用於抑制細胞外囊泡的分泌的細胞外囊泡分泌抑制劑及其用途的製作方法

2024-04-16 01:22:05 1

1.本發明涉及一種用於抑制來自細胞的細胞外囊泡的分泌的細胞外囊泡分泌抑制劑及其用途。


背景技術：

2.近年來，由細胞分泌的外泌體等細胞外囊泡備受關注。所述細胞外囊泡內含微小rna(mirna)等核酸、蛋白質。然後，由於這些內含物從分泌所述細胞外囊泡的細胞經由所述細胞外囊泡傳遞至接受側的細胞，因此細胞外囊泡被認為是作為細胞間的通訊工具發揮作用。作為具體例，例如，已報告了關於癌的轉移，也有由原發癌分泌的細胞外囊泡的參與。


技術實現要素：

發明要解決的課題
3.然而，來自細胞的細胞外囊泡的分泌是如何控制的，其分泌的機制尚未被闡明。一旦所述細胞外囊泡的分泌的機制被闡明，也可以例如通過基於該機制抑制所述細胞外囊泡的分泌，容易地分析所述細胞外囊泡的分泌對生物體的影響。此外，如果是由所述細胞外囊泡的分泌引起的疾病等，也可以通過基於所述機制抑制所述細胞外囊泡的分泌來治療該疾病。
4.因此，本發明的目的是提供一種針對來自細胞的細胞外囊泡的分泌的、新的分泌抑制劑及分泌抑制方法。用於解決課題的手段
5.為了實現所述目的，本發明是一種用於抑制來自細胞的細胞外囊泡的分泌的細胞外囊泡分泌抑制劑，其特徵在於，含有絲氨酸合成途徑的阻滯劑。
6.本發明的分泌抑制方法是來自細胞的細胞外囊泡的分泌的抑制方法，其特徵在於，包括將本發明的細胞外囊泡分泌抑制劑施用於給藥對象的步驟。
7.本發明的篩選方法是一種用於抑制來自細胞的細胞外囊泡的分泌的細胞外囊泡分泌抑制劑的候選物質的篩選方法，其特徵在於，從被檢物質中選擇阻滯絲氨酸合成途徑的阻滯物質作為抑制來自細胞的細胞外囊泡的分泌的候選物質。發明的效果
8.本發明人等經過深入研究，結果發現，絲氨酸合成途徑參與來自細胞的細胞外囊泡的分泌，能夠通過阻滯絲氨酸合成途徑，抑制來自細胞的細胞外囊泡的分泌。如上所述，關於來自細胞的細胞外囊泡的分泌的機制尚未被闡明，本發明人等首次發現了這一點。根據本發明，能夠通過絲氨酸合成途徑的阻滯抑制來自細胞的細胞外囊泡的分泌。因此，通過根據本發明進行分泌抑制，也可以例如分析細胞外囊泡的分泌或分泌的抑制對生物體的影響。因而，本發明可以說是例如在醫療領域中非常有用的技術。
附圖說明
9.【圖1】圖1中，(a)是示出了對於轉染了mir-891b的轉化體(mir-891b)和作為陰性對照的轉化體(nc)，利用exoscreen法的ev量的相對值的圖；(b)是示出了利用nta法的ev量的相對值的圖。【圖2】圖2中，(a)是示出了對於轉染了sipsat1的轉化體(sipsat1)和作為陰性對照的轉化體(nc)，利用exoscreen法的ev量的相對值的圖；(b)是示出了利用nta法的ev量的相對值的圖。【圖3】圖3中，(a)是示出了對於所述轉化體(mir-891b)和所述轉化體(nc)的psat1基因的表達量的相對值的圖；(b)是示出了psat1蛋白的相對值的圖；(c)是示出了psat1基因的3』utr與mir-891b的關係的圖；(d)是示出了轉染了psat1基因和mir-891b的轉化體中psat1的表達量的圖。【圖4】圖4是示出了對於用sipsat1轉染各種癌細胞的轉化體(sipsat1)和作為陰性對照的轉化體(nc)，利用nta法的分泌ev量的相對值的圖。【圖5】圖5是示出了對於用sipsat1轉染癌細胞的轉化體(sipsat1)和作為陰性對照的轉化體(nc)，細胞內cd63陽性ev的相對量的圖。【圖6】圖6是對於用sipsat1轉染癌細胞的轉化體(sipsat1)和作為陰性對照的轉化體(nc)，在不含絲氨酸的培養基或含有絲氨酸的培養基中的培養的結果，其中，(a)是示出了利用exoscreen法的分泌ev量的相對值的圖；(b)是示出了利用nta法的分泌ev量的相對值的圖。【圖7】圖7是示出了細胞內cd63陽性ev的相對量的圖。【圖8】圖8是示出了對於使絲氨酸合成的阻滯劑共存的癌細胞，利用nta法的分泌ev量的相對值的圖。【圖9】圖9是示出了對於用sipsat1轉染各種癌細胞的轉化體(sipsat1)和作為陰性對照的轉化體(nc)，利用nta法的分泌ev量的相對值的圖。【圖10】圖10是乳腺癌轉移株mda-mb-231_luc_d3h2ln的結果，其中，(a)是示出了利用nta法的分泌ev量的相對值的圖；(b)是示出了psat1蛋白的表達的免疫印跡法的照片。【圖11】圖11是移植了乳腺癌轉移株的小鼠的結果，其中，(a)是示出了小鼠的原發灶(乳腺)的腫瘤體積的圖；(b)是原發灶(乳腺)的腫瘤重量的圖。【圖12】圖12是沉默了psat1或phgdh的肺癌細胞的結果，其中，(a)是細胞存活率的結果；(b)是示出了利用nta法的分泌ev量的相對值的圖；(c)是示出了利用exoscreen法的分泌ev量的相對值的圖。【圖13】圖13是沉默了psat1或phgdh的大腸癌細胞的結果，其中，(a)是細胞存活率的結果；(b)是示出了利用nta法的分泌ev量的相對值的圖；(c)是示出了利用exoscreen法的分泌ev量的相對值的圖。【圖14】圖14是示出了每個細胞的ev分泌量的圖，其中，(a)是大腸的正常上皮細胞的結果；(b)是肺的正常上皮細胞的結果。
具體實施方式
10.本發明的細胞外囊泡(extracellular vesicle；ev)分泌抑制劑，以下稱為ev分泌
抑制劑。
11.根據本發明的ev分泌抑制劑，例如，所述阻滯劑為抑制絲氨酸合成途徑中的酶蛋白的表達的表達抑制物質或抑制絲氨酸合成途徑中的酶蛋白的催化功能的催化功能抑制物質。
12.根據本發明的ev分泌抑制劑，例如，所述絲氨酸合成途徑為包含psat1的合成途徑。
13.根據本發明的ev分泌抑制劑，例如，所述絲氨酸合成途徑的阻滯劑為psat1蛋白的表達抑制物質或催化功能抑制物質。
14.根據本發明的ev分泌抑制劑，例如，所述絲氨酸合成途徑的阻滯劑為phgdh蛋白的表達抑制物質或催化功能抑制物質。
15.根據本發明的ev分泌抑制劑，例如，所述絲氨酸合成途徑的阻滯劑為psph蛋白的表達抑制物質或催化功能抑制物質。
16.根據本發明的ev分泌抑制劑，例如，所述細胞為癌細胞。
17.根據本發明的ev分泌抑制劑，例如，所述癌細胞為選自由大腸癌細胞、肺癌細胞、黑色素瘤細胞、乳腺癌細胞、胰腺癌細胞以及多發性骨髓瘤細胞組成的組中的至少一種。
18.根據本發明的ev分泌抑制劑，例如，所述細胞為病毒感染細胞。
19.根據本發明的ev分泌抑制劑，例如，所述阻滯劑為低分子化合物、蛋白質或肽。
