離析核酸的方法

2023-11-06 21:07:32

專利名稱：離析核酸的方法
技術領域：
本發明涉及具有玻璃表面的磁性顆粒，以及使用玻璃顆粒在離液序列高的鹽存在條件下純化生物物質，特別是核酸的方法。本發明還涉及離析這些生物物質的方法以及濃縮生物物質並將其從高濃度鹽溶液轉移到低濃度鹽溶液的方法。
許多生物物質，特別是核酸，要從其自然環境中將它們離析出來存在著特殊的困難。一方面，它們常以非常低的濃度存在，另一方面，它們經常與許多其它固體和溶解物質一起存在，使它們難以被離析或測量。
因為這個原因，近年來提出了許多方法和材料用於把核酸從其自然環境中離析出來。例如在Proc.Natl.Acad.USA 76,615-691(1979)中提出了把瓊脂糖凝膠中的核酸在碘化鈉存在下結合到磨碎的火石玻璃上的方法。
在高氯酸鈉存在條件下，在玻璃粉上純化DNA質粒以去除細菌的方法。在Anal.Biochem.121，382-387(1982)上有介紹。
在DE-A 37 34 442中介紹了用醋酸通過噬菌體顆粒沉澱把單旋M13噬菌體的DNA離析到玻璃纖維過濾器上並用高氯酸裂解這些噬菌體顆粒。結合到玻璃纖維過濾器上的核酸經洗滌後用含薄荷醇緩衝液洗脫到三甲醇氨基甲烷/乙二胺四乙酸緩衝液中。
從λ噬菌體中純化DNA的類似方法在Anal.Biochem.175，196-201(1988)有介紹。
按過去已知的方法，核酸必須在離液序列高的鹽溶液中有選擇地結合到玻璃表面並且把核酸與汙染物如瓊脂糖，蛋白質或細胞碎片分離。按照過去的方法，為把玻璃顆粒與汙染物分離，如是顆粒則通過離心分離，如是液體則通過玻璃纖維過濾器濾出。但是這是一個卡關的步驟，它限制了這些方法用於處理大量樣品。
通過加入鹽和乙醇產生沉澱後，用磁性顆粒來固定核酸的方法在Anal.Biochem.201，166-169(1992)和PCT GB 91/00212有介紹。在這個方法中核酸隨磁性顆粒被凝集。通過加磁場並進行一次洗滌把凝集物和原始溶劑分離。經一次洗滌後，核酸被溶於三甲醇氨基甲烷緩衝液中。但是此法有缺點，其中沉澱作用對核酸不是選擇的。而是許多固體和溶解物質也被凝集出來。結果，這種方法不能用來去除可能存在的特定酶反應的大量抑制劑。
一種有磁性顆粒埋置其中的多孔玻璃在US-A-4,233,169中有介紹。
磁性多孔玻璃在市場上可以買到，它在多孔的特種玻璃基體中包容磁性顆粒，並帶有含鏈酶抗生物素的包復層。這種產品可以用來離析生物物質，例如蛋白質或核酸，如果在絡合物製備時對其作些修飾，則可以共價結合到生物素上。
本發明的任務是提供更好的材料來固定生物物質以及一種簡單的方法來離析生物物質，特別是核酸，它也適用於常規診斷過程。
本發明主要涉及具有基本上無孔或孔徑小於10nm的玻璃外表面的磁性顆粒。本發明還涉及具有玻璃表面的鐵磁顆粒，一種離析生物物質特別是核酸的方法，以及一種製備磁性玻璃顆粒的方法。
按照專家的說法，顆粒是直徑小的固體材料。這裡談到的顆粒也常稱為色素。按照本發明，平均顆粒尺寸小於100μm的顆粒特別適用。更為適用的是平均顆粒尺寸10-60μm的顆粒。顆粒尺寸的分布最好較均勻。特別是不含尺寸＜10μm或＞60μm的顆粒。
會受磁體吸引的材料被認為是磁性的，例如鐵磁或超順磁材料。此外，被叫做軟磁的那些材料也被認為是磁性的，如鐵素體。按照本發明特別優選的是鐵磁材料，特別是它們還沒有被預磁化過。在這裡預磁化意指與磁體接觸，從而增加了剩磁。特別優選的是鐵磁材料，如磁鐵礦(Fe3O4)或Fe2O3。
顆粒的外表面意指鄰接的表面，從表面向顆粒外面的環境畫垂線，它不穿會過顆粒自己。
孔就是顆粒外表面的凹進處。該表面一直深達顆粒的這個位置，即在凹進處表面向顆粒相鄰環境畫的垂線至少穿過該顆粒一次。此外，孔深達顆粒內的深度大於孔的半徑。
按照本發明的玻璃就是一種包含矽的非晶形材料。玻璃可以包含其它材料如下B2O3(0-30％)Al2O3(0-20％)CaO (0-20％)
