一種癌症基因及其醫藥用途的製作方法
2023-11-06 10:13:32 3
專利名稱：一種癌症基因及其醫藥用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及新基因及其用途，具體地說是人體1號染色體短臂36區(1p36)的新基因及其醫藥用途。
背景技術：
現代生物學研究表明，癌的發生是一種多因子多步驟的複雜事件，是多種癌基因激活或抑癌基因失活的結果。目前，癌基因醫學研究主要包括三個方面(1)尋找具有治療意義的目的基因。(2)建立有效的向靶細胞轉移目的基因的載體系統。(3)使目的基因在靶細胞中表達，發揮生物學效應。因此，尋找癌基因或抑癌基因是目前癌症研究中的重中之重。
人體1p36的雜合性缺失和染色體獲得已有報導(reviewed by Schwab et al.1996 Kraggerud et al.，2000；Loveday et al.，2000；Stock et al.，2000；Alvarez et al.，2001；Zielenska et al.，2001)。這些研究結果提示，在此區存在癌基因或抑癌基因。
發明內容
本發明的目的就是篩選並分離出1p36.13區域中出現的新的與癌相關的基因及轉錄物，並開發其具有的醫藥用途。
本發明的目的是這樣實現的本發明人利用克隆篩選技術，在人類(homo sapiens)第1號染色體上，找到了一個新的癌基因。該基因在人類多種癌組織中(卵巢癌，乳腺癌，胰腺癌，結腸癌，肺癌，前列腺癌，腦癌，胃癌，肝癌，子宮癌等)都有過表達，PCR定量顯示，其高出正常組織數百至數千倍。進一步研究證實，該基因與增殖及磷酸化有關。將該基因導入細胞接種於裸鼠皮下，經過一個月的觀察，可長出腫瘤。另外，該基因與非常著名的MAPK經路有關。其能夠刺激RAS過表達和MEK，ERK2磷酸化。用幹擾RNA(RNAi)的方式，阻斷該基因的表達，可以減少磷酸化和PCNA的表達。在細胞水平和活體均已證實能夠抑制癌細胞的生長。
本發明人命名該基因為PPO基因(Phosphorylation and ProliferationOncogene)。
由PPO的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述。其DNA長度約36-kb，cDNA長度6022鹼基。
PPO的cDNA核苷酸序列(SEQ ID NO.1)推斷的胺基酸序列如SEQ ID NO.2所述。其具有編碼SEQ ID NO.2所示的993個胺基酸殘基的可讀框的基因。
本發明的PPO基因編碼的胺基酸分子量為100kD。
該核苷酸序列的編碼區代表密碼子的組合的例子，所述密碼子針對SEQ ID NO2所示的胺基酸序列中的各自胺基酸殘基。
本發明基因中密碼子的組合不限於SEQ ID NO1中所示的例子。密碼子的任意組合可用於各自的胺基酸殘基。密碼子的選擇可以採用常規方式進行。
本發明基因的生產方法是從其中表達本發明基因的適當來源中以常規程序製備cDNA文庫或直接購得，並且使用適當的探針或特異於本發明基因的抗體從該文庫中篩選所需的克隆。
適用作cDNA來源的是例如表達本發明基因的各種細胞和組織以及從中衍生的培養細胞。
來自這種來源的總RNA的分離，mRNA的分離和純化以及cDNA的獲取和克隆可以按常規方式進行。
市售的cDNA文庫如購於Clontech(PaloAltocA)公司的各種cDNA文庫可用於本發明基因的生產。
從cDNA文庫生產的本發明基因，其篩選方法沒有特別的限制，可採用常規的方法。
篩選方法的例子，包括使用針對由cDNA所產生的蛋白的特異抗體來篩選相應cDNA克隆免疫篩選方法，使用探針選擇性地與目的DNA序列結合的方法，如噬菌斑雜交方法或菌落雜交方法，以及這些方法的組合。
作用於上述方法的探針，一般可使用依據本發明基因的核苷酸序列的信息而化學合成的DNA。已獲得的本發明基因或其片段也可用於探針。
依據本發明基因的核苷酸序列的信息而設計的有義引物和反義引物可用作篩選的探針。
在獲得本發明基因中，可通過PCR的DNA/RNA擴增。特別是可採用RNACE方法獲得全長的cDNA。
用於這些PCR方法中的引物可參考本發明基因的核苷酸序列信息進行合理設計，也可通過常規程序合成。
本發明基因可通過常規程序進行檢測，如PCR方法。
當選擇PCR方法用於檢測時，有待使用的引物可以是僅能導致本發明基因選擇性擴增的任何引物。
本發明PPO基因的篩選、分離、確定、克隆、核苷酸序列的確定是按下列方法進行的。
cDNA文庫篩選胎肝，胎腦，胰腺和腎臟cDNA文庫購於Clontech(Palo Alto，CA)。大腸，肺，肝，卵巢和纖維母細胞的cDNA文庫購於Stratagene.(La Jolla，CA)。設計10組引物，用來篩選cDNA文庫，通過cDNA文庫篩選，最終確定EST Hs.154797並克隆全長cDNA。精確定位PPO於1p36.13並測定DNA序列用自己所做的1p36疊連群(contig)，通過DNA印跡雜交(SouthernBlotting)雜交的方式找到BAC克隆b203I24，b140B13，b81G11，and b57B11，精確定位於1p36.13並測定DNA序列。
指出外顯子序列利用GenScan program(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)(Burge andKarlin，1997)指出外顯子及內含子序列。利用RACE方法找到5』端的序列。利用5』SMART RACE試劑盒(Clontech，Palo Alto，CA)，自腎癌細胞株ACHN找到5』端的序列。
引物如下R1，5』-AACCAACTTCTTGGATCCAGGGGA-3』.
R2，5』-TTGGAATTCAATCAAACTTGCCCACCTG-3.
