作為基因載體的多肽樹狀大分子及其應用的製作方法

2023-11-07 00:29:02 2

專利名稱：作為基因載體的多肽樹狀大分子及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及作為基因栽體的多肽樹狀大分子及其應用，目的在於提供 一種有效地介導治療基因送遞到靶細胞中的組合物，用來有效地進行
DNA送遞的生物適合的組合物，從而導致非細胞毒性地轉染到把細胞 中，這種可用於製備裝栽治療基因的樹狀多肽大分子栽體系統，由治療基 因、樹狀多肽大分子或者具有連接有陽離子髙分子的樹狀多肽大分子組 成。樹狀多肽大分子的結構單元為天然的胺基酸，可以是單一的胺基酸， 也可以由不同的胺基酸組成.樹狀多肽大分子栽體系統，可以是藥學可 接受的鹽類化合物和癍類化合物。這種裝栽治療基因的樹狀多肽大分子栽 體系統可以治療基因缺陷所致的遺傳病、免疫缺陷或抑癌基因的失活所致 的肺瘤等疾病，
背景技術：
對疾病的預防和治療來講，基因治療是一種有效和經濟的方法。基因 治疔是將人的正常基因或有治療作用的基因通過一定方式導入人體靶細 胞以糾正基因的缺陷或者發揮治療作用，從而達到治療疾病目的的生物醫 學技術，基因治療是當代醫學和生物學一個新的研究領域。它試圖M因 水平調控細胞中的缺陷基因表i^以正常基因矯正、替代缺陷基因，達到 治療基因缺陷所致的遺傳病、免疫缺陷或抑癌基因的失活所致的腫瘤等疾 病，
高效的基因轉移和表達U因治療的關鍵技術。目前常用的基因栽體 包括病毒栽體和非病毒栽體，臨床試驗中以上利用病毒為栽體來轉運目的 基因.雖然病毒栽體具有較高的轉染效率，但同時也存在著很多難以克服 的缺點，如具有免疫原性、細胞毒性、缺少組織特異性等等.因此對非病 毒栽體的研究受到人們的重視，尋找新的高效、安全、靶向的非病毒栽體成為目前的研究熱點.
近年來，納米栽體以其轉染效率高、安全低毒、無免疫原性的特點引 M來越多關注，尤其是陽離子聚合物納米基因栽體是最有前途的非病毒
基因導入栽體系統之一，例如聚-L-賴氛酸(PLL ) ( M. A. wolfert等人， "由DNA與合成的嵌段共聚物自組裝形成的基因治療栽體的特性描述" 《人類基因治療》1996， 7, 2123-2133; AV Kabanov & VA Kabanov "於 將遣傳材料送遞到細胞中的具有聚陽離子的DNA複合體"，Bioconj. chem.l995，6:7-20)，
體或栽劑已經有報導R. Esfsndando， D. A. Tomalia ， DDT. 2001， 6:427-436; US5338532和5527524，特別是提出了樹枝狀聚合物的外表面
釋放系統的新方法.樹狀大分子應用最活躍的一個領域是作為非病毒類基 因轉染劑進行基因轉染，聚胺類樹狀大分子如PAMAM和聚丙烯亞胺 (PPI)等巳經商品化，它們與DNA分子的複合也巳有研究，在pH7.4的 生理條件下，它們具有形成聚陽離子的趨勢，因而被用於基因治療. PolyFect是商品化的體外基因轉染劑，由PAMAM樹狀大分子經部分化 學水解而得到.
多肽樹枝狀大分子是指在分子結構中包含有多肽的樹枝狀大分子，在 多肽樹枝狀大分子中，M酸或多肽作為引發核或者枝化單元，以共價鍵 形式連接在整個分子中.樹枝狀多肽大分子具有一般樹枝狀大分子的普遍 特性，同時又具有多肽的生物特性.樹枝狀多肽大分子的特性主要包括以 下幾個方面(1)具有類蛋白的球狀結構，能作為天然配體的受體；(2)多 價結構使其能同時與兩個或多個配體發生相互作用或者連接眾多的有用 基團；(3)生物相容性好，細胞毒性低；(4)水溶性好；(5)高支化度使其 不易被蛋白酶降解；(6)容易被細胞內吞，可用作治療基因的傳輸栽體.由 於這些特性，使多肽樹枝狀大分子在生物、醫藥領域有著廣泛的潛在應用，

發明內容
本發明涉及作為基因栽體的多肽樹狀大分子及其應用。這種可用於制 備裝栽治療基因的樹狀多肽大分子栽體系統，由治療基因、樹狀多肽大分 子或者具有連接有陽離子高分子的樹狀多肽大分子組成.