BaO (0-10％)K2O (0-20％)Na2O (0-20％)MgO (0-18％)Pb2O3(0-15％)玻璃還可以包含較小百分數(0-5％)的許多其它氧化物如Mn2O3，TiO2，As2O3，Fe2O3，CuO，CoO等。由硼矽酸鹽玻璃，火石玻璃或二氧化矽組成的表面被證實特別有效。根據核酸的收率，特別優選的是硼矽酸鹽玻璃，其氧化硼含量超過25％。SiO2/B2O3成分為70/30的玻璃是特別優選的。按照本發明特別優選的是用溶膠凝膠法成型然後乾燥和壓縮的玻璃。這種方法的基本原理是已知的，並有有所報導，例如C.J.Brinker，G.W.Scherer「溶膠凝膠科學-溶膠凝膠工藝的物理化學」，AcadamicPress Inc.1990，溶膠凝膠光學，工藝和應用，Lisa C.Klein，Ed.，Kluwer Academic Publishers 1994，p.450 ff.，和DE-A-1941191，DE-A-3719339，DE-A-4117041和DE-A-4217432。但是到目前為止，磁性顆粒的原理尚未有報導。但是這種方法可以用來創造一種磁性顆粒，當用它們來離析生物物質特別是核酸時所具有的令人驚奇的特性是沒有預計到的。在凝膠溶膠法中，構成骨架的成分，如SiO2，B2O3，Al2O3，TiO2，ZrO2，GeO2的醇鹽與其它組分如在酒精溶液中的氧化物和鹽化合，然後被水解。下面的方程描寫了製備硼鋁矽酸鈉玻璃的方法NaOH+B2O3+Al(OR)3+Si(OR)4-ROH+H2O]]>NaOH+B2O3+Al(OH)3+Si(OH)4]]> 加入水以使起始的組分開始水解。因為鹼性離子對矽酸酯的水解速度有催化作用，所以反應進行得相當快。一旦凝膠形成，就可以利用熱處理過程進行乾燥並密實以形成玻璃。
溶膠色素的比例對本發明的磁性色素的收率有相當大的影響。比例受如下的原因限制，色素的份額必須小到所產生的漿狀物仍能被泵送和噴霧。如果色素的份額太小，則粉末部分如非磁性材料變得太大並造成幹擾。從色素的收率來講，發現10-25克色素∶100毫升溶膠的比例是適用的。
為造備粉末，漿液最好通過管嘴噴霧，氣溶膠在下降過程中就被乾燥了。管嘴最好要加熱以加速漿液的乾燥。根據管嘴的尺寸，管嘴溫度優選地為120-200℃。通過選用足夠的蒸發速度但又避免過熱可以找到折中方案。
為了收率的最佳化，密實溫度應儘可能高。但是如果過高的話，顆粒會粘在一起並形成結塊，它必須被篩掉。在過高的溫度下對顆粒作進一步處理會造成喪失磁性。因此過高的溫度應該不於考慮。
基本無孔的表面意指孔(如上所述)所佔面積小於5％的表面，優選地小於2％，特別優選地小於1％。如果有孔存在，其直徑最好小於10nm，特別優選地為小於1nm。
按照本發明特別優選的顆粒是含有帶TiO2包層的雲母核的顆粒，磁性顆粒固定在其上面。在這種設計中，形成的複合材料由玻璃層包圍。核和磁性顆粒兩者都是晶狀無孔的。雲母表面的未被磁性顆粒佔據的空間由玻璃層包復，它要比磁性顆粒頂部要厚，結果基本上是一種無孔的玻璃表面。
磁性顆粒無孔性僅在外表面而不在顆粒內部。因此在顆粒內部可以有孔，只要表面基本上被無孔玻璃或帶有直徑小於10nm的玻璃包圍。
令人驚奇地，本發明提供的磁性顆粒特別適用於把生物物質從試樣中離析。特別是當長鏈核酸固定在上面時，它們不被破壞，或僅僅最少量地被破壞。此外，核的材料是天然的，因此不引起生態學的問題。此外，按照本發明的顆粒既便宜又容易製備。
本發明還涉及具有玻璃表面的鐵磁顆粒。超順磁顆粒早先已有報導。已經證實用玻璃表面包復的鐵磁顆粒對離析生物物質表現出相當大的優越性。如果鐵磁顆粒未與磁場接觸，則重力是造成它們沉澱出來的唯一的力。搖晃溶液可使它們既快又容易地再懸浮起來。不利用磁場的沉澱過程最好進行得比生物物質在顆粒表面的固定要慢。對核酸來講更是這樣。利用磁場鐵磁顆粒可以很容易地在試樣流體中一個特定的位置收集起來。然後把流體與顆粒分離，因此也就是與固定其上的生物物質分離。
本發明提供的鐵磁顆粒的玻璃表面可以是無孔或者有孔的。由於上面對本發明提供的磁性顆粒所述的原因，鐵磁顆粒的外表面也是基本上無孔或者有直徑小於10nm的孔。本發明提供的鐵磁顆粒的尺寸在10-60μm，特別優選為20-50μm。特別優選的顆粒是其表面孔(如果有)的直徑小於10nm，特別優選的為1nm。本發明鐵磁顆粒的一個例子是上面所描寫的由雲母和磁性顆粒構成的複合材料，外面包著一層玻璃。