20.根據本發明的ev分泌抑制劑，例如，針對所述酶蛋白的表達抑制物質為選自由抑制自編碼所述酶蛋白的基因的轉錄的物質、降解經轉錄的轉錄產物的物質以及抑制自所述轉錄產物的蛋白的翻譯的物質組成的組中的至少一種。
21.根據本發明的ev分泌抑制劑，例如，所述表達抑制物質為選自由mirna、sirna、反義物以及核酶組成的組中的至少一種核酸物質。
22.根據本發明的ev分泌抑制劑，例如，所述表達抑制物質為表達所述核酸物質的表達載體。
23.根據本發明的ev分泌抑制劑，例如，所述蛋白的功能抑制物質為針對所述酶蛋白的活性阻滯物質或活性中和物質。
24.根據本發明的ev分泌抑制劑，例如，所述活性中和物質為針對所述蛋白的抗體或抗原結合片段。
25.根據本發明的ev分泌抑制劑，例如，所述功能抑制物質為表達所述活性中和物質的表達載體。
26.根據本發明的ev分泌的抑制方法，例如，所述細胞為癌細胞。
27.根據本發明的ev分泌的抑制方法，例如，所述癌細胞為選自由大腸癌細胞、肺癌細胞、黑色素瘤細胞、乳腺癌細胞、胰腺癌細胞以及多發性骨髓瘤細胞組成的組中的至少一種。
28.根據本發明的ev分泌的抑制方法，例如，所述細胞為病毒感染細胞。
29.根據本發明的ev分泌的抑制方法，例如，所述給藥對象為人或非人動物。
30.根據本發明的ev分泌的抑制方法，例如，所述給藥在體內或體外進行。
31.根據本發明的ev分泌抑制劑的候選物質的篩選方法，例如，所述細胞為癌細胞。
32.根據本發明的ev分泌抑制劑的候選物質的篩選方法，例如，所述癌細胞為選自由
大腸癌細胞、肺癌細胞、黑色素瘤細胞、乳腺癌細胞、胰腺癌細胞以及多發性骨髓瘤細胞組成的組中的至少一種。
33.根據本發明的ev分泌抑制劑的候選物質的篩選方法，例如，所述細胞為病毒感染細胞。
34.《細胞外囊泡分泌抑制劑》本發明的細胞外囊泡(ev)分泌抑制劑(以下稱為ev分泌抑制劑)為用於抑制來自細胞的細胞外囊泡的分泌的抑制劑。如上所述，本發明的ev分泌抑制劑的特徵在於含有絲氨酸合成途徑的阻滯劑。本發明的ev分泌抑制劑的特徵在於含有所述阻滯劑，其他的結構和條件沒有特別限制。此外，本發明的ev分泌抑制劑，可以援引後述的本發明的ev分泌的抑制方法等的記載。
35.本發明中，所述阻滯劑可以是針對絲氨酸合成途徑中的酶蛋白的表達抑制物質，也可以是針對絲氨酸合成途徑中的酶蛋白的催化功能抑制物質。如上所述，本發明的特徵在於發現絲氨酸合成途徑的表達行為控制ev分泌，通過阻滯絲氨酸的合成，能夠抑制來自細胞的ev分泌。因此，關於阻滯絲氨酸合成的物質的種類及阻滯的方法沒有任何限制。
36.所述阻滯劑只要能夠阻滯絲氨酸合成途徑即可，對於該阻滯的形式沒有特別限制。即，可以通過抑制絲氨酸合成途徑中的酶蛋白的表達來阻滯，也可以通過抑制絲氨酸合成途徑中的酶蛋白的催化功能來阻滯。在前一種情況下，所述阻滯劑是例如針對絲氨酸合成途徑中的酶蛋白的表達抑制物質；在後一種情況下，所述阻滯劑是例如針對絲氨酸合成途徑中的酶蛋白的催化功能抑制物質。根據本發明的ev分泌抑制劑，例如，作為有效成分的所述阻滯劑，可以包含所述表達抑制物質，也可以包含所述催化功能抑制物質，還可以包含前者和後者兩者。
37.所述阻滯劑的種類沒有特別限制，例如可以舉出核酸物質等低分子化合物、抗體等蛋白質、抗原結合片段等肽等。
38.所述表達抑制物質，例如，可以是抑制在來自編碼所述酶蛋白的基因(以下，也稱為靶基因)的所述酶蛋白(以下，也稱為靶蛋白)的表達中的轉錄及翻譯中的任一步驟的物質，沒有特別限制。作為轉錄的抑制，例如可以舉出從dna到mrna前體的轉錄的阻滯、由mrna前體形成成熟mrna的rna加工的阻滯、mrna前體或成熟mrna的降解等。作為所述翻譯的抑制，例如可以舉出自成熟mrna的翻譯的阻滯、翻譯產物的修飾的阻滯等。
39.所述表達抑制物質，例如是核酸物質(以下，也稱為核酸型抑制物質)，可以是直接抑制表達的形態(第1形態)，也可以是在體內(in vivo)、體外(in vitro)或離體(ex vivo)的環境下成為抑制表達的狀態的前體的形態(第2形態)。
40.所述第1形態的表達抑制物質，例如可以舉出反基因、反義物(反義寡核苷酸)、rna幹擾(rnai)物質、核酶等。rnai物質，例如可以舉出sirna、mirna等。反基因例如阻滯mrna的轉錄；反義物和mirna例如阻滯自mrna的翻譯；sirna和核酶例如降解mrna。對於這些表達抑制物質，例如所述靶基因的整個區域和部分區域中的任一區域都可以作為靶區域。作為具體例，反義物和mirna例如能夠被設計成結合至自靶基因轉錄的mrna的3'utr區域；sirna和核酶例如能夠被設計成完全互補地結合至自靶基因轉錄的mrna的一部分區域。
41.所述第1形態的表達抑制物質例如可以通過後述的篩選方法獲得，或者也可以根據所述靶基因的序列來設計。
42.所述第1形態的表達抑制物質例如可以是單鏈或雙鏈。所述表達抑制物質的結構單元沒有特別限制，例如可以舉出含有糖、嘌呤或嘧啶等鹼基和磷酸的脫氧核糖核苷酸骨架或核糖核苷酸骨架，除此之外，例如還可以是含有吡咯烷或哌啶等鹼基的非核苷酸骨架等。這些骨架可以是修飾型或非修飾型。此外，所述結構單元例如可以是天然型或人工非天然型。所述表達抑制物質例如可以由相同的結構單元形成或由兩個種類以上的結構單元形成。
43.如上所述，所述第2形態的表達抑制物質是所述前體，作為具體例，可以舉出表達所述第1形態的表達抑制物質的前體。例如，所述前體，可以通過施用於對象，例如，在體內、體外或離體的環境下，使所述第1形態的表達抑制物質表達並發揮作用。
44.所述前體，例如可以舉出含有所述第1形態的表達抑制物質和接頭的形態。作為具體例，所述前體可以舉出用所述接頭連結sirna的兩條鏈的形態。根據這樣的前體，例如，可以在體內、體外或離體的環境下，通過切斷所述前體，從所述前體除去所述接頭，生成(表達)雙鏈sirna。作為所述前體的具體例，例如可以例示通過切斷生成sirna的shrna等。
45.此外，所述前體例如可以是插入了所述第1形態的表達抑制物質的編碼序列的表達載體。根據所述表達載體，例如，可以在體內、體外或離體的環境下，表達所述第1形態的表達抑制物質。在所述表達載體中，例如可以插入前述shrna等前體的編碼序列。所述表達載體的種類沒有特別限制，例如可以舉出質粒載體、病毒載體等，所述病毒載體，例如可以舉出腺病毒載體、仙臺病毒載體等。
46.所述催化功能抑制物質，例如可以舉出阻滯所述酶蛋白的活性的活性阻滯物質、中和所述酶蛋白的活性的活性中和物質。
47.所述活性阻滯物質沒有特別限制，可以舉出低分子化合物等。
