茄子游離小孢子愈傷組織誘導及植株再生方法
2023-11-07 01:21:27
專利名稱：茄子游離小孢子愈傷組織誘導及植株再生方法
技術領域：
本發明涉及一種植物培育方法，特別是涉及一種茄子的單倍體育種方法。
背景技術：
目前，在茄子育種工作中，自交系的選育是非常重要的工作，但往往存在再生周期長 等問題。單倍體育種是解決這一問題的重要的育種方法之一，可以大大提高育種選擇的效 率，縮小育種群體的規模，並縮短育種年限。單倍體在遺傳與育種的應用和意義 一加速 遺傳性純化、縮短育種年限；二可以從配子水平鑑別遺傳分離類型，提高選擇效率；三可 以有效地利用微生物遺傳技術於高等植物；四利用花粉愈傷組織或植物組織的倍數性化， 誘導產生倍數性植物；五提高遠緣雜交在育種上的利用，克服遠緣雜交的不親和性，克服 遠緣雜交種的不孕性；六是遺傳研究的良好實驗材料；七突變體的篩選；八遺傳轉化的受 體材料等。
從分子生物學角度看，獲得單倍體的重要意義還在於通過利用花葯(粉)培養誘導的 單倍體經染色體加倍後得到高純度的純合雙單倍體，由其所建立起來雙單倍體群體(DH), 在遺傳上是純合的基因組，DH群體是比較理想的分子標記作圖群體之一，是RFLP、 AFLP、 RAPD、 SSR等分子標記和基因圖譜的理想材料，可避免二倍體來自雙親的兩條染色體在DNA
鹼基序列的細微差別，從而大大提高基因定位標圖的準確性。
花葯培養與小孢子培養是獲得單倍體的有效的方法。但目前在花葯培養中仍存在著很
多問題需要解決，由於花葯各部分組織的幹擾，培育產物可能不是由花粉而來的，致使產 生不同倍性的體細胞混雜體。
發明內容
本發明所解決的技術問題是提供一種茄子游離小孢子愈傷組織誘導及植株再生方法， 本方法得到單倍體的機率高、小孢子愈傷組織發生頻率高，不僅是茄子單倍體育種技術上 的突破，而且該游離小孢子培養胚狀體誘導體系還可能成為進行植物細胞分化、發育研究， 分子標記和基因圖譜的良好實驗體系。
一種茄子游離小孢子愈傷組織誘導及植株再生方法，主要步驟是選取合適的花葯進行 預培養，然後進行小孢子的游離和收集，然後在液體培養基中進行靜止淺層暗培養，20 30d後陸續出現愈傷組織，愈傷組織出現後於光照下培養，當愈傷組織塊徑長到2 6咖時，
將愈傷組織轉到固體再生培養基上繼續培養，30 45d愈傷組織上開始分化出芽點，當芽點 長到1 3 cm時轉到生根培養基，10 15d後長出健壯的根。
本發明茄子游離小孢子愈傷組織誘導及植株再生方法，其中所述選取花葯步驟選取在 自然條件下生長健壯植株上的盛花期即對茄、四門鬥時期的花蕾。
本發明茄子游離小孢子愈傷組織誘導及植株再生方法，其中所述花葯的預培養包括如 下步驟
d) 消毒花蕾；
e) 接種在超淨工作檯上，從滅好菌的花蕾中輕輕剝取花葯接種於裝有預培養基i的 培養皿中，每培養皿接2 3個花蕾的花葯，每培養皿裝有8 10mL培養基；
f) 熱激處理將接種好的花葯放到暗培養箱內進行熱激處理，熱激溫度為30 36'C， 處理時間為4 8d;
其中所述的預培養基i如下MS培養基、和0. 05 0. 5mg 'L—12, 4-D、和0. 5 2mg *L—'KT、 和6 10mg'L—'Vc、和2 4%蔗糖、和5 10g L—'瓊脂，培養基pH值為5. 5~7，採用高壓 滅菌121。C下滅菌15 20min。
本發明茄子游離小孢子愈傷組織誘導及植株再生方法，其中所述小孢子的游離和收集 包括如下步驟-
