通過動力學比濁法測量內毒素或(1→3)-β-D-葡聚糖的方法

2023-12-09 04:38:31

專利名稱：通過動力學比濁法測量內毒素或(1→3)-β-D-葡聚糖的方法
技術領域：
本發明涉及測定包含於樣品中的內毒素或(13)-β-D-葡聚糖(以下稱作β-葡聚糖)的量的方法，包括將內毒素或β-葡聚糖與馬蹄蟹的變形細胞溶胞產物反應，並用動力學比濁法分析反應混合物。
內毒素是存在於革蘭氏陰性菌細胞壁內的物質，並具有諸如發熱等多種生物活性。因而，當直接與藥品或血液接觸的醫療器械被內毒素汙染時，儘管在內毒素的量很低的情況下也會帶來嚴重後果。因此，內毒素汙染應嚴格控制。同樣地，對於歸因於革蘭氏陰性菌的敗血症的早期診斷，也要檢測內毒素在血液中的含量。
而且，β-葡聚糖是已知存在為酵母和黴菌細胞壁的骨胳組成，為許多擔子菌綱子實體(磨菇)的重要聚糖成份，為從用於血液透析等的膜的洗出成份。β-葡聚糖的生物活性不象內毒素情況下那樣清楚；然而，真菌病的早期診斷和醫療器械被真菌汙染的檢測通過測量β-葡聚糖而成為可能。這已經被考慮到。
每種內毒素和葡聚糖已知與含有馬蹄蟹的變形細胞溶胞產物的溶液(以下稱作AL溶液)反應以激活一種酶並引起凝膠反應。利用這類性質，測量含於樣品中的內毒素或β-葡聚糖的多種方法被發展和應用。
利用在AL溶液和內毒素(或β-葡聚糖)之間發生的凝膠化反應的測量方法的代表性例子包括所謂的膠凝法，其中目測確定是否發生膠凝化，和所謂的動力學比濁法，如用於測定含於樣品中的內毒素(或β-葡聚糖)的量的方法，以內毒素(或β-葡聚糖)濃度和凝膠化時間之間的關係為基礎，該時間通過測量透光度比(Rt)[起始階段的透光度(Io)和樣品與AL溶液混合後經過時間t後或樣品與AL溶液混合後經過預定時間後的透光度(It)之間的比。Rt＝It/Io]，(這一比值被凝膠化反應降低)的變化程度或比值Rt的對數值的改變程度達到預期值所需的時間而確定。由內毒素(β-葡聚糖)濃度和開始時間之間的關係測定樣品中內毒素(或β-葡聚糖)的含量的方法，開始時間通過測量直到歸因於凝膠化反應的透光或吸光的變化的改變程度達到預定值的需要時間而確定，等等。
在這些方法中，動力學比濁法與膠凝法相比更簡單且具有更高的靈敏度因而被廣泛使用。
然而，最近的動力學比濁法的內毒素檢測極限通常為約0.001EU/ml，因而，需要一種能使更低得多的內毒素被檢測到的高靈敏度的測定方法。
另一方面，US-4221865公開了測定內毒素的方法，它改進了測量靈敏度，並通過在AL溶液和內毒素(或β-葡聚糖)反應期間存在離子型表面活性劑和懸浮劑或同時存在具有兩者性質的聚合物而加強濁度測定法的重現性。根據這一美國專利，加入離子型表面活性劑以停止Limulus蛋白的凝聚，而加入懸浮劑以穩定藥物或食物乳膠和膠態溶液。
然而，這一方法必須使用表面活性劑和懸浮劑兩種試劑，這就有這樣的問題，即操作變複雜且AL溶液被存在於試劑中的內毒素或β-葡聚糖汙染的可能性增加。因此，即使現在也需要進一步改進。
本發明的目的在於提供一種通過動力學比濁法測量含於樣品中的內毒素和β-葡聚糖的方法，這一方法具有非常高的靈敏度，與常規方法相比，更低含量的內毒素或β-葡聚糖可被檢測到。
以下詳述本發明的其它目的和優點。
根據本發明，提供了一種測量含於樣品中的內毒素或β-葡聚糖的方法，包括將含內毒素或β-葡聚糖的樣品在至少一種選自聚乙二醇，聚乙烯醇，甲基纖維素和羥丙基纖維素的水溶性聚合物的存在下與馬蹄蟹的變形細胞溶胞產物混合。
用光照射得到的液體混合物，測量直到液體混合物的光學變化程度達到一個預定值所需的時間，這是在樣品與變形細胞溶胞產物混合之後，或從樣品與變形細胞溶胞產物混合開始經過預定的時間後進行的，和基於所說的時間與內毒素或β-葡聚糖之間的關係測定含於樣品中的內毒素或β-葡聚糖的量。