48.所述活性中和物質，例如可以舉出針對所述酶蛋白的抗體或抗原結合片段(抗原結合肽)(以下，統稱為抗體型抑制物質)。所述抗體型抑制物質，例如通過與所述酶蛋白的結合，能夠抑制所述酶蛋白的功能，因此也稱為中和抗體或中和抗原結合片段。所述抗體型抑制物質，例如也可以通過後述的篩選方法獲得。
49.所述抗體例如可以是單克隆抗體、多克隆抗體中的任一種，此外，其同種型沒有特別限制，例如可以舉出igg、igm、iga等。所述抗體在施用於人時，例如優選完全人抗體、人源化抗體、嵌合抗體等。
50.所述抗原結合片段例如可以舉出具有所述抗體的互補性決定區域(cdr)的片段，只要能夠識別並結合所述靶蛋白的目標部位即可。作為具體例，所述抗原結合片段，例如可以舉出fab、fab』、f(ab』)等片段等。
51.所述催化功能抑制物質，例如可以是直接抑制所述酶蛋白的催化功能的第1形態也可以是在體內、體外或離體的環境下成為抑制表達的狀態的前體的第2形態。所述第1形態的催化功能抑制物質，例如是如上所述的抗體型抑制物質。此外，所述第2形態的前體，例如可以舉出插入了抑制所述酶蛋白的催化功能的蛋白質或肽的編碼序列的表達載體。所述表達載體的種類沒有特別限制，與前述同樣，可以舉出質粒載體、病毒載體等。
52.此外，所述催化功能抑制物質，例如可以是所述酶蛋白具有催化活性且不失去其作為催化劑的功能但抑制其能夠發揮作用的狀態的物質。即，作為具體例，可以是使所述酶蛋白發揮作用所需的基質減少或使基質改變等抑制物質。所述基質的減少，例如可以是基
質的生成的抑制，也可以是基質的分解。
53.絲氨酸合成途徑，例如可以舉出下式所示的合成途徑(i)。本發明的ev分泌抑制劑，例如優選含有包含psat1的絲氨酸合成途徑(i)的阻滯劑。如上所述，本發明人等發現絲氨酸合成途徑的表達行為控制ev分泌。具體地，得到了以下見解：例如，癌細胞等非正常細胞由於絲氨酸合成途徑的基因及其編碼的蛋白的表達過度，與正常細胞相比較，ev分泌量增加。然後，對於該絲氨酸合成途徑中的蛋白，具體地，例如下述絲氨酸合成途徑(i)中的蛋白，確認通過抑制(阻滯)對其進行編碼的基因的表達或抑制(阻滯)功能，能夠抑制非正常細胞的ev分泌的增加，從而確立了本發明。本發明中的ev分泌的抑制例如可以說是ev分泌的增加的抑制，具體地，例如也可以說是抑制ev分泌增加超過正常水平。【化1】
54.phgdh是d-3-磷酸甘油酸脫氫酶(d-3-phosphoglycerate dehydrogenase)。人phgdh蛋白及對其進行編碼的phgdh基因在資料庫(genetic testing registry(gtr))中以gene id:26227註冊。針對phgdh的表達抑制物質，例如可以根據phgdh基因的序列來設定。此外，針對所述phgdh的催化功能抑制物質，例如可以使用nct-503、cbr-5884等阻滯劑、phgdh抗體等中和抗體。
55.psat1是磷酸絲氨酸氨基轉移酶1(phosphoserine aminotransferase 1)。人psat1蛋白及對其進行編碼的psat1基因在資料庫(gtr)中以gene id:29968註冊。針對psat1的表達抑制物質，例如可以根據psat1基因的序列來設定，作為具體例，可以使用mir-891b等。此外，針對所述psat1的催化功能抑制物質，例如可以使用psat1抗體等中和抗體。
56.psph是磷酸絲氨酸磷酸酶(phosphoserine phosphatase)。人psph蛋白及對其進行編碼的psph基因在資料庫(gtr)中以gene id:5723註冊。針對psph的表達抑制物質，例如可以根據psph基因的序列來設定。此外，針對所述psph的催化功能抑制物質，例如可以使用psph抗體等中和抗體。
57.本發明中，絲氨酸合成途徑的阻滯劑，例如可以是psat1蛋白的表達抑制物質和催化功能抑制物質、phgdh蛋白的表達抑制物質和催化功能抑制物質、以及psph蛋白的表達抑制物質和催化功能抑制物質中的任一種，可以包括其中任一個種類，也可以包括兩個種類以上。
58.本發明的ev分泌抑制劑，例如可以僅含有所述有效成分，也可以進一步含有其他添加成分。所述添加成分沒有特別限制，例如可以舉出以下成分，優選藥理學上可容許的成分。所述添加成分，例如可以根據所述ev分泌抑制劑的給藥方法、給藥對象及劑型等適當設定。
59.所述添加成分，例如可以舉出賦形劑。所述賦形劑，例如可以舉出水性溶劑、醇溶劑、多元醇溶劑、油性溶劑、它們的混合溶劑(例如，乳化溶劑)等液體介質、乳糖、澱粉等。所述水性溶劑，例如可以舉出水、生理鹽水、氯化鈉等的等滲液等；油性溶劑，例如可以舉出大豆油等。所述添加成分除此之外，例如還可以舉出澱粉糊等粘合劑；澱粉、碳酸鹽等崩解劑；滑石、蠟等潤滑劑等。此外，所述添加成分例如可以包括用於將所述有效成分遞送至目的部
位的dds劑。
60.本發明中，成為ev的分泌抑制的對象的細胞沒有特別限制，通過抑制細胞外囊泡的分泌，希望確認分泌的影響或分泌抑制的影響的細胞成為對象。所述細胞例如可以是正常細胞，也可以是對於目的項目非正常的細胞。所謂對於所述目的項目非正常，沒有特別限制，例如，在所述項目為癌的情況下，非正常的細胞可以是癌細胞；在所述項目為病毒感染的情況下，非正常的細胞可以是病毒感染細胞。根據本發明，例如由於能夠分析癌的發生、轉移、治療等機制，因此作為所述細胞，優選癌細胞。特別地，如上所述，由於細胞外囊泡起到細胞間的信息傳遞的作用，因此優選轉移至其他器官(臟器)的原發癌的癌細胞。所述癌細胞沒有特別限制，例如可以舉出大腸癌細胞、肺癌細胞、黑色素瘤細胞、乳腺癌細胞、胰腺癌細胞或多發性骨髓瘤細胞等。此外，根據本發明，例如，由於可以分析病毒感染的機制，因此作為所述細胞，優選病毒感染細胞。所述病毒的種類沒有特別限制，例如可以舉出流感病毒、冠狀病毒等。
61.本發明中，細胞外囊泡例如是通過內吞途徑分泌的外泌體、微囊泡(microvesicle)、凋亡小體等，其中，例如是外泌體。外泌體通常可以通過alix、tsg101、cd81、cd63、cd9、筏蛋白(flotillin)等標記分子來檢測。