d) 用無菌的鑷子從預培養過的花葯中選取無汙染、無褐化且膨大的花葯放到一無菌的 培養皿中；
e) 將洗滌培養基ii加入上面的培養皿中，用無菌的手術刀切開花葯並擠壓，以使小孢 子從花葯中游離到洗滌培養基ii中；
f) 將上述含有小孢子的洗滌培養基ii經200目尼龍篩網過濾，收集濾液於500rpm離心 1 10min，去掉上清，沉澱再離心，重複3次；
其中所述的洗滌培養基ii如下MS培養基和2 3%蔗糖，pH值為5.5 7，採用高 壓滅菌115 121。C下滅菌15 20min。 本發明茄子游離小孢子愈傷組織誘導及植株再生方法，其中所述游離小孢子的培養包 括如下步驟
c) 離心後的小孢子用液體培養基iii稀釋至小孢子密度2 4X105個 mL—1 ，分裝到無菌 培養皿中，每皿3 5mL，用Parafilm封口；
d) 將培養皿放進培養盒內，在25 28'C下，進行靜止淺層暗培養至愈傷組織出現，15 20d後換一次新鮮的液體培養基iii， 20 30d後陸續出現愈傷組織，愈傷組織出現後
拿到光照強度1500 2000Lx、光照12 16h d—'下培養； 其中所述的液體培養基iii可以是如下的培養基中的任一種
a. KM培養基、和0. 05 0. 5mg I/1 2， 4 D、和0. 1 0. 5mg L-1KT、和0. 5 2mg L,AA、 和100 300mg L，EG、和5 7%葡萄糖；
b. KM培養基、和0. 5 2mg L—'歸、和l 3mg L_1KT、和150 300mg L-1PEG、和5 10% 葡萄糖；
液體培養基iii用0. 22Pm —次性濾器過濾滅菌。
本發明茄子游離小孢子愈傷組織誘導及植株再生方法，其中所述愈傷組織的再生包括 如下步驟當愈傷組織塊徑長到2 6mm時，將愈傷組織轉到固體再生培養基iv中，15 20d 繼代一次，30 45d愈傷組織上開始分化出芽點；
其中所述的再生培養基iv如下MS培養基、和0 0. 2mg 'L—'NAA、和0. 5 5mg *L—'6-BA 、 和1 5%蔗糖、和5 10g L-'瓊脂。
本發明茄子游離小孢子愈傷組織誘導及植株再生方法，其中所述再生植株的生根包括 如下步驟當芽點長到1 3cm時轉到生根培養基v, 10 15d後長出健壯的根；其中所述 的生根培養基v如下1/2 MS培養基、和0. 05 0. 5mg 'L—'IBA、和1 5%蔗糖、和5 10g '1/1 瓊脂。
本發明茄子游離小孢子愈傷組織誘導及植株再生方法，其中所述花葯的選取最好是通 過鏡檢觀察小孢子的發育時期，選取單核中期和靠邊期的小孢子，對應的花蕾外部特徵為 花冠低於花萼l 2mm至花冠高於花萼l 2mm,萼片即將開裂前後，花葯為黃綠色。
本發明茄子游離小孢子愈傷組織誘導及植株再生方法，其中所述花蕾消毒步驟採用 70 75%的酒精進行花蕾表面消毒，消毒時間l 3min，然後用5. 0 8. 0%的次氯酸鈉浸泡 5 40min，最後用無菌水洗滌3次，每次1 10min，用無菌紙吸乾備用。
本發明茄子游離小孢子愈傷組織誘導及植株再生方法中的小孢子培養可以克服花葯培 養的缺陷，小孢子培養與花葯培養相比有如下幾點優點 一、可以排除花葯壁、花葯隔等 體細胞組織的影響，消除了藥壁和其他相關組織不能控制的影響，並且能夠較好地調節支 配雄核發育的各種因素；二、培養中不存在花粉競爭問題，可以提高得到單倍體的機率； 三、小孢子培養能在更大的基因型範圍內以更高頻率誘導小孢子愈傷組織發生；四可以觀 察到單個細胞開始雄核發育的全過程；五由於小孢子能均勻地接觸化學的和物理的誘變因 素，因此小孢子也是研究吸收、轉化和誘變的理想材料；總之，在單倍體誘導和遺傳育種 研究效率上，顯示出比花葯培養高得多的潛力。