樹狀多肽大分子的結構單元為天然的胺基酸，可以是單一的氣基酸，
也可以由不同的4M^酸組成，樹狀多肽大分子以天然胺基酸為結構單元， 優選的為甘氨酸、賴氨酸、穀氨酸、脯氨酸等胺基酸，樹狀多肽大分子可 以有同種Ai酸單元構建，也可以由不同種的胺基酸來構建.其合成方法 和傳統樹枝狀大分子的相同，可分為發散法和收斂法兩大類.發散法是一 種直接合成的方法，從引發核開始逐步生長，不斷向外發散，形成樹枝狀 大分子.收斂法是一種間接合成的方法，先合成需要的功能基團，純化後 以特定的化學方法連接到樹狀核心上。優選的採用發散法和收斂法相結合 的合成方法，首先用發散法合成扇形的樹枝狀多肽大分子片斷，然後通過 收斂法與特定的核心鍵合，得到不同結構的球型、啞鈴型樹枝狀多肽大分 子.無論發散法還是收斂法，都可以運用固相、液相或固，液結合方法合 成方法來實現，
用於製備裝栽治療基因的樹狀多肽大分子栽體系統中栽體系統可以 由連接有陽離子大分子樹狀多肽大分子構築的納米粒組成，陽離子大分子
優選自下列化合物殼聚糖、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯亞胺等.例如樹 狀多肽大分子含有共價連接一定百分比的聚乙二醇單元，樹狀多肽大分子 與聚乙二醇單元之比可以通過改變^L^^來調整，這種合成的栽體(其 中樹狀多肽大分子中5-30 %的氨基與PEG綴合，而其餘的4UM J保
持為未取代的游離基)能夠與核酸一起形成穗定且可溶的複合體，其繼而 能夠有效地進行轉染.與單獨使用樹狀多肽大分子相比，這種接枝的PEG 部分使得核酸/栽體複合體的溶解性更好並且細胞毒性下降，
用於製備裝栽治療基因的樹狀多肽大分子栽體系統中樹狀多肽大分 子，可以是藥學可接受的鹽類化合物對於鹼性樹狀多肽大分子栽體優選 的為氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、疏酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、乙酸 鹽、三氣乙酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、枸櫞酸鹽、草酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、蘋果酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽或對甲苯磺酸鹽；對於酸性樹 狀多肽大分子栽體基於鹼金屬和鹼土金屬的陽離子，如鈉鹽、鋰鹽、鉀鹽、 鈣鹽、鎂鹽、招鹽等，以及銨、季銨和胺陽離子，其中包括但不限於銨、 四甲基銨、四乙基銨、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等以及用於 形成鹼加成鹽的其它代表性有機胺包括二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇 胺、旅喚等，
用於製備裝栽治療基因的樹狀多肽大分子栽體系統中樹狀多肽大分 子，可以是藥學可接受的酯類化合物，指可在體內水解的酯，包括在人體 內降解釋放出母體化合物或其鹽的酯，合適的酯基團包括例如衍生自藥 學上可接受的脂族羧酸或脂族族醇，尤其是鏈烷酸(醇)、鏈烯酸(醇)、 環烷酸(醇)和鏈烷二羧酸(二醇)的酯，其中優選的各烷基或烯基部分 少於6個碳原子.
