一種植物抽穗期相關蛋白TaMYB72及其應用的製作方法

2023-10-26 02:38:02

一種植物抽穗期相關蛋白TaMYB72及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種植物抽穗期相關蛋白TaMYB72及其應用。本發明公開了如下任一物質在縮短植物抽穗期和/或降低植株高度中的應用：（1）SEQ?ID?No.2所示的蛋白；（2）SEQ?ID?No.2所示蛋白的編碼基因；（3）含有（2）所述編碼基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。本發明公開的TaMYB72蛋白在縮短植物抽穗期以及降低植株高度方面有重要作用。
【專利說明】—種植物抽穗期相關蛋白TaMYB72及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種植物抽穗期相關蛋白TaMYB72及其應用。
【背景技術】
[0002]高等植物在其整個生活史的發育過程中，開花是由營養生長向生殖生長轉變的一個重要過程，在合適的時間完成這個轉變是植物實現正常生殖發育所必需的。植物在長期進化過程中已經形成了一種對環境的適應性，它可以通過感知晝夜長短變化而控制開花，這就是光周期現象。植物開花途徑的分子生物學機制在模式植物擬南芥和水稻中的研究已取得很大的進展，但在主要糧食作物小麥中的研究還相對薄弱。
[0003]在植物生長發育的過程中，頂端分生組織(SAM)不斷分化出新的葉片，經過一定時間的營養生長後，在內外因素的雙重調控下，植物頂端細胞開始分化出花器官組織，植物由營養生長向生殖生長轉變，並在合適的時間內開花結實，完成生活史。對於擬南芥來說，成花時間指播種到開花的這段時間，對於水稻來說，成花時間就是指抽穗期，指從播種到穗子抽出劍葉葉鞘的這段時間。抽穗(開花)是植物由營養生長向生殖生長轉換的重要階段。對農作物而言，抽穗期的長短直接決定作物品種的地域和季節適應性，對品種的高產與穩產起著重要的作用，是作物育種的重要目標。
[0004]由於抽穗期性狀受一系列內在及外在環境因素的影響，所以抽穗期性狀呈現出多樣的變化，這樣就保證了作物對不同的生態環境具有廣泛的適應性。因此，克隆控制抽穗期的關鍵基因，並研究這些基因的功能及作用機制，對於深入探討農作物抽穗期的遺傳本質，為選擇性地培育適應不同 生態地區的農作物新品種提供候選基因及理論基礎。我國不同地區，尤其是南北之間的氣候差異很大，光照強度、日照時間及氣溫等生態環境顯著不同，因此培育具有適應不同生態地區的品種對保證我國糧食安全具有重要的意義。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一種植物抽穗期相關蛋白TaMYB72及其應用。
[0006]本發明提供的如下任一物質在縮短植物抽穗期和/或降低植株高度中的應用:
[0007](I) SEQ ID N0.2 所示的蛋白；
[0008](2) SEQ ID N0.2所示蛋白的編碼基因；
[0009](3)含有(2)所述編碼基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
[0010]所述抽穗期是指從播種到穗子抽出劍葉葉鞘的這段時間。
[0011]上述應用中，所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1中自5』末端起第258至第1325位核苷酸所示。
[0012]上述任一所述的應用中,所述植物為水稻。
[0013]一種製備抽穗期變短和/或植株高度變低的轉基因植物的方法也屬於本發明的保護範圍，包括如下步驟:將SEQ ID N0.2所示蛋白的編碼基因導入出發植物中，得到轉基因植物；與出發植物相比，轉基因植物的抽穗期變短和/或植株高度變低。[0014]上述方法中，所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1中自5』末端起第258至第1325位核苷酸所示。
[0015]上述任一所述的方法中，所述植物為水稻。
[0016]一種蛋白也屬於本發明的保護範圍，為如下(I)或(2)所示:
[0017](1)SEQ ID N0.2 所示的蛋白；
[0018](2)將SEQ ID N0.2所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質。
[0019]上述蛋白的編碼基因也屬於本發明的保護範圍。
[0020]上述編碼基因中，所述編碼基因為如下中至少一種:
[0021]1) SEQ ID N0.1 所示的 DNA 分子；
[0022]2) SEQ ID N0.1中自5』末端起第258至第1325位核苷酸所示的DNA分子；
[0023]3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA分子雜交且編碼所述蛋白質的DNA分子；
[0024]4)與I)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述蛋白質的DNA分子。
[0025]含有上述任一所述編碼基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也屬於本發明的保護範圍。