62.本發明的ev分泌抑制劑的使用方法沒有特別限制，例如可以添加到希望抑制細胞外囊泡的分泌的對象中，添加方法沒有特別限定，例如，可以是體內、體外或離體。本發明的ev分泌抑制劑的添加對象例如是細胞或組織、或者生物體等。所述細胞和組織的種類以及生物體的部位(器官)沒有特別限制，例如可以舉出大腸、肺、皮膚、乳房、乳管、乳腺、胰腺以及骨髓等。所述細胞和組織例如可以是從生物體分離的，也可以是細胞系或其培養物。所述添加對象的細胞和組織例如可以人來源，也可以是非人動物來源。此外，所述添加對象的生物體例如可以是人，也可以是非人動物。所述非人動物，例如可以舉出小鼠、大鼠、兔、馬、羊、牛、駱駝等哺乳動物。在所述添加對象為非人動物來源或非人動物的情況下，所述ev分泌抑制物質例如優選為與該特定的非人動物來源的靶蛋白(所述酶蛋白)或靶基因相對特異性地對應的抑制物質，此外，在所述添加對象為人來源或人的情況下，所述抑制物質例如優選為與人來源的所述靶蛋白或靶基因相對特異性地對應的抑制物質。
63.《ev分泌抑制方法》本發明的ev分泌抑制方法是抑制來自細胞的ev的分泌的方法，其特徵在於，包括將所述本發明的ev分泌抑制劑施用於給藥對象的步驟。本發明的要點在於使用所述本發明的ev分泌抑制劑，其他的步驟和條件沒有特別限制。關於所述本發明的ev分泌抑制方法，可以援引所述本發明的ev分泌抑制劑中的記載。
64.在所述給藥對象為細胞的情況下，例如，在培養基的存在下，通過添加所述ev分泌抑制劑並孵育，能夠抑制來自所述細胞的ev分泌。所述孵育條件沒有特別限制，例如可以根據細胞的種類來設定所述培養基、溫度、時間、溼度等。
65.在所述給藥對象為組織的情況下，例如，在培養基的存在下，通過添加所述ev分泌抑制劑並孵育，能夠抑制來自構成所述組織的細胞的ev分泌。所述孵育條件沒有特別限制，例如可以根據組織的種類、大小等來設定所述培養基、溫度、時間、溼度等。
66.在所述給藥對象為生物體的情況下，所述ev分泌抑制劑的給藥方法沒有特別限制，例如可以舉出非口服給藥、口服給藥、靜脈給藥等。給藥條件沒有特別限制，例如可以根
據生物體的種類、給藥對象的器官的種類等適當決定。
67.在所述非口服給藥的情況下，給藥部位例如可以是對象器官，即具有希望抑制ev分泌的細胞的器官(也稱為對象部位)，也可以是能夠將作為所述ev分泌抑制劑的有效成分的所述阻滯劑遞送至所述對象部位的部位。作為具體例，例如，在對象細胞為大腸細胞的情況下，給藥部位可以是作為對象部位的大腸，也可以是能夠將所述阻滯劑遞送至大腸的部位。此外，例如，在對象細胞是肺細胞的情況下，給藥部位可以是作為對象部位的肺，也可以是能夠將所述阻滯劑遞送至肺的部位，對於其他器官也是同樣的。所述非口服給藥的方法例如可以舉出患部注射、靜脈注射、皮下注射、皮內注射、滴注、經皮給藥等。所述ev分泌抑制劑的形態沒有特別限制，如上所述，可以根據給藥方法等適當設定，可以援引前述記載。
68.在非口服給藥的情況下，劑型沒有特別限制，可以根據給藥方法適當決定，例如為液狀、乳膏狀、凝膠狀等，可以通過將介質與所述阻滯劑混合來製備。所述介質中，水性溶劑例如為生理鹽水、等滲液等；油性溶劑例如為大豆油等；乳化溶劑例如為它們的混合液。所述非口服給藥劑例如可以進一步含有醇、多元醇、表面活性劑等。此外，所述非口服給藥劑可以包含用於將所述阻滯劑從對象部位以外的部位有效地遞送至所述對象部位的dds劑。另外，在所述對象部位的組織中，例如，在將所述阻滯劑有效地遞送至癌細胞的情況下，所述非口服給藥劑例如也可以包含特異性地識別所述癌細胞的dds劑。
69.在所述口服給藥的情況下，口服給藥劑的劑型沒有特別限制，例如可以舉出片劑、丸劑、顆粒劑、散劑、膠囊劑、糖漿劑等。所述口服給藥劑例如可以含有稀釋劑、賦形劑、載體等。此外，所述口服給藥劑例如可以包含用於將所述阻滯劑有效地遞送至所述對象部位的dds劑。另外，在所述對象部位的組織中，例如，在將所述阻滯劑有效地遞送至癌細胞的情況下，所述口服給藥劑例如也可以包含特異性地識別所述癌細胞的dds劑。
70.在對所述生物體的給藥中，本發明的ev分泌抑制劑的給藥條件例如可以根據年齡、體重、給藥對象的器官的種類、性別等適當決定。
71.本發明人等報告了作為癌的轉移的機制，通過原發癌的癌細胞分泌細胞外囊泡，經由所述細胞外囊泡的細胞間的信息傳遞，產生癌的轉移。根據本發明的ev分泌抑制劑，如上所述，通過對已患癌的患者的對象部位(癌器官)的給藥，抑制來自所述對象部位中癌細胞的細胞外囊泡的分泌，能夠抑制癌的進展並抑制癌向其他器官的轉移。因此，本發明的ev分泌抑制劑例如也可以用作癌治療劑。本說明書中，治療包括例如所謂的用於減緩癌的進展、治癒癌等的行為，以及用於預防癌的患病、復發的行為。本發明的ev分泌抑制劑例如可以用作任一種目的，也可以用作兩種及以上的目的。
72.在這種情況下，在對所述生物體的給藥中，本發明的ev分泌抑制劑的給藥條件例如除了前述例示的項目之外，可以進一步根據癌的種類(例如大腸癌、肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌以及多發性骨髓瘤等)、癌的進展度等適當決定。此外，所述生物體例如，從治療的觀點來看，可以是已患所述癌的對象，從預防的角度來看，可以是未患所述癌的對象或患病的有無不明的對象。
73.作為本發明的ev分泌抑制的用途，不限於這樣的例示。近年來，例如，有報告稱外泌體等ev參與體內細胞間的傳遞。作為具體例，例如可以舉出感染的病毒(例如，流感病毒、冠狀病毒等)在體內的傳遞。因此，根據本發明的ev分泌抑制劑，通過ev的分泌抑制，例如抑制病毒的傳遞，其結果是，也能夠阻滯病毒感染在體內的擴大。
m-010398、dharmacon公司)用作核酸分子sirna、all star陰性對照sirna(si03650318)(均為qiagen)用作陰性對照用的核酸分子sirna。
83.(細胞培養)mm231用的培養基使用在rpmi 1640培養基(gibco)中添加了10％熱滅活胎牛血清(fbs)和抗生物質-抗真菌溶液(gibco)的rpmi完全培養基。hct116用的培養基使用在maccoy5a中添加了10％熱滅活fbs和抗生素-抗真菌劑的maccoy5a完全培養基、其他細胞用的培養基使用在dmem培養基(gibco)中添加了10％熱滅活fbs和抗生素-抗真菌劑的dmem完全培養基。培養條件為37℃、5％二氧化碳、95％相對溼度(rh)。將約100000個細胞接種在18ml所述完全培養基中，孵育3-4天，使用繼代數少於20的細胞。
84.(分泌ev的回收)將培養的癌細胞用磷酸鹽緩衝生理鹽水(pbs)洗滌，並將培養基置換為含有所述抗生物質-抗真菌劑和2mmol/l l-穀氨醯胺(gibco)的advanced rpmi或advanced dmem。將置換後的調整培養液以2000
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g離心分離10分鐘除去細胞，得到的上清液用0.22μm過濾器(millipore)過濾。將得到的濾液以110000
