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用於治療炎性疾病的組合物和方法

2023-09-19 21:43:35 2

專利名稱：用於治療炎性疾病的組合物和方法
技術領域：
本發明涉及使用含單結構域抗體配體和雙特異性配體的抗體多肽構建物治療疾病(包括類風溼性關節炎)的方法、這些配體的組合物以及製備和使用這些配體的方法。具體地說，本發明提供結合炎性細胞因子(包括TNF-α和VEGF)的單結構域抗體的製備方法。本發明還公開了含結合第一個抗原或表位的第一個單免疫球蛋白可變結構域和結合第二個抗原或表位的第二個單免疫球蛋白可變結構域的雙特異性配體。更具體地說，本發明涉及雙特異性配體，其中與第一個和第二個抗原或表位中至少一個的結合起增加配體體內半壽期的作用。本發明描述了含一種以上結合特異性的開放和封閉構象配體。本發明公開了使用單結構域抗體構建物和結合第一個與第二個抗原的雙特異性配體治療類風溼性關節炎的方法，其中所述雙特異性配體可包含例如TNF-α、VEGF和HSA的任意組合。
TNF-α顧名思義，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)最初被描述為具有抗腫瘤特性的分子，但隨後發現該分子在其它過程中起關鍵作用，包括在介導炎症和自身免疫疾病中的顯著作用。TNF-α在炎性疾病中是關鍵的促炎細胞因子，這些炎性疾病包括例如類風溼性關節炎(RA)、Crohn病、潰瘍性結腸炎和其它腸病、銀屑病、中毒性休克、移植物抗宿主疾病和多發性硬化。
TNF-α的促炎作用導致組織損傷，例如誘導對血管內皮細胞的促凝血活性(Pober等，J.Immunol.1361680(1986))、增加嗜中性粒細胞和淋巴細胞的粘附(Pober等，J.Immunol.1383319(1987))和刺激巨噬細胞、嗜中性粒細胞和血管內皮細胞釋放血小板活化因子(Camussi等，J.Exp.Med.1661390(1987))。
合成為具有胞內尾的26kD跨膜前體蛋白的TNF-α，其被TNF-α-轉換金屬蛋白酶切割，然後分泌為17kD的可溶性蛋白。活性形式由17kD單體的同三聚體組成，其與兩種不同的細胞表面受體p55TNFR1和p75 TNFR2相互作用。還有證據表明，TNF-α的細胞表面結合前體形式可介導該因子的某些生物學作用。大部分細胞同時表達介導配體的不同生物學功能的p55和p75受體。p75受體參與觸發淋巴細胞增殖，p55受體參與TNF介導的細胞毒性、凋亡、抗病毒活性、成纖維細胞增殖和NF-κB活化(參見Locksley等，2001，Cell 104487-501)。
TNF受體是膜蛋白家族的成員，該家族包括NGF受體、Fas抗原、CD27、CD30、CD40、Ox40和淋巴毒素α/β異二聚體的受體。同三聚體與受體的結合誘導受體聚集為2個或3個p55或p75分子的小簇。TNF-α主要由活化的巨噬細胞和T淋巴細胞產生，但在急性炎症反應當中也由嗜中性粒細胞、內皮細胞、角質細胞和成纖維細胞產生。
TNF-α處於促炎細胞因子級聯的頂點(綜述於Feldmann和Maini，2001，Ann.Rev.Immunol.19163)。該細胞因子誘導另外的促炎細胞因子(具體地說為IL-1和IL-6)的表達或釋放(參見例如Rutgeerts等，2004，Gastroenterology 1261593-1610)。抑制TNF-α會抑制包括IL-1、IL-6、IL-8和GM-CSF的炎性細胞因子的產生(Brennan等，1989，Lancet2244)。
由於TNF-α在炎症中的作用，所以其在減輕炎性疾病症狀的工作中已成為重要的抑制標靶。已實行了各種用於疾病臨床治療的TNF-α抑制方法，具體地說包括使用可溶性TNF-α受體和TNF-α特異性抗體。被批准臨床使用的商品包括例如抗體產品RemicadeTM(英利昔單抗；Centocor，Malvern，PA；一種攜帶人IgG4恆定區和小鼠可變區的嵌合單克隆IgG抗體)、HumiraTM(阿達木單抗或D2E7；AbbottLaboratories，描述於美國專利第6,090,382號)和可溶性受體產物EnbrelTM(依那西普，一種可溶性的p75 TNFR2 Fc融合蛋白；Immunex)。