用於製備裝栽治療基因的樹狀多肽大分子栽體系統中栽體與治療基 因的比例為0.5 ~20:1,
用於製備裝栽治療基因的樹狀多肽大分子栽體系統中治療基因含有 編碼遺傳標記的基因序列，所述的遺傳標記選自螢光素酶基因、p —半乳 糖普酶基因、潮審素杭性基因和新審素杭性基因以及氯黴素乙餘轉移酶基 因，選自低密度脂蛋白受體、凝固因子、腫瘤的基因抑制劑、主要組織相 容性蛋白、杭癌基因、P16 、 p53 、胸普激酶、IL2 、 IL4以及TNFa,
製備裝栽治療基因的樹狀多肽大分子栽體系統中所述治療基因含有 編碼病毒杭原的DNA序列，選自RNA 、反義RNA和核酶的RNA; 所述的核酸編碼凝集素、甘露糖受體、唾液酸粘附素或逆轉錄病毒反式激 活因於(TAT ),
細胞與裝栽治療基因的樹狀多肽大分子栽體系統在一定的條件下接 觸，其中在所述的M下所說的組合物iiX到所說的細胞中並且釋放出所 說組合物的核酸.
本發明涉及帶負電的治療基因和帶正電的樹狀多肽大分子之間形成 的栽體系統複合體，其中所述核酸和所述樹狀多肽大分子之間的關係本質 上是靜電的.所說的帶正電的裝栽治療基因栽體系統由樹狀多肽大分子或者具有連接有陽離子高分子的樹狀多肽大分子.在樹狀多肽大分子的jy^ 部分上加入陽離子大分子如聚乙二醇可以有效的防止了由栽體大分子與 核酸形成的複合體(或納米顆粒)的沉澱和聚集，從而增加了複合體的溶 解度.如與樹狀多肽大分子連接的聚乙二醇還起到了融合細胞膜與防止 核酸蛋白酶解降解的作用，從而提高了轉染率和定向效率.
本發明的樹狀多肽大分子栽體系統可以與治療基因一起形成穩定且 可溶的複合體，它可以有效地轉染哺乳動物的細胞，所述治療基因可以在 下列物質中進行選擇'.(i)基因標記，諸如螢光素酶基因、p —半乳糖 普酶基因、氯黴素乙醯轉移酶基因、對抗生素(諸如潮審素或新黴素)具
有抗性的基因；(2)用於治療目的的基因，如編碼在血膽固醇過多的情 況下(肝臟)缺陷的低密度脂蛋白受體的基因、編碼凝固因子的基因、腫 瘤的抑制基因、編碼主要組織相容性蛋白的基因、抗癌基因、RNA和反 義RNA和編碼核酶的基因；(3)具有疫苗目的的基因，如編碼病毒抗 原的基因.
本發明所涉及裝栽治療基因的樹狀多肽大分子栽體系統用於轉染的 細胞可以選自下列細胞造血細胞；肝細胞；骨骼肌細胞；皮膚細胞，如 成纖維細胞、角質細胞、樹突細胞或黑素細胞；血管壁細胞，如內皮細胞 或平滑肌細胞；呼吸道的上皮細胞；中央神經系統的細胞；癌細胞；免疫 系統的細胞，諸知淋巴細胞、巨噬細胞、NK細胞等.
裝栽治療基因的樹狀多肽大分子栽體系統用於系統治療基因缺陷所 致的遺傳病、免疫缺陷或抑癌基因的失活所致的腫瘤等疾病，尤其是相關 的肺瘤疾病.
其中所述的腫瘤性疾病選自白血病(包括急性白血病、急性淋巴白血 病、急性號細胞性白血病、成號細胞白血病、前號細胞性白血病、粒-單 核細胞型白血病、單核細胞性白血病、紅白血病、悵性白血病、慢性髄細 胞性白血病、慢性淋巴白血病)、真性紅細胞增多、淋巴瘤、何杰金病、 非何杰金病、多發性骨號瘤、特發性巨球蛋白血症、實體瘤、肉瘤和癌、 纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉
8瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因瘤、 平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、 鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭腺 癌、囊腺癌、號樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、 精原細胞瘤、胚胎癌、維爾姆斯腫瘤、子宮頸癌、子宮癌、睪丸腫瘤、肺 癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、星形細胞瘤、成神經管 細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經瘤、少 突神經膠質瘤、硬腦膜肉瘤、黑素瘤、神經母細胞瘤和視網膜神經細胞瘤 等，
具體實施例方式
下面用實施例具體說明本發明，公開和描述本發明用於基因送遞的 組合物以及方法，並不限於本文所公開的具體的結構、方法步驟和胺基酸 單體，這是因為這樣的結構、方法步驟和4Ut酸單體可以發生變化.本文 使用的術語僅僅是用於描述具體實施方案而不是進行限制，這是因為本發 明的範圍將僅僅受到所附權利要求及其等同內容的限制.