×
g離心分離70分鐘，得到ev濃縮後的顆粒。用11ml的pbs洗滌所述顆粒，進一步地以110000
×
g超離心分離70分鐘，再回收。
85.(exo screen法)ev的檢測使用由alphascreen鏈黴親和素包被供體珠(6760002)、alphalisa非結合受體珠(6062011)和alphalisa通用緩衝液(al001f)構成的alphalisa試劑(perkin elmer)、96孔半區白板(6005560、perkin elmer)和檢測裝置enspire alpha 2300mutilabel讀板器(perkin elmer)。具體地，在所述板的各孔中添加5μl ev或10μl cm(細胞的培養上清液)、10μl用所述緩衝液製備的5nmol/l生物素化抗體、以及10μl 50μg/ml alphalisa受體珠結合抗體。cd9/cd9雙重陽性ev的檢測使用生物素化抗人cd9抗體和alphalisa受體珠結合抗人cd9抗體；cd9/cd63雙重陽性ev的檢測使用生物素化抗人cd9抗體和alphalisa受體珠結合抗人cd63抗體。此外，cd63/cd63雙重陽性ev的檢測使用生物素化抗人cd63抗體和alphalisa受體珠結合抗人cd63抗體。然後，將所述板在37℃下孵育1小時後，添加25μl 80μg/ml alphascreen鏈黴親和素包被供體珠，進一步在37℃下暗處孵育30分鐘。接著，將所述檢測裝置設定為激發波長680nm及發射檢測波長615nm，測定所述板的孔中的發射。抗體使用小鼠單克隆抗人cd9(克隆12a12)和cd63抗體(克隆8a12)(均屬cosmo bio)，均為市售品。
86.(利用納米粒子跟蹤分析(nta)的ev的分析)將回收的分泌ev懸浮於pbs中，進一步用pbs製備稀釋體系，用nanosight粒子跟蹤分析(lm10，軟體版本2.03)進行分析。所述粒子跟蹤以相機水平14從各樣本獲得至少5個60秒視頻。分析設定經最優化並在樣本間維持恆定。ev濃度計算為培養液的粒子/細胞，得到淨ev分泌率。由於利用所述exoscreen法的ev的測定結果與利用nta分析的ev的測定結果呈相關關係，能夠確認可以利用exoscreen法測定分泌ev量。
87.(一次性轉染試驗)在1.0
×
105個細胞/孔的條件下將2ml癌細胞懸浮液接種在6孔板中，孵育24小時後，添加10nmol/l目的核酸分子，通過轉染試劑(商品名dharmafect transfection reagent 1)進行所述核酸分子的轉染。所述核酸分子，使用所述mirna、所述sirna。在所述
24小時的孵育後，將培養基置換為含有所述抗生物質-抗真菌劑和2mmol/l-穀氨醯胺(gibco)的advanced rpmi 1640培養基或advanced dmem培養基。在置換的48小時後，提取總rna並用qpcr測定目的基因的表達。
88.(rna提取和qpcr分析)使用市售試劑(商品名qiazol、商品名mirneasy mini kit、qiagen)從培養細胞中提取總rna。使用市售試劑盒(商品名high-capacity cdna reverse transcription kit、applied biosystems)和隨機六聚體引物進行逆轉錄反應。使用市售試劑盒(商品名stepone plus、商品名taqman universal pcr mastermix、thermo fisher scientific)進行實時pcr分析。用β-肌動蛋白標準化mrna的表達。psat1用的探針使用taqman探針(applied biosystems)。
89.除非另有說明，否則實施例中的數據以平均值
±
標準誤差表示。統計顯著性由學生t檢驗決定。在點圖中，條形表示中位數和四分位數範圍，統計顯著性由學生t檢驗決定。p《0.05被認為具有統計顯著性。＊p《0.05、＊＊p《0.01。
90.[實施例a][實施例a1]鑑定了參與大腸癌和肺癌中ev分泌的調節的靶基因。
[0091]
(1)由癌細胞分泌的ev的檢測用mir-891b分別轉染大腸癌細胞hct116和肺癌細胞a549，回收其轉化體(mir-891b)的培養上清液(cm)和含有由所述轉化體(mir-891b)分泌的ev的ev級分，並利用所述exoscreen法測定了分泌ev量作為強度信號。此外，利用nta分析確認了各轉化體的分泌ev量。作為陰性對照，對轉染了mir-891b mirna mimic negative control#1的a549的轉化體(nc)也同樣測定了分泌ev量。然後，將轉化體(nc)的分泌ev量設為1，求出轉化體(mir-891b)的分泌ev的相對值(n＝3)。
[0092]
這些結果示於圖1。圖1中，(a)是示出了利用exoscreen法的分泌ev量的相對值的圖；(b)是示出了利用nta法的分泌ev量的相對值的圖。如圖1(a)所示，轉染了mir-891b的大腸癌細胞hct116和肺癌細胞a549的轉化體(mir-891b)，在所述cm和ev級分中，與轉化體(nc)相比，分泌ev量均被顯著地抑制。此外，如圖1(b)所示，利用nta方也獲得了同樣的結果。由這些結果可知，在大腸癌細胞和肺癌細胞中，mir-891b抑制ev分泌。
[0093]
(2)mir-891b的靶基因所述(1)中，由於通過mir-891b的轉染抑制了ev分泌，因此發明人等通過進一步的深入研究發現了psat1基因作為被mir-891b抑制表達的靶基因。因此，用抑制psat1基因的表達的sirna(sipsat1)轉染大腸癌細胞hct116和肺癌細胞a549，並利用exoscreen法和nta法確認了分泌ev量。此外，作為陰性對照，轉染all star陰性對照sirna並進行同樣的確認。這些結果示於圖2。圖2中，(a)是示出了利用exoscreen法的分泌ev量的相對值的圖；(b)是示出了利用nta法的分泌ev量的相對值的圖。
[0094]
如圖2(a)所示，轉染了sipsat1的大腸癌細胞hct116和肺癌細胞a549的轉化體(sipsat1)，在所述cm和ev級分中，與轉化體(nc)相比，分泌ev量均被顯著地抑制。此外，如圖2(b)所示，利用nta方也獲得了同樣的結果。以此方式，通過sipsat1對psat1基因的下調，
ev分泌被抑制，因此結合所述(1)的結果，可知mir-891b的靶基因為psat1基因。
[0095]
