原蛋白轉化酶2基因在製備治療癌症藥物中的應用的製作方法
2023-11-06 11:33:42 2
專利名稱：原蛋白轉化酶2基因在製備治療癌症藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物醫藥領域，具體涉及一種原蛋白轉化酶2基因在製備治療癌症藥物中的應用，特別是治療人肺癌或人肝癌或人乳腺癌或小鼠乳腺癌或小鼠黑素瘤等癌症藥物中的應用。
背景技術：
原蛋白轉化酶(Subtilisin-likeProprotein Convertases, SPCs 或 PCs)是一類蛋白內切加工酶，它們介導了與胚胎形成、基因表達、細胞周期、凋 亡和神經內分泌等功能活動的相關前體蛋白的加工和成熟。這些前體蛋白分子的成熟需要涉及多個加工酶的分子加工步驟。目前，這些屬於絲氨酸蛋白酶家族的原蛋白轉化酶有PCl (或PC1/3)，PC2，PC4，Furin，PACE4，PC5/6，PC7，SK1-1和PCSK9等9種。它們在脊椎動物功能細胞中單獨或共同表達，在時間和空間上起作用。已經證實，哺乳類原蛋白轉化酶與許多疾病相關，如癌症、腦卒中、青光眼等。原蛋白轉化酶2 (PC2)廣泛地表達在內分泌組織中，在原蛋白加工成熟中伴有基礎的角色。Tanaka S等和Sang-Nam L等報導，在高Ca2+、pH5. O和其它原蛋白轉化酶存在下，鼠PC2原蛋白(proPC2，637aa/74kDa)裂解成成熟的PC2酶(529aa/64kDa)。在這個加工成熟過程中，proPC2蛋白分子的正確摺疊需其分子伴侶7B2蛋白(21kDa)的幫助。文獻報導,在人pc2基因(1914bp/638aa)和小鼠pc2基因(1911bp/637aa)之間有96. 55%同源性；在大鼠和小鼠之間，pc2基因有99. 53%同源性，這顯示pc2基因在人和鼠之間有極高度保守性。PC2是內肽酶，許多文獻報導，前體蛋白的成熟需要PC2作用。神經內分泌肽前體蛋白到成熟通常有三種形式，帶有信號肽的前原蛋白(pre-pro-protein)，原蛋白(pro-protein)和成熟肽。這些加工過程是由信號肽酶和PCs系統起作用。
發明內容
本發明的第一個目的是提供原蛋白轉化酶2基因在製備治療癌症藥物中的應用，特別是在製備治療人肺癌或人肝癌或人乳腺癌或小鼠乳腺癌或小鼠黑素瘤等癌症藥物中的應用。本發明所述的原蛋白轉化酶2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發明的第二個目的是提供原蛋白轉化酶2在製備治療癌症藥物中的應用，特別是在製備治療人肺癌或人肝癌或人乳腺癌或小鼠乳腺癌或小鼠黑素瘤等癌症藥物中的應用，所述的原蛋白轉化酶2，其胺基酸序列如SEQ ID NO. 2的第109 637位所示。本發明的第三個目的是提供編碼原蛋白轉化酶2的基因在製備治療癌症藥物中的應用，特別是在製備治療人肺癌或人肝癌或人乳腺癌或小鼠乳腺癌或小鼠黑素瘤等癌症藥物中的應用。所述的編碼原蛋白轉化酶2的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第325 1911位所示。本發明將原蛋白轉化酶2基因和7b2基因分別插入表達載體P⑶NA3.1中，形成表達載體PCDNA3.1_pc2和pCDNA3.1_7b2。將重組細菌培養，重組質粒用通用的DNA純化試劑盒抽提後，通過脂質體介導將P⑶NA3. l-pc2和P⑶NA3.1_7b2重組質粒共轉染人肺癌細胞A549、人肝癌細胞H印G2、人乳腺癌細胞MCF、小鼠乳腺癌細胞4T1和小鼠黑色素瘤細胞B16。應用MTT法測定pc2重組質粒對上述癌細胞的半數起效量IC50分別為94. 