本發明涉及一種能夠與核酸形成穩定的、可溶的複合體的裝栽治療基 因的樹狀多肽大分子栽體系統及其製備方法，所述的組合物含有與聚乙二 醇等陽離子大分子單元共價連接的樹狀多肽大分子.在解離的過程中，該 栽體系統複合體能夠釋放出核酸以便轉染幾種類型的細胞，
下列實施例不應理解為任何意義上的對本發明的限制
實施例l賴氨^*#枝多肽大分子(1)的合成
賴氨酸是構建多肽樹狀大分子時使用最多的枝化單元，以二苯甲胺為
核，Boc保護的L-賴氨酸為枝化單元，DCC為偶聯劑，三氟乙酸為脫保 護刑，反覆進行偶聯-脫保護的反應.合成過程中的每一代產物都需要用 柱層析法進行分離提純，然後再進行下一代的合成，所以效率較低，但是 所得的產物的結構非常規整，理論分子量與質謙測試所得結果幾乎一致。 這種樹枝狀多肽大分子的結構非常規整，外層氨基的數量可以準確控制，具有樹枝狀大分子的典型特徵如分子結構內松外緊、分子尺寸單一、溶 液粘度小等,反應中採用的偶聯劑是含砩縮合劑HBTU和HOBt.DCC的 反應中副反應多，雜質4iU舉除去而HBTU的反應中副反應少，雜質容易 除去，因此在多肽樹狀大分子的合成中常使用BOP或HBTU等含磷縮 合刑，HOBt的加入是為了進一步減少副反應，同時減少消^J1應，由常 M^iL應可以得到一代、二代到多代的賴氨^W枝狀多肽大分子(1G-1、
2G-1.......7G-1 ),
實施例2賴氨酸基樹狀多肽大分子-聚乙二醇偶合物(l-PEG)的合
成
在氮氣保護水水浴中，各種分子量範圍的聚乙二醇0.042M溶解在0 . 5mL無水的DMF中.將溶於0.5mLNMF的IBCF ( 0.036M )逐滴添 加到上述溶液中，將該混合物在冰水浴中攪拌30分鐘，然後逐滴地加入 到含有25 mg賴氨^^樹枝狀多肽大分子lHBr )和10fiL TEA的1 mL 無水的二甲亞礬(DMSO)中，然後在室溫下再攪拌3小時.在100mL的 無水乙醚中沉澱產物，並將沉澱溶解在10mL蒸餾水中，將其在0.01M的 NaHC03溶液中透析(透析袋的MWCO為25,000 ),然後再在O，IM的 鹽酸溶液中透析，之後再在蒸餾水中透析.最後冷凍幹^it:析所得的產物. 通過力-NMR計算出nG-l-PEG中4U^的摩爾比，
nG-l-PEG的力-腿R分析
在水中進行由實施例1和2的步驟製得的l-PEG的^-NMR圖諉 中，大約3.5ppm處的峰表明該組合物中存在著PEG.通過將 PEG(-CH2CH2- ，s， 3.4-3.7ppm)峰與1側鏈(-CH2CH2CHr ，m， 1.1-1.8ppm) 峰相關聯，從NMR諮中計算出PEG的含量，通過該方法證實了由本發 明製得的四種說明性的栽體組合物中PEG含量之比如下分別為 7(5G-1-PEG)， 11(4G-1-PEG)， 20(2G國1-PEG)和30(7G-1-PEG)摩爾％ 。
實施例3 ^*^#狀多肽大分子(2)的合成