(3)靶基因的確認對於所述(2)中的psat1基因，進行其為mir-891b的直接靶基因的確認。
[0096]
首先，對於所述轉化體(mir-891b)和針對其的作為對照的所述轉化體(nc)，檢測psat1基因的表達。然後，將所述轉化體(nc)的表達量設為1，求出所述轉化體(mir-891b)的表達量的相對值。這些結果示於圖3(a)。圖3(a)是示出了psat1基因的表達量的相對值的圖。此外，對於所述轉化體(mir-891b)和針對其的作為對照的所述轉化體(nc)，利用免疫印跡法檢測psat1蛋白的表達。此外，作為對照，還檢測了β-肌動蛋白。這些結果示於圖3(b)。圖3(b)是示出了psat1蛋白的表達的免疫印跡法的照片。
[0097]
接下來，如圖3(c)所示，mir-891b具有與人psat1 mrna的3』utr(序列號2：uggacuuaauaaugcaaguugc為3』utr的部分區域)中的連續7個鹼基區域完美匹配的序列。因此，使用3』utr的所述7個鹼基區域為野生型序列(序列號3：aagttgc)的野生型psat1基因和3』utr』的所述7個鹼基區域為突變型序列(序列號4：ttcaacg)的突變型psat1基因，確認mir-891b的影響。具體地，進行了如下實驗。將野生型psat1基因或突變型psat1基因亞克隆到質粒載體psicheck2中，使用lipofectamine3000用該重組載體連同mir-891b或陰性對照用的mirna轉染人胚腎細胞(hek293細胞)。轉染48小時後，根據雙螢光素酶報告基因檢測系統(dual-luciferase reporter assay system)的操作程序，用讀板器定量轉化體的螢光素酶活性。
[0098]
這些結果示於圖3(d)。圖3(d)是示出了用螢光素酶活性相對值表示psat1的表達量的圖。
[0099]
如圖3(d)所示，mir-891b的轉染抑制了psat1基因的表達和psat1蛋白的表達。進一步地，在mir-891b的識別區域的序列為野生型的野生型psat1的情況下，通過mir-891b的轉染，psat1的表達量顯著地降低，但通過mir-891b的識別區域的序列為突變型，psat1的表達量沒有降低。由此可知，mir-891b識別psat1的3』utr並切斷psat1。即，證實了psat1基因是mir-891b的直接靶基因。
[0100]
[實施例a2]通過psat1基因的表達抑制，確認了來自各種癌細胞的ev分泌的抑制。
[0101]
除了使用黑色素瘤細胞a375、乳腺癌細胞mm231、胰腺癌細胞panc-1、多發性骨髓瘤細胞rpmi8226以外，與實施例a1(2)同樣，用sirna(sipsat1)進行轉染，並利用納米粒子跟蹤分析(nta)法測定了ev分泌量。這些結果示於圖4。圖4是示出了利用nta法的分泌ev量的相對值的圖。
[0102]
如圖4所示，在所有癌細胞中，與作為陰性對照的轉化體(nc)相比，轉染了sipsat1的轉化體(sipsat1)的分泌ev量被顯著地抑制。由這些結果可知，不僅是大腸癌細胞和肺癌細胞，各種癌細胞的ev分泌也可以通過psat1的表達抑制來抑制。由此，通過抑制psat1的表達，抑制來自各種癌細胞的ev分泌，可以治療這些癌、預防癌向其他器官轉移。
[0103]
[實施例a3]與所述實施例a1(2)同樣，用sirna(sipsat1)轉染大腸癌細胞hct116和肺癌細胞a549，確認了psat1沉默後的ev生物發生。對於沉默後的各轉化體，通過免疫螢光確認了cd63和psat1，確認在psat1沉默後的細胞質中，作為ev的標記的cd63的蓄積。此外，在轉染
了mir-891b的情況下，也同樣能夠確認cd63的蓄積。從該結果可以確認，通過抑制psat1的表達，ev的產生本身得以維持，但產生的ev在細胞質內蓄積，抑制了從細胞向外部的ev分泌。
[0104]
進一步地，對於psat1沉默後的所述轉化體，進行作為ev的標記的cd63和作為早期內體標記的eea1或作為晚期內體標記的rab7的共免疫染色。其結果為：在psat1沉默後的轉化體和作為陰性對照的轉化體中均未確認eea1與cd63之間的重複。另一方面，在作為陰性對照的轉化體中，cd63與rab7之間的大部分重疊，但在psat1沉默後的轉化體中，cd63與rab7之間的重疊很少。因此，基於強度測定了cd63單陽性的面積。該結果示於圖5。確認了如圖5所示，對於hct116和a549，通過進行psat1沉默，cd63單陽性的面積均顯著增加，ev在細胞內蓄積。這些結果表明，psat1可能在晚期內體合成的過程中在ev分泌中發揮作用。
[0105]
[實施例b]確認了在所述實施例a中，psat1參與ev分泌，通過psat1的表達抑制，能夠抑制ev分泌。由於psat1是絲氨酸合成途徑的酶蛋白，絲氨酸合成途徑參與ev分泌，推測可以通過絲氨酸合成途徑的阻滯，即絲氨酸合成的阻滯來抑制ev分泌。因此，確認了在實施例b中，無論psat1如何，通過阻滯絲氨酸合成途徑的任一步驟都可以抑制ev分泌。
[0106]
[實施例b1]由於普通dmem培養基中含有絲氨酸，因此使用不含絲氨酸的培養基，確認了添加絲氨酸對ev分泌的影響。
[0107]
使用含有1
×
胰島素、運鐵蛋白、硒溶液(100
×
its-g)、1
×
mem維生素溶液和絲氨酸(4mmol/l)的無血清含有絲氨酸的mem培養基和除不含絲氨酸以外組成相同的無血清不含絲氨酸的mem培養基。將大腸癌細胞hct116和肺癌細胞a549以使其成為5
×
103個細胞/孔接種至96孔板，並以使其成為1.5
×
105個細胞/孔接種至6孔板(第0天)，在培養基(含有10％fbs和1
×
抗生素-抗真菌劑(antibiotic-antimycotic)的dmem)中孵育24小時。在孵育後(第1天)，用sirna(sipsat1)或所述all star陰性對照sirna(nc)轉染各細胞，進一步孵育24小時。孵育後(第2天)，將孔中的培養基更換為所述不含絲氨酸的mem培養基或所述含有絲氨酸的mem培養基，進一步孵育48小時後(第4天)後，將所述96孔板用於exoscreen法，從所述6孔板回收培養後的培養基。從所述回收的培養基回收分泌ev，並進行nta。
[0108]
其結果為：與使用所述含有絲氨酸的mem培養基的情況相比較，在使用所述不含絲氨酸的mem培養基的情況下，psat1沉默後的轉化體生長緩慢。
[0109]