本發明還提供用於測定樣品中的內毒素或β-葡聚糖含量的試劑，包括馬蹄蟹的變形細胞溶胞產物和至少一種選自聚乙二醇，聚乙烯醇，甲基纖維素和羥丙基纖維素。
在所謂動力學比濁法中，例如基於內毒素(或β-葡聚糖)濃度和凝膠化時間之間的關係來測定含於樣品中的內毒素(或β-葡聚糖)的含量的方法，凝膠化時間通過測量直到透光量比Rt[初始階段的透光度(Io)與經過預定時間(t)之後的透光度(It)之間的比，Rt＝It/Io]的變化程度或比值Rt的對數值的變化程度，(該比值被作為AL溶液和內毒素(或β-葡聚糖)之間反應結果的凝膠化反應所降低)達到一個預定值所需的時間而確定；由內毒素(β-葡聚糖)濃度和開始時間之間關係測定含於樣品中的內毒素(或β-葡聚糖)含量的方法，開始時間通過測量直到歸因於凝膠化反應的透光度或吸光度的變化達到一個預定值所需的時間而確定；等等，凝膠化反應可通過在AL溶液與內毒素(或β-葡聚糖)反應期間在反應體系中特定的水溶性聚合物存在而不共用離子型表面活性劑而有效地加速。換句話說，縮短動力學比濁法中的反應時間和加強動力學比濁法的測量靈敏度兩者均通過只使用特定的水溶性聚合物而不用離子型表面活性劑而實現。
如前面提到的，離子型表面活性劑根本不被用於本發明中。因為離子型表面活劑具有，例如，停止馬蹄蟹變形細胞溶胞產物和內毒素(β-葡聚糖)之間反應的功能，在AL溶液中沉澱一個成分(不是由與內毒素或β-葡聚糖反應產生的凝膠)的功能，等等，當離子型表面活性劑以常用量(例如在US-4221865中指出的，在溶液中濃度為0.5至20％重量)使用時，根據本發明在動力學比濁法中靈敏度的改進(換句話說，由於反應時間縮短而使測量靈敏度的改進)則不能獲得。
在用於本發明的特定水溶性聚合物中，聚乙二醇優選地具有重量平均分子量3000至4000000，更優選地7500至70000。當重量平均分子量太小時，凝膠化加速作用很弱，而當其太大時，含有聚乙二醇的溶液的粘度變得太高故其處理變得困難。如上相同的原因，聚乙烯醇優選地具有聚合度500至2000。
用於作為內毒素(或β-葡聚糖)與AL溶液反應結果的凝膠化反應中的特定水溶性聚合物的濃度(以下稱作用於凝膠化反應中的濃度)在某種程度上根據所用的水溶性聚合物的類別，分子量，聚合度等，和所用AL溶液的類別和份量而變化；然而，當例如具有重量平均分子量約3000的聚乙二醇被使用時，適當地選自0.5至4W/W％的範圍；當用具有重量平均分子量約7500的聚乙二醇時，範圍為0.3至4W/W％；當用具有重量平均分子量20000至70000的聚乙二醇時，範圍為0.3至1.5W/W％；當用具有重量平均分子量500000至4000000的聚乙二醇時，範圍為0.2至0.5W/W％。而且，當使用聚合度約500的聚乙烯醇時，凝膠化反應中所用的濃度適當地選自1至3W/W％的範圍；當用具有聚合度約2000的聚乙烯醇時，範圍為0.2至1W/W％；當用具有粘度約15CPS的甲基纖維素時，範圍為0.2至1W/W％；當用具有粘度約100CPS的甲基纖維素時，範圍為0.1至1W/W％；或當用羥丙基纖維素時，範圍為0.1至1W/W％。
這些水溶性聚合物即使各自單獨使用也具有足夠的效果；然而，它們將以兩種或更多的適當組合被應用。
用於本發明的水溶性聚合物理所當然地必須不含有足以影響測量含於樣品中的內毒素或β-葡聚糖含量的內毒素或β-葡聚糖。為此目的，選用具有微量內毒素或β-葡聚糖含量的水溶性聚合物，或者，當所用的水溶性聚合物含有明顯量的內毒素和β-葡聚糖時，水溶性聚合物需要用高壓釜或內毒素吸收劑等預先除去內毒素和β-葡聚糖。
當內毒素和β-葡聚糖的除去用高壓滅菌器進行時，它足以，例如，使上述水溶性聚合物形成具有合適聚合物濃度的溶液，然後使其在高壓滅菌器內在，例如，在常用溼度(約121℃)下處理約15至120分鐘。