以L-穀氨酸乙酯和(Z)-L-g酸作為枝化單元，HBTU和HOBt作
為偶聯劑利用^M目法合成扇形的樹枝狀多肽大分子片斷，然後通過收斂法 與特定的核心^t合，得到不同結構的球型、啞鈴型樹枝狀多肽大分子，由常規反應可以得到一代、二代到多代的穀氨酸基樹枝狀多肽大分子
(1G-2、 2G醫2.......7G-2),
實施例4^4M^樹狀多肽大分子-聚乙二醇偶合物(2-PEG)的合成 合成過程同反應實施例2,得到1G-2-PEG、 7G-2-PEG…… 7G-2-PEG.通過iH-NMR計算出nG-2-PEG中4RJ^的摩爾比， 實施例5脯氨⑩時狀多肽大分子(3)的合成
脯氦酸由於分子中具有一個環狀結構和亞胺，使其具有獨特的空間化 學性質.脯氨酸寡聚物具有兩種不同的構象.在有機溶劑中，聚脯氨酸呈
右旋螺旋鏈結構(PPI);在水溶液中，聚脯氨酸呈左旋螺旋鏈結構(PPII)。 基於這種特性，以寡聚脯氨酸來構建多肽樹狀大分子，有望開發出一種功 能性藥物栽體.藥物可以在有機溶刑中包袞在處於PPI構像的螺旋鏈中， 而當在人體環境中，寡聚脯氨酸的構象將從PPI向PPII轉變，從而藥物 得到釋放.脯氨酸多肽樹狀大分子合成的有效策略是採用收斂固相合成 法.由常MA應可以得到一代、二代到多代的脯氨^fcW枝狀多肽大分子
(lG-3、 2G畫3.......7G-3),
實施例6穀氨^Lfc時狀多肽大分子-聚乙二醇偶合物(3-PEG)的合成 合成過程同反應實施例2,得到1G-3-PEG、 7G-3-PEG…… 7G-3-PEG,通過iH-NMR計算出nG-3-PEG中4y^的摩爾比。
實施例7樹狀多肽大分子栽體-綠色螢光蛋白基因(pEGFP )複合體 的合成
取20^L濃度的樹狀多肽大分子納米顆粒水懸液，加入6聘 pEGFP質粒DNA ，混合均勻，室溫放置30分鐘.由此可以得到nG-l-pEGFP , nG-2醫pEGFP , nG-3-pEGFP和nG-l-PEG-pEGFP ， nG國2-PEG-pEGFP, nG畫3-PEG誦pEGFP的基因栽體複合物.
將得到的DNA-納米顆粒複合物加入200^無血清培養基中，混勻， 放置60分鐘.培養基逐滴加入培M人體乳腺癌細胞的培養亞中，共同 培養4-6個小時，然後再加入完全培養基共同培養，培養20 40小時後 在螢光顯微鏡下觀察細胞的螢光，進行轉基因的檢測，同種方法可以製備樹狀多肽大分子栽體-紅色色螢光蛋白基因複合體
實施例8樹狀多肽大分子栽體-綠色螢光蛋白基因體外轉染實驗 以昆蟲細胞系Sfg為測試細胞系，細胞培養方法^Xt數生長期的細 胞，細胞匯合度達到卯％時，加入一定量的含有IO %胎牛血清的新鮮 Grace ， s昆蟲細胞培養基.^Hfc細胞團塊，分裝到培養瓶中，放置於27 T 培養箱中培養.
參照實施例6的方法分別製備一系列不同質量比的樹狀多肽大分子 栽體-質粒DNA的複合物溶液.保證每種配比中被包覆質粒DNA質量 相同.