本發明還涉及離析生物物質的方法，此方法是通過-使流體中所包含生物物質的樣品與本發明的磁性顆粒或本發明的鐵磁顆粒接觸，其條件為生物物質結合到顆粒表面上去，和-從流體中分離出生物物質。
生物物質意指帶有特定基礎或分子基礎的物質。它們特別包括，細胞如病毒或細菌，以及離析的人類和動物的細胞如白細胞，和免疫活性低或高的分子化學化合物如半抗原，抗原，抗體和核酸。核酸如脫氧核糖核酸或核糖核酸是特別優選的。
本發明的試樣包括醫學試樣如血，血清，漱口水，尿液，腦液，痰液，大便，活組織樣品和骨髓樣品。試樣也可能是用於環境分析，食品分析或分子生物學研究，例如來自細菌培育，噬菌體溶菌液和擴增過程的產物如PCR。
本發明的顆粒有一個內核，外面包了一層玻璃表面。核可以是複合材料，或者是一個簡單的鐵核。核可以由結晶體，陶瓷或類似玻璃的結構構成，其中埋入了氧化鐵。
所描述的方法可以用來離析天然或者修飾的生物物質。天然生物物質就是一種其結構與天然存在的生物物質相比沒有不可逆的改變的物質。但是這並不意味試樣的其它成分不可以被修飾。舉例來說，如果細胞被離析，包圍細胞的介質可以修飾，但不是細胞本身。如果核酸被離析，它們應該按它們天然的形式即非變性地切割或修飾，不要把它們通過和活性基團結合進行切割或修飾。因此，天然生物物質的概念特別是不包括生物素化的核酸。天然生物物質的例子有噬菌體脫氧核糖核酸或血液細胞核酸。
修飾的生物物質包括自然界不存在的物質，例如通過接上活性的，可探測的或有固定能力的基團修飾的核酸。這種例子有生物素化的核酸。
某些情況下，按照本發明試樣可以不經予處理而用於本發明的離析過程中。但是，在許多情況下試樣應使用適當的方法裂解，釋放包含在試樣中的生物物質。專家知道裂解試樣的方法，它可以是化學的，酶的或物理的。也可以是這些方法的組合。例如，可以用超聲，高壓，利用剪切力，用鹼，洗滌劑或離液序列高的鹽溶液，或者利用蛋白酶或脂肪酶。
關於用裂解得到核酸的方法，特別要引用Sambrook et al.MolecularCloning，A Laboratory Manual，2nd Addition，Cold Spring HarbourLaboratory Press，Cold Spring Harbour，NY and AuSubel et al.CurrentProtocols in Molecular Biology 1987，J.Viley and Sons，NY。
除了要被離析的生物物質外，試樣也可能包含流體中的其它成分如細胞殘基，蛋白質，鹽和其它不被離析的物質。優選地包含天然形式生物物質的試樣，在靶生物質可結合到顆粒表面上的條件下與顆粒接觸。這個條件依賴於有關的生物物質的類型，但這基本上是已知的。它們也依賴於生物物質結合到表面上去的方法。舉例來說，如果是免疫相互作用結合，則必須選擇適宜於免疫絡合物形成的條件。如果使用修飾的核酸，結合可以通過體現修飾的核酸基團，即生物素與鏈酶抗生物素包復表面來進行。但是，特別是對於核酸，優選的是核酸與玻璃直接結合，因為除了其它原因之外，核酸不必要經過修飾，甚至天然核酸也可以被結合。天然核酸與玻璃顆粒結合的方法類似於早先報導過的方法。最好在離液序列高的鹽中進行，其濃度在2-8mol/l，優選地4-6mol/l。離液序列高的鹽可以是碘化鈉，高氯酸鈉，硫氰酸胍，異硫氰酸胍或氫氯化胍。其它化合物也是可能的。
為使試樣和顆粒接觸，將試樣和顆粒混合併培育一段足夠的時間使結合發生。專家通常熟悉用非磁性顆粒處理的方法所需的培育時間。通過在不同時間點測定固定到表面的生物物質的數量可以使這一步最佳化。對核酸來講，培育時間在10秒到30分之間是合適的。
根據磁性顆粒的尺寸和類型，顆粒可以在培育階段從流體中分離出來，也可以讓懸浮體保持較長時間不動。如果顆粒很小和超順磁的，則懸浮體保持較長時間不變。如果顆粒尺寸大，在培育階段顆粒會慢慢從流體中分離出來。這種性質的結塊特別在涉及鐵磁顆粒時會形成。當鐵磁顆粒沒有予磁化，這是優選的，可以保證只有輕度分離。
固定作用最好不要藉助降低被固定物質的溶解度而產生沉澱的方法來進行。相反，固定要基於生物特異的相互作用(俘獲分子)或吸附。這就大大地防止非特異性的汙染。