當用內毒素吸收劑除去內毒素時，可以用，例如，其上已固定多粘菌素B的載體，其上已通過間隔物固定組氨酸的載體，等等。尤其是可以用Detoxi-Gel(PIERCE的商品名)，Affi-Prep Polymyxin(Bio-Rad Laboratories的商品名)，Pyro Sep(TANA BE SEIYAKUCO.，LTD.的商品名)等；然而，內毒素吸收劑當然不限於這些例子。
在本發明的方法中，可以用光學變化，它被用作測量樣品中內毒素(或β-葡聚糖)濃度的指數並由作為AL溶液與內毒素(或β-葡聚糖)之間的反應結果的凝膠化反應而產生。例如，由透光度變化吸收變化引起的光學變化，透光量比Rt的變化程度，透光度比R的對數值的變化程度等在所謂動力學比濁法中被用作測量指數是優選的。
用於本發明的馬蹄蟹變形細胞溶胞產物不是關鍵；可以屬於，例如，Limulus屬，Tachypleus屬等的馬蹄蟹變形細胞的溶胞產物，該溶胞產物增加與內毒素或β-葡聚糖反應的濁度。理所當然的，可以用，例如，從ACC(Associates of Cape Cod)，Whittaker Bioproducts，Inc.，Endosafe./nc.，Seikagaku Corp.，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.等購買的AL溶液凍乾產品來製備。
在實施本發明的方法時；上述水溶性聚合物被加入並溶入AL溶液與內毒素(或β-葡聚糖)的反應混合物中，以使用於凝膠化反應的濃度成為預定的濃度，這樣得到的溶液被用於以常規方式通過動力學比濁法測量內毒素(或β-葡聚糖)。
利用本發明的方法通過動力學比濁法測量含於樣品中的內毒素(或β-葡聚糖)的方法在下面解釋。
本方法的優選過程是，例如，根據FDA準則[作為對人和動物非腸道藥物，生物製品，醫療器械的最終產物內毒素試驗的Limulus變形細胞溶胞產物試驗的批准準則，Food and Drug Adm.(1987)]中所述的動力學比濁法。
更特定地，通過動力學比濁法用AL溶液，利用獨特的器械如Toainometer ET-201(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.的商品名)，Toxinometer ET-251(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.的商品名)，Toinometer ET-301(Wako Pure Chemical Industries，Ltd的商品名)，LAl-5000[Acc(Associates of Caps Code公司的商品名]，Mi-croplate ieader Tmax(Molecular Device Company的商品名)等進行測量是足夠的。
這就是說，例如，下面的操作用上面的器械進行首先，馬蹄蟹的變形細胞溶胞產物與含有內毒素或β-葡聚糖的樣品在至少一種選自聚乙二醇，聚乙烯醇，甲基纖維素和羥丙基纖維素的水溶性聚合物存在下混合，用光照射得到的液體混合物，並且隨後，將液體混合物用於測量在樣品與變形細胞溶胞產物混合之後，或在樣品與變形細胞溶胞產物混合之後經過預定時間，直到光學變化如透光度變化，吸光度的變化程度，透光度比Rt的變化程度，透光度比Rt的對數值的變化程度等達到一個預定值所需的時間。以這樣得到的時間和內毒素或β-葡聚糖的量之間的關係(例如，利用原先得到的所說時間與內毒素或β-葡聚糖量之間的校準曲線)，可確定含於樣品中的內毒素或β-葡聚糖的含量。