進一步地，利用exoscreen法和nta的測定結果示於圖6。對於利用所述exoscreen法的分泌ev量，將用sirna(sipsat1)轉染的轉化體的結果設為1，求出相對值；對於利用nta的分泌ev量，將用sirna(sipsat1)轉染的轉化體的分泌ev量設為1，求出相對值。圖6中，(a)是示出了利用exoscreen法的分泌ev量的相對值的圖；(b)是示出了利用nta法的分泌ev量的相對值的圖。
[0110]
如圖6所示，psat1未沉默的陰性對照(nc)在所述不含絲氨酸的mem培養基和所述含有絲氨酸的mem培養基中的結果幾乎相同。另一方面，用sirna(sipsat1)轉染的轉化體在所述不含絲氨酸的mem培養基中培養的結果，與作為陰性對照的轉化體(nc)相比，ev分泌量減少。其次，用sirna(sipsat1)轉染的轉化體的ev分泌量通過所述含有絲氨酸的mem培養基的使用(即，絲氨酸的添加)，與使用所述不含絲氨酸的mem培養基的結果相比，顯著地增加，
成為與陰性對照(nc)同程度的結果。由這些結果可知，絲氨酸合成參與ev分泌，可以通過絲氨酸合成的阻滯來抑制ev分泌。
[0111]
[實施例b2]在絲氨酸合成途徑中使用阻滯劑，並確認了對ev分泌的影響。
[0112]
在絲氨酸合成途徑中使用酶蛋白(phgdh)的阻滯劑nct-503作為所述阻滯劑。【化2】
[0113]
具體地，進行了如下試驗。將大腸癌細胞hct116和肺癌細胞a549以使其成為1.5
×
105個細胞/孔分別接種至6孔板(第0天)，在培養基(dmem+10％fbs，1
×
anti-anti培養基)中孵育24小時。孵育後(第1天)，除去所述培養基，然後向所述孔中添加不含絲氨酸的培養基和阻滯劑溶液。所述阻滯劑溶液由nct-503溶解在dmso中製備而成，每所述孔的阻滯劑的濃度為2.5μmol/l。然後，在進一步48小時的孵育後(第3天)，回收所述孔中的培養基，並進行所述孔中的細胞的計數。另外，陰性對照(nc)除了添加dmso代替所述阻滯溶液以外，同樣地進行。
[0114]
對於細胞內的蓄積ev，如下進行分析。即，對回收的細胞進行免疫染色，基於螢光強度測定cd63單陽性的面積，求出除以核數的值作為細胞內蓄積的ev量。這些結果示於圖7。另一方面，對於分泌ev，從所述回收的培養基回收ev並進行nta。將陰性對照的分泌ev量設為1，利用nta的分泌ev量作為相對值求出。該結果示於圖8。
[0115]
首先，確認了免疫螢光觀察的結果為：通過使癌細胞與阻滯劑共存，與所述實施例a3中的psat1沉默的轉化體的結果同樣，cd63陽性ev的細胞內蓄積。該結果在圖7中也同樣。即，在圖7中，使阻滯劑共存的細胞與nc相比較，ev量增加，因此也可以確認ev在細胞內蓄積，分泌受到阻滯。此外，與此相對應，如圖8所示，使阻滯劑共存的細胞的培養基與nc相比較，ev量減少，因此可以確認來自細胞的ev分泌受到阻滯。由這些結果也可知，可以通過絲氨酸合成的阻滯來抑制ev分泌。
[0116]
[實施例c]使用各種癌細胞確認了絲氨酸合成對ev分泌的控制。另外，已確認在本實施例中，利用了psat1沉默作為絲氨酸合成途徑的阻滯，但如上所述，並不限定於psat1的沉默，只要是絲氨酸合成的阻滯，同樣地可以抑制ev分泌。
[0117]
大腸癌細胞株(hct15、colo201、colo205、ht-29)和正常大腸成纖維細胞(ccd-18co)、肺癌細胞株(a427、h1650、h2228)和正常肺上皮細胞用作細胞。從這些細胞製備總rna並確認了psat1的表達水平，對於大腸細胞連同肺細胞，癌細胞中psat1的表達水平明顯地高於正常細胞。此外，除大腸癌和肺癌之外，對於卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、頭頸癌、多發性骨髓瘤、胰腺癌的細胞也同樣地確認了癌細胞中psat1的表達水平明顯地高於正常細胞。此外，肺癌患者中psat1的表達水平與存活率呈高度相關關係，具體地，表達水平越高，存活率越低。
[0118]
因此，在本實施方式中，與所述實施例a2同樣地，對於用sirna(sipsat1)轉染所述各種癌細胞並沉默了psat1的轉化體，利用nta進行ev分泌量的測定。這些結果示於圖9。圖9
是示出了利用nta法的分泌ev量的相對值的圖。
[0119]
如圖9所示，在所有癌細胞中，與作為陰性對照的轉化體(nc)相比，轉染了sipsat1的轉化體(sipsat1)的分泌ev量被顯著地抑制。由這些結果可知，各種癌細胞的ev分泌也可以通過psat1的表達抑制來抑制。由此，確認了通過抑制psat1的表達，絲氨酸合成受到阻滯，可以抑制來自各種癌細胞的ev分泌。因此，可以說通過psat1的表達抑制等阻滯絲氨酸合成，可以治療這些各種癌、預防癌向其他器官轉移。
[0120]
[實施例d]在絲氨酸合成途徑中使用酶蛋白(phgdh)的阻滯劑nct-503，確認了體內腫瘤體積的減少、ev分泌的抑制等。
[0121]
mda-mb-231_luc_d3h2ln細胞株(以下，稱為d3h2ln)用作乳腺癌轉移株。該細胞株是親株乳腺癌細胞mda-mb-231的修飾株，已確認相對於所述親株，其外泌體分泌量顯著地高且psat1的表達量顯著地高。即，對於所述親株和所述d3h2ln，與所述實施例a1同樣地，利用nta分析測定ev分泌量，此外，利用免疫印跡法測定psat1的表達。該結果示於圖10。在圖10中，(a)是示出了利用nta法的分泌ev量的相對值的圖；(b)是示出了psat1蛋白的表達的免疫印跡法的照片。如圖10所示，已確認相對於所述親株，d3h2ln的外泌體分泌量顯著地高且psat1的表達量顯著地高。
[0122]
免疫缺陷小鼠c.b-17scid mouse(雌性、6周齡)用作小鼠。將所述d3h2ln懸浮於pbs中以製備1
×
106個細胞/100μl的細胞懸浮液。然後，在第0天，將100μl所述細胞懸浮液注射到小鼠的乳腺皮下進行移植。接著，在第7天，所述d3h2ln植活，每天以每公斤體重40mg的條件，通過腹腔內注射向阻滯劑給藥組(n＝6)施用nct-503液(溶劑pbs)。對於非給藥組(n＝6，載劑(vehicle))，每天施用同量的pbs代替所述nct-503。所述給藥組連同所述非給藥組每周使用ivis-spectrum(住商醫藥有限公司(summit pharmaceuticals international corporation))測定原發灶(乳腺)的腫瘤體積。具體地，使用所述腫瘤的長徑和短徑，通過計算式(短徑
×
短徑
×
長徑
×