20,0. 02,8. 11、1.39和2. 23 (μ g/50y I)。由此可見本發明的原蛋白轉化酶2基因對人肝癌細胞H印G2、人乳腺癌細胞MCF、小鼠乳腺癌細胞4Τ1和小鼠黑色素瘤細胞Β16具有較好的抑制作用，這顯示，pc2基因對人和鼠癌症有同樣的效果。因此可以將原蛋白轉化酶2基因用於製備治療人肺癌或人肝癌或人乳腺癌或小鼠乳腺癌或黑素瘤等癌症藥物中。再通過脂質體介導，將質粒P⑶NA3. l-pc2和p⑶NA3.1_7b2基因共轉染小鼠乳腺癌細胞株4T1，結果顯示，轉染小鼠乳腺癌細胞株4T1具有最高的PC2酶活性和明顯的PC2蛋白表達。轉染48小時後，培養液中出現大量的懸浮細胞，與相同細胞密度的轉染空載體PCDNA3.1的瘤細胞比較，共轉染組貼壁細胞明顯減少，不同密度瘤細胞的共轉染引起相同的凋亡現象。貼壁細胞螢光染色(DAPI)顯示，部分癌細胞核裂解成碎塊和TUNEL反應陽性， 顯示有明顯細胞死亡。體內試驗顯示，通過脂質體介導，將質粒P⑶NA3. 1-PC2和P⑶NA3.1_7b2共轉染乳腺癌細胞4T1，轉染的瘤細胞接種在雄性BALB/c小鼠腹部皮下(Ex vivo技術)，5和15天後，分別測定瘤體積或瘤重，以空質粒P⑶NA3.1轉染的乳腺癌細胞4T1接種雄性BALB/c小鼠腹部皮下作為對照。結果顯示相同瘤細胞接種5天和15天後，重組質粒共轉染組瘤直徑比對照組分別減少了 66. 5±7. 4%或66. 2±1. 9%(P〈0. 01)，而15天的瘤重僅為對照組的
I1.8%，減少了 88±1. 8%。在雄性BALB/c小鼠腹部皮內接種野生型乳腺癌細胞4T18. 4X IO6個/mm2，2天後，在癌細胞接種部位一次性對角注射各100微升含有重組質粒p⑶NA3. l-pc2和P⑶NA3. l-7b2的脂質體懸液(每個重組質粒15微克，共30微克基因載體/100 μ I)(瘤內注射技術)。繼續生長6和8天後，分別測定瘤體積和瘤重。結果顯示一次60微克原蛋白轉化酶2基因的瘤內注射，與注射等量pCDNA3.1空載體的對照組比較，平均瘤體積縮小了 54. 4±13. 3% (6天)和47. 2±7. 7% (8天)，8天平均瘤重僅是對照組的27. 7%，減少了 72.3±0.4%。Ex vivo技術的基因轉染組的瘤組織和瘤內注射的瘤組織進行HE染色和PC2、CPE免疫組化分析，顯示與P⑶ΝΑ3.1空載體轉染的對照組比較，重組基因共轉染組細胞出現大量核固縮、碎裂等死亡現象，重組基因瘤內注射出現灶狀壞死。PC2免疫組化染色顯示，重組基因共轉染組的死亡細胞顯示了明顯高的PC2蛋白表達，瘤內注射組的灶狀壞死細胞顯示了高的PC2蛋白表達。CPE免疫組織化學染色顯示，重組基因轉染組的死亡細胞顯不了略聞的CPE蛋白表達，瘤內注射組灶狀壞死細胞顯不了聞的CPE蛋白表達。這些結果顯示，癌細胞的PC2基因轉染和瘤內注射含質粒P⑶ΝΑ3. l-pc2和ρ⑶ΝΑ3.1_7b2的脂質體懸液可引起明顯的癌細胞死亡。以上結果表明，含有原蛋白轉化酶2基因的表達載體經脂質體介導轉染癌細胞後，在癌細胞中，原蛋白轉化酶2基因表達PC2原蛋白前體(pr印roPC2，637aa/84kDa，其序列如SEQ ID NO. 2所示)，該原蛋白前體包括信號肽序列SEQ ID NO. 2的第I位到24位所示、原肽序列(Prop印tide)序列SEQ ID NO. 2的25 108位所示和成熟PC2酶序列SEQ IDN0. 2的109 637所示。該PC2原蛋白前體經癌細胞自身轉化成PC2原蛋白，後者經過共轉基因7b2表達產物7B2分子伴侶的幫助，使PC2原蛋白轉化成成熟PC2，最終該成熟PC2蛋白誘導了小鼠乳腺癌細胞4T1死亡。