細胞培養OVK18，OVK18#102(Uehara et al.，1984)，OVCAR3(Hamilton et al.，1984)，CoLoTC(Quinn et al.，1979)，Lu65(Hirohashi et al.，1989)，HT1(Tsuchiya et al.，1982)，HCT15(Dexter et al.，1979)，HEC1A(Kuramotoet al.，1972)，ACHN(Giard et al.，1973)，U251N(Hirohashi et al.，1978)，SUN5(Brattain et al.，1981)，LK-2(Yoshioka et al.，1989)和NIH/3T3(Aaronson SA et al)PK1，PK8 and PK9，(Kobari et al.，1986)，所用細胞均來自東北大學加齡醫學研究所。LNCaP(Gibas et al.，1983)，HEK 293(Graham et al.，1977)and U87(Beckma.et al.，1971)購於美國ATCC(Manassas，VA).並嚴格按照說明培養。
反轉錄PCRRNA自冷凍組織或細胞株中提取。通過翻轉錄變成cDNA後，PCR條件如下94℃ 5分，94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 30秒，40個循環。72℃ 7分。
引物如下F，5』-TTTGATTGGAGACAGCAATATG-3』。
R，5』-CTGCGATGTACCTTACAGAC-3』。
定量反轉錄PCR定量PCR機器用ABI PRISM 7000 Sequence Detection System(AppliedBiosystems，Foster City，CA).
引物如下F，5』-GCTTTTCGGAGAAGTCTAGTTCAAAG-3』.(從1117th nt到1142nd nt).
R，5』-TCTCCACGAGGTATAGGTTAATGGT-3』.(從1197th nt到1173rd nt).
探針，5』-CTTGCTTCAATCAGACCTA-3』.(從1153rd nt到1171st nt).
β2-microglobulin基因作為控制基因。
引物如下F，5』-GTGACTTTGTCACAGCCCAAGA-3』.(從373rd nt到394th nt).
R，5』-AACCTCCATGATGCTGCTTACA-3』.(從437th nt到416th nt)探針，5』-AGTTAAGTGGGATCGAGAC-3』.(從396th nt到414th nt)結果用標準曲線法測量。
質粒的構建質粒的構建分兩步，首先自KpnI位點至EcoRI位點，然後從EcoRI位點至XbaI位點，先用KpnI和EcoRI酶分別處理載體和PCR產物，再用連接酶連接。測序證明沒有突變後再大量培養，然後用EcoRI和XbaI酶分別處理載體和PCR產物，再用連接酶連接，測序證明沒有突變後再大量培養後轉染NIH/3T3細胞株並獲得穩定表達。全長3000個鹼基對。裝入表達載體為pcDNA3.1/V5His(Invitrogen，Carlsbad，CA)。
蛋白印跡雜交(Western Blotting)分析細胞培養回收後，方法詳見參考文獻(Kondo et al.，1999)，抗體V5，PCNA，Phospho-MAPK，anti-beta actin購於(Sigma，St Louis，MO)。ERK2購於(BDBioscience，Palo Alto，CA)，RAS(Oncogen，Boston，MA)，MEK1/2 andPhospho-MEK1/2購於(Cell Signaling Beverly，MA)細胞免疫染色質粒轉染NIH/3T3細胞株並獲得穩定表達細胞回收後塗片，經過PBS緩衝液的處理，V5作為一抗，1％FITC作為二抗染色，4，6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)染核。顯示該基因的蛋白質在細胞中存在的位置。
MTT分析細胞培養用96孔培養皿，每24小時檢測一次，共6天。用MTT染色，MTT購於(Sigma，St Louis，MO)，VERSA max microplate reader機器檢測溶液的透光性，機器購於日本(Molecular Devices，Tokyo，Japan)。
軟瓊脂上的集落形成能力分析用6孔板培養皿，1％軟瓊脂(DIFCO LABORATORIES，Detroit，MI)，將1×104個細胞種植於每孔中，4周後，用MTT染色檢查，看細胞的增殖情況。
通過本發明基因通過常規遺傳工程技術，可以穩定而大量地生產其表達產物或含有同樣表達產物的蛋白。
本發明蛋白及其生產方法本發明PPO蛋白的胺基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本發明蛋白還包括其任何同系物。所述同系物可以是具有相同的胺基酸序列並保留PPO活性的蛋白。
本發明蛋白的同系物包括有同衍生自人、馬、羊、犬、猿、貓和其他哺乳動物物種以及齧齒動物如大鼠、小鼠和兔的具有同SEQ IP NO2所示的胺基酸序列的具有相同活性或功能的蛋白。
從表2也可以看出，在其他生物中，存在PPO基因的同型基因，包括老鼠、果蠅、蚊子、線蟲和酵母。
本發明蛋白可通過常規重組DNA技術，依據本發明公開的PPO基因核苷酸序列信息來製備。
如構建質粒，允許在宿主細胞中編碼目的蛋白基因的表達，通過向其中轉導載體轉化宿主細胞；使所得的轉化因子生長，從培液中收集蛋白。
宿主細胞可以是任何原核細胞和真核細胞。
當原核細胞用作宿主細胞時，表達質粒的構建方法是使用宿主細胞中可複製的載體，並在本發明基因的上遊添加啟動子和SD(Shine和Dalgqrno)序列，以使該基因可在其中表述。
作為本發明基因的表達載體，可利用任何常規融合蛋白表達載體(如pcDNA3.1)。
將所述表達載體導入宿主細胞中的方法以及相關的轉化方法可採用常規方法進行。所得的轉化子可以採用常規方式培養。
如此獲得的本發明重組蛋白可通過常規技術進行分離、純化。這些技術包括重建處理、蛋白沉澱、離心、超濾、吸附層析、離子交換、親和層析和高效液相層析等等。
本發明蛋白或其片段可以作為製備特異抗體的抗原，使用該抗原可以製備出所需的多克隆抗體和單克隆抗體。
製備該抗體的方法，可採用免疫學中常規的製備方法。
該抗體可用於本發明蛋白的純化及其測定或鑑定。