在上面的說明中，直到光學變化程度達到一個預定值所需時間的開始點是樣品與變形細胞溶胞產物混合的時刻，或樣品與變形細胞溶胞產物混合後預定時間過去後的時刻。儘管預定的時間不是關鍵且隨變形細胞溶胞產物對內毒素或β-葡聚糖的活性(或測量靈敏度)等而變化，但根據測量目的，一般在2或3秒至3至5小時的範圍。
預定時間可考慮下列點來確定a)不影響內毒素或β-葡聚糖測量的時間，b)與在樣品與變形細胞溶胞產物混合後得到的混合物實際開始光學變化所需的時間相比足夠短的時間，和c)如果發生測量誤差，使測量誤差在±25％之內的時間，因為根據FDA對通過動力學比濁法測量內毒素的準則，內毒素測量中的允許誤差在±25％之內。
例如，當用具有這樣的測量靈敏度(對於含有高於許可量內毒素的樣品測量可在30分鐘內完成)的AL溶液測量注射用水中的內毒素量以判斷內毒素量是否超過最大允許極限(即約0.25EU/ml)時，預定時間一般在2或3秒至2或3分鐘的範圍內。
當測定用動力學比濁法的器械進行時，開始點可以是樣品與變形細胞溶胞產物混合的時刻，或者是含有這些混合物的測量試管被置於器械中的時刻。在這種情況下，當樣品與變形細胞溶胞產物混合後多隻測量試管立即被置於器械中時，對每隻試管的測量起始點將是不同的，以使起始點的差別在幾秒鐘之內，因為這樣一個時間差一般不會在測量中引起明顯的誤差。
為了在根據本發明測量內毒素(或β-葡聚糖)時獲得時間，光學變化程度的預定值被預先設定在足以實現目標測量的範圍。當光學變化由透光度比Rt的變化程度引起時，例如，預定值合適地在-3至-25％，優選-5至-20％的範圍。而且，當光學變化由透光度變化，吸收變化，透光度比Rt的對數值的變化程度等引起時，預定值將根據透光度比Rt″選定。
將用於本發明的水溶性聚合物加到馬蹄蟹的變形細胞溶胞產物與內毒素(或β-葡聚糖)的反應混合物中以使聚合物濃度成為預定值的方法將是這樣一種方法-通過該法，水溶性聚合物可被加到馬蹄蟹變形細胞溶胞產物與內毒素(或β-葡聚糖)的反應混合物中使聚合物的最終濃度變為預定濃度；然而，這一方法不是關鍵的，並可被優選地使用，例如，其中以預定濃度含有水溶性聚合物的AL溶液被凍幹然後重新溶解並使用的方法；其中合適量的水溶性聚合物被加入並溶於AL溶液中的方法；其中AL溶液的凍乾產物被溶於含水溶性聚合物的水溶液中的方法；其中被測的樣品(含內毒素或β-葡聚糖)適當地用含水溶性聚合物的水溶液稀釋的方法；等等。
順便提一句，勿需說明，含水溶性聚合物的水溶液將含有，例如，緩衝劑如磷酸緩衝液，Good’s緩衝液等，其量為內毒素或β-葡聚糖的測量既不被抑制，也不被加速。
本發明的測試劑被用於實施上述測量含於樣品中的內毒素或β-葡聚糖的方法，且含有馬蹄蟹的變形細胞溶胞產物和選自聚乙二醇，聚乙烯醇，甲基纖維素和羥丙基纖維素的水溶性聚合物。各個構成要素的優選方式，方案如前所述。而且，本發明的測試劑除上述成份外，可額外地含有如磷酸緩衝液，Good’s緩衝液等之類的緩衝液，其量為使內毒素或β-葡聚糖的測量既不被抑制也不被加速。
下面給出的實施例更具體地說明本發明；然而，本發明不受這些實施例的限制。實施例1(試劑)內毒素溶液使用用注射用水(Otsuka Pharmaceutical Co.，Ltd.生產)適當稀釋的Escherichia Coli關聯的內毒素(日本藥典中定義的標準內毒素，由E.Coli VKT-B菌株產生的脂多糖，在一小瓶內含相當於16000內毒素單位(EU)的內毒素)。AL溶液由Limulus屬的馬蹄蟹衍生的AL溶液的凍乾產物(凍乾產品以後稱作LAL，從Wako Pure Chemucal Industries，Ltd.購買，對5ml的凝膠化靈敏度0.06EU/ml)溶於2.5ml LAL-溶解緩衝溶液(由Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生產)的溶液被使用。聚乙二醇溶液通過將Wako Pure Chemucal Industries，Ltd.生產的聚乙二醇溶於注射用水(Otsuka Pharmaceutical Co.，Ltd.)中使濃度成為預定值而製備，然後將溶液進行高壓滅菌處理(121℃15分鐘)。確認聚乙二醇溶液不含內毒素。
