一種酶法製備艾沙度林中間體的方法與流程

2023-12-06 09:01:26 2

本發明屬於生物製藥領域，具體涉及一種酶法製備艾沙度林中間體的方法。

背景技術：

伊盧多啉(Eluxadoline)又稱為艾沙度林，其化學名稱為4-(氨基羰基)-N-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-2,6-二甲基-L-苯丙氨酸，商品名為Viberzi，2015年5月27日獲FDA批准上市，用於治療腹瀉性腸易激綜合症，據權威機構統計，這種病症的患者在歐洲和美國高達2800萬，市場前景廣闊。艾沙度林結構式如下所示

其中化合物I為伊盧多啉製備過程中所需的關鍵中間體，該中間體收率、成本直接影響伊盧多啉的產品純度和成本，故化合物I的製備方法已引起科研工作者的高度重視。

Chaozhong Cai等人描述了一種製備化合物I的方法(Tetrahedron,2005,61,6836-6838.)，其合成路線如下所示：

該方法以N-Boc-2,6-二甲基-L-酪氨酸為原料經4步反應得到化合物I，但是存在起始物料價格昂貴、總收率低等缺點。

現有文獻報導的化合物I的製備方法均為化學法製備，存在反應條件苛刻、收率較低、環境汙染嚴重等問題，工業化生產受到極大阻礙。與化學合成法相比，生物合成法具有反應條件溫和、轉化率高等優點近年來受到廣泛關注，目前未見生物法製備艾沙度林中間體的公開文獻。

技術實現要素：

為了克服現有技術所存在的上述缺陷，本發明公開了一種酶法製備艾沙度林中間體的方法。

具體工藝路線如下所示：

化合物V在腈水合酶的作用下進行酶催化反應得到化合物I，其中R1選自C1-C6的烷基、苄基或氫原子，優選為氫原子；R2選自Boc(叔丁氧羰基)、Cbz(苄氧羰基)、Fmoc(芴甲氧羰基)、Teoc(三甲基矽乙氧羰基)或氫原子，優選為叔丁氧羰基。

進一步說，腈水合酶為市場上可以購得的NHT101～NHT124，來自尚科生物醫藥(上海)有限公司。

進一步說，腈水合酶以酶粉形式、含腈水合酶的細胞破碎液或全細胞的形式加入，優選以酶粉形式加入。

進一步說，該酶法反應在溫度為30～40℃，pH＝6～8條件下進行。

進一步說，該酶法反應將化合物V、腈水合酶和緩衝液按一定比例混合反應得到產物，其中化合物V的濃度為30～100g/L，腈水合酶的濃度為5～10g/L和所述緩衝液的濃度為10～100mM。

進一步說，化合物V的製備方法包括如下步驟：

步驟a)：化合物II與鋅粉在有機溶劑中反應生成化合物III；

步驟b)：化合物III與化合物IV在鈀催化劑和膦配體的催化下反應得到化合物V；

其中化合物II、III、V、I的R1和R2所代表的基團相同。

進一步說，所述有機溶劑為二甲基乙醯胺或二甲基甲醯胺，優選為二甲基甲醯胺。

進一步說，鈀催化劑為Pd2(dba)3，膦配體為三(鄰甲苯基)膦。

進一步說，步驟b)中鈀催化劑與化合物IV的質量比為0.001～0.1，膦配體與化合物IV的質量比為0.001～0.1。

一種酶法製備下式化合物(I-A)的方法，

所述方法包括，

步驟a)：化合物II-A與鋅粉在有機溶劑中反應生成化合物III-A；所述有機溶劑為二甲基乙醯胺或二甲基甲醯胺，優選為二甲基甲醯胺。

步驟b)：化合物III-A與化合物IV在鈀催化劑和膦配體的催化下反應得到化合物V-A；鈀催化劑為Pd2(dba)3，膦配體為三(鄰甲苯基)膦。

步驟c)：化合物V-A經過鹼性條件下酯的水解和腈水合酶作用下氰基還原製備化合物I-A，所述鹼性條件為LiOH，NaOH或KOH，所述腈水合酶選自尚科生物醫藥(上海)有限公司自有的腈水合酶酶庫，即NHT101～NHT124。

與現有化學合成方法相比，本發明提供了一種製備艾沙度林中間體的綠色技術方案，該方案反應條件溫和，收率較高，對環境友好，具有良好的工業應用價值。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明的技術內容作進一步的闡述，其目的是為了更好的理解本發明的內容，但本發明的保護範圍不限於此。