本發明基因如前所述在多種癌組織中都有高於正常組織數百至數千倍的表達，因此，該抗體可用於癌症的診斷。其醫藥用途為以該抗體為活性成分用於製備癌症診斷劑或試劑盒。
本發明癌症診斷劑或試劑盒至少包括PPO基因或片段的活性成份或其互補核苷酸序列的活性成份。可任選含有其他組分，如標記介質和PCR試劑。
標記介質可以是放射性同們素或化學修飾物如黃光物質。
試劑盒可以含有適當的反應稀釋劑、標準抗體、緩衝液、反應終止液等等。
本發明PPO基因的另一個醫藥用途是以PPO基因被分離的DNA的表達產物的抗體為活性成分，與合適的藥物載體製備成癌症治療藥物製劑或稀釋劑。
本發明治療藥物製劑，可以根據不同的製劑載體製備成各種劑型(如液體製劑、固體製劑)。
製劑載體可選用藥學製劑中常用的載體，如稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、溼潤劑、崩解劑、表面活性劑、等滲劑、穩定劑(如人血清的蛋白、L-胺基酸、糖類以及纖維素衍生物)等等。
包含在藥物製劑中的本發明活性成份的含量，沒有特別的限定，一般可依據治療需要以及給藥方法、療程以及患者的年齡因素進行選擇。
就一般情況而言，常用劑量為成人每公斤體重約0.01μg～10mg/天。每日1-3次。
本發明PPO基因的又一個的醫藥用途是以PPO基因的反義核苷酸轉移載體或用其反義核苷酸轉化/轉染的細胞系作為活性成分以藥物有效量與合適的藥物載體或稀釋劑製備成藥物製劑。
該藥物製劑具有抑制PPO基因在細胞中PPO基因的翻譯和表達，從而達到抑制癌細胞的增殖。
向目的基因引入目的基因的起始載體或起源載體是本領域的公知技術。
以反義核苷酸轉移載體或用其反義核苷酸/轉化轉染的系作為活性成份所製備的藥物製劑，其活性成分的劑量不受特別的限定。
通常情況下，其劑量可根據反轉錄病錄效價每kg體重每天約1×102pfu.～1×1010pfu.。
在本說明書中，本發明的基因(DNA)分子稱為PPO或KIAA0090，由該基因編碼的蛋白成為PPO蛋白，以及次蛋白的功能活性稱為PPO蛋白活性。
基於上述研究結果所開發的本發明提供了下列主題1)包括下列多核苷酸中的一種被分離的DNA分子a)編碼由SEQ ID NO.2所示的胺基酸序列組成的多肽的多核苷酸。
b)與SEQ ID NO.1所示核苷酸序列比較具有至少95％同源性的多核苷酸。
c)在嚴格條件下能與SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列雜交的多核苷酸序列。
d)與上述a或b互補的多核苷酸。
2)如上1)所述的被分離的DNA分子，其編碼由SEQ ID NO.2所示的胺基酸序列組成的多肽的多核苷酸序列。
3)如2)所屬的被分離DNA分子，其具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
4)包含SEQ ID NO.2所示的胺基酸序列表達產物。
5)包含如上1)或3)所屬的被分離的DNA分子的重組表達載體。
6)內含如上5)所述的重組表達載體的宿主細胞為NIH/3T39。
7)一種PPO檢測用探針，其具有包含來自SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的至少15個連續核苷酸序列。
8)如7)所述的PPO檢測用探針，其具有包含來自SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的至少30個連續核苷酸序列。
9)癌症診斷劑，其包括如上7)或8)所屬的探針或引物。
10)癌症診斷試劑盒，其包括如上(7)或(8)所屬的探針或引物。
11)抗體或抗體片斷，其能與如上1)所屬的被分離的DNA分子的表達產物結合。
12)診斷癌症的方法其包括下列步驟製備生物樣製品，製備如上11)所述的抗體或其片斷，以及將上述樣品與上述抗體或片斷進行免疫反應並且檢測樣品中的免疫反應產物。
13)癌症的治療方法。其包括下列步驟製備生物樣製品，製備如上11)所述的抗體或其片斷，以及將上述樣品與上述抗體或片斷進行免疫反應以及利用RNA幹擾技術或反義基因治療手段所進行的治療方法。
14)一種序列的反義核苷酸，該序列包含來自SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的至少15個連續核苷酸。
15)如上14)所述的反義核苷酸，其反義與一種序列，該序列包含來自於SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的至少30個連續核苷酸。
16)基因治療藥物製劑，其包含如上14)或15)所述的反義核苷酸作為活性成分。
17)篩選一種或多種物質(激動劑和/或拮抗劑或幹擾劑)的方法，所述一種或多種物質如上1)所述的被分離的DNA分子的表達產物相互作用，所述方法包含下列步驟在含有待選的測試物質的培養基中對含有如上1)所述的被分離的DNA分子的宿主細胞進行培養，然後定量如上1)所述的被分離的DNA分子的表達產物。
18)用於癌症治療藥物劑，其包含有效量的如上11)所述的抗體或其片斷以及可藥用的載體或基因本身的RNA幹擾劑。
說明書中胺基酸，肽，核苷酸序列，核酸等以縮寫表示，按《核苷酸和或胺基酸序列表電子標準文件》(中華人民共和國智慧財產權行業標準ZC003-2001)的規則撰寫。
SEQ ID NO.1PPO的cDNA核苷酸序列。
SEQ ID NO.2PPO的胺基酸序列。
圖1SEQ ID NO.1所示核苷酸序列其中的EST Hs.154797在人體不同組織中的表達情況。
圖2反轉錄PCR顯示。
圖中的beta2-MG是內在控制基因。
圖3克隆的部分PPO基因的核苷酸序列。
圖4PPO基因的結構示意。
圖5A、圖5B是RNA印跡雜交結果。
從圖中可以看出該基因在不同組織中的表達情況。
圖5A中1心臟、2腦、3胎盤、4肺、6骨骼肌、7腎臟、8胰臟圖5B中1脾臟、2甲狀腺、3前列腺、4睪丸、5卵巢、6小腸、7大腸、8周圍血白細胞圖6人和鼠的功能域分析比較。
其中藍色字母代表B.cAMP-和cGMP-依賴蛋白激酶磷酸化點，紅色盒子代表C.蛋白磷酸化點，綠色盒子代表酪蛋白激酶II磷酸化點。深藍色盒子代表酪氨酸激酶磷酸化點。
圖7、圖8人的基因和其它物種比較。
圖9A-B定量PCR顯示。
