一種誘導捕食線蟲真菌同步產生捕食器官的方法

2023-12-12 00:25:42 11

專利名稱：一種誘導捕食線蟲真菌同步產生捕食器官的方法
技術領域：
本發明涉及一種誘導捕食線蟲真菌同步產生捕食器官的方法，屬於應用微生物學領域。
背景技術：
植物寄生線蟲是植物的重要病害之一，全世界每年由於植物寄生線蟲所引起的農 作物經濟損失達到780億美元(Barker, 1998)。在我國，線蟲危害菸草、花卉、蔬菜、棉花、 大豆、花生、小麥、水稻、林木、中藥材等幾乎所有的經濟作物，成為農業生產中重要的限制 因子之一。目前對線蟲病害的防治仍然以化學防治為主，但由於化學農藥對生態環境的影 響以及寄生線蟲抗藥性的增加，使其應用逐步受到限制，因此採用線蟲天敵進行生物防治 已日益受到研究人員的關注(Siddiqui and Mahmood， 1996 ;劉杏忠等，2004)。對線蟲真 菌天敵的研究已經有160多年的歷史，其中捕食線蟲真菌(Nematode-tr即ping fungi)是 自然界中控制線蟲種群數量的一類重要的真菌生物因子。捕食線蟲真菌根據形態學特徵 劃分為節叢 包屬(Arthrobotrys)、單頂抱屬(Monacrosporium)禾口隔指抱屬(Dactylella) (Subramanian， 1963)，它們利用營養菌絲特化形成的捕食器官，如收縮環、非收縮環、粘性 菌絲、粘性分枝、粘性網等完成對植物寄生線蟲的捕捉和侵染過程(張克勤等，2006)。捕食 線蟲真菌的捕食器官的形態結構十分穩定，不但在捕食線蟲的功能方面有重要意義，而且 也是鑑定和分類的重要依據之一。目前，捕食線蟲真菌作為一種有效的生物防治資源已經 廣泛應用於植物寄生線蟲的生物防治(劉杏忠等，2004)。然而，人們對捕食線蟲真菌的侵 染機制和分子背景的了解還非常有限，限制了高效線蟲生防製劑的研發和應用。
捕食線蟲真菌的捕食器官是其侵染植物寄生線蟲的必要條件之一，捕食器官在營 養貧瘠的培養基上可以自發產生，也可以通過環境因子(胺基酸和多肽等)的誘導產生 (Friman et al. ， 1985)。目前所正式報導的捕食線蟲真菌捕食器官的誘導方法主要包括 飢餓法，在營養貧瘠的培養基上如玉米粉培養基上培養產生；誘導法，在固體或液體培養基 中加入特定的胺基酸或多肽等誘導物質誘導捕食器官產生；小室法(挖塊法)在固體培養 基(平板內)中挖出一塊(0.5xlcm)，並在其中加入新鮮線蟲，誘導捕食器官產生。以上幾 種捕食器官的誘導方法存在產生的捕食器官數量有限、捕食器官產生不同步和可控制性不 強等缺點。 經文獻檢索，未發現與本發明內容相同文獻的公開報導。

發明內容
本發明的目的是克服現有技術不足，提供一種快速誘導捕食線蟲真菌同步產生捕 食器官的方法，迅速獲得大量同步的捕食器官，為進一步研究捕食線蟲真菌捕食器官形成 的分子機制提供了良好的實驗材料。 本發明涉及的秀麗隱杆線蟲(Caenorhabditis elegans)為實驗室常規實驗用線 蟲，能從國內外的線蟲保藏機構購買得到。
本發明在常規方法基礎上改進而成。本發明實現的步驟如下
1.培養基和線蟲的培養 1)燕麥培養基用於培養線蟲。在250mL三角瓶中加入10g燕麥片(超市購買) 加入30mL去離子水將燕麥片浸潤，12rC滅菌20分鐘。 2)秀麗隱杆線蟲的培養在滅菌的燕麥培養基中加入lmL的線蟲懸液，21-26t:培 養6-7天。培養好的線蟲在4t:保存i周。 2.線蟲提取物的製備 1)用3層擦鏡紙將含有秀麗隱杆線蟲的燕麥培養基包好，用貝氏漏鬥法過夜收集 燕麥培養基培養的線蟲； 2)將收集到的線蟲用M9緩衝液(磷酸氫二鈉6g ;磷酸二氫鉀3g ;氯化鈉5g ;硫 酸鎂O. 25g，水1000mL)清洗，去除殘留的培養基；
3)離心收集線蟲，4t:，8，000g，離心20分鐘; 4)用無菌去離子水懸浮線蟲，離心收集線蟲，4t:，8，000g，離心20分鐘；重複3
次；最後用無菌去離子水懸浮線蟲，10g (溼重)線蟲加入30mL無菌去離子水； 5)將線蟲懸浮液置於冰水混合物上超聲50%強度，6s 0N， 3s OFF， 10分鐘；放置