順便提一下，所用的幾種聚乙二醇具有如下平均分子量聚乙二醇4000重量平均分子量3000聚乙二醇6000重量平均分子量7500聚乙二醇20000重量平均分子量20000
聚乙二醇50000重量平均分子量50000聚乙二醇70000重量平均分子量70000聚乙二醇500000重量平均分子量500000聚乙二醇2000000重量平均分子量2000000聚乙二醇4000000重量平均分子量4000000。(過程)在測試管中加入0.05ml AL溶液，0.1ml所需的聚乙二醇溶液和0.05ml內毒素溶液(0.2EU/ml)，將產生的混合物攪拌，然後用Toxinometer ET-201測量在保持溫度37℃時直到液體混合物(反就混合物)的透光度比(Rt)降低5％所需的時間(以後稱所說的時間為Tg)。作為陰性對照，與上面相同的過程被重複，只是用0.05ml注射用水(Otsuka Parmaceutical Co.，Ltd.生產)代替內毒素溶液，確證Tg值大於測量時間(90分鐘)(凝膠化未被判定)。
而且，顯示Tg值與內毒素濃度之間關係的校準曲線預先通過在測試管中放置0.05ml AL溶液，0.1ml注射用水(Otsuka Pharmaceuti-cal Co.，Ltd.生產)和具有預定濃度的0.05ml內毒素溶液，攪拌得到的混合物，然後以如上相同的方式進行測量而製得。用上面得到的幾種聚乙二醇溶液得到的Tg值被用於校準曲線以確定表觀內毒素濃度。這樣得到的表觀內毒素濃度被用於下面的公式以確定相對活性(％)相對活性(％)＝(表觀內毒素濃度)/0.2×100(結果)當具有幾種分子量的聚乙二醇被允許以幾種濃度存在時得到的相對活性示於表1至3中。順便提一下，在表中，聚乙二醇(PEG)濃度表示在反應期間(測量Tg值期間)在溶液中的濃度。
表1<
>注PEG聚乙二醇-由於產生不是因為內毒素的非特殊濁度，沒有測出相對活性。
表2
注PEG聚乙二醇-由於產生不是因為內毒素的非特殊濁度，沒有測出相對活性。
表3
注PEG聚乙二醇從表1至3的結果可以看出表觀內毒素濃度是增加的，也就是說，當AL溶液與內毒素反應時，允許合適量的具有重量平均分子量3000至4000000的聚乙二醇存在，使內毒素的測量靈敏度增加。
順便地說，儘管沒有示於表中，當具重量平均分子量500000至4000000的高分子量聚乙二醇的濃度超過1.0％時，聚乙二醇溶液的粘度變得較高，其操作變得困難，因而所說的聚乙二醇溶液不實用。
而且，儘管沒有示於表中，但已發現當使用具有重量平均分子量2000的聚乙二醇時，沒有發現對AL溶液與內毒素反應有加速作用，而且在一些情況下，所說的反應被抑制。而且，當具有大重量平均分子量的聚乙二醇被使用時出現這樣的問題，反應混合物的粘度變得太高，當AL溶液被傾倒時，反應混合物含有氣泡因而產生誤差，而且AL溶液附於反應試管壁妨礙反應。因此，已發現用於本發明這一目的的聚乙二醇需要具有重量平均分子量3000至4000000。實施例2(試劑)β-葡聚糖溶液將(13)-β-D-葡聚糖羧甲基化衍生物的羧甲基化的Curd-lan(由Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生產)溶於注射用水(由Otsuka Pharmaceutical Co.，Ltd.生產)以製備1mg/ml溶液，並將其適當稀釋然後使用。AL溶液將LAL溶液的凍乾產品(從Wako Pure Chemical Industries，Ltd.購買的，對5ml的凝膠化靈敏度0.06EU/ml)溶於5ml LAL-溶解緩衝溶液(由Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生產)中，使用得到的溶液。聚乙二醇溶液使用由實施例1中的聚乙二醇6000製備的具有各種濃度的聚乙二醇。測量用的樣品等當量的β-葡聚糖溶液(40ng/ml)和具有預定濃度的聚乙二醇溶液的混合物被用作測量的樣品。