轉染方法轉染前24小時，以lx106個細胞/毫升的密度接種於24 孔板，使細胞匯合度達到75% 每孔加入1毫升含血清的Grace ， s昆蟲 細胞培養基，轉染當天，吸去原培養基，並用細胞培養基洗滌細胞一次， 然後將100微升上述栽體/質粒DNA複合物與400微升無血清培養基 混勻，並均勻地加入每孔中，27 "C培養5-8小時，吸去原培養基後加入 1毫升含血清的Grace ， s昆蟲細胞培養基培養6-9天，然後用雷射共聚 焦顯微鏡觀察並拍照.轉染效率結果顯示，各種分子量的基因栽體，綠色 螢光蛋白基因表達的效率均髙於紅色螢光蛋白基因.對比發現，轉染效率 最高的為nG-2和nG-3-PEG樣品，超過50 %.通過優化這些栽體的分 子量，其轉染效率有望進一步提高
實施例9樹狀多肽大分子栽體-pSVl-p-gal基因栽體系統複合物的合
成
不同數量的樹狀多肽大分子栽體(O.l-lO嗎)添加到2嗎的質拉 DNA中，並在室溫下培養30分鐘.將凝膠電泳樣品緩衝液加入到每個 樣品中，然後採用電泳系統在100V下通過在1 % ( w/v )瓊脂糖凝膠上 電泳卯分鐘來分離樣品.使用TBE(45mMTris-硼酸鹽，lmMEDTA， pH 8.0)緩衝液作為電泳緩衝液.用澳化乙錠(1嗎/ mL )對皿染色 30分鐘並用紫外發光器照明以顯示DNA的位置，採用由EcoRI消化的 入DNA ( Promega )作為DNA大小的標記物，由此可以得到nG-l畫 pSVl畫p-gal， nG國2-pSVl-p-gal， nG-3-pSVl-P-gal和nG畫l-PEG-pSVl-p畫
12gal， nG-2-PEG畫pSVl-P-gal， nG-3-PEG-pSVl-P畫gal的基因栽體複合物.
實施例9樹狀多肽大分子栽體-pSVl-p-gal的轉染
採用Hep G2細胞系評價樹狀多肽大分子栽體-pSVl-P-gal的體外轉 染率，在37T下，在5。/oC02培養箱中，在lmM丙酮酸鈉和10。/。FBs 的MEM培養基中維持細胞，使用不含FBs的細胞培養基作為混合培養 基.體外轉染通常進行如下，將H印GZ細胞以20xlO"個細胞/mL的密 度接種在96孔平底微量測定平板中，並且在加入質粒DNA /栽體複合 體或者單加入栽體之前培養24小時.通過在100^不含FBS的細胞培 養基中混合l嗎的pSVl-卩-gal和不同數量的栽體來製備樹狀多肽大分子 栽體-pSVl-P-gal複合體.並在室溫下培養30分鐘.分別以10 % ( v / v ) 和100 的最終濃度添加FBs和氯奎.用IOOjiL的轉染混合物替換 96孔平板中每個孔中的培養基.然後在37 r下在5 % C02培養箱中培 養細胞4小時.4個小時後，除去轉染混合物並向每個孔中加入100pL含 有10。/。FBS的新鮮培養基.在37C下再培養細胞48小時.通過測量 由pSVl-P-gal引入細胞中的P-半乳糖普酶的活性來測定轉染率.
實施例10樹狀多肽大分子栽體-pSVl-p-gal細胞毒性
樹狀多肽大分子栽體-pSVl-p-gal轉染H叩G2細胞系，以96孔板 中每個孔3嗎的濃度(細胞培養基中為30嗎/mL)測試不同的基因栽 體.在37 "下4先基因栽體與細胞一起培養4小時，然後測定細胞的存 活，結果顯示出針對H印G2細胞的合成栽體的細胞毒性.在有30呢/ mL 基因栽體存在的情況下培養Hep G2細胞4小時.對樹狀多肽大分子栽 體-pSVl-P-gal而言，在Hep G2細胞中沒有觀察到細胞毒性，而樹狀多 肽大分子則呈現出中等至高度的細胞毒性.PEG取代比例的不同並未在
細胞生存力方面帶來顯著的變化.這可以得到相差顯m測的進一步支
持，即把樹狀多肽大分子栽體-pSVl-p-gal與Hep G2細胞一同培養並未 給細胞的生存力帶來任何顯著的影響.將樹狀多肽大分子栽體與細胞一起 培養4小時改變了細胞的形態，但是在相同的濃度和培養時間下樹狀多 肽大分子栽體-pSVl-P-gal並未顯著地改變細胞的形態.
權利要求
1. 一種可用於製備裝載治療基因的樹狀多肽大分子載體系統，其特徵在於由治療基因、樹狀多肽大分子或者具有連接有陽離子高分子的樹狀多肽大分子組成。
2. 按權利要求1所述裝栽治療基因的樹狀多肽大分子栽體系統，其特 徵在於所述栽體系統可以由樹狀多肽大分子納米粒組成，其結構單元為天 然的胺基酸，可以是單一的胺基酸，也可以由不同的胺基酸組成，其中氛基酸優選自下列化合物賴氨酸、穀氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸等;所述 樹狀多肽大分子為l-7代化合物，
3. 按權利要求1所述裝栽治療基因的樹狀多肽大分子栽體系統，其特 徵在於所述栽體系統可以由連接有陽離子大分子樹狀多肽大分子構築的 納米粒組成，陽離子大分子優選自下列化合物殼彩瞎、聚乙二醇、聚乙 烯亞胺等.