30分鐘後，再次超聲，6s 0N，3s 0FF，5分鐘； 6) 12， 000g，30分鐘，離心收集上清; 7)用0.22ym的濾膜過濾上清液，過濾後的上清液即為線蟲提取物，分裝後存 於-80。C待用。 3.捕食線蟲真菌的培養(以捕食線蟲真菌的模式菌株寡孢節叢孢A. oligospora 為例) 1)培養基PDA培養基和CMA培養基的組成和配製方法如下CMA培養基稱取20g玉米粉，加入1000mL去離子水，煮沸(IO(TC ) 20分鐘，用6
層紗布過濾收集液體，加入20g瓊脂，12rC滅菌20分鐘。 PDA培養基去皮馬鈴薯200g，切塊、煮沸30分鐘，6層紗布過濾收集上清液，加入 葡萄糖20g，加水補充體積到1000mL， 12rC滅菌20分鐘。 2)寡孢節叢孢的活化和孢子培養在CMA固體培養基上接種寡孢節叢孢，26°。恆 溫培養箱內培養10天，以得到大量的孢子。用無菌水衝洗CMA平板上的寡孢節叢孢菌絲； 用移液器將平板上的液體轉移至裝有無菌擦鏡紙的漏鬥內過濾，收集孢子；用血球計數板 計數並計算孢子的濃度。 3)寡孢節叢孢的液體發酵及新鮮菌絲的收集 製備PDA液體培養基，分裝於500mL的三角瓶內，200mL培養基/瓶。在液體培養 基內接種孢子，100個孢子/mL液體培養基，搖床培養26t:，160rpm，5-6天。用無菌的6層 紗布過濾收集菌絲，並用無菌去離子水衝洗菌絲3-4遍，去除培養基成份，用40mL無菌去離 子水懸浮菌絲，用於三維菌網的液體誘導。 4.捕食線蟲真菌捕食器官的誘導(以捕食線蟲真菌的模式菌株寡孢節叢孢 A. oligospora為例) 將收集得到的寡孢節叢孢新鮮菌絲用無菌去離子水懸浮後，實驗組(三維菌網誘 導組)內加入線蟲提取物(l : 10，v/v);對照組(營養菌絲組)內加入等量無菌去離子水；將平皿靜置於26t:恆溫培養箱內孵育24-48h，大量的捕食器官(三維菌網)產生。誘導結
束後，用無菌的6層紗布分別過濾收集對照組和實驗組的菌絲，並用無菌去離子水衝洗菌
絲3-4遍；用無菌濾紙去除菌絲內的水分；菌絲用液氮凍幹後，存於-S(TC待用。 5.捕食線蟲真菌對秀麗隱杆線蟲的捕捉觀察(以捕食線蟲真菌的模式菌株寡孢
節叢孢A. oligospora為例) 1)用1%的次氯酸鈉對秀麗隱杆線蟲進行消毒處理後，用無菌去離子水反覆衝洗 蟲體3-4次。將液體誘導產生的三維菌網鋪在水瓊脂平板上，加入100條/皿消毒後的秀 麗隱杆線蟲。 2)用光學顯微鏡(Olympus, Japan)觀察液體誘導產生的三維菌網的形態和對線 蟲的捕捉。 與以往的報導相比，本發明有以下幾個特徵1)線蟲提取物能夠有效誘導捕食線 蟲真菌產生大量同步的捕食器官(10e捕食器官/mg菌絲)；2)線蟲提取物為水溶性物質， 誘導實驗結束後，通過過濾、無菌去離子水衝洗的方法即可將線蟲提取物去除，對後續實驗 沒有影響；3)線蟲提取物的製備方法和三維菌網誘導方法簡單易行，重複性好，可控性強。 4)本發明為進一步研究捕食線蟲真菌捕食器官形成的分子機制提供了良好的實驗材料。
具體實施例方式以下是本發明的實施例，但本發明的內容並不局限於此。
實施例一 捕食線蟲真菌寡孢節叢孢菌絲捕食器官的誘導 按照上面所描述的方法製備線蟲提取物，寡孢節叢孢接種PDA液體培養基，26°C ， 160rpm培養5或6天，過濾收集菌絲。並用無菌去離子水衝洗菌絲3或4遍，去除培養基成 份，用適量無菌無菌去離子水懸浮菌絲，用於三維菌網的誘導。 將收集得到的寡孢節叢孢新鮮菌絲用無菌去離子水懸浮後，置於玻璃平皿內，
40mL/皿實驗組(三維菌網誘導組)內加入線蟲提取物(1 : 10， v/v);對照組(營養菌
絲組)內加入等量無菌去離子水；將平皿靜置於26t:恆溫培養箱內孵育24或36或48h。
寡孢節叢孢的菌絲誘導15h後即可觀察到三維菌網產生，在20或24h時，大量的捕食器官
(三維菌網)產生。不同批次的線蟲提取物對捕食器官的誘導能力差異較小。 實施例二 捕食線蟲真菌寡孢節叢孢分生孢子形成捕食器官的誘導 按照上面所描述的方法製備線蟲提取物，寡孢節叢孢接種CMA固體培養基，26t:
恆溫培養箱內培養10天，以得到大量的孢子。用無菌水衝洗CMA平板上的寡孢節叢孢菌絲，
