.8 37.1 35.2 - -聚胞藻屬(藍藻)(PCC 7942) 20.6 79.4 - - - -魚腥藻屬菌轉結合體cSy753.8 24.4 22.3 9.1 27.9 12.5cSy75-3.54.3 27.6 18.1 3.2 40.4 6.4pAM542-1.8F 4.2 13.9 12.1 19.1 25.4 25.4pAM542-1.8R 7.7 23.1 38.4 30.8 - -pAM542-1.7F 2.8 27.8 36.1 33.3 - -pAM542-1.7R 2.8 25.4 42.3 29.6 - -聚胞藻屬菌轉結合體pAM854 27.8 72.2 - - - -pAM854-Δ12 4.0 43.2 46.0 - - -pAM854-Δ6 18.2 81.8 - - - -pAM854-Δ6和Δ12 42.7 25.3 19.5 -16.5 -180，硬脂酸；181，油酸；182，亞油酸；183(α)，α-亞麻酸，183(γ)，γ-亞麻酸；184，十八碳四烯酸。
實施例4用Δ6和Δ12去飽和酶基因轉化聚胞藻屬用根據公開的集胞藻屬菌Δ12去飽和酶基因順序(Wada et al，1990，Nature，347，200-203)合成的寡核苷酸篩選集胞藻屬菌基因組文庫，分離到含有Δ12去飽和酶基因的第三種粘性質粒cSy7。得自含有Δ12去飽和酶基因的這種粘性質粒的1.7kb AvaI片段被鑑定並用作探測器測定cSy13，測定表明cSy13不僅含有Δ6-去飽和酶基因，而且含有Δ12-去飽和酶基因(圖3)。基因組的Southern吸印分析進一步表明Δ6和Δ12去飽和酶基因兩者在集胞藻屬菌基因組中是唯一的，所以兩種涉及C18脂肪酸去飽和作用的功能性基因緊密連接在集胞藻屬菌基因組中。
單細胞藍藻細菌聚胞藻屬菌(PCC 7942)缺乏亞油酸和GLA(3)。Δ6和Δ12去飽和酶基因被單個和一起克隆穿梭載體pAM854(Bustos etal，1991，J.Bacteriol.174，7525-7533)中，該載體含有將外源DNA整合到聚胞藻屬菌基因組中所需的順序(Golden et al，1987，Methods inEnzymol.153，215-231)。用這些基因構建體轉化聚胞藻屬菌並篩選菌落。從轉基因聚胞藻屬菌中提取脂肪酸甲基酯，並且GLC進行分析。
表2說明，野生型聚胞藻屬菌中的主要脂肪酸是硬脂酸(180)和油酸(181)。用pAM854-Δ12轉化的聚胞藻屬菌表達了除主要脂肪酸以外的亞油酸(182)。帶有pAM854-Δ6和Δ12轉化體生產亞油酸和GLA(表1)。這些結果表明，含有Δ12和Δ6-去飽和酶基因的聚胞藻屬菌已經獲得了在C18脂肪酸的Δ12位置上引進第二個雙鏈和在Δ6位置上引進第3個雙鍵的能力。但是，觀察表明，在含pAM854-Δ6的轉化體中，脂肪酸組成並沒有變化，這表明，在由Δ12去飽和酶合成的酶作用物缺乏的情況下，Δ6去飽和酶不活潑。該實驗進一步證明1.8kb NheI/Hind III片段(圖3)含有集胞藻屬菌Δ6-去飽和酶基因的編碼區和啟動子區。改變了多不飽和脂肪酸含量的轉基因聚胞藻屬菌在生長速度和形態學方面與野生型菌株相似。
實施例5Δ6-去飽和酶的核苷酸順序測定了包括功能性Δ6-去飽和酶基因的cSy75-3.5的1.8kb片段的核苷酸順序。一個編碼359個胺基酸多肽的開放讀碼被鑑定(圖4)。由Kyte-Doolittle(Kyte et al.，J.Mol.Biol.157.105-132水療分析鑑定疏水胺基酸的兩個區可代表轉換膜區(transmembrane domains)(圖1A)，並且Δ6-去飽和酶基因與Δ12-去飽和酶基因(圖1B，Wada et al.)和Δ9去飽和酶基因(Thiede et al.)J.Biol Chem.261，13230-13235)的水療圖相似。
但是，集胞藻屬菌的Δ6-去飽和酶和Δ12-去飽和酶之間的順序相似性在核苷酸水平小於40％，在胺基酸水平約小於18％。
實施例6藍藻細菌的Δ6-去飽和酶轉移到菸草中將藍藻細菌的Δ6-去飽和酶基因轉移到植物表達載體中，再通過土壤桿菌介導的基因轉移技術轉移到菸草中。為了保證被轉移的去飽和酶在葉及發育的種子中合適地表達及內質網和葉綠素中去飽和基因產物的確定。安裝帶有集胞藻屬菌去飽和酶開放讀碼(ORF)的各種表達盒。這些盒的成分包括(i)35S啟動子或衍生於向日葵半日花素基因的種子特異性啟動子，它分別啟動Δ6-去飽和酶基因在所有植物組織中表達或僅在發育的種子中表達；(ii)一種推測的信號肽，它來自胡蘿蔔延伸蛋白基因或向日葵半日花素基因，引導新合成的Δ6-去飽和酶進入ER；(iii)位於Δ6-去飽和酶ORF羧基末端的ER腔滯留信號順序(KDEL)；(iv)引導Δ6-去飽和酶進入葉綠體的理想轉運肽。35S啟動子是Restrepo等人(1990)所述質粒pRTL2衍生物。Van de Broeck等人(1985)描述了理想的轉移肽順序。Chen等人(1985，EMBO J.9，2145)描述了胡蘿蔔延伸蛋白信號肽。