實施例1

(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(化合物V)的製備

將鋅粉(2.17克)、DMF(5.4毫升)和1,2-二溴乙烷(0.36克)加入反應瓶中，加熱至100℃，保溫5分鐘。冷卻至室溫，加入三甲基氯矽烷(0.13g),將(R)-3-碘代-N-Boc-丙氨酸甲酯(化合物II，7.1克)的DMF(5.4毫升)溶液在20℃下滴加入反應體系，攪拌1小時。25℃保溫反應過夜得鋅試劑，直接用於下一步反應。

將2,6-二甲基-4-氰基碘苯(2.8克)、三(鄰甲苯基)膦(0.02克)、Pd2(dba)3(0.03克)和DMF(6毫升)加入反應瓶中，加熱至90℃，滴入上述製備的鋅試劑，0.5小時滴加完。TLC顯示原料反應完全，冷卻至15～20℃。加入飽和氯化銨溶液(20毫升)和乙酸乙酯(20毫升)，攪拌，分層，有機相用飽和氯化銨溶液(20毫升)洗滌、水(20毫升)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濃縮得(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(化合物V，3.29克，收率90％)。

(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(化合物I)的製備

於30mL反應容器中加入10mM的磷酸鹽緩衝液(10mL，pH＝7.0)，用磷酸調節pH至7.0，加入上述製備得到的化合物V(1.5克)，攪拌均勻後加入腈水合酶酶粉NHT101(0.15克)定容至15mL，30℃下磁力攪拌敞口反應，反應過程中用NaOH(3M)控制反應pH在7.0左右，TLC檢測反應進程。反應結束後70℃保溫2h使反應液中蛋白質變性，過濾去除蛋白質，加NaOH(3M)調節pH＝9，等體積乙酸乙酯萃取三次，合併有機相，無水硫酸鈉乾燥，減壓蒸餾獲得(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(化合物I，1.55g，收率98％)，HPLC檢測S型產物ee值為99.1％。

實施例2

百克級(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(化合物V)的製備

將鋅粉(216.6克)、DMF(540毫升)和1,2-二溴乙烷(36克)加入反應瓶中，加熱至100℃，保溫5分鐘。冷卻至室溫，加入三甲基氯矽烷(13克)，將(R)-3-碘代-N-Boc-丙氨酸甲酯(化合物II，710克)的DMF(540毫升)溶液在20℃下滴加入反應體系，攪拌1.5小時。25℃保溫反應過夜得鋅試劑，直接用於下一步反應。

將2,6-二甲基-4-氰基碘苯(280克)、三(鄰甲苯基)膦(2克)、Pd2(dba)3(3克)和DMF(600毫升)加入反應瓶中，加熱至90℃，滴入上述製備的鋅試劑，1.5小時滴加完。TLC顯示原料反應完全，冷卻至15～20℃。向反應液中加入矽膠(100克)，攪拌1小時過濾。濾液中加入飽和氯化銨溶液(4500毫升)，攪拌1小時過濾，濾餅烘乾得(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(化合物V，333克，收率92％)。

百克級(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(化合物I)的製備

向帶夾套的玻璃反應釜(5L)中加入10mM的磷酸鹽緩衝液(2L，pH＝7.0)，用磷酸調節pH至7.0，加入上述製備得到的化合物V(150克)，攪拌均勻後加入腈水合酶酶粉NHT101(10克)定容至3L，30℃下磁力攪拌敞口反應，反應過程中用NaOH(3M)控制反應pH在7.0左右，TLC檢測反應進程。反應結束後70℃保溫2h使反應液中蛋白質變性，過濾去除蛋白質，加NaOH(3M)調節pH＝9，等體積乙酸乙酯萃取三次，合併有機相，無水硫酸鈉乾燥，減壓蒸餾獲得(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(化合物I，151.8克，收率96％)，HPLC檢測S型產物ee值為99.3％。

實施例3

(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Boc-苯丙氨酸乙酯(化合物V)的製備

將鋅粉(1.08克)、DMF(2.7毫升)和1,2-二溴乙烷(0.18克)加入反應瓶中，加熱至90℃，保溫5分鐘。冷卻至室溫，加入三甲基氯矽烷(0.07克),將(R)-3-碘代-N-Boc-丙氨酸乙酯(化合物II，3.3克)的DMF(2.7毫升)溶液在20℃下滴加入反應體系，攪拌0.5小時。20℃保溫反應過夜得鋅試劑，直接用於下一步反應。