因此，本發明的第四個目的是提供原蛋白轉化酶2基因聯合7b2基因在製備治療癌症藥物中的應用，特別是在製備治療人肺癌或人肝癌或人乳腺癌或小鼠乳腺癌或小鼠黑素瘤等癌症藥物中的應用，所述的原蛋白轉化酶2基因的核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示，所述的7b2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。經過pc2:7b2不同比例優化選擇，本文所述的原蛋白轉化酶2基因和7b2基因是按照質量比1:1聯合使用的。本發明的原蛋白轉化酶2基因在小鼠乳腺癌細胞中表達，能夠誘導小鼠乳腺癌細胞凋亡，進一步將原蛋白轉化酶2基因在人肺癌細胞A549、人肝癌細胞H印G2、人乳腺癌細胞MCF和小鼠黑色素瘤細胞B16中表達，對上述癌細胞具有抑制作用，從而可以將原蛋白轉化酶2基因用於製備治療癌症的藥物，特別是治療人肝癌或人乳腺癌或小鼠乳腺癌或黑素瘤等癌症藥物中，具有良好的應用前景。
圖1是大鼠垂體總RNA的電泳圖。泳道I為總RNA，泳道2為DNAmarkers(100-2000bp)；圖2是原蛋白轉化酶2基因擴增產物和連接產物質粒P⑶NA3.1_pc2的電泳圖。泳道I為質粒P⑶NA3.1_pc2，泳道2為原蛋白轉化酶2基因PCR擴增產物，DNAmarkers(O. 5-lOkb)；圖3是7b2基因擴增產物的電泳圖。泳道I為7b2基因PCR擴增產物，泳道2為DNA markers(100-2000bp)；圖4是7b2基因重組質粒pCDNA3.1_7b2的電泳圖。泳道I為DNAmarkers (O. 5-lOkb)，泳道 2 為質粒 pCDNA3.1_pc2，泳道 3 為 pCDNA3.1_7b2 ；圖5是原蛋白轉化酶2基因在乳腺癌細胞4T1中的蛋白表達的Western blot分析圖。泳道I為轉染空載體P⑶NA3.1的乳腺癌細胞，泳道2為共轉染重組質粒P⑶NA3.1_pc2和P⑶NA3. l-7b2的乳腺癌細胞，對照為β -Actin蛋白；圖6是質粒pCDNA3.1_pc2和pCDNA3.1_7b2共轉染乳腺癌細胞4T1對體外培養癌細胞生長的影響(光鏡，放大倍數10X5)。A :共轉染重組質粒P⑶NA3.1_pc2和PCDNA3.1_7b2，轉染瘤細胞密度70%，培養48小時；B :轉染空質粒pCDNA3.1，轉染瘤細胞密度70%，培養48小時；C :共轉染重組質粒pCDNA3.1_pc2和pCDNA3.1_7b2，轉染瘤細胞密度30%，培養48小時；D :轉染空質粒pCDNA3. 1，轉染瘤細胞密度30%，培養48小時；圖7是重組質粒pCDNA3.1_pc2和pCDNA3.1_7b2共轉染乳腺癌細胞4T1的細胞核螢光染色分析(DAPI染色，放大倍數10X20)。A :轉染空質粒p⑶NA3.1的瘤細胞；B :轉染重組質粒P⑶NA3. l-pc2和P⑶NA3.1_7b2的瘤細胞，箭頭顯示細胞核破碎和死亡；圖8是重組質粒pCDNA3.1_pc2和pCDNA3.1_7b2共轉染乳腺癌細胞4T148小時後體外凋亡分析(TUNEL染色，綠色為陽性)。A :轉染空質粒P⑶NA3.1的貼壁乳腺癌細胞(放大倍數IOX 15) ；B :共轉染重組質粒pCDNA3.1_pc2和pCDNA3.1_7b2的貼壁乳腺癌細胞(放大倍數10 X 15) ；C共轉染重組質粒pCDNA3.1_pc2和pCDNA3.1_7b2的懸浮乳腺癌細胞(放大倍數10X10)；