TNF-α在炎性關節炎中的作用綜述於例如Li和Schwartz，2003，Sringer Semin.Immunopathol.2519-33。在RA中，TNF-α在發炎的滑膜中(具體地說是在軟骨-血管翳接合處)高度表達(DiGiovine等，1988，Ann.Rheum.Dis.47768；Firestein等，1990，J.Immunol.1443347；和Saxne等，1988，Atrhritis Rheum.311041)。除了證實TNF-α增加炎性細胞因子IL-1、IL-6、IL-8和GM-CSF的水平以外，TNF-α還可獨自引發關節炎症和成纖維細胞樣滑膜細胞增殖(Gitter等，1989，Immunology 66196)；誘導膠原酶，由此引起軟骨破壞(Dayer等，1985，J.Exp.Med.1622163；Dayer等，1986，J.Clin.Invest.77645)；通過關節軟骨細胞抑制蛋白聚糖合成(Saklatvala，1986，Nature 322547；Saklatvala等，1985，J.Exp.Med.1621208)；並可刺激破骨細胞生成和骨吸收(Abu-Amer等，2000，J.Biol.Chem.27527307；Bertolini等，1986，Nature 319516)。TNF-α誘導骨髓的CD14+單核細胞釋放增加。該單核細胞可浸潤關節，並經RANK(受體活化物或NF-κB)-RANKL信號轉導途徑放大炎症反應，在關節炎症中導致破骨細胞形成(綜述於Anandarajah和Richlin，2004，Curr.Opin.Rheumatol.16338-343)。
TNF-α是急性期蛋白，通過其對IL-8的誘導增加血管通透性，由此將巨噬細胞和嗜中性粒細胞募集至感染部位。一旦出現這種情況，活化的巨噬細胞就繼續產生TNF-α，由此保持和放大炎症反應。
用可溶性受體構建物依那西普滴定TNF-α對RA治療有效，但對Crohn病治療無效。相反，抗體TNF-α拮抗劑英利昔單抗有效治療RA和Crohn病這二者。因此，僅中和可溶性TNF-α不是與抗TNF型治療效力相關的唯一機制。相反，封閉由TNF-α誘導的其它促炎信號或分子也起作用(Rutgeerts等，出處同上)。例如，給予英利昔單抗明顯降低粘附分子的表達，導致嗜中性粒細胞對炎症部位的浸潤下降。此外，英利昔單抗治療在Crohn病中導致先前發炎的腸黏膜上的炎性細胞消失。固有層中活化T細胞的消失由以Fas依賴性方式活化Caspase 8、9接著活化Caspase 3引起的具有膜結合TNF-α的細胞的凋亡介導(參見Lugering等，2001，Gastroenterology 1211145-1157)。因此，膜結合的或受體結合的TNF-α是抗TNF-α治療方法的重要標靶。其他人已經表明，英利昔單抗結合活化的外周血細胞和固有層細胞，並通過活化Caspase 3誘導凋亡(參見Van den Brande等，2003，Gastroenterology 1241774-1785)。
在細胞內，三聚TNF-α與其受體的結合觸發信號轉導事件級聯，包括替代抑制分子如SODD(死亡結構域沉默子)以及結合適體因子FADD、TRADD、TRAF2、c-IAP、RAIDD和TRIP，加上激酶RIP1和某些Caspase(綜述於Chen和Goeddel，2002，Science 2961634-1635；以及Muzio和Saccani，載於Methods in Molecular MedicineTumor Necrosis Factor，Methods and Protocols；Corti和Ghezzi編輯，(Humana Press，New Jersey)，81-99頁)。組裝的信號轉導複合物可通過NF-κB活化和隨後的下遊基因活化來活化細胞存活通路，或通過Caspase活化來活化凋亡通路。
在其它疾病中，TNF-α可誘導相似的胞外下遊細胞因子級聯和胞內信號轉導通路。因此，對於其中TNF-α分子促進病理狀況的其它疾病或障礙，抑制TNF-α提供了一種治療方法。
VEGF血管生成在炎性滑膜組織的活性增殖中起重要作用。高度血管化的RA滑膜組織侵襲外周關節軟骨和骨組織，導致關節損傷。