0.5)進行計算。此外，作為毒性的判定，每天測定小鼠的體重。在第35天宰殺小鼠，切除作為原發灶的乳腺和作為轉移灶的肺，測定原發灶的重量。
[0123]
這些結果示於圖11。在圖11中，(a)是示出了第21天和第35天的小鼠的原發灶(乳腺)的腫瘤體積的圖(計算值)；(b)是第35天的小鼠的原發灶(乳腺)的腫瘤重量的圖(實測值)。
[0124]
如圖11(a)所示，與所述非給藥組相比較，施用了所述阻滯劑的給藥組的原發灶的腫瘤的體積經時顯著地減小。此外，如圖11(b)所示，與所述非給藥組相比較，施用了所述阻滯劑的給藥組的原發灶的腫瘤的重量也顯著地減少。另外，在通過he染色確認作為轉移灶的肺時，與所述非給藥組的肺相比較，所述給藥組的肺傾向於具有更少的轉移灶。
[0125]
[實施例e]對於作為絲氨酸合成途徑的酶蛋白的phgdh，將上述實施例中確認ev分泌抑制的psat1作為陽性對照，通過各個基因(phgdh基因和psat1基因)的表達抑制，確認了來自癌細胞的ev分泌的抑制。除非另有說明，否則與所述實施例b1的方法同樣地進行。
[0126]
對於phgdh基因，siphgdh(產品號m-9518-01-0010、dharmacon公司)用作sirna。對於psat1基因，與所述實施例a同樣地，使用sipsat1。
[0127]
將肺癌細胞a549和大腸癌細胞hct116以使其成為5
×
103個細胞/孔分別接種至96孔板，並以使其成為1.5
×
105個細胞/孔分別接種至6孔板(第0天)，孵育24小時。培養基使用在dmem培養基(gibco)中添加了10％熱滅活fbs和抗生素-抗真菌劑的dmem完全培養基。然後，在第1天，用sirna(sipsat1或siphgdh)或所述all star陰性對照sirna轉染各細胞，進一步孵育24小時。孵育後(第2天)，將孔中的培養基更換為advanced dmem培養基，進一步孵育48小時後(第4天)，將所述96孔板用於exoscreen法，從所述6孔板回收培養後的培養基。從所述回收的培養基回收分泌ev，並進行nta。此外，對在所述6孔板中培養第4天的細胞數進行計數，將所述陰性對照的細胞數設為相對值1，計算存活率。
[0128]
圖12示出了肺癌細胞a549的結果；圖13示出了大腸癌細胞hct116的結果。在圖12和圖13中，(a)是細胞存活率的結果；(b)是示出了利用nta法的分泌ev量的相對值的圖。
[0129]
如圖12(a)和圖13(a)所示，與未沉默的對照相比較，所有癌細胞的沉默的轉化體的存活率幾乎沒有變化。此外，如圖12(b)和12(c)所示，與對照相比較，沉默的轉化體的ev分泌減少。
[0130]
[實施例f]確認了在所述實施例b2中，使用阻滯絲氨酸合成途徑的phgdh的阻滯劑nct-503可以抑制癌細胞中的ev分泌。此處，示出了不是由於細胞的細胞死亡而抑制ev分泌，而是通過nct-503的添加，絲氨酸合成途徑的阻滯抑制癌細胞等非正常細胞中特有的ev分泌的補充數據。
[0131]
在本例中，作為癌細胞中特有的ev分泌被抑制的間接數據，確認了正常細胞中nct-503的影響。在所述實施例b2中，添加了nct-503以使其相對於孔的培養基成為2.5μmol/l。因此，對於肺(hbec)和大腸(hcoepic)的各自的正常上皮細胞，使用未添加nct-503(添加dmso)的培養基或添加了nct-503以達到規定濃度(0.15625～2.5μmol/l)的添加nct-503的培養基進行培養，確認了細胞存活率和利用exoscreen的ev分泌量。
[0132]
具體地，進行了如下正常試驗。將所述正常上皮細胞以使其成為5000個細胞/孔接種至96孔板(第0天)，在培養基中孵育24小時(第1天)。所述大腸細胞的培養基使用coepicm 1
×
anti-anti培養基，所述肺細胞的培養基使用bebm 1
×
anti-anti培養基。在所述孵育後，確認細胞的粘附，進一步地，與所述實施例b2同樣地添加所述阻滯劑溶液(nct-503/dmso)，以使nct-503成為2.5μmol/l，進一步進行48小時的孵育(第3天)。然後，回收所述孔中的培養基，並進行所述孔中的細胞的計數。此外，作為對照，除了添加dmso代替所述阻滯劑溶液之外，同樣進行所述孔中的細胞的計數。然後，將作為對照的所述未添加(0m)nct的培養基(即添加dmso的培養基)中的細胞數設為相對值1，計算細胞存活率。另外，利用exoscreen測定ev分泌量。
[0133]
這些結果示於圖14。圖14是示出了每個細胞的ev分泌量的圖，其中，(a)是大腸的正常上皮細胞的結果；(b)是肺的正常上皮細胞的結果。其結果為：就所述添加nct-503的培養基的ev分泌量相對於作為未添加(0m)nct的添加dmso的培養基的ev分泌量，大腸及肺的正常上皮細胞幾乎看不到差別。作為具體例，例如，在添加了2.5μmol/l的nct-503的情況下，就所述添加nct-503的培養基的ev分泌量相對於未添加(0m)nct的添加dmso的培養基的ev分泌量，大腸的正常上皮細胞相對值為0.98，肺的正常上皮細胞相對值為1.17，幾乎看不到差別。即，nct-503的添加對正常上皮細胞中的ev分泌沒有影響。與這些結果相對，在所述
實施例b2中，通過對癌細胞添加2.5μmol/lnct-503，與僅添加了作為nct-503的溶劑的dmso的對照相比較，能夠顯著地抑制ev分泌。由這些結果確認，由癌細胞中nct-503的添加引起的ev抑制不是由於細胞死亡，而是由於細胞的癌化上調絲氨酸合成體系的表達，與此相對，阻滯劑nct-503阻滯所述合成體系的phgdh，其結果是，ev分泌被抑制。
[0134]
以上，參照實施方式及實施例對本發明進行說明，但本發明並非僅限於上述實施方式及實施例。對於本發明的結構和細節，本領域技術人員可以在本發明的範圍內進行能夠理解的各種變更。
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本技術要求以2020年4月7日申請的日本技術特願2020-069392及2021年2月16日申請的日本技術特願2021-022825為基礎的優先權，並將這些公開全部併入本文。【產業上的可利用性】
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根據本發明，能夠通過絲氨酸合成途徑的阻滯抑制來自細胞的細胞外囊泡的分泌。因此，通過根據本發明進行分泌抑制，可以分析細胞外囊泡的分泌或分泌的抑制對生物體的影響。因而，本發明可以說是例如在醫療領域中非常有用的技術。