圖9A定量PCR顯示，該基因在多種癌組織和細胞株中有過表達。其中1和5是正常的卵巢組織，2是卵巢細胞株VK18、3是卵巢細胞株VK18#102、4是卵巢細胞株OVCAR-3。自6-14是卵巢癌組織標本。15是正常的子宮體標本，16-19是子宮體癌，20是子宮體癌細胞株HEC1A。21是正常的腎臟組織，22是正常的細胞株293，23是腎臟癌細胞株ACHN，24-27是腎臟癌組織標本，28及29是正常的肝臟組織，30-34是肝癌組織標本，35是正常乳腺組織，36-39是乳腺癌組織標本，40是正常結腸組織，41-44是結腸癌的細胞株。45是正常胃組織，46-49是胃癌組織標本，50-51是正常腦組織，52和53是腦膠質瘤的細胞株，54是正常胰臟組織，55-57是胰臟的細胞株，58是胰臟癌組織標本，59-60是正常肺臟組織，62-63是肺臟的細胞株，64是正常前列腺標本，65是前列腺癌細胞株。
圖9B表達量的分析。
圖10細胞免疫染色顯示結果。
A表示細胞質，B表示細胞核，C表示重疊後的圖像。
圖11MTT分析。
其中A表示基因導入後的質粒轉染NIH/3T3。
B表示空白載體轉染NIH/3T3。
圖12 PPO基因與磷酸化有關的表現。
圖12A表示ERK2磷酸化蛋白在穩定表達克隆明顯增加。
圖12B表示MEK1/2磷酸化蛋白在穩定表達克隆明顯增加。
由圖12A與圖12B相比較可以看出PPO基因與磷酸化有關。
圖12C表示細胞核增殖抗原PCNA明顯增加。
圖12D表示BRAF沒有改變，RAS有過表達。
圖12E免疫沉澱表示該基因可能和RAS有關。
圖12FPPO蛋白質的長度。
圖13軟瓊脂上的集落形成能力實驗分析圖13中的A和B為正常3T3細胞在軟瓊脂上的表現。
圖13中的C和D為PPO基因導入載體的細胞在軟瓊脂上的表現。如圖所示該基因導入細胞能夠形成大的集落群。
圖13中的E和F是正常細胞和空白載體導入細胞集落群大小的比較。從圖中可以看出，集落群大小是不同的。
圖13的G是正常細胞和空白載體導入細胞集落群數量的比較，從圖中可以看出，集落群的數量也有明顯的差別。
圖13的H空白載體導入細胞不能夠形成細胞疊加現象。
圖13的I該基因導入細胞能夠形成細胞疊加現象。
這些結果表示PPO基因導入載體轉染的細胞具有癌細胞的特點。
圖14活體分析顯示圖。
圖14A顯示該基因導入後的3T3細胞能夠在老鼠身上刺激細胞生長。
圖14B顯示該基因導入後，自老鼠身上解剖下的腫瘤比較。
圖14C生長曲線圖，○連線為基因導入後轉染細胞的生長曲線，*連線為對照組的生長曲線。
從圖中可以看出，該基因導入後能夠明顯刺激細胞生長並具有致瘤性。
圖15A.定量PCR的結果。
由圖可以看出，用RNA幹擾後，PPO在2個卵巢癌細胞株中，該基因的表達量減少。
圖15.B-C.D.蛋白印跡雜交顯示結果。由圖可以看出蛋白印跡雜交顯示磷酸化和增殖指標減少。在細胞水平抑制癌細胞的生長。
圖15.B是卵巢癌細胞株OVK18。
圖15C是卵巢癌細胞株OVCAR-3，。
圖15D是PPO轉染後的3T3細胞株。蛋白印跡雜交顯示磷酸化和增殖指標均減少。
圖16.該基因在MAPK通路中的作用示意圖。由此可推測該基因可能在MAPK通路中的作用。刺激RAS過表達和MEK1/2及MAPK的磷酸化。
圖17-19.為將RNAi試劑注射於荷瘤鼠的實驗結果。
圖17A將RNAi試劑注射子荷瘤鼠及注射21天後的表現。
圖17B兩側腫瘤的比較。
圖17C生長曲線，綠色代表對照基因Lamin，左側，紅色代表PPO基因。
由圖可以看出，將RNAi試劑注射於荷瘤鼠能夠明顯抑制癌症的生長。
圖18為重複試驗條件和結果與圖17一樣。
圖19為生長曲線。
RNA幹擾在活體實驗證明能夠抑制癌症的生長。
圖20A所用載體和克隆方法示意圖。
圖20B為具體的序列，自起始子前3個核苷酸開始。
圖20C到EcoRI酶切點為前半部分。
圖20D自EcoRI酶切點開始到終止子為後半部分，終止子TAA被XbaI酶切點所替代繼續編碼V5蛋白。
圖21是PPO基因轉染的正常NIH/3T3。
圖22A用於RNA幹擾技術的RNA序列。
圖22B用於診斷試劑盒的引物和探針。
表1外顯子和內含子的連接部位符合ag-gt規則以及外顯子和內含子的長度。
表2表示在其它生物中，PPO基因的同型基因，包括老鼠、果蠅、蚊子、線蟲、和酵母。
表3表示在生物進化中最保守的胺基酸。而這些胺基酸和磷酸化有關。
具體實施例方式
實施例cDNA文庫的篩選胎肝，胎腦，胰腺和腎臟cDNA文庫購於Clontech(Palo Alto，CA)。大腸，肺，肝，卵巢和纖維母細胞的cDNA文庫購於Stratagene.(La Jolla，CA)。設計多組引物，用來篩選cDNA文庫，通過cDNA文庫篩選，最終確定EST Hs.154797並克隆全長cDNA，6022鹼基對，雙鏈螺旋結構。
如圖1所示，1個EST Hs.154797能夠在cDNA文庫中有明確的產物。其在胎腦，腎組織，肝組織及胰腺組織中有表達。在卵巢組織，大腸組織及肺臟中沒有表達。
精確定位KIAA0090於1p36.13並測定DNA序列用自己所做的1p36疊連群(contig)，通過DNA印跡雜交(Southern Blotting)雜交的方式找到BAC克隆b203I24，b140B13，b81G11，and b57B11，精確定位於1p36.13並測定DNA序列。
如圖SEQ ID NO.1所示本發明的PPO基因其DNA長度約36-kb，cDNA長度6022鹼基。
PPO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
指出外顯子序列利用GenScan program(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)(Burge andKarlin，1997)指出外顯子及內含子序列。
利用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)方法找到5』端的序列。
利用5』SMART RACE試劑盒(Clontech，Palo Alto，CA)，首先自腎癌細胞株ACHN提取RNA按SuperScript IIRT Kit(GIBCO，BRL)(Rockville，MD)操作程序合成第一鏈cDNA。合成後反應體積稀釋至120μl，1μl約含8ng總RNA，反轉錄後得到的第一鏈cDNA。RACE的反應條件如下cDNA 2μlAdaptor Pimer 0.25μl10mMdNTP 0.25μl10XPCR Buffer 1.25μl50XPolymerase Mix 0.25μlGene-specific Primer(10pmol/μl0.25μlH2O7.75μlTotal 12μl基因特異的引物如下R1，5』-AACCAACTTCTTGGATCCAGGGGA-3』.