血管內皮細胞生長因子(VEGF)是已知最有效的血管生成細胞因子。VEGF是肝素結合的分泌性同二聚糖蛋白，由於其初級轉錄物的可變剪接而以幾種可變形式存在(Leung等，1989，Science 2461306)。還已知VEGF為血管通透性因子(VPF)，這歸因於其誘導炎症中的重要過程血管滲漏的能力。在RA患者滑膜組織中鑑別出VEGF突顯了VEGF在RA病理學中的潛在作用(Fava等，1994，J.Exp.Med.180341346；Nagashima等，1995，J.Rheumatol.221624-1630)。依據其中於鼠膠原蛋白誘導型關節炎(CIA)模型中給予抗VEGF抗體的研究，VEGF在RA病理學中的作用得以鞏固。在這些研究中，當誘發疾病時，關節中的VEGF表達增加，給予抗-VEGF抗血清阻斷了關節疾病的發展，並改善既有疾病(Sone等，2001，Biochem.Biophys.Res.Comm.281562-568；Lu等，2000，J.Immunol.1645922-5927)。
抗體多肽抗體對其結合靶是高度特異性的，儘管抗體源自天然的自身防禦機制，但抗體在用於治療人類患者疾病時面臨著幾個挑戰。常規抗體是多亞單位的大蛋白分子，含至少4條多肽鏈。例如，人IgG具有2條重鏈和2條輕鏈，其二硫鍵鍵合，以形成功能性抗體。常規IgG的大小為約150kD。因為其相對較大的尺寸，所以完整抗體(例如IgG、IgA、IgM等)在治療有效性方面受限，這可歸因於例如組織穿透方面的問題。相當多的研究工作集中在鑑別和生產保留抗原結合功能和溶解性的較小抗體片段。
抗體的重鏈和輕鏈多肽鏈含直接參與抗原相互作用的可變(V)區以及提供結構支持和起與免疫效應子的非抗原特異性相互作用的恆定(C)區。常規抗體的抗原結合結構域由兩個分離的結構域組成重鏈可變結構域(VH)和輕鏈可變結構域(VL其可為Vκ或者Vλ)。抗原結合位點自身由6個多肽環組成3個來自VH結構域(H1、H2和H3)，3個來自VL結構域(L1、L2和L3)。在體內，通過組合重排基因節段產生編碼VH和VL結構域的V基因的多樣性主庫。C區包括輕鏈C區(稱為CL區)和重鏈C區(稱為CH1、CH2和CH3區)。
已依據蛋白酶消化鑑別出天然抗體的眾多較小抗原結合片段。這些片段包括例如「Fab片段」(VL-CL-CH1-VH)、「Fab′片段」(具有重鏈鉸鏈區的Fab)和「F(ab′)2片段」(通過重鏈鉸鏈區接合的Fab′片段的二聚體)。已使用重組方法產生更小的抗原結合片段，稱為「單鏈Fv」(可變片段)或「scFv」，其由通過合成肽接頭接合的VL和VH組成。
單結構域抗體儘管通常已知天然抗體(例如人和大部分其它哺乳動物中)的抗原結合單位由一對V區(VL/VH)組成，但駱駝科(camelid)物種表達大比例的全功能、高特異性、無輕鏈序列的抗體。已發現駱駝科重鏈抗體為單個重鏈經其恆定區二聚化的同二聚體。這些駱駝科重鏈抗體的可變區被稱為VHH結構域，保留在分離為VH鏈片段時以高特異性結合抗原的能力((Hamers-Casterman等，1993，Nature 363446-448；Gahroudi等，1997，FEBS Lett.414521-526)。還已由例如由免疫小鼠脾臟的基因組DNA擴增並在大腸桿菌中表達的鼠VH基因文庫中鑑別出抗原結合的單VH結構域(Ward等，1989，Nature 341544-546)。Ward等將分離的單VH結構域命名為「dAb」，代表「結構域抗體」。術語「dAb」在本文指特異性結合抗原的單免疫球蛋白可變結構域(VH、VHH或VL)多肽。「dAb」獨立於其它V結構域結合抗原；但是，如同該術語在本文使用的情況一樣，「dAb」可以同其它VH或VL結構域的同或異多聚體形式存在，在該情況下dAb結合抗原不需要其它結構域，即在該情況下dAb獨立於另外的VH、VHH或VL結構域結合抗原。
單免疫球蛋白可變結構域，例如VHH，是已知最小的抗原結合抗體單位。為用於治療，優選人抗體，這主要是因為其在給予患者時不大可能激發免疫應答。如上所述，分離的非駱駝科VH結構域往往相對不溶，通常表達較差。駱駝科VHH與人抗體VH結構域的對比揭示，在對應於人VH結構域的VH/VL接合處的駱駝科VHH結構域構架區中有幾個關鍵差異。已對人VH3的這些殘基進行了更接近地類似VHH序列的突變(具體地說為Gly 44 Glu、Leu 45 Arg和Trp 47Gly)，以產生保留抗原結合活性(Davies和Riechmann，1994，FEBS Lett.339285-290)且還有改善的表達和溶解性的「駱駝化」人VH結構域。(本文使用的可變結構域胺基酸編號與Kabat編號慣例(Kabat等，1991，Sequences of Immunological Interest，第5版，美國健康與人類服務部，Washington，D.C.)一致)。WO 03/035694(Muyldermans)報導，Trp 103Arg突變改善了非駱駝科VH結構域的溶解性。Davies和Riechmann(1995，Biotechnology N.Y.13475-479)還報導了駱駝化人VH結構域噬菌體展示庫的產生和以100-400nM範圍內的親合力結合半抗原的克隆的選擇，但選定的結合蛋白抗原的克隆具有較弱的親合力。