培育以後，把生物物質從流體中分離。一般使用磁場把結合在磁性顆粒上的物質分離。例如，磁性顆粒可以被吸引到進行培育的器壁。然後，含有未被結合到磁性顆粒上的試樣成分的流體可以被去除。所用的去除方法取決於培育容器的類型。合適的方法包括通過移液管或抽吸器去除流體。
如果需要，可以用洗滌液淨化磁性顆粒一次或多次。所用的洗滌液不會造成生物物質離開顆粒表面，而是儘可能徹底地洗掉不希望的汙染物。洗滌步驟最好在洗滌液與顆粒培育時進行。這時顆粒最好又懸浮起來，即通過搖晃或施加磁場，此磁場與第一磁場不一樣。被汙染的洗滌液最好就和上面描寫的試樣一樣在結合生物物質的那一步被分離。
在最後一步洗滌之後，磁性顆粒可以在真空中被初步乾燥，或讓流體蒸發。也可以用丙酮進行予處理。
如果需要，以這種方式淨化的生物物質可以與磁性顆粒分離。這一步也取決於生物物質結合到磁性顆粒上的方式。如果生物物質是天然核酸，並且磁性顆粒是玻璃包復的顆粒，按照本發明核酸可以用低鹽含量的洗脫緩衝液從顆粒上移去。這種性質的緩衝液可從DE 3724442和分析生物化學175，196-201(1988)中了解。低鹽含量的洗脫緩衝液即特別是含量小於0.2mol/l的緩衝液。在一個特別優選的實施方案中，洗脫緩衝液含有三甲醇氨基甲烷。在另一個特殊的實施方案中，洗脫緩衝液是無離子水。
在另一個實施方案中，所描述的淨化和離析過程在細胞(如病毒顆粒或原核或真核細胞)從體液或細胞組織免疫磁化分離以後進行。在這一步中，如在搖晃的同時樣品與顆粒進行培育，抗體挨著細胞上的抗原被固定在顆粒上。這些顆粒可以是按照本發明的顆粒或者是市場上可買到的顆粒。(如Miltenyi Biotec GmbH，Bergisch Gladbach，Germany的MACS微粒)。在加上磁場後，用鹽溶液進行一次或多次洗滌。獲得結合有所希望的細胞的顆粒。然後，結合的細胞在鹽緩衝液中再懸浮。在一個優選的實施方案中，這種鹽緩衝液是一種離液序列高的鹽溶液，以致包含在細胞中的核酸被從細胞中釋放出來。
一種特別優越的把核酸從含細胞試樣中離析出來的方法是把上述的細胞離析和上述的核酸-優選地以它們天然的形式-的離析，在本發明的磁性顆粒上結合起來。這個實施方案的優越性是潛在的簡單性(單試管方法)，高靈敏度(在醫藥微生物學和腫瘤學上特別重要)，和易自動化。
使用本發明的方法離析的生物物質，需要時可以進一步被利用。例如，它們可以被用來作為許多酶反應的基質。當涉及核酸時，它們可以被用來確定序列結構，放射性或非放射性標記，它們包含的一個或多個序列結構的擴增，轉錄，與標記的示蹤核酸雜化，轉譯或連接。本發明方法的優點是生物物質與流體非常容易分離。早先的方法中，使用離心分離來把玻璃顆粒與汙染物分離，或者，當生物物質是結合到玻璃纖維過濾器上時，流體通過過濾器被去除。這是卡關的一步，它使處理大量試樣很困難。
使用本發明的顆粒，生物物質可以更有效地與汙染物分離。特別是按照本發明可在很大程度上去除某些酶反應的抑制劑。生物物質的收率相當高。沒有觀察到長鏈核酸的斷裂。本發明的顆粒最好是能被較快磁化的顆粒。


圖1表示核酸從包含細胞的試樣中的離析。
圖2表示按照本發明離析的核酸在瓊脂糖凝膠中的分離。
圖3描述在按照本發明離析後反應產物的分離和利用PCR的擴增。
圖4給出顯示例4結果的凝膠。
圖1表示核酸從包含細胞的試樣中的離析。包含細胞的試樣(試片)經予處理成試樣專有的形式，以致欲探測核酸的細胞就以合適的形式存在。例如，當使用已去除體液的試樣時，需要添加試劑，如液化粘稠的試樣如唾液。將結合到固相上，最好是微珠上的能探測和結合細胞的抗體加入到含有這種被處理試樣的容器中。例如，細胞表面的抗原被證明是抗體適宜的配體。抗體的特性依賴於所作分析的特性。如果固相是容器壁，細胞就直接結合到壁上。如果固相由微珠所組成，則使用適當的分離方法，將其與流體分離。舉例來說，可以利用過濾來進行。如果使用磁性微珠，在容器外壁加磁場就可以把它們分離。分離的細胞用液體洗滌以與包圍細胞的介質一起把汙染物(它們會干擾測量)去除。優選的條件是細胞既不從固相上分離也不被破壞。然後細胞被破壞，即裂解。例如，這可以通過用離液序列高的鹽處理細胞來進行。其它的可能性包括加入蛋白酶和洗滌劑。