R2，5』-TTGGAATTCAATCAAACTTGCCCACCTG-3』RACE產物直接測序，條件嚴格按照試劑盒要求操作。找到5』端的序列。
如圖3所示利用SMART RACE試劑盒，克隆了起始子和非編碼區共28個鹼基以及EST Hs.154797的一部分。自斜體字母開始是KIAA0090cDNA的一部分。
如圖4所示PPO基因含有25個外顯子，起始密碼位於第一個外顯子，終止密碼位於第23個外顯子。
外顯子和內含子的連接部位符合ag-gt規則以及外顯子和內含子的長度(見表1)。
細胞培養OVK18，OVK18#102(Uehara et al.，1984)，OVCAR3(Hamilton et al.，1984)，CoLoTC(Quinn et al.，1979)，Lu65(Hirohashi et al.，1989)，HT1(Tsuchiya et al.，1982)，HCT15(Dexter et al.，1979)，HEC1A(Kuramotoet al.，1972)，ACHN(Giard et al.，1973)，U251N(Hirohashi et al.，1978)，SUN5(Brattain et al.，1981)，LK-2(Yoshioka et al.，1989)和NIH/3T3(Aaronson SA et al)PK1，PK8 and PK9，(Kobari et al.，1986)，所用細胞均來自東北大學加齡醫學研究所。LNCaP(Gibas et al.，1983)，HEK 293(Graham et al.，1977)和U87(Beckma.et al.，1971)購於美國ATCC(Manassas，VA).並嚴格按照說明培養。
反轉錄PCR反轉錄用Trizol提取細胞和冷凍組織中的RNA，取總RNAlμg，總反應體積20μl按SuperScript IIRT Kit(GIBCO，BRL)(Rockville，MD)操作程序合成第一鏈cDNA。合成後反應體積稀釋至120μl，1μl約含8ng總RNA，反轉錄後得到的第一鏈cDNA。
PCR反應依次加入下列試劑反轉錄單鏈cDNA 1μl(稀釋後)10XPCR緩衝液1.5μl2nMdNTP 1.5μl上遊引物F 1.5μL下遊引物R 1.5μlTaq酶(promaga 0.5u/μl) 1.5μl水 6.5總體積 15μl反轉錄PCR條件如下；94℃ 5分，94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 30秒，40個循環。72℃ 7分。
引物如下F，5』-TTTGATTGGAGACAGCAATATG-3』.
R，5』-CTGCGATGTACCTTACAGAC-3』.
如圖2所示，反轉錄顯示PPO基因在卵巢癌中有過表達。
定量反轉錄PCR在反轉錄PCR的基礎上，利用同樣的cDNA作為模版，做定量PCR機器用ABI PRISM 7000 Sequence Detection System(Applied Biosystems，Foster City，CA).引物如下Forward primer，5』-GCTTTTCGGAGAAGTCTAGTTCAAAG-3』.(from 1117th nt to1142nd nt).
Reverse primer，5』-TCTCCACGAGGTATAGGTTAATGGT-3』.(from 1197th nt to1173rd nt).
Probe，5』-CTTGCTTCAATCAGACCTA-3』.(from 1153rd nt to 1171st nt).
β2-microglobulin基因作為控制基因，引物如下Forward primer，5』-GTGACTTTGTCACAGCCCAAGA-3』.(from 373rd nt to 394thnt).
Reverse primer，5』-AACCTCCATGATGCTGCTTACA-3』.(from 437th nt to 416thnt)Probe，5』-AGTTAAGTGGGATCGAGAC-3』.(from 396th nt to 414th nt)結果用標準曲線法測量。
所有試劑均購於Applied Biosystems公司並嚴格按照說明操作。具體而言，我們按照說明準備反應溶液，兩個基因的標準曲線製作，PPO和β2-microglobulin的cDNA按cDNA 5倍倍比稀釋，(8×10-2ng，1.6×10-2ng，3.2×10-3ng，6.4×10-4ng，1.28×10-4ng，2.56×10-5ng和陰性對照).每份標本準備兩分樣品，機器自動計算其平均值，人類的基因組DNA作為陰性對照。標準曲線的相關係數在0.98和0.99之間。為確保結果，相同試驗重複三次以上，求出平均值和標準曲線。
如圖9A和9B所示該基因在多種癌組織(如卵巢癌，乳腺癌，胰腺癌，結腸癌，肺癌，前列腺癌，腦癌，胃癌，肝癌，子宮癌等)和細胞株中有過表達。
質粒的構建質粒的構建分兩步，首先cDNA文庫自己製備，自腎癌細胞株ACHN中提取RNA後，反轉錄為cDNA，如上所述，利用此cDNA為模版，設計的引物分別包括KpnI位點和EcoRI位點，Forward primer，5』-CATGGTACCGCATCATGGCGGCTGAGTG-3』.
Reverse primer，5』-CAGCTCAGTGGTGAGATCCT-3』.
PCR產物經KpnI和EcoRI酶分別處理，同時，表達載體pcDNA3.1/V5His(Invitrogen，Carlsbad，CA)也經KpnI和EcoRI酶分別處理，再用連接酶連接。如圖20A、B、C、D所示。這樣，約1.5kb的cDNA被裝入載體，用DNA印跡法(Southern blotting)確認是否成功導入，並測序加以證實。並以此為新的載體，同樣，利用自己合成的cDNA為模版，設計的引物分別包括EcoRI位點和XbaI位點，Forward primer，5』-ATGAGATCAACATTGACACC-3』.