隨著科學技術的發展，小孢子培養應用範圍日趨廣泛(1)在基礎科學中通過對小孢 子在培養過程中脫分化，再分化及細胞內的相應生理生化變化的研究，對實驗胚胎學、生 理學和分子生物學中基因表達和調控機理的研究都有很大幫助。(2)由於小孢子數量大，
單個狀態體積小且形態均一，因而便於在人工控制條件下研究其生長、分化和遺傳轉化過 程，例如人工誘變花粉、染色體功能鑑定等。(3)小孢子植株隱性性狀容易表現，因而植 株類型多樣，同時可以得到純合的單倍體、雙單倍體以及異源附加系和代換系，提供了多 種遺傳分析材料，加速了育種進程。(4)小孢子為單細胞，具有天然的分散性，數量巨大，
易於獲得，所以小孢子培養具有與單細胞微生物系統相似的所有優勢，加上小孢子胚胎髮
生和植株再生能力強，因而能用於胚胎的克隆和新基因型或突變體的大量快速繁殖。(5) 從分子生物學角度看，單倍體的重要意義還在於通過此法所建立起來的雙單倍體群體
(doubled haploid progenies),因為DH群體在遺傳上是純合的基因組，所以是AFLP、 RAPD、 SSR等分子標記和基因圖譜的理想材料，可避免二倍體由於來自雙親的兩條染色體在 DNA鹼基分子鹼基序列的細微差異，從而大大提高基因定位標圖的準確性。
具體實施例方式
實施例1:
一種茄子游離小孢子愈傷組織誘導及植株再生方法，包括如下步驟
(1) 選取花葯選取在自然條件下生長健壯植株上的盛花期即對茄、四門鬥的花蕾，通過 鏡檢觀察小孢子的發育時期，選取單核中期和靠邊期的小孢子，對應的花蕾外部特徵為花
冠低於花萼l 2iM至花冠高於花萼l 2mm,萼片即將開裂前後，花葯為黃綠色。
(2) 花葯的預培養包括如下步驟
a) 消毒花蕾採用70 75%的酒精進行花蕾表面消毒，消毒時間2min，然後用6. 5% 的次氯酸鈉浸泡10 15min，最後用無菌水洗滌3次，每次5min，用無菌紙吸乾備 用；
b) 接種在超淨工作檯上，從消好菌的花蕾中輕輕剝取花葯接種於裝有預培養基i的 培養皿(O60mm)中，每培養皿接2個花蕾的花葯，每培養皿裝有8 10mL培養基；
c) 熱激處理將接種好的花葯放到暗培養箱內進行熱激處理，熱激溫度為32'C，處理 時間為8d (天)；
(3) 小孢子的游離和收集包括如下步驟
a)用無菌的鑷子從預培養過的花葯中選取無汙染、無褐化且膨大的花葯放到一無菌的 培養皿中；
b) 將洗滌培養基ii加入上面的培養皿中，用無菌的手術刀切開花葯並擠壓，以使小孢 子從花葯中游離到洗滌培養基ii中；
c) 將上述含有小孢子的洗滌培養基ii經200目尼龍篩網過濾，收集濾液於500rpm離心 5min，去掉上清，沉澱再離心，重複3次；
(4) 游離小孢子的培養包括如下步驟
a) 離心後的小孢子用液體培養基iii稀釋至所需濃度(用血球計數板計數)，小孢子密度 3X15個 ml/1,分裝到無菌培養皿(060咖)中，每皿5mL，用Parafilm封口；
b) 將培養皿放進培養盒內，在25 28'C下，進行靜止淺層暗培養至愈傷組織出現，每 15d左右換一次新鮮的液體培養基iii， 30d後陸續出現愈傷組織，愈傷組織出現後拿 到光照強度2000Lx、光照16h cT下培養；