抗體的抗原結合結構域包含2個分離的區域重鏈可變結構域(VH)和輕鏈可變結構域(VL其可為Vκ或者Vλ)。抗原結合位點自身由6個多肽環組成3個來自VH結構域(H1、H2和H3)，3個來自VL結構域(L1、L2和L3)。通過組合重排基因節段生產編碼VH和VL結構域的V基因的多樣性主庫。VH基因通過3個基因節段VH、D和JH的重組產生。在人中，根據單倍型，有約51種功能性VH節段(Cook和Tomlinson(1995)Immunol Today，16237)、25種功能性D節段(Corbett等，(1997)J.Mol.Biol.，26869)和6種功能性JH節段(Ravetch等，(1981)Cell，27583)。VH節段編碼形成VH結構域的第一個和第二個抗原結合環(H1和H2)的多肽鏈區，而VH、D和JH節段組合形成VH結構域的第三個抗原結合環(H3)。VL基因通過重組僅2個基因節段VL和JL產生。在人中，根據單倍型，有約40種功能性Vκ節段(Schable和Zachau(1993)Biol.Chem.Hoppe-Seyler，3741001)、31種功能性Vλ節段(Williams等，(1996)J.Mol.so Biol.，264220；Kawasaki等，(1997)Genome Res.，7250)、5種功能性Jκ節段(Hieter等，(1982)J.Biol.Chef.，2571516)和4種功能性Jλ節段(Vasicek和Leder(1990)J.Exp.Med.，172609)。VL節段編碼形成VL結構域的第一個和第二個抗原結合環(L1和L2)的多肽鏈區，而VL和JL節段組合形成VL結構域的第三個抗原結合環(L3)。一般認為，選自該主庫的抗體多樣化得足以以至少中等的親合力結合幾乎所有抗原。通過重排基因的「親合力突變」產生高親合力抗體，其中免疫系統以改善的結合為基準生產和選擇點突變。
抗體的結構和序列分析表明，6個抗原結合環中有5個(H1、H2、L1、L2、L3)具有少量主鏈構象或規範結構(Chothia和Lesk(1987)dMol.Biol.，196901；Chothia等，(1989)Nature，342877)。主鏈構象由(i)抗原結合環的長度和(ii)抗原結合環和抗體構架中的某些關鍵位置的特定殘基或殘基類型決定。環長和關鍵殘基的分析能使我們預測由大部分人抗體序列編碼的H1、H2、L1、L2和L3的主鏈構象(Chothia等，(1992)J.Mol.Biol.，227799；Tomlinson等，(1995)EMBOJ.，144628；Williams等，(1996)J.Mol.Biol.，264220)。儘管H3區就序列、長度和結構而言更加多樣化(由於使用D節段)，但其也形成少量短環長的主鏈構象，其取決於環和抗體構架中關鍵位置的具體殘基的長度和存在情況或殘基類型(Martin等，(1996)J.Mol.Biol，263800；Shirai等，(1996)FEBS Letters，3991)。
雙特異性抗體含VH和VL區互補對的雙特異性抗體是本領域已知的。這些雙特異性抗體必須包含2對VH和VL，各個VH/VL對結合單個抗原或表位。所描述的方法包括雜合雜交瘤(Milstein和Cuello，Nature 305537-40)、微型抗體(Hu等，(1996)Cancer Res 30563055-3061)、雙功能抗體(Holliger等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，6444 6448；WO 94/13804)、螯合重組抗體(CRAb；(Neri等，(1995)J.Mol.Biol.246，367-373)、雙scFv(例如Atwell等，(1996)Mol.Immunol.33，13011312)、「洞中結(knobs in holes)」穩定化抗體(Carter等，(1997)ProteinSci.6,781 788)。在每種情況下，各個抗體類型均包含兩個抗原結合位點，每個抗原結合位點均為VH和VL結構域互補對的形式。各個抗體由此能夠同時結合2個不同的抗原或表位，與每個抗原或表位的結合由VH及其互補VL結構域介導。這些技術中的每一種均具有其特定的缺點；例如對雜合雜交瘤來說，失活的VH/VL對可極大地降低雙特異性IgG的分數。