(過程)在測量用的試管中放入0.1ml AL溶液和0.1ml測量用樣品，攪拌得到的混合物，在此之後，液體混合物(反應混合物)的Tg用Toxinometer ET-201在溫度保持37℃時測量。作為陰性對照，與上相同的過程被重複，只是測量樣品用0.1ml注射用水(由OtsukaPharmaceutical Co.，Ltd.生產)代替以確證Tg大於測量時間(60)分鐘(凝膠化未被判定)。
(結果)測量結果示於表4中。
表4
注*顯示測量樣品的濃度從表4的結果可以看出，凝膠化時間被縮短，也就是說，通過使聚乙二醇在反應期間存在使β-葡聚糖的測量靈敏度增加。實施例3(試劑)內毒素溶液與實施例1中相同AL溶液與實施例1中相同聚乙烯醇溶液具有聚合度500的聚乙烯醇或者具有聚合度2000的聚乙烯醇(兩者都由Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生產)被溶於注射用水(Otsuka Parmaceutical Co.，ltd.生產)以製備2％溶液，將此溶液在121℃進行高壓滅菌處理15分鐘。使用這樣得到的聚乙烯醇溶液。甲基纖維素溶液將具有粘度15CPS的甲基纖維素或具有粘度100CPS的甲基纖維素(兩者都由Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生產)溶於注射用水(由Otsuka Pharmaceutical Co.，Ltd.生產)以製備2％溶液，將此溶液在121℃進行高壓滅菌處理15分鐘。該溶液然後被冷卻並再次攪拌以確證甲基纖維素完全溶解。使用這樣得到的甲基纖維素溶液。羥丙基纖維溶液將具有粘度150至400CPS的羥丙基纖維素(由Wako PureChemical Industries，Ltd.生產)溶於注射用水(由Otsuka Pharmaceuti-cal CO.，Ltd.生產)以製備1％溶液，將此溶液在121℃進行高壓滅菌處理15分鐘，使用這樣得到的羥丙基纖維素溶液。GANTRETZ(GAF公司的甲基乙烯基醚/馬來酐共聚物的商品名)溶液將GANTRETZ AN-119，AN-139或AN-169(都由GAF公司生產)及GANTRETZ的三倍量的氫氧化鈉溶於注射用蒸餾水(Ot-suka Pharmaceutieal Co.，Ltd.)以製備1％溶液，此溶液在121℃進行高壓滅菌處理15分鐘。使用這樣得到的GANTRETZ溶液。聚丙烯酸鈉溶液具有聚合度22000至70000的聚丙烯酸鈉(由Wako Prue Chemi-cal Industries，Ltd.生產)被溶於注射用水(由Otsuka PharmaccuticalCo.，Ltd.生產)以製備0.5％溶液，將此溶液在121℃進行高壓滅菌處理15分鐘。使用這樣得到的聚丙烯酸溶液。