4. 權利要求1至權利要求4中任一權利要求的樹狀多肽大分子栽體 系統，可以是藥學可接受的鹽類化合物和酯類化合物鹽類化合物是對於 鹼性樹狀多肽大分子栽體優選的為氣化物、氯化物、溴化物、碘化物、硫 酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、三氣乙酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、枸 櫞酸鹽、草酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、蘋果酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽 或對甲笨承酸鹽；對於酸性樹狀多肽大分子栽體基於鹼金屬和鹼土金屬的陽離子，如鈉鹽、鋰鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽、鋁鹽等，以及銨、季銨和胺 陽離子，其中包括但不限於銨、四甲基銨、四乙基銨、甲胺、二甲胺、 三甲胺、三乙胺、乙胺等以及用於形成鹼加成鹽的其它代表性有機胺包括 二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、旅喚；酯類化合物，指可在體內水 解的酯，包括在人體內降解釋放出母體化合物或其鹽的醋，合適的酯基團 包括例如衍生自藥學上可接受的脂族羧酸或脂族族醇，尤其是鏈烷酸 (醇)、鏈烯酸(醇)、環烷酸(醇)和鏈烷二羧酸(二醇)的醋，其中 優選的各烷基或烯基部分少於6個碳原子。
5. 權利要求1至權利要求5中任一權利要求的樹狀多肽大分子栽體系統，其特徵在於所述栽體與治療基因的比例為0.5~20:1.
6. 權利要求1至權利要求5中任一權利要求的樹狀多肽大分子栽體 系統，其特徵在於所迷栽體與治療基因含有編碼遺傳標記的基因序列，所 述的遺傳標記選自勞光素酶基因、p —半乳糖普酶基因、潮黴素杭性基因 和新黴素杭性基因以及氟審素乙敏轉移酶基因，選自低密度脂蛋白受體、 凝固因子、腫瘤的基因抑制劑、主要組織相容性蛋白、杭癌基因、P16 、 p53 、胸普激酶、IL2 、 IL4以及TNFou
7. 權利要求1至權利要求5中任一權利要求的樹狀多肽大分子栽體 系統，其特徵在於所述治療基因含有編碼病毒杭原的DNA序列，選自 RNA 、反義RNA和核酶的RNA;所述的核酸編碼凝集素、甘露糖受體、 唾液酸粘附素或逆轉錄病毒反式激活因於(TAT )。
8. —種轉染細胞的方法，所述的方法包括使所說的細胞與1至權利要 求5中任一權利要求的樹狀多肽大分子栽體系統在一定的條件下接觸，組合物的核酸，
9. 權利要求1至權利要求5中任一權利要求的樹狀多肽大分子栽體 系統，其特徵在於所迷栽體系統治療基因缺陷所致的遺傳病、免疫缺陷或 抑癌基因的失活所致的腫瘤等疾病，尤其是相關的腫瘤疾病，例如白血病、 結腸癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌等，
全文摘要
本發明涉及作為基因載體的多肽樹狀大分子及其應用。這種可用於製備裝載治療基因的樹狀多肽大分子載體系統，由治療基因、樹狀多肽大分子或者具有連接有陽離子高分子的樹狀多肽大分子組成。樹狀多肽大分子的結構單元為天然的胺基酸，可以是單一的胺基酸，也可以由不同的胺基酸組成。樹狀多肽大分子載體系統，可以是藥學可接受的鹽類化合物和酯類化合物。這種裝載治療基因的樹狀多肽大分子載體系統可以治療基因缺陷所致的遺傳病、免疫缺陷或抑癌基因的失活所致的腫瘤等疾病。
文檔編號A61K47/48GK101461947SQ200810171638
公開日2009年6月24日 申請日期2008年10月23日 優先權日2008年10月23日
發明者湖 劉 申請人:湖 劉