[0026]本發明提供的TaMYB72蛋白在縮短植物抽穗期以及降低植株高度方面有重要作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為水稻的表型。
【具體實施方式】
[0028]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0029]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0030]以下實施例中的定量實驗，均設置三次重複，結果取平均值。
[0031]2XPfu PCR MasterMix購自天根生化科技(北京)有限公司，產品目錄號為KP201，該試劑含pfutaq酶。
[0032]入門載體pD0NR?Zeo 購自 Life Technologies,產品目錄號為 12535-035。
[0033]BP Clonase? II Enzyme Mix 購自 Life Technologies,產品目錄號為 11789020。
[0034]大腸桿菌T0P10感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司。
[0035]LR Clonase? II Enzyme Mix 購自 Life Technologies,產品目錄號為 11791020。
[0036]Gateway ? Vector Conversion System,購自 Life Technologies,產品目錄號為 11828-019。
[0037]pCUbil390在文獻「彭昊(2005)博士論文，《利用T-DNA插入突變和RNA幹擾技術研究水稻基因功能》」中公開過，公眾可以從中國農業科學院作物科學研究所獲得。
[0038]目標載體pGW_CUbil390的構建:用平末端酶PmlI切開pCUbil390，得到載體；利用 Gateway ? Vector Conversion System,將 gateway cassete A (平端)連入載體，具體的方法為Gateway ? Vector Conversion System標準流程，公眾可從LifeTechnologies主頁下載,所得到的重組載體即為pGW_CUbil390。
[0039]日本晴(0.Sativa L.spp.japonica, var nippobare, AA genome)在文獻「李嘉，薛薌，左示敏，陳宗祥，潘存紅，張亞芳，李亞超，朱俊凱，馬玉銀，潘學彪(2013)，揚州大學學報，2013年02期」中公開過，公眾可以從中國農業科學院作物科學研究所獲得。
[0040]中國春小麥(Triticumaestivum L.)在文獻 「P.Sourdille, T.Cadalen, H.Guyomarc' h, J.Snape, M.Perretant, G.Charmet, C.Boeuf, S.Bernard and M.Bernard.(2003)An update of the Courtot X Chinese Spring intervarietal molecular markerlinkage map for the QTL detection of agronomic traits in wheat.Theoretical andApplied Geneticsl06(3): 530-538」中公開過，公眾可以從中國農業科學院作物科學研究所獲得。
[0041]—篩培養基:一篩培養基由NB基本培養基、2，4-D、潮黴素、噻孢黴素和Phytgel組成，ρΗ5.8 ;各成分的濃度如下:2.0mg/12, 4_D，50mg/l潮黴素，0.5g/l噻孢黴素，2.5g/lPhytgel0
[0042]二篩培養基:二篩培養基由NB基本培養基、脫落酸(ABA)、6_苄氨基嘌呤(BA)、α -萘乙酸(NAA)、潮黴素、噻孢黴素和phytgel組成，pH5.8 ;各成分的濃度如下:5.0mg/
1脫落酸(ABA)，2.0mg/16-苄氨基嘌呤(BA)，1.0mg/1 α -萘乙酸(NAA)，50mg/l 潮黴素，0.5g/l 噻孢黴素，2.5g/lphytgel, pH5.8。
[0043]三篩培養基:三篩培養基由MS培養基(含大量兀素,微量兀素和有機成分)、鹿糖和瓊脂組成，PH5.8 ;各成分的濃度如下:30g/l蔗糖，15g/l瓊脂。
[0044]實施例1、TaMYB72基因過表達載體以及重組農桿菌的構建
[0045]TaMYB72的全長cDNA序列如SEQ ID N0.1所示，TaMYB72蛋白的胺基酸序列如SEQID N0.2 所示。
[0046]一、利用Gateway技術構建TaMYB72基因過表達載體
[0047](一)attB 引物設計
[0048]設計併合成如下引物，並在上遊引物(Fl)和下遊引物(Rl)的5』端分別加入attBl和attB2重組位點。
[0049]Fl:5，-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT CGATGTTCTCTTCCAAGAAG-3，；