Reverse primer，5』-CCCTCTAGATCGCCAGGCCC-3』.
PCR產物經EcoRI和XbaI酶分別處理，並且新的載體也經EcoRI和XbaI酶分別處理後，再用連接酶連接。這樣約1.5kb的cDNA被裝入新的載體。共裝入pcDNA3.1/V5His載體的cDNA約3.0kb。包括所有的編碼蛋白的序列。並且擁有pcDNA3.1/V5His載體的特點，對新黴素耐藥，並且產生的蛋白可被V5單克隆抗體所識別。測序證明沒有突變後質粒轉染大腸桿菌，經LB培養後，氯化銫超速離心分離出質粒，酒精和醋酸沉澱並提純質粒，詳細方法按分子克隆(美J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis.金冬雁，黎孟楓等譯。1992年第二版，科學出版社)書中提取質粒的方法製備。測序證明沒有突變後轉染NIH/3T3細胞株並獲得穩定表達。用蛋白印跡雜交法確認穩定表達的單克隆細胞。最後，有兩株細胞被確定獲得穩定表達而做進一步的研究。
穩定表達克隆的篩選空白對照載體和基因導入新構建質粒分別轉染3對NIH/3T3細胞株培養皿，轉染方法嚴格按照LIPOFECTAMINE PLUS Reagent(Invitrogen公司)試劑盒說明。第一對培養皿用來驗證是否轉染成功。另外兩對培養皿加入新黴素篩選，耐藥株能夠生存，最後，得到30個克隆，用蛋白印跡雜交方法去驗證是否能夠表達V5抗體，只有表達V5抗體，才能證明轉染成功。最後，獲得2株穩定表達克隆。
蛋白印跡雜交(Western Blotting)蛋白印跡雜交的抗體V5，PCNA，Phospho-MAPK，anti-beta actin購於(Sigma，St Louis，MO)。ERK2購於(BD Bioscience，Palo Alto，CA)，RAS(Oncogen，Boston，MA)，MEK1/2 and Phospho-MEK1/2購於(Cell SignalingBeverly，MA)。穩定表達的細胞株經DMEM培養基，同時加入10％的小牛血清和500μg/ml G418，培養48小時後收集，細胞經PBS衝洗後溶解於3％SDS中。蛋白的濃度用BSA試劑盒(Bio-Rad，Hercules，CA).測定。具體方法參見參考文獻(Kondo et al.，1999)。製備10-20％積層膠和SDS-聚丙烯醯胺分離膠，取各組細胞漿蛋白40μg，與等體積上樣緩衝液(0.05mol Tris-HClpH6.8，2％SDS，10％beta-巰基乙醇，20％甘油，0.1％溴酚蘭)混合均勻，沸水浴5分，自然冷卻後上樣於凝膠加樣孔內，按積層膠8V/cm及分離膠15V/cm的條件進行恆壓電泳，電泳緩衝液為Tris-甘氨酸-SDS緩衝液，溴酚蘭移動至膠底部中止電泳。將蛋白轉至Clear blot membrane-P膜(ATTO，Tokyo，Japan)。膜的封閉條件按照廠家的說明，將膜置於2.5％脫脂奶粉中封閉1個小時。加入過夜4℃，用PBST(含有0.05％Tween20的PBS)洗膜3×10分，加入二抗，37℃孵育1小時，用PBST洗膜3×10分鐘，信號觀察用ECL Detection Reagent(AmershamBiosciences，Buckinghamshire，U.K.)分析用LAS 1000 Plus with a ScienceLab 99 Image Gauge(Fuji Photo Film，Minamiashigara，Japan).
細胞免疫染色質粒轉染NIH/3T3細胞株並獲得穩定表達細胞回收後塗片，經過PBS緩衝液的處理，V5作為一抗，1％FITC作為二抗染色，4，6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)染核。如圖10顯示，該基因的蛋白質位於在細胞質內。
MTT還原法(MTT assay)檢測細胞增殖將穩定表達的細胞株接種在96孔培養板內(1×104個細胞種植於每孔中)，每24小時檢測一次，共6天。用MTT染色，細胞溶解於100％酒精，搖動10分鐘使之混勻，選擇490nm波長，計算百分比加以比較。MTT購於(Sigma，St Louis，MO)，VERSA max microplate reader機器檢測溶液的透光性，機器購於日本(Molecular Devices，Tokyo，Japan)從圖11中可以看出，空載體和該基因轉染細胞株在生長速度上沒有明顯的差別。
免疫沉澱試驗Immunoprecipitation(IP)這種方法詳見(Kondo，E.，1999)，簡而言之，穩定表達的細胞株經過培養收集後，經PBS衝洗，溶解於500μl的Brij97細胞提取液緩衝液(20mM Tris-HClpH7.4，75mM NaCl，1mM EDTA，1mM Na3VO4，1％ Brij 97，1mM phenylmethylsulfonyl fluoride，20μg/ml aprotinin)(Higuchi，M.，1996).蛋白質的表達量檢測與蛋白印跡雜交(Western Blotting)相同。結果如圖12E所示，該基因可能與RAS有關。