而且，大部分雙特異性方法依賴於不同VH/VL對的結合或VH和VL鏈的結合，以重建兩個不同的VH/VL結合位點。因此，不可能控制組裝分子中針對各個抗原或表位的結合位點的比率，因此，許多組裝分子結合一個抗原或表位，但不結合另一個。在某些情況下，已有可能在亞單位接合處工程改造重鏈和輕鏈(Carter等，1997)，以便提升對兩個抗原或表位均具有結合位點的分子數，但這永不會導致所有分子都結合兩個抗原或表位。
有一些證據表明，可將兩種不同的抗體結合特異性加入到同一結合位點中，但這些結合位點通常提供兩種或多種對應於結構相關抗原或表位的特異性，或者對應於具有廣泛交叉反應的抗體。例如，已如此描述了交叉反應抗體，通常其中兩個抗原在序列或結構上相關，例如雞蛋溶菌酶和火雞溶菌酶(McCafferty等，WO 92/01047)，或者游離半抗原和綴合至載體的半抗原(Griffiths AD等，EMBO J 19941314 3245-60)。在另一個實例中，WO 02/02773(Abbott Laboratories)描述了具有「雙重特異性」的抗體分子。所提到的抗體分子為針對多種抗原產生或選擇的抗體，使得其特異性覆蓋一種以上的抗原。在WO 02/02773的抗體中的各個互補VH/VL對指定了對兩個或更多結構相關抗原的單一結合特異性；在這種互補對中的VH和VL結構域均不具有單獨的特異性。
因此，抗體具有廣泛的單一特異性，其包括兩種結構相關抗原。而且，已描述了為多反應性的天然自身抗體(Casali和Notkins，Ann.Rev.Immunol.7，515-531)，其與至少兩種(通常更多)結構不相關的不同抗原或表位反應。還已經表明，對單克隆抗體使用噬菌體展示技術選擇隨機肽庫將鑑別出一系列匹配抗原結合位點的肽序列。這些序列中有一些是高度相關的，具有共有序列，而其它序列非常不同，被稱為模擬表位(Lane和Stephen，Current Opinion in Immunology，1993，5，268-271)。因此，很明顯，含結合和互補的VH和VL結構域的天然4鏈抗體具有結合大範圍已知抗原中的多種不同抗原的潛力。較不清楚如何在同一抗體中建立針對兩個給定抗原(具體地說是結構上未必相關的抗原)的結合位點。
已經表明，蛋白工程方法對這方面可能有意義。例如，還已提出可通過一個可變結構域建立對金屬離子具有結合活性的催化抗體，或通過與金屬離子和互補可變結構域接觸建立對半抗原(底物)具有結合活性的催化抗體(Barbae等，5 1993 Proc.Natl.Acad.Sci USA 90，6385-6389)。但是，在此情況下，已提出底物(第一個抗原)的結合和催化需要金屬離子(第二個抗原)的結合。因此，與VH/VL對的結合涉及單組分而不是多組分抗原。
業已描述了由駱駝抗體重鏈單結構域建立雙特異性抗體的方法，其中在一個可變結構域中建立對一個抗原的結合接觸，在第二個可變結構域中建立對第二個抗原的結合接觸。但是，可變結構域是不互補的。因此，選擇抗第一個抗原的第一個重鏈可變結構域和抗第二個抗原的第二個重鏈可變結構域，然後將兩個結構域一起連接在同一條鏈上，以產生雙特異性抗體片段(Conrath等，J.Biol.Chem.270，27589-27594)。但是，駱駝重鏈單結構域的與眾不同之處在於其源自不具有輕鏈的天然駱駝抗體，實際上重鏈單結構域不能與駱駝輕鏈結合以形成互補性VH和VL對。
還已經描述了單重鏈可變結構域，其源自一般與輕鏈結合的天然抗體(源自單克隆抗體或結構域庫；參見EP-A-0368684)。已經表明，這些重鏈可變結構域特異性地與一種或多種相關抗原相互作用，但不與其它的重鏈或輕鏈可變結構域組合以建立對兩種或多種不同抗原具有特異性的配體。而且，已經表明，這些單結構域具有非常短的體內半壽期。因此，此結構域的治療價值有限。