[0050]Rl:5，-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT TTATCCGTAGATCACCGAC-3，。
[0051](下劃線所示序列為attB重組位點)
[0052](二)提取中國春小麥的總RNA，反轉錄為cDNA。
[0053](三)以步驟(二)得到的cDNA為模板，用Fl和Rl為引物進行PCR擴增，得到PCR
擴增產物。
[0054]PCR 體系(25.0μ l):12.5μ 12XPfu PCR MasterMix、3.0 μ l 上遊引物(濃度為
2μ Μ)、3.0 μ l 下遊引物(濃度為 2 μ Μ)、2.0 μl cDNA(質量為 30ng)、DMS01.5 μ 1，加 ddH20補足體系至25.0 μ 1
[0055]PCR 程序:95°C 5min ；94°C 30sec (變性)、60°C 30sec (退火)、72°C 1.5min (延伸)，35 個循環；72°C 5min。
[0056](四)BP反應[0057]BP反應體系:步驟(三)得到的PCR擴增產物25ng、入門載體pD0NR?Zeo40ng、BPClonase? II Enzyme Mix0.3 μ 1，加滅菌 ddH20 補足體系至 2.5 μ I。
[0058]BP 反應程序:25°C IOh。[0059](五)將2.5 μ I步驟(四)得到的BP反應產物加入30 μ I大腸桿菌Τ0Ρ10感受態細胞，冰浴15min，42°C熱激90sec，然後迅速置於冰上2min ;加入500 μ I SOC培養基，37°C、225rpm/min復甦50min ;將復甦液均勻塗布於LB固體培養基(含30 μ g/mlZeocin)表面，37°C倒置培養過夜；pD0NR?Zeo載體自身帶有致死基因，不能在培養基上生存，通過BP反應目標基因片段會取代致死基因，所以在LB固體培養基(含30μ g/ml Zeocin)上生存的克隆即為含有目標基因片段的入門克隆(entry clone)。
[0060](六)將步驟(五)得到的入門克隆提取質粒進行雙向測序驗證，測序驗證所用引物為pD0NRTMZeo通用引物，序列如下:
[0061]M13F:5，-GTAAAACGACGGCCAG-3，；
[0062]M13R:5，-CAGGAAACAGCTATGAC-3，。
[0063]測序結果表明，得到的質粒為在入門載體pD0NR?Zeo的attPl和attP2重組位點之間插入了 SEQ ID N0.1中自5』末端起第258至第1325位核苷酸所示的DNA分子，將該質粒命名為入門質粒(entry plasmid)。
[0064](七)LR反應
[0065]LR反應體系:入門質粒25ng、目標載體pGW_CUbil39040ng、LRClonase? II EnzymeMix0.3 μ 1，加滅菌 ddH20 補足體系至 2.5 μ I。
[0066]LR 反應程序:25°C、IOh。
[0067](八)將2.5 μ I步驟(七)得到的LR反應產物加入30 μ I大腸桿菌Τ0Ρ10感受態細胞，冰浴15min，42°C熱激90sec，然後迅速置於冰上2min ;加入500 μ I SOC培養基，37°C、225rpm/min復甦50min ;將復甦液均勻塗布於LB固體培養基(含50 μ g/ml卡那黴素)表面，37°C倒置培養過夜；PGW-CUbil390自身帶有致死基因，不能在LB固體培養基(含50 μ g/ml卡那黴素)上生存，通過LR反應目標基因片段會取代致死基因，所以在培養基上生存的克隆即為含有目標基因片段的目標克隆(Destiantion clone)。
[0068](九)將步驟(八)得到的目標克隆提取質粒進行雙向測序驗證，測序驗證所用引物為pGW-CUbil390載體插入片段兩端啟動子區及終止區引物，序列如下:
[0069]Pub1:5， -TTTGTCGATGCTCACCCTG-3，；
[0070]Tnos:5， -TTGCCAAATGTTTGAACGA-3，。
[0071]測序結果表明，得到的質粒為在目標載體pGW_CUbil390的attRl和attR2重組位點之間插入了 SEQ ID N0.1中自5』末端起第258至第1325位核苷酸所示的DNA分子，將該質粒命名為目標質粒。
[0072]二、重組農桿菌的構建
[0073]將步驟一得到的目標質粒轉化農桿菌EHA105，得到重組菌；將重組菌提質粒，送測序,結果證明重組菌構建正確。
[0074]同時將空載體pGW_CUbil390轉化農桿菌EHA105，得到對照重組菌。
[0075]實施例2、轉基因植物的獲得
[0076]一、水稻愈傷組織的農桿菌侵染[0077](一)取水稻日本晴的種子去殼滅菌，平鋪到愈傷誘導培養基誘導兩周，挑出愈傷繼代培養兩周至長出直徑2_左右的愈傷顆粒。
[0078](二)將實施例1得到的重組菌用LB液體培養基(含利福平50mg/L+潮黴素50mg/L)，培養過夜使OD6tltl值為0.6-0.8左右，得到菌液。
[0079](三)取3mL左右的菌液4000rmp離心3分鐘，去上清，將菌液重懸於20mL左右的AMM (含ΙΟΟμπιοΙ/L乙醯丁香酮)液體培養基中。28°C，150rpm搖兩個小時，得到目的菌液。