生產含有嵌合藍藻細菌性去飽和酶基因的轉基因菸草植物，所說的嵌合體由融合到內質網滯留順序(KDEL)中的集胞藻屬菌Δ6-去飽和酶基因和由CaMv 35S啟動子啟動的延伸蛋白信號肽組成。轉基因菸草基因組DNA的PCR擴增反應表明Δ6去飽和酶基因已被摻入到菸草基因組中，從這些轉基因菸草植物葉中提取脂肪酸甲基酯，並且氣液色譜(GLC)進行分析。這些轉基因菸草集聚了大量的GLA(圖4)。圖4表示通過GLC確定的脂肪酸甲基酯。與已知的脂肪酸甲基酯標準品的洗脫時間進行比較鑑定出各個峰。因此，涉及脂肪酸代謝的藍藻細菌的基因可用於生產改變了脂肪酸組成的轉基因植物。
序列表(1)概況(i)申請人Thomas，Terry L.
Reddy，Avutu S.
Nuccio，MichaelFreyssinet，Georges l.
(ii)發明名稱利用Δ6-去飽和酶生產γ亞麻酸(iii)順序數目3(iv)通信地址(A)地址Scully，Scott，MurphyPresser(B)街道400 Garden City Plaza(C)州紐約(D)國家美國(F)郵政編碼11530(v)計算機可讀形式(A)介質類型Floppy盤(B)計算機IBM PC可容性(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體Patent In Pelease#1.0 Version#1.25(vi)目前的申請資料(A)申請號待定(B)申請日1992.1.8(C)分類(viii)代理人情況(A)姓名McNulty，Willian E.
(B)登記號22，606(C)參考/標記號8383Z(ix)電信信息(A)電話(516)742-4343(B)傳真(516)742-4366(C)電傳230 901 SANS UR(2)SEQ ID NO1(i)順序特徵(A)長度3588bp(B)類型核酸(C)鏈股數雙(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(ix)性質(A)名稱/關鍵CDS(B)定位2002..3081(xi)順序描述SEQ ID NO1GCTAGCCACC AGTGACGATG CCTTGAATTT GGCCATTCTG ACCCAGGCCC GTATTCTGAA 60TCCCCGCATT CGCATTGTTA ATCGTTTGTT CAACCATGCC CTGGGTAAAC GTTTAGACAC 120CACCTTGCCA GACCACGTTA GTTTGAGTGT TTCCGCCCTG GCGGCCCCGA TTTTTTCCTT 180TGCGGCTTTG GGCAATCAGG CGATCGGGCA ATTGCGTTTG TTTGACCAGA CTTGGCCCAT 240TCAGGAAATT GTCATTCACC AAGACCATCC CTGGCTCAAT TTACCCCTGG CGGATTTATG 300GGATGATCCG AGCCGAATGT TGATCTATTA CCTACCGGCC CACAGTGAAA CGGATTTAGT 360AGGCGCAGTG GTGAATAATT TAACGTTGCA ATCTGGGGAC CATTTAATAG TGGGACAAAA 420ACCCCAACCC AAGACCAAAC GGCGATCGCC TTGGCGCAAA TTTTCCAAAC TGATTACCAA 480CCTGCGGGAG TATCAGCGGT ATGTCCAACA GGTGATATGG GTGGTGTTGT TTTTATTGTT 540GATGATTTTT CTGGCCACCT TCATCTACGT TTCCATTGAT CAACATATTG CCCCAGTGGA 600CGCGTTGTAT TTTTCCGTGG GCATGATTAC CGGGGCCGGT GGCAAGGAAG AGGTGGCCGA 660AAAGTCCCCC GATATCATCA AAGTATTCAC 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Gly