為進一步證實PPO基因具有致瘤性，本發明人進行了軟瓊脂上的集落形成能力分析。
方法為空白對照表達載體的細胞株和PPO新構建質粒表達載體的細胞株分別種植於6孔板培養皿，1％軟瓊脂(DIFCO LABORATORIES，Detroit，MI)放入培養皿中為底層，0.5％agar/DMEM為第2層，0.3％agar/DMEM為第3層，將1×104個細胞種植於每孔中，每周更換一次培養液，4周後，用3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)染色檢查，看細胞的增殖情況。以上試驗嚴格按照廠家說明操作。
實驗結果如圖13A、B、C、D、、E、F所示。
如圖13A、B所示，其正常3T3細胞在軟瓊脂不能夠形成大的集落群。
如圖13中的C、D所示該基因導入載體的細胞能夠形成大的集落群。
從圖13中的E和F中可以看出，正常細胞和空白載體導入細胞集落群大小是不同的。
從圖13的G中可以看出正常細胞和空白載體導入細胞集落群的數量有明顯的差別。
從圖13的H中可以看出空白載體導入細胞不能夠形成細胞疊加現象。
從圖13的I中可以看出該基因導入細胞能夠形成細胞疊加現象。
以上結果表示PPO基因導入載體轉染的細胞具有癌細胞的特點。
為了證明PPO基因與MAPK通路有關，按照常規方法，進行了基因磷酸化實驗。如圖6；圖12A、B、D、E；圖15B、圖15C、圖15D；圖16所示本發明基因位於細胞質內並有多個磷酸化點，進一步研究顯示其具有磷酸化功能，能夠使MEK和ERK2磷酸化，位於MAPK通路中。
由圖6可以看出，該基因有很多磷酸化點，可能與磷酸化有關。
由圖12A可以看出，ERK2磷酸化蛋白在穩定表達克隆明顯增加。
由圖12B可以看出，MEK1/2磷酸化蛋白在穩定表達克隆明顯增加。
由圖12A.與圖12B相比較可以看出，PPO基因與磷酸化有關。
由圖12D可以看出，BRAF沒有改變，RAS有過表達。
由圖12E可以看出，免疫沉澱表示該基因可能與RAS有關。
本發明的基因可調節各種細胞或在其中的增殖，分化，腫瘤發生以及轉錄激活等(如圖12C；圖13A、B、C、D、E、F、G、H、I；圖14A、B、C所示)，該基因能夠明顯刺激細胞生長並具有致瘤性。依據這些活性，其可用於與這些活性相關的疾病如惡性腫瘤的病理學解釋，診斷和治療。
本發明的PPO基因編碼的胺基酸分子量為100kDa(如圖12F所示)。
本發明基因的全部或部分可用於生產能夠與基因表達產物(蛋白)結合的抗體或其片斷。所得的抗體或其片斷可用於診斷本發明基因參與其中的上述疾病。如圖22B所示的引物和探針可用於製備診斷盒或試劑盒。
本發明基因的反義片斷或RNA幹擾技術或其表達產物可用於控制上述疾病(如腫瘤的生長)的發作。
本說明書中，術語「PPO基因(DNA分子)」不僅包括雙鏈DNA而且包括其組成的單鏈DNA，不管是有義的還是無義的以及其片斷。因此，除非另有說明，術語「PPO基因(DNA分子)」包括含有人基因組DNA的雙鏈DNA，包括cDNA的單鏈DNA(有義鏈)，具有與有義鏈互補的序列的單鏈DNA(反義鏈)以及它們的片斷。
本發明基因可含有前導序列，編碼區，外顯子和內含子。如圖4和表1所示其含有25個外顯子，起始密碼位於第一個外顯子，終止密碼位於第23個外顯子。
本發明基因多核苷酸包括RNA和DNA。所述DNA包括cDNA，基因組DNA以及合成DNA。多肽包括其片斷，同源物和突變體。
人的基因與其它物種相比較，從進化的角度上看有些胺基酸序列非常保守(如圖7、圖8所示)。
活體分析具體如下裸鼠購於(Japan Clea，Tokyo，Japan)公司，5周齡，每隻裸鼠，左側種植空白對照表達載體的細胞株，右側種植PPO新構建質粒表達載體的細胞株，每側種植細胞5×106個，每4天測量腫瘤大小一次，共4周。該試驗共進行兩次，結果相同。老鼠餵養於東北大學醫學部附屬動物實驗中心。條件符合國際標準並且不會帶來致病性。
實驗結果如圖14A、B、C所示，該基因導入後能夠明顯刺激細胞生長並具有致瘤性。
活體實驗表明該基因與增殖及磷酸化有關。
用RNA幹擾方法，從反面得到同樣的結果如圖15A所示，用RNA幹擾後，PPO基因在2個卵巢癌細胞株中，該基因的表達量減少。蛋白印跡雜交顯示磷酸化和增殖指標減少(如圖15B、C、D所示)。將RNAi試劑注射於荷瘤鼠能夠明顯抑制癌細胞的生長(如圖17所示)。重複試驗表明，其結果相同。實驗表明用單鏈RNA幹擾劑，也可以達到部分抑制卵巢癌細胞生長的作用(如圖17所示)。
RNA幹擾(RNAi)細胞分析，方法
RNAi試劑購於Japan Bioservice(Asaka，Japan)序列如下正義RNA，5』-UAUGUUGGGAAGGUCAAGUdTdT-3』；反義RNA，5』-ACUUGACCUUCCCAACAUAdTdT-3』.
Lamin是控制基因，序列如下正義RNA，5』-CUGGACUUCCAGAAGAACAdTdT-3』；反義RNA，5』-UGUUCUUCUGGAAGUCCAGdTdT-3』.