(5) 愈傷組織的再生當愈傷組織塊徑長到3 5 mm時，將愈傷組織轉到固體再生培養基 iv中，20d繼代一次，45d愈傷組織上開始分化出芽點；
(6) 再生植株的生根當芽點長到2 3cm時轉到生根培養基v， 10d後長出健壯的根； 其中所述的培養基如下
預培養基i : MS+0. 5mg L-12, 4-D+2mg 匚'KT+10mg L—'Vc+4M蔗糖+10g L 1瓊脂，培養基 pH值為6.4，採用高壓滅菌12rC下滅菌15 20min;
洗滌培養基ii: MS+2呢蔗糖，pH值為6.4，採用高壓滅菌115 121'C下滅菌15 20min; 液體培養基iii:
a. KM+0. 5mg L-12, 4-D+0. 5mg , !/'KT+2rag L,AA+300mg L—'PEG +7%葡萄糖；
b. KM+2mg L_1NAA+3mg L-1KT +300mg L—'PEG +10%葡萄糖; 液體培養基iii用0. 22Mm —次性濾器過濾滅菌；
再生培養基iv: MS+O. 2mg L—'NAA+5mg l/'6-BA+5M蔗糖+10g IZ'瓊脂； 生根培養基v : 1/2MS+0. 5mg 1/'IBA+5y。蔗糖+10g 1/'瓊脂。 實施例2:
一種茄子游離小孢子愈傷組織誘導及植株再生方法，包括如下步驟
(1) 選取花葯選取在自然條件下生長健壯植株上的盛花期即對茄、四門鬥的花蕾，通過
鏡檢觀察小孢子的發育時期，選取單核中期和靠邊期的小孢子，對應的花蕾外部特徵為花 冠低於花萼l 2咖至花冠高於花萼l 2mm，萼片即將開裂前後，花葯為黃綠色。
(2) 花葯的預培養包括如下步驟
d) 消毒花蕾採用70 75%的酒精進行花蕾表面消毒，消毒時間2min，然後用6. 5% 的次氯酸鈉浸泡10 15min，最後用無菌水洗滌3次，每次5min，用無菌紙吸乾備 用；
e) 接種在超淨工作檯上，從消好菌的花蕾中輕輕剝取花葯接種於裝有預培養基i的 培養皿(C>60ram)中，每培養皿接3個花蕾的花葯，每培養皿裝有8 10mL培養基；
f) 熱激處理將接種好的花葯放到暗培養箱內進行熱激處理，熱激溫度為35'C，處理 時間為8d (天)左右；
(3) 小孢子的游離和收集包括如下步驟
d) 用無菌的鑷子從預培養過的花葯中選取無汙染、無褐化且膨大的花葯放到一無菌的 培養皿中；
e) 將洗滌培養基ii加入上面的培養皿中，用無菌的手術刀切開花葯並擠壓，以使小孢 子從花葯中游離到洗滌培養基ii中；
f) 將上述含有小孢子的洗滌培養基ii經200目尼龍篩網過濾，收集濾液於500rpm離心 5min，去掉上清，沉澱再離心，重複3次；
(4) 游離小孢子的培養包括如下步驟
c) 離心後的小孢子用液體培養基iii稀釋至所需濃度(用血球計數板計數)，小孢子密度 2X15個 mL—'，分裝到無菌培養皿(0>60,)中，每皿5mL，用Parafilm封口；
d) 將培養皿放進培養盒內，在25 28'C下，進行靜止淺層暗培養至愈傷組織出現，每 15d左右換一次新鮮的液體培養基iii, 30d左右陸續出現愈傷組織，愈傷組織出現後 拿到光照強度1500Lx、光照12h.cT下培養；
(5) 愈傷組織的再生當愈傷組織塊徑長到3 5 mm時，將愈傷組織轉到固體再生培養基 iv中，20d左右繼代一次，45d左右愈傷組織上開始分化出芽點；