優選的實施方案中，本發明的顆粒被加到裂解混合物中。經適當的時間裂解後-這可通過吸附於表面的核酸來最佳化-顆粒與包含其它不需探測的細胞成分的流體分離。最好利用在容器壁上放一塊磁體所產生的磁場來進行。
為了去除還可能存在的任何汙染物，最好用一種不引起被探測的核酸從玻璃表面分離的流體進行洗滌。然後加入一種含有可將核酸從玻璃表面分離的試劑的洗脫緩衝液，以把核酸從玻璃表面分離。這種條件就是低鹽條件。根據核酸進一步使用的打算，可以與顆粒分離並作進一步處理。分離步驟最好是通過加磁場以達顆粒相互分離。
下面的實例將更詳細解釋本發明。實例1本發明磁性顆粒的製備使用六種溶膠。溶膠的製備如下溶膠1(SiO2∶B2O3＝7∶3)合成在250ml圓形燒瓶中進行，同時不停地攪動。86.6ml四乙基正矽酸鹽+7ml無水非變性乙醇+14.1ml 0.15M HCl產生一種兩相混合物。在室溫情況下一直攪動到成為單相。一滴一滴加入+37.8ml硼酸三甲酯然後溶膠在50℃下放置2小時。加入+14.1ml 0.15M HCl溶膠2(SiO2∶B2O3＝4∶1)合成在250ml圓形燒瓶中進行，同時不停地攪動。100.5ml四乙基正矽酸鹽+7ml無水非變性乙醇+16.3ml 0.15M HCl產生一種兩相混合物。在室溫情況下一直攪動到成為單相。一滴一滴加入+25.6ml硼酸三甲酯然後溶膠在50℃下放置2小時。加入+16.3ml 0.15M HCl溶膠3(SiO2∶B2O3＝85∶15)合成在250ml圓形燒瓶中進行，同時不停地攪動。107.8ml四乙基正矽酸鹽+7ml無水非變性乙醇+17.5ml 0.15M HCl產生一種兩相混合物。在室溫情況下一直攪動到成為單相。一滴一滴加入+19.4ml硼酸三甲酯然後溶膠在50℃下放置2小時。加入+17.5ml 0.15M HCl溶膠4(SiO2∶B2O3＝4∶1；2Mol％P2O5)合成在250ml圓形燒瓶中進行，同時不停地攪動。100.5ml四乙基正矽酸鹽+7ml無水非變性乙醇+16.3ml 0.15M HCl產生一種兩相混合物。在室溫情況下一直攪動到成為單相。一滴一滴加入+25.6ml硼酸三甲酯然後溶膠在50℃下放置2小時。加入+16.3ml 0.15M HCl+1.63g P2O5溶膠5(SiO2∶B2O3＝4∶1，Mol％Al2O3)合成在250ml圓形燒瓶中進行，同時不停地攪動。100.5ml四乙基正矽酸鹽+7ml無水非變性乙醇+16.3ml 0.15M HCl產生一種兩相混合物。在室溫情況下一直攪動到成為單相。一滴一滴加入+25.6ml硼酸三甲酯然後溶膠在50℃下放置2小時。加入+16.3ml 0.15M HCl+3.06g Al2O3溶膠6(SiO2∶B2O3＝4∶1，Mol％ZrO2)合成在250ml圓形燒瓶中進行，同時不停地攪動。100.5ml四乙基正矽酸鹽+7ml無水非變性乙醇+16.3ml 0.15M HCl產生一種兩相混合物。在室溫情況下一直攪動到成為單相。一滴一滴加入+25.6ml硼酸三甲酯+5.15ml鋯(IV)-丙基酸，70％(重量)1-丙醇溶液然後溶膠在50℃下放置2小時。加入+16.3ml 0.15M HCl再在50℃下放置2小時後，每150ml溶膠加入22.5g lriodin 600(黑雲母)並攪動。然後用噴霧乾燥器(B①chi190，Mini Spray Dryer)進行包復。噴霧乾燥器管嘴溫度為134℃。然後噴霧乾燥過程得到的粉末要在氮的氣氛(90l/h)下進行溫度處理。溫度以1k/min的速率增加，粉末在密實化溫度中保持2小時。用溶膠1包復的情況，溫度為750℃，用溶膠2包復為860℃。對所有其它包復過程溫度為800℃。燒結處理以後，爐子就關掉，使粉末處於室溫。使用50μm的篩子把結塊篩掉。實例2GMP1，GMP2，GMP3和GMP4的製備GMP1，GMP2，GMP3和GMP4是從溶膠1(實例1)按實例1描述的過程在如下條件下製備的不同批色素
實例3使用磁性玻璃顆粒對人的全血PCR試樣予處理核酸離析玻璃磁性顆粒3份(GMP2-4)，每份10mg放入微量試管。精確的試樣重量在表1上給出。進行三次重複測定。