圖9是體內共轉染pc2和7b2基因的乳腺癌組織形態分析(n=4，Ex vivo技術)(細胞接種15天)。共轉染組共轉染重組質粒P⑶NA3. l-pc2和p⑶NA3.1_7b2的乳腺癌細胞4T18. 4 X IO6個/mm2，對照組轉染空質粒p⑶NA3.1的乳腺癌細胞4T18. 4 X IO6個/mm2 ；圖10是體內共轉染pc2和7b2基因的乳腺癌組織形態分析(n=4，Invivo瘤內注射技術)(細胞接種8天)，PBS組注射空載體P⑶NA3.1的脂質體一 PBS溶液(60微克p⑶NA3.1空載體);基因組注射含質粒P⑶NA3. l-pc2和P⑶NA3.1_7b2的脂質體懸液一 PBS溶液(每100 μ L注射液含15微克PCDNA3.1_pc2和15微克pCDNA3.1_7b2基因載體)；圖11是體內共轉染pc2和7b2基因的乳腺癌組織的HE染色分析(放大倍數200)，A :轉染空質粒pCDNA3.1的乳腺癌組織；B :共轉染含質粒pCDNA3.1_pc2和pCDNA3.1_7b2的乳腺癌組織；C :瘤內注射含重組質粒P⑶NA3. l-pc2和P⑶NA3.1_7b2的脂質體懸液的乳腺癌組織，黑色箭頭為灶狀壞死細胞； 圖12是體內共轉染pc2和7b2基因的乳腺癌組織的PC2免疫組織化學染色分析(放大倍數400 X，Envision法)，A :轉染空質粒p⑶NA3.1的乳腺癌組織；B :共轉染重組質粒pCDNA3.1_pc2和pCDNA3.1_7b2的乳腺癌組織；C :瘤內注射含重組質粒pCDNA3.1_pc2和P⑶NA3. l-7b2的脂質體懸液的乳腺癌組織，黑色箭頭為灶狀壞死細胞；圖13是體內共轉染重組質粒pCDNA3.1_pc2和pCDNA3.1_7b2的乳腺癌組織的CPE免疫組織化學染色分析(放大倍數400 X，Envision法)，A :轉染空質粒p⑶NA3.1的乳腺癌組織:共轉染重組質粒P⑶NA3. l-pc2和p⑶NA3.1_7b2的乳腺癌組織；C :瘤內注射含重組質粒P⑶NA3. l-pc2和P⑶NA3.1_7b2的脂質體懸液的乳腺癌組織，黑色箭頭為灶狀壞死細胞。
具體實施例方式以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。實施例1:一、大鼠腦垂體總RNA的分離和cDNA的獲取將S-D大鼠(購自廣州中醫藥大學)處死並立即將其垂體轉移保存於液氮中，用Trizol試劑盒提取大鼠垂體組織的總RNA，其電泳圖如圖1所示。按照試劑盒說明書的方法將6 μ g的總RNA，用逆轉錄酶(AMV)製備成雙鏈的總cDNA。二、RT-PCR擴增原蛋白轉化酶2基因以總cDNA 為模板，pc2基因克隆的兩個引物是上遊引物5』 -ggg ^gatccftttttatttgcatcttccctc-3』，其限制性內切酶是 BamHl,下遊引物 5』 -aagca aagcnjcagaccaggct-3'，其限制性內切酶是HindiII ;7b2基因克隆的兩個引物是上遊引物5，-GTATGAA IggatccI aatggcctcaaggctggtctctgctatg-3',其限制性內切酶是 BamH I,下遊引物 5，-GGCCC IttcgaaI ctttattctgcttccttctcctcttctg-3 '，其限制性內切酶是Hind III。兩個PCR的反應體系為18· 6μ I H2O, L 2 μ I含MgCI2的10XPCR緩衝液，各O. 6 μ I (5 μ Μ)的上下遊引物，2 μ I (IOmM) dNTP, 2. 4 μ I tag 酶(5U/ μ I)和 O. 6 μ I 總 cDNA模板。pc2基因的PCR反應條件為95° C變性I分鐘，55° C退火I分鐘，72° C延伸1. 