(6) 再生植株的生根當芽點長到2 3cm時轉到生根培養基v， 10d左右長出健壯的根； 其中所述的培養基如下-
預培養基i : MS+0. 05mg L_12， 4-D+0. 5mg L—KT+6mg L—Vc+2y。蔗糖+5g L '瓊脂，培養基 pH值為5.5，採用高壓滅菌12rC下滅菌15 20min;
洗滌培養基ii: MS+2M蔗糖，pH值為5.5，採用高壓滅菌115 121。C下滅菌15 20min; 液體培養基iii:
a. KM+0. 05mg L-12, 4-D+0. lmg L—'KT+O. 5mg L"磁+100mg L'PEG +5%葡萄糖;
b. KM+0. 5mg L墨'隱+lmg L—'KT +150mg L—屮EG +5%葡萄糖; 液體培養基iii用0. 22m —次性濾器過濾滅菌；
再生培養基iv: MS+0. 5mg U16-BA+W蔗糖+5g L—'瓊脂； 生根培養基v : 1/2MS+0. 05mg L—'IBA+l呢蔗糖+5g L—'瓊脂。 實施例3:
一種茄子游離小孢子愈傷組織誘導及植株再生方法，包括如下步驟
(1) 選取花葯選取在自然條件下生長健壯植株上的盛花期即對茄、四門鬥的花蕾，通過
鏡檢觀察小孢子的發育時期，選取單核中期和靠邊期的小孢子，對應的花蕾外部特徵為花
冠低於花萼l 2mm至花冠高於花萼l 2皿，萼片即將開裂前後，花葯為黃綠色。
(2) 花葯的預培養包括如下步驟
g) 消毒花蕾採用70 75%的酒精進行花蕾表面消毒，消毒時間2min，然後用6. 5% 的次氯酸鈉浸泡10 15min，最後用無菌水洗滌3次，每次5min，用無菌紙吸乾備
用；
h) 接種在超淨工作檯上，從消好菌的花蕾中輕輕剝取花葯接種於裝有預培養基i的 培養皿(O60M1)中，每培養皿接2個花蕾的花葯，每培養皿裝有8 10mL培養基；
i) 熱激處理將接種好的花葯放到暗培養箱內進行熱激處理，熱激溫度為36'C，處理
時間為6d (天)；
(3) 小孢子的游離和收集包括如下步驟
g) 用無菌的鑷子從預培養過的花葯中選取無汙染、無褐化且膨大的花葯放到一無菌的 培養皿中；
h) 將洗滌培養基ii加入上面的培養皿中，用無菌的手術刀切開花葯並擠壓，以使小孢
子從花葯中游離到洗滌培養基ii中；
i) 將上述含有小孢子的洗滌培養基ii經200目尼龍篩網過濾，收集濾液於500rpm離心 5min,去掉上清，沉澱再離心，重複3次；
(4) 游離小孢子的培養包括如下步驟
e) 離心後的小孢子用液體培養基iii稀釋至所需濃度(用血球計數板計數)，小孢子密度 4X15個 mL、分裝到無菌培養皿(060順)中，每皿5mL，用Parafilm封口；
f) 將培養皿放進培養盒內，在25 28'C下，進行靜止淺層暗培養至愈傷組織出現，每 20d左右換一次新鮮的液體培養基iii, 30d後陸續出現愈傷組織，愈傷組織出現後拿 到光照強度2000Lx、光照16h'cT下培養；
(5) 愈傷組織的再生當愈傷組織塊徑長到3 5 rran時，將愈傷組織轉到固體再生培養基 iv中，20d左右繼代一次，45d左右愈傷組織上開始分化出芽點；
(6)再生植株的生根當芽點長到2 3cm時轉到生根培養基v， 10d後長出健壯的根；
其中所述的培養基如下
預培養基i : MS+0. 2mg L-'2, 4-D+lmg L 'KT+8mg L—'Vc+3免蔗糖+7g L '瓊脂，培養基pH 值為5.8，採用高壓滅菌121'C下滅菌15 20min;