用移液管把40μl蛋白酶K(20mg/ml，由低壓凍幹製成)放入200μl解凍的全血中並立即混合。下一步加入200μl結合緩衝液(6M胍-HCl，10mM三甲醇氨基甲烷-HCl，10mM尿素，30％Triton X-100，pH4.4)並混合，然後在70℃下培育10分鐘。加入200μl異丙醇，然後製劑在vortex混合器中混合10秒。試樣在室溫放置20分鐘，然後再一次混合10秒鐘。磁分離這一步在Boehringer Mannheim(ID#1 641 794)的磁性顆粒分離器中進行至少30秒。按下面描述取出上清液並進行分析。
磁性顆粒用500μl洗滌緩衝液(20mM NaCl，10mM三甲醇氨基甲烷-HCl，pH7.5(25°)，80％乙醇)混合10秒鐘進行洗滌，在室溫中放置1分鐘，然後混合10秒鐘。然後用磁性顆粒分離器把它們吸引到容器壁。棄去上清液。重複洗滌過程直到清洗液沒有顏色為止(總共四次)。然後核酸經洗脫三次，每次用預熱到70℃的200μl洗脫緩衝液(10mM三甲醇氨基甲烷-HCl，pH8.5)，然後混合10秒鐘，在室溫放置10分鐘，再混合10分鐘。上清液的製備對在第一次結合到磁性玻璃顆粒上以後得到的上清液中的核酸含量進行如下研究上清液放入濾管(Boehringer Mannheim ID#1744003，如在高純PCR產品淨化包內提供的)，並在微量臺式離心機以8000rpm離心分離1小時。棄去流出的物質，過濾管用500μl洗滌緩衝液洗滌兩次(如上述進行離心分離)。過濾管經離心分離近幹，然後用2×200μl預熱到70℃的洗脫緩衝液進行洗脫，並再次離心。結果上清液1∶8 第1次洗脫液1∶8260 280nm 收率260/28260 280收率260/28nm 0nm nm 0GMP/2 12mg 10,0210,013 1,7μg 1,6 0,1710,16413,7μg1,010mg 20,0450,035 3,7μg 1,3 0,1370,13811,0μg1,09mg30,0360,027 2,9μg 1,3 0,1530,16412,2μg0,9GMP/3 10mg 10,0500,042 4,0μg 1,2 0,2450,24619,6μg0,910mg 20,0330,022 2,6μg 1,5 0,3970,39831,8μg1,010mg 30,0420,030 3,4μg 1,4 0278 0,28222,2μg0,9GMP/4 10mg 10,0650,056 0,7μg 1,2 0,1350,14211,0μg1,011mg 20,0710,142 2,4μg 0,5 0,1400,14211,2μg1,010mg 30,0660,051 1,7μg 1,3 0,1300,13010,4μg1,0第2次洗脫液1∶8第3次洗脫液1∶4260 280nm 收率 260/ 260 280 收率 260/ ∑nm 280 nm nm 280洗脫液GMP/210,0990,101 7,9μg 1,0 0,0570,0622,3μg 0,923,9μg20,0780,076 6,2μg 1,0 0,0410,0491,6μg 0,818,8μg30,1030,112 8,2μg 0,9 丟失GMP/310,1470,147 11,8μg 1,0 0,0840,0983,4μg 0,934,8μg20,2560,252 20,5μg 1,0 0,0420,0431,7μg 1,054,0μg30,1470,143 11.8μg 1,0 0,0730,0932,9μg 0,836,9μgGMP/410,1060,108 8,5μg 1,0 0,0830,0983.3μg 0,822,8μg20,1110,114 8,9μg 1,0 0,0540,0632,2μg 0,922,3μg30,1350,141 10,8μg 1,0 0,0770,0953,1μg 0,824,3μg表1使用磁性玻璃顆粒和200μl血的核酸收率洗脫液和試樣上清液的分析在50μl洗脫液中和用過濾管制備的上清液中分別加入10μl試樣緩衝液。45μl的製劑在0.8％的瓊脂糖凝膠中用120V的電泳分離90分鐘。不同稀釋度的洗脫液和製備的上清液用Uvikon710(Kontron)光譜儀在260和280nm處進行光譜測定。對兩等份5μl的洗脫液使用ExpandTMLong Template PCR(BoehringerMannheim ID#1681834)用人類tPA基因(預計產物長度15kb)的特定引物進行了重複測定。