將2,6-二甲基-4-氰基碘苯(1.4克)、三(鄰甲苯基)膦(0.01克)、Pd2(dba)3(0.15克)和DMF(3毫升)加入反應瓶中，加熱至90℃，滴入上述製備的鋅試劑，0.5小時滴加完。TLC顯示原料反應完全，冷卻至15～20℃。加入飽和氯化銨溶液(10毫升)和乙酸乙酯(10毫升)，攪拌，分層，有機相用飽和氯化銨溶液(10毫升)洗滌、水(10毫升)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濃縮得(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Boc-苯丙氨酸乙酯(化合物V，1.66克，收率88％)。

(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Boc-苯丙氨酸乙酯(化合物I)的製備

於50mL反應容器中加入10mM的磷酸鹽緩衝液(20mL，pH＝7.0)，用磷酸調節pH至8.0，加入上述製備得到的化合物V(1.5克)，攪拌均勻後加入腈水合酶酶粉NHT110(0.12克)定容至30mL，35℃下磁力攪拌敞口反應，反應過程中用NaOH(3M)控制反應pH在8.0左右，TLC檢測反應進程。反應結束後70℃保溫2h使反應液中蛋白質變性，過濾去除蛋白質，加NaOH(3M)調節pH＝9，等體積乙酸乙酯萃取三次，合併有機相，無水硫酸鈉乾燥，減壓蒸餾獲得(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Boc-苯丙氨酸乙酯(化合物I，1.53克，收率97％)，HPLC檢測S型產物ee值為99.0％。

實施例4

(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Cbz-苯丙氨酸甲酯(化合物V)的製備

將鋅粉(2.17克)、DMF(5.4毫升)和1,2-二溴乙烷(0.36克)加入反應瓶中，加熱至100℃，保溫5分鐘。冷卻至室溫，加入三甲基氯矽烷(0.13克),將(R)-3-碘代-N-Cbz-丙氨酸甲酯(化合物II，7.9克)的DMF(5.4毫升)溶液在20℃下滴加入反應體系，攪拌1小時。25℃保溫反應過夜得鋅試劑，直接用於下一步反應。

將2,6-二甲基-4-氰基碘苯(2.8克)、三(鄰甲苯基)膦(0.02克)、Pd2(dba)3(0.03克)和DMF(6毫升)加入反應瓶中，加熱至90℃，滴入上述製備的鋅試劑，0.5小時滴加完。TLC顯示原料反應完全，冷卻至15～20℃。加入飽和氯化銨溶液(20毫升)和乙酸乙酯(20毫升)，攪拌，分層，有機相用飽和氯化銨溶液(20毫升)洗滌、水(20毫升)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濃縮得(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Cbz-苯丙氨酸甲酯(化合物V，3.66克，收率91％)。

(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Cbz-苯丙氨酸甲酯(化合物I)的製備

於100mL反應容器中加入10mM的磷酸鹽緩衝液(20mL，pH＝7.0)，用磷酸調節pH至6.5，加入上述製備得到的化合物V(1.5克)，攪拌均勻後加入腈水合酶酶粉NHT121(0.12克)定容至30mL，30℃下磁力攪拌敞口反應，反應過程中用NaOH(3M)控制反應pH在7.0左右，TLC檢測反應進程。反應結束後75℃保溫2h使反應液中蛋白質變性，過濾去除蛋白質，加NaOH(3M)調節pH＝9，等體積乙酸乙酯萃取三次，合併有機相，無水硫酸鈉乾燥，減壓蒸餾獲得(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Cbz-苯丙氨酸甲酯(化合物I，1.54克，收率98％)，HPLC檢測S型產物ee值為99.0％。

實施例5

(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Boc-苯丙氨酸(化合物I-A)的製備

將鋅粉(2.17克)、DMF(5.4毫升)和1,2-二溴乙烷(0.36克)加入反應瓶中，加熱至100℃，保溫5分鐘。冷卻至室溫，加入三甲基氯矽烷(0.13克),將(R)-3-碘代-N-Boc-丙氨酸甲酯(7.1克)的DMF(5.4毫升)溶液在20℃下滴加入反應體系，攪拌1小時。25℃保溫反應過夜得鋅試劑，直接用於下一步反應。