已經提出通過將不同特異性的重鏈可變結構域連接在一起(如上所述)製備雙特異性抗體片段。該方法的缺點在於分離的抗體可變結構域可具有疏水界面，其一般與輕鏈相互作用，暴露於溶劑，可為「粘性的」，使得單結構域結合疏水表面。而且，在沒有配偶體輕鏈時，兩個或更多不同重鏈可變結構域可經其疏水界面組合和結合，這可阻止其結合其在分離時能夠結合的一種或兩種配體。此外，在此情況下，重鏈可變結構域不能與互補輕鏈可變結構域結合，因此可能不穩定和容易被打開(Worn和Pluckthun，1998 Biochemistry 37，13120-7)。
發明概述本發明的發明人在其共同待審的國際專利申請WO 03/002609中以及共同待審的未公開英國專利申請0230203.2中已描述了含免疫球蛋白單可變結構域的雙特異性免疫球蛋白配體，其中各個可變結構域可具有不同的特異性。結構域可相互起競爭作用，或獨立地結合靶分子上的抗原或表位。
本發明描述了在患TNF-α相關性炎性疾病的個體中治療該疾病的方法。該方法包括給予該個體治療有效量的單結構域抗體多肽構建物，優選人單結構域抗體構建物，其中單結構域抗體多肽構建物結合人TNF-α，由此治療TNF-α相關性疾病。
在一個方面，炎性疾病為類風溼性關節炎，該方法包括使用一種或多種單結構域抗體多肽構建物，其中一種或多種構建物拮抗人TNF-α與受體的結合。本發明描述了含一種或多種拮抗人TNF-α與受體結合的單結構域抗體多肽構建物的組合物，並描述了雙特異性配體，其中配體的一種特異性針對TNFα，第二種特異性針對VEGF或HSA。本發明進一步描述了雙特異性抗體，其中配體的一種特異性針對VEGF，第二種特異性針對HSA。
本文還包含如本文所述的多肽構建物在製備疾病治療藥物中的用途，具體地說是在製備類風溼性關節炎治療藥物中的用途。
在一個方面，本發明包括治療類風溼性關節炎的方法，該方法包括給予有需要的個體治療有效量的組合物，其包含拮抗人TNF-α與受體結合的單結構域抗體多肽構建物，由此治療類風溼性關節炎。
在一個實施方案中，組合物在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時阻止關節炎記分增加。
在另一個實施方案中，給予Tg197轉基因小鼠組合物包括以下步驟a)每周一次腹膜內注射給予雜合Tg197轉基因小鼠組合物，b)每周一次稱步驟a)小鼠的重量，和c)按照以下系統每周一次記錄小鼠的關節炎宏觀表型病徵0＝無關節炎(正常外觀和屈曲狀態)，1＝輕度關節炎(關節扭曲)，2＝中度關節炎(腫脹，關節變形)，3＝重度關節炎(移動嚴重受損)。
在另一個實施方案中，在關節炎症狀明顯發作之前給予小鼠組合物。在另一個實施方案中，在小鼠3周大時第一次給予組合物。在另一個實施方案中，在小鼠6周大時第一次給予組合物。
在另一個實施方案中，組合物在Tg197轉基因小鼠關節炎實驗中具有的效力在統計顯著性範圍內大於或等於相等劑量(以mg/kg為基準)藥物(選自依那西普、英利昔單抗和D2E7)的效力。
在另一個實施方案中，組合物在Tg197轉基因小鼠關節炎實驗中具有效力，使得治療產生0-0.5的關節炎記分。在另一個實施方案中，組合物在Tg197轉基因小鼠關節炎實驗中具有效力，使得治療產生0-1.0的關節炎記分。在另一個實施方案中，組合物在Tg197轉基因小鼠關節炎實驗中具有效力，使得治療產生0-1.5的關節炎記分。在另一個實施方案中，組合物在Tg197轉基因小鼠關節炎實驗中具有效力，使得治療產生0-2.0的關節炎記分。
在另一個實施方案中，治療包括抑制類風溼性關節炎進展。在另一個實施方案中，治療包括預防或延遲類風溼性關節炎的發作。
在另一個實施方案中，給予導致一種或多種RA指徵的統計學顯著變化。在另一個實施方案中，一種或多種RA指徵包括以下的一種或多種紅細胞沉降率(ESR)、Ritchie關節指數和晨僵持續時間、關節活動性、關節腫脹、一個或多個關節的x射線造影和一個或多個關節固定化切片的組織病理學分析。
在另一個實施方案中，一種或多種RA指徵包括Tg197轉基因小鼠中的關節炎宏觀表型病徵減退，其中給予Tg197轉基因小鼠組合物，其中記錄Tg197轉基因小鼠的關節炎宏觀表型病徵，其中按照以下系統記錄關節炎宏觀表型病徵0＝無關節炎(正常外觀和屈曲狀態)，1＝輕度關節炎(關節扭曲)，2＝中度關節炎(腫脹，關節變形)，3＝重度關節炎(移動嚴重受損)。