混合物1 每批 混合物2 每批dNTP，每批100mM lμl ExpandTM緩衝液，10X 5μl引物1，200ng/ml 1μl ExpandTM聚合酶 0.75 μl引物2，225ng/ml 1μl 兩次蒸餾，H2O19.25μl兩次蒸餾H2O17μl20μl 25μl將混合物1與5μl洗脫液放入一個薄壁PCR管中，然後加入混合物2。該製劑進行初步混合後用一層30μl的礦物油覆蓋。該製劑用一臺PerkinElmer thermal cycler 9600按如下設定參數進行擴增2分 92℃10秒 92℃30秒 65℃ 10循環12分 68℃10秒 92℃30秒 65℃ 20循環12分+ 68℃每循環20秒7分 68℃然後 7℃將10μl試樣緩衝液加到含50μl製劑的PCR管中，45μl的混合物在0.8％的瓊脂糖凝膠中進行120v的電泳分離90分鐘。第1次洗脫液顏色還輕微帶黃並且被細的磁性顆粒輕微汙染。在瓊脂糖凝膠(圖2)中洗脫物的分析表明收率的重複性很好。磁性顆粒GMP2-4表明沒有顯著的不同。洗脫液1(上)和洗脫液2(下)幾乎含有相同濃度的核酸(用凝膠來估計)。洗脫液3中的核酸濃度低。上清液也含低濃度的核酸。除個別外，ExpandTMPCR對所有的試樣都得到非常好的特定的擴增產物(表2)。當使用磁性玻璃微粒時，核酸從人血試樣中離析，然後在PCR步驟中產生特定的擴增。
15kb ExpandTMPCR 人類tPA基因第1次洗脫液 第2次洗脫液GMP/21不適用+ +2 + + + +3 + + 不適用GMP/31 + + + +2 (+) + + +3 - (+) + +GMP/41 + + + +2 + + +(+)*3 + + 不適用K，BM Control DNA表2ExpandTMPCR的結果*第3次洗脫液圖3表示在PCR擴增後含反應產物的凝膠。MWM III是克分子量標記(洗脫液1，上；洗脫液2，下)。實例4把DNA長度標準結合到磁性玻璃顆粒上1.磁性玻璃顆粒的準備將12mg GMP4玻璃磁性顆粒放入微量試管。2.裂解和結合900μl裂解緩衝液(4.6M GuSCN，45mM三甲醇氨基甲烷，20mM EDTA，pH7.3)和100μl DNA試樣，其中加入Boehringer Mannheimm(Cat.No.528552)的DNA長度標準III作為標樣，並在1.5ml的微量試管中與12mg磁性玻璃顆粒混合2-10秒直到得到一個均勻的懸浮液為止。該溶液在室溫培育20分鐘，並每5分鐘混合一次。在磁性顆粒分離器中至少進行15秒磁分離。用移液管去掉上清液。3.洗滌和乾燥用移動磁場的方法洗滌磁性玻璃顆粒，用洗滌緩衝液(5.2M GuSCN，50mM三甲醇氨基甲烷，pH6.5)洗滌兩次，用70％預冷的乙醇洗兩次，再用丙酮洗一次，用移液管加入800μl溶液，混合2秒鐘，在室溫中放置1分鐘，加上磁場，然後通過移液管去掉上清液。去除丙酮，顆粒在敞口的加熱裝置內於56℃下乾燥10分鐘。4.DNA洗脫DNA用4×50μl洗脫緩衝液(10mM三甲醇氨基甲烷-HCl，1mM EDTA，pH8.0)在56℃下不停地搖晃地培育10分鐘來進行洗脫。然後含有DNA的上清液用移液管移到新的微量試管中。5.洗脫液分析五分之一體積的洗脫液與試樣緩衝液混合，在1％的瓊脂糖凝膠中在90V下進行DNA分離。為了測定收率，把DNA長度標準III的一系列稀釋液加到同一種包含有試樣預計數量DNA的凝膠中。用掃描法對瓊脂糖凝膠的Polaroid照片進行定量評定。以標準稀釋系列用作定標。使用磁性玻璃顆粒的DNA的收率在表1中給出。