洗滌培養基ii: MS+3M蔗糖，pH值為5.8，採用高壓滅菌115 121。C下滅菌15 20min; 液體培養基iii:
a. KM+0. 2mg L—12， 4-D+0. 5mg L—'KT+lmg L—'NAA+250mg L—'PEG +6. 5%葡萄糖；
b. KM+lmg L-1NAA+2mg l/'KT +250mg L—'PEG +6. 5%葡萄糖； 液體培養基iii用0. 22Mm —次性濾器過濾滅菌；
再生培養基iv: MS+O. Olmg L—'NAA+2mg L—16-BA+2")4蔗糖+7g L—'瓊脂； 生根培養基v : 1/2 MS+O. 2mg LlBA+2M蔗糖+7g L^瓊脂。
以上所述的實施例僅僅是對本發明的優選實施方式進行描述，並非對本發明的構思和 範圍進行限定，在不脫離本發明涉及方案前提下，本領域技術人員對本發明的技術方案作 出的各種顯而易見的變型和改進，均應落入本發明的保護範圍，本發明請求保護的技術內 容，已經全部記載在權利要求書中。
權利要求
1.一種茄子游離小孢子愈傷組織誘導及植株再生方法，其特徵在於選取合適的花葯進行預培養，然後進行小孢子的游離和收集，然後在液體培養基中進行靜止淺層暗培養，20～30d後陸續出現愈傷組織，愈傷組織出現後於光照下培養，當愈傷組織塊徑長到2～6mm時，將愈傷組織轉到固體再生培養基上繼續培養，30～45d愈傷組織上開始分化出芽點，當芽點長到1～3cm時轉到生根培養基，10～15d後長出健壯的根。
2. 根據權利要求1所述的茄子游離小孢子愈傷組織誘導及植株再生方法，其特徵在於所 述選取花葯步驟選取在自然條件下生長健壯植株上的盛花期即對茄、四門鬥時期的花蕾。
3. 根據權利要求2所述的茄子游離小孢子愈傷組織誘導及植株再生方法，其特徵在於所 述花葯的預培養包括如下步驟-a) 消毒花蕾；b) 接種在超淨工作檯上，從滅好菌的花蕾中輕輕剝取花葯接種於裝有預培養基i的培養皿中，每培養皿接2 3個花蕾的花葯，每培養皿裝有8 10mL培養基；c) 熱激處理將接種好的花葯放到暗培養箱內進行熱激處理，熱激溫度為30 36'C， 處理時間為4 8d;其中所述的預培養基i如下MS培養基、和0. 05~0. 5mg *L—'2, 4-D、和0. 5 2mg *L—'KT、 和6 10mg L/'Vc、和2 4%蔗糖、和5 10g L—'瓊脂，培養基pH值為5. 5 7,採用高壓 滅菌121。C下滅菌15 20min。
4. 根據權利要求3所述的茄子游離小孢子愈傷組織誘導及植株再生方法，其特徵在於所 述小孢子的游離和收集包括如下步驟a) 用無菌的鑷子從預培養過的花葯中選取無汙染、無褐化且膨大的花葯放到一無菌的 培養皿中；b) 將洗漆培養基ii加入上面的培養皿中，用無菌的手術刀切開花葯並擠壓，以使小孢 子從花葯中游離到洗滌培養基ii中；c) 將上述含有小孢子的洗滌培養基ii經200目尼龍篩網過濾，收集濾液於500rpm離心 1 10min，去掉上清，沉澱再離心，重複3次；其中所述的洗滌培養基ii如下MS培養基和2 3%蔗糖，pH值為5.5 7，採用高 壓滅菌115 121。C下滅菌15 20min。