5分鐘，循環40次，72° C延伸10分鐘，最後4° C保存；7b2基因的PCR反應條件為95° C變性5分鐘，95° C變性15秒，55° C退火15秒，72° C延伸I分鐘，循環40次，最後4° C保存。將pc2基因的PCR產物1%瓊脂糖電泳，其電泳圖如圖2所示，2號泳道的條帶為2133bp，經割膠回收測序驗證，其包括原蛋白轉化酶2基因5』端的部分非編碼區序列tttttatttgcatcttccctcttcttcccctgctccaccaccctgcgcgcctcgcagccccacttttcactcccaaagaagg、原蛋白轉化酶2基因表達序列(1914bp，ACCESSI0N NM 012746，其序列如SEQ ID NO.1所示和原蛋白轉化酶2基因3』端的部分非編碼區序列gccacgcttccgcctccatctccccttcctccctgtctctgcctctccttggtccacagttctggcagccaccacctgttaccctcacacaagcagtcccagcctggtctgaagctt,加上末端設計的內切酶位點，總序列長為2133bp,與電泳圖上的條帶大小一致。這顯示它是嚴格按原形PC2蛋白表達的。將7b2基因的PCR產物2. 5%瓊脂糖電泳，其電泳圖如圖3所示，7b2基因的PCR產物大小為680bp，經割膠回收測序驗證，其包括7b2基因信號肽序列(l_78bp)編碼區序列79-636bp、7b2基因序列為636bp [ACCESSION X15830，其序列如SEQ ID NO. 3所示，與電泳圖上的條帶大小一致。這顯示它是嚴格按原形7B2蛋白表達的。上述基因PCR產物純化後，用BamHl和Hind III雙酶切。載體p⑶NA3.1同樣用BamHl和HindIII雙酶切。用T4連接酶將pc2和7b2基因分別與載體p⑶NA3.1連接。連接反應為pc2或7b2基因，載體pCDNA3. 1，T4DNA連接酶緩衝液(IOX)和T4DNA連接酶，14°C過夜，具體按T4DNA連接酶的說明書進行操作，由此而獲得連接液。轉化篩選感受態菌的製備將E. coli BL21 (DE3)單菌落接種於IOml LB培養基，37°C搖菌至OD6tltl為O. 8，8000rpm離心2min收集沉澱菌體，按每毫升菌體加O. lmol/L CaCl2IOO μ I,冰上放置30min,8000rpm離心5min,棄上清,沉澱用相同濃度CaCl2懸浮菌體，100 μ I分裝，
4°C保存。轉化取連接液I 一 7μ 1，加入100μ I感受態細胞，冰上放置30min，42°C熱 激90秒，加入37°C預熱的LB培養基1ml，37°C緩慢震搖45min，塗布於氨苄青黴素(Amp+)(100 μ g/ml) LB平板，同時設陰、陽性對照，37 °C過夜。重組菌的篩選將轉化菌經Amp+抗性平板篩選後，經原菌PCR擴增，DNA測序和誘導表達等方法篩選陽性克隆。①原菌PCR擴增擴增模板為重組菌落，以W:5』 -ggggaattcggcacgagtttttatttgcatcttccctc-3』 ; F: 5' -aagcaaagcttcagaccaggct-3' 作為引物進行菌落 PCR。擴增產物經瓊脂糖電泳，如圖2和3所示，在2133bp (pc2基因PCR產物，1%瓊脂糖電泳)和680bp (7b2基因PCR產物，2. 5%瓊脂糖電泳)位置出現電泳條帶之菌落為陽性。②DNA測序原菌擴增的陽性克隆經上海生工公司測序。測序用ABI PRISM377DNASequencer測序儀和PCR引物測序。③PC2蛋白基因的誘導表達將帶有pc2基因的工程菌接種在200ml含有Amp+抗性的LB培養基中，經37°C搖瓶培養，待菌密度達到A6tltl = O. 6，加O. 5M乳糖到終濃度50mM誘導6小時。