用移液器將平板上的液體轉移至裝有無菌擦鏡紙的漏鬥內過濾，收集孢子。 將收集得到的寡孢節叢孢孢子用無菌去離子水懸浮後，置於玻璃平皿內，20mL/
皿實驗組(三維菌網誘導組)內加入線蟲提取物(1 : 10， v/v);對照組(營養菌絲組)
內加入等量無菌去離子水；將平皿靜置於26t:恆溫培養箱內孵育24或36或48h。寡孢節
叢孢的菌絲誘導12-15h後即可觀察到三維菌網產生，在20或24h時，大量的捕食器官(三
維菌網)產生。
權利要求
一種誘導捕食線蟲真菌同步產生捕食器官的方法，包括線蟲培養、線蟲提取物製備，捕食線蟲真菌培養和捕食器官誘導步驟，其特徵在於本方法具體如下(1).培養基和線蟲的培養a.在250mL三角瓶中加入10g燕麥片，加入30mL去離子水將燕麥片浸潤，121℃滅菌20分鐘；b.秀麗隱杆線蟲的培養在滅菌的燕麥培養基中加入1mL的線蟲懸液，21-26℃培養6-7天，培養好的線蟲在4℃保存1周；(2).線蟲提取物的製備a.用3層擦鏡紙將含有秀麗隱杆線蟲的燕麥培養基包好，用貝氏漏鬥法過夜收集燕麥培養基培養的線蟲；b.將收集到的線蟲用M9緩衝液清洗，去除殘留的培養基；c.離心收集線蟲，4℃，8,000g，離心20分鐘；d.用無菌去離子水懸浮線蟲，4℃，8,000g，離心20分鐘收集線蟲；重複3次；最後用無菌去離子水懸浮線蟲，10g線蟲加入30mL無菌去離子水；e.將線蟲懸浮液置於冰水混合物上超聲50％強度，6s ON，3s OFF，10分鐘；放置30分鐘後，再次超聲，6s ON，3s OFF，5分鐘；f.12,000g，離心30分鐘收集上清液；g.用0.22μm的濾膜過濾上清液，過濾後的上清液即為線蟲提取物，分裝後存於-80℃待用；(3).捕食線蟲真菌的培養a.CMA和PDA培養基CMA培養基稱取20g玉米粉，加入1000mL去離子水，100℃煮沸20分鐘，用6層紗布過濾收集液體，加入20g瓊脂，121℃滅菌20分鐘；PDA培養基去皮馬鈴薯200g，切塊、煮沸30分鐘，6層紗布過濾收集上清液，加入葡萄糖20g，加水補充體積到1000mL，121℃滅菌20分鐘；b.捕食線蟲真菌的活化和孢子培養在CMA固體培養基上接種捕食線蟲真菌，26℃恆溫培養箱內培養10天，以得到大量的孢子，用無菌水衝洗CMA平板上的捕食線蟲真菌菌絲；用移液器將平板上的液體轉移至裝有無菌擦鏡紙的漏鬥內過濾，收集孢子；用血球計數板計數並的計算孢子的濃度；c.捕食線蟲真菌的液體培養和新鮮菌絲的收集製備PDA液體培養基，分裝於500mL的三角瓶內，200mL培養基/瓶，在液體培養基內接種孢子，100個孢子/mL液體培養基，搖床培養26℃，160rpm，5-6天，用無菌的6層紗布過濾收集菌絲，並用無菌去離子水衝洗菌絲3-4遍，去除培養基成份，用40mL無菌去離子水懸浮菌絲，用於三維菌網的液體誘導；(4).捕食線蟲真菌捕食器官的誘導將收集得到的捕食線蟲真菌新鮮菌絲用無菌去離子水懸浮後，在三維菌網誘導實驗組內加入線蟲提取物，加入量為1∶10，v/v；在營養菌絲對照組內加入等體積的無菌去離子水；將平皿靜置於26℃恆溫培養箱內孵育24-48h，大量的捕食器官三維菌網產生；誘導結束後，用無菌的4層紗布分別過濾收集對照組和實驗組的菌絲，並用無菌去離子水衝洗菌絲3-4遍；用無菌濾紙去除菌絲內的水分；菌絲用液氮凍幹後，存於-80℃待用。
全文摘要
本發明涉及一種誘導捕食線蟲真菌同步產生捕食器官的方法，屬於應用微生物學領域。本發明方法包括線蟲培養、線蟲提取物製備，捕食線蟲真菌培養和捕食器官誘導步驟。本發明通過培養線蟲(秀麗隱杆線蟲Caenorhabditis elegans)，利用超聲波破碎和離心製備線蟲提取物，利用線蟲提取物誘導捕食線蟲真菌同步產生大量捕食器官(106捕食器官/mg菌絲)。本發明操作簡單易行，重複性好，可以獲得大量同步的三維菌網，為進一步研究捕食線蟲真菌捕食器官形成的分子機制提供了良好的實驗材料。
文檔編號A01P5/00GK101724569SQ20091021831
公開日2010年6月9日 申請日期2009年12月9日 優先權日2009年12月9日
發明者張克勤, 楊金奎, 梁連銘, 米其利 申請人:雲南大學