5. 根據權利要求4所述的茄子游離小孢子愈傷組織誘導及植株再生方法，其特徵在於所述游離小孢子的培養包括如下步驟a) 離心後的小孢子用液體培養基iii稀釋至小孢子密度2 4X105個 mL—1,分裝到無菌 培養皿中，每皿3 5mL,用Parafilm封口；b) 將培養皿放進培養盒內，在25 28'C下，進行靜止淺層暗培養至愈傷組織出現，每 15 20d換一次新鮮的液體培養基iii， 20 30d後陸續出現愈傷組織，愈傷組織出現 後拿到光照強度1500 2000Lx、光照12 16h cf'下培養；其中所述的液體培養基iii為如下培養基中的任一種a. KM培養基、和0. 05 0. 5mg L-1 2, 4 D、和0. 1 0. 5mg L-1KT、和0. 5 2mg L—'NAA、 和100 300mg L—'PEG、和5 7%葡萄糖；b. KM培養基、和0. 5 2mg L—'NAA、和1 3mg L—LKT、和150 300rag L—'PEG、和5 10% 葡萄糖；液體培養基iii用0. 22陶 一次性濾器過濾滅菌。
6. 根據權利要求5所述的茄子游離小孢子愈傷組織誘導及植株再生方法，其特徵在於所 述愈傷組織的再生包括如下步驟當愈傷組織塊徑長到2 6mm時，將愈傷組織轉到固體再 生培養基iv中，15 20d繼代一次，30 45d愈傷組織上開始分化出芽點；其中所述的再生培養基iv如下MS培養基、和0 0. 2mg叱—'NAA、和0. 5 5mg *L—'6-BA 、 和1 5%蔗糖、和5 10g L—'瓊脂。
7. 根據權利要求6所述的茄子游離小孢子愈傷組織誘導及植株再生方法，其特徵在於所 述再生植株的生根包括如下步驟當芽點長到1 3cm時轉到生根培養基v, 10 15d後長 出健壯的根；其中所述的生根培養基v如下1/2MS培養基、和0. 05 0. 5mg L—'IBA、和 1 5%蔗糖、和5 10g L—'瓊脂。
8. 根據權利要求2所述的茄子游離小孢子愈傷組織誘導及植株再生方法，其特徵在於所述花葯的選取通過鏡檢觀察小孢子的發育時期，選取單核中期和靠邊期的小孢子，對應的 花蕾外部特徵為花冠低於花萼1 2 mm至花冠高於花萼1 2 mm，萼片即將開裂前後，花葯為黃綠色。
9. 根據權利要求3所述的茄子游離小孢子愈傷組織誘導及植株再生方法，其特徵在於所 述花蕾消毒步驟採用70 75%的酒精進行花蕾表面消毒，消毒時間l 3min，然後用5. 0 8.0%的次氯酸鈉浸泡5 40min，最後用無菌水洗滌3次，每次1 10min，用無菌紙吸乾備用o
全文摘要
一種茄子游離小孢子愈傷組織誘導及植株再生方法，主要步驟是選取合適的花葯進行預培養，然後進行小孢子的游離和收集，然後在液體培養基中進行靜止淺層暗培養，20～30d後陸續出現愈傷組織，愈傷組織出現後拿到光照下培養，當愈傷組織塊徑長到2～6mm時，將愈傷組織轉到固體再生培養基上繼續培養，30～45d愈傷組織上開始分化出芽點，當芽點長到1～3cm時轉到生根培養基，10～15d後長出健壯的根；本方法得到單倍體的機率高、小孢子愈傷組織發生頻率高，不僅是茄子單倍體育種技術上的突破，而且該游離小孢子培養胚狀體誘導體系還可能成為進行植物細胞分化、發育研究，分子標記和基因圖譜的良好實驗體系。
文檔編號C12N5/04GK101371650SQ20071012074
公開日2009年2月25日 申請日期2007年8月24日 優先權日2007年8月24日
發明者劉富中, 孫振英, 燕 宋, 涵 徐, 適 範, 勇 連, 陳鈺輝, 欣 馬 申請人:中國農業科學院蔬菜花卉研究所