試驗中，每過一小時，定量取培養基離心收集菌體，做SDS-PAGE表達分析。挑上述鑑定為陽性的單菌落接種於5ml LB Amp+ (100 μ g/ml)液體培養基，37°C搖管培養重組細菌12h，重組質粒採用通用的DNA純化試劑盒抽提質粒後，1. 2%瓊脂糖電泳篩選，其電泳圖如圖4所示，從圖4中可以看出，具體見泳道2和3，泳道2和3顯示的DNA大小與實際的大小相符，再將該質粒進行測序驗證，測序結果表明，原蛋白轉化酶2基因插入了載體口0)嫩3.1中。同理,構建得到重組質粒pO)NA3.1_7b2,進一步經Western blot技術和PC2酶活性驗證，pc2和分子伴侶7b2基因的1:1共轉染達到最大PC2酶活力，導致成熟PC2蛋白的明顯轉活。四、重組pc2基因的表達分析用通用的DNA純化試劑盒抽提上述重組菌中的質粒P⑶NA3.1_pc2和pCDNA3.1_7b2，將 10 μ I 的質粒溶液(含 5 μ gpCDNA3.1_pc2 和 5 μ g pCDNA3.1_7b2 重組質粒)與180 μ I H2O混合，記為混合液A0將10 μ I的脂質體(Lipofactamine 2000，購自Invitrogen公司)與180 μ I的水混合,記為混合液B。強烈混合混合液A和B 3min,靜置30min,得到混合液C。將小鼠乳腺癌細胞4T1種在6孔板中，在37°C和5%C02條件下，在高糖DMEM —血清培養基中培養，待細胞密度達到80%時，棄除DMEM培養液，用不含血清的DMEM培養液衝洗一次。將細胞在無血清的DMEM中培養30分鐘後，加入380 μ I混合液C到培養的4Τ1乳腺癌細胞孔中，繼續培養16小時後，每孔中加入2ml含血清的DMEM培養液， 在37°C、5%C02條件下繼續培養48小時。對照組細胞用空的P⑶NA3.1質粒-脂質體做相同處理。用37°C預熱的PBS溶液洗滌每個孔的腫瘤細胞一次，再用冷的PBS溫和地懸浮細胞。將懸浮細胞在6000rpm，4°C離心6分鐘，收集細胞沉澱。用2mL勻漿器和凍融方法將細胞勻漿。勻漿中使用T-H緩衝液50mM Tris -HCl (pH 7. 5)含l%Triton X-100提取蛋白質，得到含蛋白質的上清液。用Bradford法測定上清液的蛋白質濃度。用SDS - PAGE分離蛋白(150V 2小時，每孔進樣30微克蛋白質)，將SDS - PAGE膠上的蛋白帶轉到PVDF膜上(Millipore Co. , USA) (166mA，2. 5h)。用原蛋白轉化酶2的抗體檢測(ABC0M公司，貨號ab28571，以1:1000稀釋)，用ECL方法(A和B液購自碧雲天公司)檢測膜上的抗體。以β -Actin為參照。如圖5所示,泳道I表示的是轉染空質粒P⑶ΝΑ3.1的乳腺癌細胞4Τ1,泳道2表示的是轉染重組質粒PCDNA3. l-pc2和pCDNA3.1_7b2的乳腺癌細胞4T1，對照為β -actin蛋白。從圖5可以看出，乳腺癌細胞4T1轉染質粒pCDNA3.1_pc2和pCDNA3.1_7b2後，表達出74kDa(proPC2)和64kDa(成熟PC2)的蛋白質，這與PC2的蛋白大小是一致的。五、原蛋白轉化酶2酶活性分析用上述轉染方法轉染pCDNA3. l-pc2和pCDNA3.1_7b2的乳腺癌細胞4T1或對照或單獨轉染P⑶NA3. 1-PC2的乳腺癌細胞4T1，先用37°C保溫過的PBS洗滌每個孔的腫瘤細胞一次，再用冷的PBS溫和地懸浮細胞。將懸浮細胞在6000rpm，4°C離心6分鐘，收集細胞沉澱。用 2mL 勻漿器，將乳腺癌細胞 4T1 用 50mM Tris-HCl [pH 7. 