將2,6-二甲基-4-氰基碘苯(2.8克)、三(鄰甲苯基)膦(0.02克)、Pd2(dba)3(0.03克)和DMF(6毫升)加入反應瓶中，加熱至90℃，滴入上述製備的鋅試劑，0.5小時滴加完。TLC顯示原料反應完全，冷卻至15～20℃。加入飽和氯化銨溶液(20毫升)和乙酸乙酯(20毫升)，攪拌，分層，有機相用飽和氯化銨溶液(20毫升)洗滌、水(20毫升)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濃縮得(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(3.29克，收率90％)。

將(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(3.29克)加入到四氫呋喃(15毫升)和水(15毫升)，攪拌下降溫至0～5℃。向溶液中滴加一水合氫氧化鋰(0.62克)的水(10毫升)溶液。攪拌1.5小時，TLC顯示反應完全。加入乙酸乙酯(15毫升*3)提取，水相中滴加1M的鹽酸調pH＝2，過濾，水(20ml)洗滌，40℃真空乾燥8小時得(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Boc-苯丙氨酸(化合物V，3.03克，96％)。

於100mL反應容器中加入10mM的磷酸鹽緩衝液(20mL，pH＝7.0)，用磷酸調節pH至7.5，加入上述製備得到的(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Boc-苯丙氨酸(1.5克)，攪拌均勻後加入腈水合酶酶粉NHT101(0.1克)定容至30mL，25℃下磁力攪拌敞口反應，反應過程中用NaOH(3M)控制反應pH在7.0左右，TLC檢測反應進程。反應結束後70℃保溫2h使反應液中蛋白質變性，過濾去除蛋白質，加NaOH(3M)調節pH＝9，等體積乙酸乙酯萃取三次，合併有機相，無水硫酸鈉乾燥，減壓蒸餾獲得(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Boc-苯丙氨酸(化合物I-A，1.54克，收率97％)，HPLC檢測S型產物ee值為99.5％。

實施例6

(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Boc-苯丙氨酸(化合物I-A)的製備

將鋅粉(2.17克)、DMF(5.4毫升)和1,2-二溴乙烷(0.36克)加入反應瓶中，加熱至100℃，保溫5分鐘。冷卻至室溫，加入三甲基氯矽烷(0.13克),將(R)-3-碘代-N-Boc-丙氨酸甲酯(7.1克)的DMF(5.4毫升)溶液在20℃下滴加入反應體系，攪拌1小時。25℃保溫反應過夜得鋅試劑，直接用於下一步反應。

將2,6-二甲基-4-氰基碘苯(2.8克)、三(鄰甲苯基)膦(0.02克)、Pd2(dba)3(0.03克)和DMF(6毫升)加入反應瓶中，加熱至90℃，滴入上述製備的鋅試劑，0.5小時滴加完。TLC顯示原料反應完全，冷卻至15～20℃。加入飽和氯化銨溶液(20毫升)和乙酸乙酯(20毫升)，攪拌，分層，有機相用飽和氯化銨溶液(20毫升)洗滌、水(20毫升)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濃縮得(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(3.29克，收率90％)。

於50mL反應容器中加入10mM的磷酸鹽緩衝液(20mL，pH＝7.0)，用磷酸調節pH至7.0，加入上述製備得到的(S)-2,6-二甲基-4-氰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(3克)，攪拌均勻後加入腈水合酶酶粉NHT101(0.3克)定容至30mL，30℃下磁力攪拌敞口反應，反應過程中用NaOH(3M)控制反應pH在7.0左右，TLC檢測反應進程。反應結束後75℃保溫2h使反應液中蛋白質變性，過濾去除蛋白質，加NaOH(3M)調節pH＝9，等體積乙酸乙酯萃取三次，合併有機相，無水硫酸鈉乾燥，減壓蒸餾獲得(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(化合物I，3.1克，收率98％)，HPLC檢測S型產物ee值為99.1％。

將(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Boc-苯丙氨酸甲酯(3.1克)加入到四氫呋喃(15毫升)和水(15毫升)，攪拌下降溫至0～5℃。向溶液中滴加一水合氫氧化鋰(0.62克)的水(10毫升)溶液。攪拌1.5小時，TLC顯示反應完全。加入乙酸乙酯(15毫升*3)提取，水相中滴加1M的鹽酸調pH＝2，過濾，水(20ml)洗滌，40℃真空乾燥8小時得(S)-2,6-二甲基-4-氨甲羰基-N-Boc-苯丙氨酸(化合物I-A，2.83克，95％)，HPLC檢測S型產物ee值為99.2％。