表1使用磁性玻璃顆粒時DNA長度標準III的收率用作定量評定基礎的瓊脂糖凝膠在圖4中給出。它是1％溴化乙錠-染色的瓊脂糖凝膠。第1列到第10列相當於DNA長度標準III的一稀釋系列液。它們是11 g DNA，2200ng DNA，3175ng DNA，4150ng DNA，5125ng DNA，6100 DNA，775ng DNA，850ng DNA，925ngDNA，1010ng DNA。第11和第12列相應於從磁性玻璃顆粒洗脫得到的DNA，並加入200ngDNA長度標準。
序列表(1)總信息(i)申請人(A)名字Boehringer Mannheim GmbH(B)街道Sandhoferstr.116(C)城市Mannheim(D)國家DE(E)郵政編碼68298(F)0621 759 4348(G)0621 759 4457(ii)發明名稱磁性色素(iii)序列數2(iv)計算機可讀形式(A)數據載體軟盤(B)計算機IBM PC兼容(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體Patentln Release #1.0，Version #1.30(EPA)(2)序列識別號#1的信息(i)序列識別(A)長度34鹼基對(B)類型核苷酸(C)螺旋體類型單(D)結構線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/deSc＝「oligodeoxyribonucleotide」(iii)假設無(iv)序列描述序列識別號1ACTGTGCTTCTTGACCCATGGCAGAAGCGCCTTC 34(2)序列識別號#2的信息(i)序列識別(A)長度34鹼基對(B)類型核苷酸(C)螺旋體類型單(D)結構線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/dese＝「oligodeoxyribonucleotide」(iii)假設無(iv)序列描述序列識別號2CCTTCACTGTCTGCCTAACTCCTTCGTGTGTTCC 3權利要求
1.一種離析核酸的方法，它包括將流體中含有天然形態核酸的試樣與具有玻璃表面的磁性顆粒在核酸能直接結合到玻璃表面上去的條件下接觸，和從流體中分離結合的核酸。
2.權利要求1的方法，其特徵在於磁性顆粒在與試樣接觸時並未預磁化。
3.權利要求1或2的方法，其中所述具有玻璃表面的磁性顆粒的玻璃表面含有硼的氧化物。
4.權利要求1-3之任一項的方法，其特徵在於所述具有玻璃表面的磁性顆粒的玻璃表面基本上不含孔或只含直徑小於10nm的孔。
5.權利要求1或4的方法，其特徵在於所述具有玻璃表面的磁性顆粒的玻璃表面含有直徑小於100μm的孔。
6.權利要求1-5之任一項的方法，其特徵在於所述玻璃表面所含的所有孔的直徑小於1nm。
7.權利要求1-6之任一項的方法，其特徵在於所述顆粒含有以雲母為芯和固定其上的磁性顆粒的複合材料，所述複合材料被埋入一玻璃層中。
8.權利要求1-7之任一項的方法，其特徵在於所述具有玻璃表面的磁性顆粒由如下方法製造提供一種磁心並通過在磁心表面沉積含有網絡形成組分的醇化物的醇溶液形成的溶膠，將所述磁心包封在基本上無孔的玻璃表面中；用噴霧乾燥法將所述溶膠層轉化為凝膠層；此後將所述凝膠層緻密化。
9.權利要求1-3之任一項的方法，其特徵在於該分離是中磁鐵幫助下進行的。
10.鐵磁性顆粒在離析天然形式的核酸中的應用。
11.具有玻璃表面的鐵磁性顆粒在離析天然形式的核酸中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種離析核酸的方法，它包括使流體中含有天然形態核酸的試樣與具有玻璃表面的磁性顆粒，在核酸能直接結合到玻璃表面上去的條件下接觸，該玻璃表面基本上無孔或有直徑小於10nm的孔，和從流體中分離結合的核酸。
文檔編號B03C1/01GK1439646SQ0310663
公開日2003年9月3日 申請日期2003年2月27日 優先權日1995年6月8日
發明者J·克萊恩, T·沃爾特, H·哈爾蒂希, C·列斯尼亞克, M·梅恩伊格, M·裡德林, H·施密特 申請人:羅赫診斷器材股份有限公司