5，l%Triton X-100，10% 甘油和蛋白酶抑制劑勻漿。將勻漿液凍融一次，渦漩振蕩破壞細胞，4°C和10，OOOXg離心10分鐘,收集蛋白上清液。將含有10微克蛋白的上清與200 μ M的l-pyroglutamyl_Arg-Thr-Lys-Arg-7-amino-4-methyl-coumarin 底物 37°C保溫,反應體積 100 微升,反應緩衝液為終濃度IOOmM的醋酸鈉(pH 5. O)和ImM CaCl2, 37°C保溫4小時。對照管加入2μΜ終濃度的PC2酶特異性抑制劑CT肽(SVNPYLQGKRLDNVVAKK)。PC2酶活性通過測定游離的7-amino-4-methylcoumarin 量來石角定，7-amino-4_methylcoumarin 的釋放量使用 SpectraMax GEMINI螢光比色計(Molecular Devices公司)測得(激發波長是360nm，散射波長是480nm)。原蛋白轉化酶2的酶活性分析的結果如表I所示表1:轉染Pc2基因的乳腺癌細胞4T1的原蛋白轉化酶2酶活性分析
權利要求
1.原蛋白轉化酶2基因在製備治療癌症藥物中的應用，所述的原蛋白轉化酶2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述的癌症為人肺癌或人肝癌或人乳腺癌或或小鼠乳腺癌或小鼠黑素瘤。
3.原蛋白轉化酶2在製備治療癌症藥物中的應用，所述的原蛋白轉化酶2的胺基酸序列如SEQ ID NO. 2的第109 637位所示。
4.根據權利要求3所述的應用，其特徵在於，所述的癌症為人肺癌或人肝癌或人乳腺癌或或小鼠乳腺癌或小鼠黑素瘤。
5.編碼權利要求3所述的原蛋白轉化酶2的基因序列在製備治療癌症藥物中的應用。
6.根據權利要求5所述的應用，其特徵在於，所述的癌症為人肺癌或人肝癌或人乳腺癌或小鼠乳腺癌或小鼠黑素瘤。
7.根據權利要求5或6所述的應用，其特徵在於，所述的編碼原蛋白轉化酶2的基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第325 1911位所示。
8.權利要求1所述的原蛋白轉化酶2基因聯合7b2基因在製備治療癌症藥物中的應用，所述的7b2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
9.根據權利要求8所述的應用，其特徵在於，所述的癌症為人肺癌或人肝癌或人乳腺癌或小鼠乳腺癌或小鼠黑素瘤。
10.根據權利要求8所述的應用，其特徵在於，所述的原蛋白轉化酶2基因和7b2基因是按照質量比1:1聯合使用的。
全文摘要
本發明公開了一種原蛋白轉化酶2基因在製備治療癌症藥物中的應用。原蛋白轉化酶2基因在製備治療癌症藥物中的應用，特別是治療人肺癌或人肝癌或人乳腺癌或黑素瘤等癌症的藥物，所述的原蛋白轉化酶2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。原蛋白轉化酶2在製備治療癌症藥物中的應用，特別是治療人肺癌或人肝癌或人乳腺癌或黑素瘤等癌症的藥物，所述的原蛋白轉化酶2的胺基酸序列如SEQ ID NO.2的第109~637位所示。本發明的原蛋白轉化酶2基因能用於製備治療癌症的藥物，特別是治療人肺癌或人肝癌或人乳腺癌或鼠乳腺癌或黑素瘤等癌症藥物中，具有良好的應用前景。
文檔編號A61K48/00GK102989008SQ20121034175
公開日2013年3月27日 申請日期2012年9月14日 優先權日2012年7月11日
發明者唐松山, 吳文峰, 李紅枝, 李謙, 張娟輝, 周東 申請人:廣東藥學院