RNA幹擾方法按照廠商提供的方法，簡而言之，等分子量的正義RNA和反義RNA經退火變性後形成雙股RNA後轉染OVK18，OVCAR-3和KIAA0090轉染3T3細胞株，轉染用oligofectamine試劑購於(Invitrogen，Carlsbad，CA)並按照廠家說明操作。培養72小時後回收細胞並進行蛋白印跡雜交和定量PCR檢查。
從圖15A、B、C、D可以看出，在細胞水平，用幹擾RNA(RNAi)的方式，阻斷該基因的表達，可以減少磷酸化和PCNA的表達。
RNA幹擾(RNAi)活體分析卵巢癌細胞株OVCAR-3，裸鼠的每側種植細胞5×106個，每3天測量腫瘤大小一次，第9天時，腫瘤大小為9mm3，然後，雙側注射RNA幹擾劑，左側為控制基因Lamin，右側為PPO基因，量為3000pmol，然後每3天測量一次，第12天，重新雙側注射RNA幹擾劑1000pmol，21天後處死老鼠，測量腫瘤的大小。
實驗結果如圖17；圖18；圖19所示。
圖17A為RNAi試劑注射於荷瘤鼠及注射21天後的表現。
圖17B兩側腫瘤的比較。
圖17C生長曲線，綠色代表對照基因Lamin，左側，紅色代表PPO基因。
由圖可以看出，將RNAi試劑注射於荷瘤鼠能夠明顯抑制癌症的生長。
圖18為重複試驗條件和結果與圖17一樣。
圖19同圖17C一樣，均為生長曲線。
以上實驗表明，用幹擾RNA(RNAi)的方式，阻斷該基因的表達，活體水平能夠抑制癌細胞的生長。
表1.PPO基因的外顯子和內含子exon size intron sequences exon sequences intron sequencesintron size1148gtggtcccgcggaggcggagCCCGCGGCGGAGTTTGATTGgtgcgtacgtgtggaacata 163842125ctgtactctttttttctcagGAGACAGCAAGGGGAGATCTgtgagtgaactgagaactgt 2890366 ctaactttcatgtctctcagTGTGGCGCCACACGGACAGGgtaagcagagtcctcccgtg 3242494 cacgatcttttcttttccagATGTGATCACACAGTGGCAGgtaggggagaaactggattt 411405129caacctgtacttgtgttcagTTTCCAGGCATCCCAGAAAGgtaaggctgcctgctcacag 512026127tttcttcttccctctcttagTGACAGCATCTGTTCAGCAGgtacaggagggtgacaggag 65967150taacgatgacttttctgtagGTTAGGGTTTCCCACTGCAGgtgagaggctgccactgctt 73118168tcctccttcttgccttccagTCTCTCGACTCTTCCCACAGgtaactgcaggcaacatggt 8515972 atgccttgcttttcccccagACTGCCCTAGGAATGAAGTGgtgagtattgagaacaacag 937310 63 tgtccttctctttctcatagCAGAAAAGTATAGTTCAAAGgtatggtgtggcactgggca 10 65511 123cgtgctgtctgtactcctagGACTCTCTGGGCCTGAGCGGgtaaggcagagcctttcttt 11 77812 97 gtcttgactgtggcttatagCTGTATATCCCAGCAGTTGGgtaagtagacctcattcaac 12 189213 120aaaaatgtttcctgtagcagGGAAGGTGGTAAAAAGGCAGgtatgaacctaagaggttgg 13 199414 200ttacttttcctttacaccagATGGCTTGCTCTCAGGCAAGgtgagtggggtttaagctcc 14 16215 150agtatttgtttatcttgcagCTTTTTGGCAGAAGGACAAGgtgaggcatccagctctgac 15 120116 162tgacagtttgctcattttagGAGTCGGGAATGAATACAAGgtactgtcttcagaggggat 16 29717 120ggctctctgggtttttcaagGTCACAGCTTGCTTCGAAAGgtaggaaggcatgtcctggc 17 339318 138cttttttgcccctgccctagGATCTCACCAGCTCTACAAGgtacatacagccagctgtct 18 374319 174ggttttctctctctctccagAGCCTGAACCGAACTGGGTGgtggtaagcggtcactacca 19 56120 211gccacctcctatccctgcagTACCAGTACTCACCTGCTGAgtgagtgactggggagcctc 20 177521 85 attcacttcctcctgtgtagTTGGACTACCAACAAAGCAGgtgagaccctcatgggcagt 21 106522 130tcccggctggtgttttgcagAGAGGAGAACCACTTGTTTGgtgagtagagcccacagctg 22 8623 1949 ttattccatctgccttccagGTTGTGGCCTCTCAAAGCAGgtgctttttttttttttgag 23 81524 908agcctgggcaacagagtgagACCCTGGCTCGTAATCCCAGctacttgggaggctgtgagg 24 91625 310aagcgaattctctgcctcagCCTCCCGAGTGGTAGACAACatcctgtgctctttcatttt
表2.PPO的同源基因speciesgenechromosomesize(aa) similarityregion ％human PPO 1p36 993mouse ha35234 9971-997 93.1DrosophiliaCG29433R915363-91544.4Anopheles agCP7856 shortgun 943378-94342.9gambiaCaenorhabditis CE27186 2 946378-94630.0elegansmelanogasteSaccharomyces Ycl045cp 3 700423-56530.9cerevisia
表3.同源基因中保守胺基酸Function domainSequenceLocation in KIAA0090Protein kinase C phosphorylation siteTEK 58-60TER 853-855TSR 858-860TKR 979-981Casein kinase II phosphorylation siteSREESLAE 443-450SSLD 824-827SAME 845-848SGLE 927-930cAMP-and cGMP-dependent protein KRSS 712-715kinase phosphorlation siteEFTVLELYEGTEQY804-817Tyrosine sulfation site VLKDDYDYVLISSV954-968
權利要求
1.一種人體基因，位於lp36.13區，其cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述。
2.一種人體基因，位於lp36.13區，其胺基酸序列如SEQ ID NO.2所述。.
3.包括權利要求1的cDNA的表達產物。
4.一種PPO基因檢測用探針，其具有包含來自SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的至少15個連續核苷酸的序列。
5.PPO基因的醫藥用途，其特徵在於以PPO基因為活性成份製備成癌症診斷劑或試劑盒。
6.PPO基因的醫藥學用途，其特徵在於以權力要求1所述的被分離的DNA的表達產物的抗體為活性成分，與合適的藥物載體製備成藥學製劑或稀釋劑。
7.PPO基因的醫藥用途，其特徵在於以PPO基因的反義核苷酸轉移載體或用其反義核苷酸轉化/轉染的細胞系作為活性成分以藥物有效量與合適的藥物載體或稀釋劑製備成藥物製劑。
全文摘要
本發明公開了一種癌症基因及其醫藥用塗。本發明人命名該基因為PPO基因，其cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述。其DNA長度約36－kb，cDNA長度6022鹼基。PPO的胺基酸序列具有編碼SEQ ID NO.2所示的993個胺基酸殘基的可讀框的基因。該基因在人類多種癌組織中(卵巢癌，乳腺癌，胰腺癌，結腸癌，肺癌，前列腺癌，腦癌，胃癌，肝癌，子宮癌等)都有過表達。活性成份可製備成癌症診斷劑或試劑盒。其表達產物的抗體為活性以及其反義核苷酸轉移載體或用其反義核苷酸轉化/轉染的細胞系作為活性成分可製備成藥學製劑。
文檔編號C07H21/04GK1704426SQ20041001230
公開日2005年12月7日 申請日期2004年5月26日 優先權日2004年5月26日
發明者劉思源, 張玉想 申請人:劉思源, 張玉想