(過程)在測量用試管中加入0.05ml AL溶液，0.1ml預定的水溶性聚合物和0.05ml內毒素溶液(0.2EU/ml)，將得到的混合物攪拌，在此之後，用Toxinometer ET-201在溫度保持在37℃時測量液體混合物(反應混合物)的Tg。作為陰性對照，重複與上述相同的過程，只是用0.05ml注射用水(由Otsuka Pharmaceutical Co.，Ltd.生產)代替內毒素溶液以確證Tg值大於測量時間(90分鐘)(凝膠化未被判定)而且，通過將0.05ml AL溶液，0.1ml注射用水和0.5ml具有預定濃度的內毒素溶液放入測試管中並以與上述相同的方式進行測量而預先製備表示Tg值和內毒素濃度之間關係的校準曲線，應用此校準曲線，用前面得到的各種水溶性聚合物溶液得到的Tg值測定表觀內毒素濃度。這樣得到的表觀內毒素濃度被用於下面的公式以確定相對活性值(％)相對活性(％)＝(表觀內毒素濃度)/0.2×100(結果)用各種水溶性聚合物在各種濃度得到的相對活性(％)被示於表5和表6中。順便提一句，在表中的水溶性聚合物濃度是反應期間(Tg值測量期間)溶液中的濃度。
表5
表6
注-由於產生不是因為內毒素的非特定濁度，相對活性值不能測定。
從表5的結果可以看出，當具有聚合度約500的聚乙烯醇被允許以1.25％或更高的濃度存在，具有聚合度約2000的聚乙烯醇被允許以0.25％或更高的濃度存在時，具有粘度15CPS的甲基纖維素允許以0.25％或更高的濃度存在時，具有粘度100CPS的甲基纖維素以0.125％或更高的濃度存在時，或羥丙基纖維素被允許以0.125％或更高的濃度存在時，內毒素的測量靈敏度增加。
另一方面，從表6的結果可以看出甲基乙烯基醚/馬來酐共聚物，聚丙烯酸鈉等的GANTRETZ之類的水溶性聚合物沒有諸如增加內毒素測量靈敏度之類的作用。
從上面的敘述已很清楚，本發明提供了用動力學比濁法測量內毒素(或β-葡聚糖)的高靈敏度方法，當本發明的方法被使用時，以大大低於常規情況的量存在的內毒素或β-葡聚糖可以高靈敏度被檢測到。因此，本發明對工業貢獻很大。
權利要求
1，測量含於樣品中的內毒素或(1→3)-β-D-葡聚糖的方法，包括將樣品在至少一種選自聚乙二醇，聚乙烯醇，甲基纖維素和羥丙基纖維的水溶性聚合物存在下與馬蹄蟹的變形細胞溶胞產物混合，用光照射得到的液體混合物，測量在樣品與變形細胞溶胞產物混合後，或樣品與變形細胞溶胞產物混合後經過預定的時間之後，直到產生的液體混合物的光學變化程度達到一個預定值所需的時間，和以該時間與內毒素或(1→3)-β-D-葡聚糖的量之間的關係為基礎測定含於樣品中的內毒素或(1→3)-β-D-葡聚糖的含量。
2，根據權利要求1的方法，其中光學變化由透光度變化，吸收變化，比值Rt＝It/Io的變化程度，或比值Rt的對數值的變化程度引起，其中Io是初始階段的透光度而It是樣品與變形細胞溶胞產物混合經過時間t之後，或樣品與變形細胞溶胞產物混合經過預定時間之後的透光度。
3，根據權利要求1的方法，其中水溶性聚合物是聚乙二醇。
4，根據權利要求3的方法，其中聚乙二醇具有重量平均分子量3000至4000000。
5，一種用於測量含於樣品中內毒素或(1→3)-β-D-葡聚糖的試劑，包含馬蹄蟹的變形細胞溶胞產物和至少一種選自聚乙二醇，聚乙烯醇，甲基纖維素和羥丙基纖維素的水溶性聚合物。
全文摘要
一種測量含於樣品中的內毒素或(1→3)-β-D-葡聚糖(以後稱作β-葡聚糖)的方法，包括將樣品在至少一種選自聚乙二醇，聚乙烯醇，甲基纖維素和羥丙基纖維素的水溶性聚合物存在下與馬蹄蟹的變形細胞溶胞產物混合，用光照射得到的混合物，測量直到樣品與變形細胞溶胞產物混合後，或樣品與變形細胞溶胞產物混合經過預定時間之後，產生的混合物的光學變化程度達到一個預定值所需的時間，以該時間與內毒素或β-葡聚糖的量之間的關係為基礎測定含於樣品中的內毒素或β-葡聚糖的含量。
文檔編號G01N33/579GK1132352SQ9511854
公開日1996年10月2日 申請日期1995年10月30日 優先權日1994年10月31日
發明者高岡文, 士谷正和, 川邊惠子, 井尻晴久 申請人:和光純藥工業株式會社