His Asp Val Glu Ile His Gly Asp Gly130 135 140Ala Val Arg Met Ser Pro Glu Gln Glu His Val Gly Ile Tyr Arg Phe145 150 155 160Gln Gln Phe Tyr Ile Trp Gly Leu Tyr Leu Phe Ile Pro Phe Tyr Trp165 170 175Phe Leu Tyr Asp Val Tyr Leu Val Leu Asn Lys Gly Lys Tyr His Asp180 185 190His Lys Ile Pro Pro Phe Gln Pro Leu Glu Leu Ala Ser Leu Leu Gly195 200 205Ile Lys Leu Leu Trp Leu Gly Tyr Val Phe Gly Leu Pro Leu Ala Leu210 215 220Gly Phe Ser Ile Pro Glu Val Leu Ile Gly Ala Ser Val Thr Tyr Met225 230 235 240Thr Tyr Gly Ile Val Val Cys Thr Ile Phe Met Leu Ala His Val Leu245 250 255Glu Ser Thr Glu Phe Leu Thr Pro Asp Gly Glu Ser Gly Ala Ile Asp260 265 270Asp Glu Trp Ala Ile Cys Gln Ile Arg Thr Thr Ala Asn Phe Ala Thr275 280 285Asn Asn Pro Phe Trp Asn Trp Phe Cys Gly Gly Leu Asn His Gln Val290 295 300Thr His His Leu Phe Pro Asn Ile Cys His Ile His Tyr Pro Gln Leu305 310 315 320Glu Asn Ile Ile Lys Asp Val Cys Gln Glu Phe Gly Val Glu Tyr Lys325 330 335Val Tyr Pro Thr Phe Lys Ala Ala Ile Ala Ser Asn 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1.一種在γ-亞麻酸缺陷或缺乏的細菌中誘導十八碳四烯酸產生的方法，其中所述細菌產生亞油酸；該方法包括用一種SEQ ID No1或SEQID No3的分離的核酸，或者用一種具有一個或多個插入、缺失或取代的鹼基、同時保持所述分離核酸的亞麻酸產生功能的SEQ ID No1或SEQ ID No3的核酸轉化所述的細菌。
2.一種在γ-亞麻酸缺陷或缺乏的細菌或植物中誘導十八碳四烯酸產生的方法，其中所述細菌或植物產生亞油酸；該方法包括用一種載體轉化所述細菌或植物，所述載體包含一種SEQ ID No1或SEQ ID No3的分離的核酸或者一種具有一個或多個插入、缺失或取代的鹼基、同時保持所述分離核酸的亞麻酸產生功能的SEQ ID No1或SEQ ID No3的核酸，所述分離的核酸可操作地與影響所述核酸的基因產物表達的啟動子相連接。
3.一種在γ-亞麻酸缺陷或缺乏的細菌或植物中誘導十八碳四烯酸產生的方法，其中所述細菌或植物產生亞油酸；該方法包括用一種載體轉化所述細菌或植物，所述載體包含一種SEQ ID No1或SEQ ID No3的分離的核酸或者一種具有一個或多個插入、缺失或取代的鹼基、同時保持所述分離核酸的亞麻酸產生功能的SEQ ID No1或SEQ ID No3的核酸，所述分離的核酸可操作地與影響所述核酸的基因產物表達的啟動子和終止信號相連接。
全文摘要
本發明公開了一種在γ－亞麻酸缺陷或缺乏的細菌或植物中誘導十八碳四烯酸產生的方法,其特徵在於該方法包括用一種SEQ ID No:1或SEQ ID No:3的分離的核酸或者一種具有一個或多個插入、缺失或取代的鹼基、同時保持所述分離核酸的亞麻酸產生功能的SEQ ID No:1或SEQ ID No:3的核酸,或者用一種包含所述核酸的載體轉化所述細菌或植物。
文檔編號C12N1/21GK1174236SQ9710456
公開日1998年2月25日 申請日期1997年3月21日 優先權日1991年10月10日
發明者T·託馬斯, A·S·雷迪, M·努西奧, G·弗雷西內 申請人:羅納-布朗克農業化學公司