[0080](四)浸染:將步驟(一)得到的愈傷顆粒在目的菌液中浸泡20分鐘，再放到有一層濾紙的共培養基上。三天以後將愈傷用滅菌蒸餾水洗三次，每次20分鐘左右，再用含500mg/L羧苄的滅菌水洗兩次，每次30分鐘，可重複多次直到洗液很清亮，將愈傷放在無菌濾紙上晾乾，再將其放到一篩培養基上。兩周後將愈傷轉到二篩培養基上，再兩周後轉到三篩培養基，得到抗性愈傷。
[0081](五)將抗性愈傷轉到分化培養基上，等待分化小苗。
[0082](六)將分化的小苗上到1/2MS培養基上生根，然後轉到溫室和大田種植，得到TO代植株，收穫TO代種子，將TO代種子播種到大田中種植，得到實驗組的Tl代植株。將Tl代植株自交，得到Tl代種子，以此方法直到獲得T2代植株。
[0083]同時將實施例1得到的對照重組菌進行上述實驗得到對照組的Tl代植株和T2代植株。
[0084]二、分別取實驗組和對照組的Tl代植株和T2代植株進行分子鑑定。
`[0085]具體步驟如下:
[0086]提取實驗組和對照組的Tl代植株和T2代植株的葉片的基因組DNA，以F2和R2為引物進行PCR鑑定，靶序列為約458bp的條帶。
[0087]F2:5， -CAAATGGAGGTTCAAAGGA-3，；
[0088]R2:5，-GGTGCCATCTGGAGTAGC-3，。
[0089]PCR鑑定為陽性的植株即為轉TaMYB72基因的植株。對於某一 Tl代植株，如果由此植株自交得到的T2代植株均經過PCR鑑定為陽性，則該植株為純合的轉TaMYB72基因的植株，該植株及其後代即為I個純合的轉TaMYB72基因株系。
[0090]經過上述鑑定實驗，得到純合的轉TaMYB72基因株系的T2代水稻。
[0091]對照組的Tl代植株和T2代植株進行上述分子鑑定，結果均為陰性。
[0092]實施例3、轉基因植物抽穗期鑑定
[0093]將實施例2鑑定的純合的轉TaMYB72基因株系的T2代水稻以及野生型日本晴水稻(以下簡稱野生型水稻)在北京和廊坊兩地種植，對轉基因水稻和野生型水稻的抽穗期、株高進行考察，結果如圖1和表1所示。
[0094]圖1A為大田中轉基因水稻和野生型水稻的生長情況；圖1B為轉基因水稻和野生水稻的盆栽對照。
[0095]圖1中的轉基因株係為純合的轉TaMYB72基因株系的T2代水稻，日本晴為野生型日本晴水稻。
[0096]抽穗期和株高的數據如表1所示。
[0097]抽穗期是指從播種到穗子抽出劍葉葉鞘的這段時間。
[0098]表1北京和廊坊兩地種植的T2代轉基因水稻以及野生型日本晴水稻表型數據[0099]
【權利要求】
1.如下任一物質在縮短植物抽穗期和/或降低植株高度中的應用: (1)SEQ ID N0.2所示的蛋白； (2)SEQ ID N0.2所示蛋白的編碼基因； (3)含有(2)所述編碼基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
2.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於:所述編碼基因的核苷酸序列如SEQIDN0.1中自5』末端起第258至第1325位核苷酸所示。
3.根據權利要求1或2所述的應用，其特徵在於:所述植物為水稻。
4.一種製備抽穗期變短和/或植株高度變低的轉基因植物的方法，包括如下步驟:將SEQ ID N0.2所示蛋白的編碼基因導入出發植物中，得到轉基因植物；與出發植物相比，轉基因植物的抽穗期變短和/或植株高度變低。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於:所述編碼基因的核苷酸序列如SEQIDN0.1中自5』末端起第258至第1325位核苷酸所示。
6.根據權利要求4或5所述的方法，其特徵在於:所述植物為水稻。
7.一種蛋白，為如下(I)或(2)所示: Cl) SEQ ID N0.2所示的蛋白； (2)將SEQ ID N0.2所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白`質。
8.權利要求7所述蛋白的編碼基因。
9.根據權利要求8所述的編碼基因，其特徵在於:所述編碼基因為如下中至少一種: 1)SEQ ID N0.1所示的DNA分子； 2)SEQ ID N0.1中自5』末端起第258至第1325位核苷酸所示的DNA分子； 3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA分子雜交且編碼權利要求7所述蛋白質的DNA分子; 4)與I)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼權利要求7所述蛋白質的DNA分子。
10.含有權利要求8或9所述編碼基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
【文檔編號】C12N15/29GK103665129SQ201310698374
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月18日 優先權日:2013年12月18日
【發明者】孔秀英, 張立超, 趙光耀, 賈繼增, 劉旭, 夏川 申請人:中國農業科學院作物科學研究所