在另一個實施方案中，一種或多種RA指徵包括Tg197轉基因小鼠中的關節炎組織病理學病徵減退，其中給予Tg197轉基因小鼠組合物，其中記錄Tg197轉基因小鼠的關節炎組織病理學病徵，其中關節炎組織病理學病徵表現在關節上，並按照以下系統記錄0＝無可檢測的病理狀況，1＝滑膜增生和出現多形核白細胞浸潤，2＝血管翳和纖維組織形成以及病灶性軟骨下骨侵蝕，3＝關節軟骨破壞和骨侵蝕，4＝廣泛的關節軟骨破壞和骨侵蝕。
在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包括人單結構域抗體多肽。在另一個實施方案中，人單結構域抗體多肽結合TNFα。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物以小於100nM的Kd結合人TNFα。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物以100nM至50pM範圍的Kd結合人TNFα。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物以30nM至50pM的Kd結合人TNFα。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物以10nM至50pM的Kd結合人TNFα。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物以1nM至50pM範圍的Kd結合人TNFα。
在另一個實施方案中，據在標準L929細胞毒性細胞實驗中的檢測，單結構域抗體多肽構建物拮抗人TNFα。
本發明進一步包括治療類風溼性關節炎的方法，該方法包括給予有需要的個體治療有效量的組合物，其包含拮抗人TNFα與受體結合的單結構域抗體多肽構建物，其中單結構域抗體多肽構建物抑制人TNFα與TNFα受體的結合，由此治療類風溼性關節炎。
在一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物特異性結合與細胞表面受體結合的人TNFα。
在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有在15分鐘至12小時範圍內的體內tα半壽期。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有在1-6小時範圍內的體內tβ半壽期。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有在2-5小時範圍內的體內tβ半壽期。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有在3-4小時範圍內的體內tβ半壽期。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有在12-60小時範圍內的體內tβ半壽期。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有在12-48小時範圍內的體內tβ半壽期。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有在12-26小時範圍內的體內tβ半壽期。
在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有15mg.分鐘/ml至150mg.分鐘/ml的體內AUC半壽期值。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有15mg.分鐘/ml至100mg.分鐘/ml的體內AUC半壽期值。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有15mg.分鐘/ml至75mg.分鐘/ml的體內AUC半壽期值。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有15mg.分鐘/ml至50mg.分鐘/ml的體內AUC半壽期值。
在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物連接至PEG分子。在另一個實施方案中，PEG連接的單結構域抗體多肽構建物具有至少24kDa的流體動力學大小，其中總PEG大小為20-60kDa。在另一個實施方案中，PEG連接的單結構域抗體多肽構建物具有至少200kDa的流體動力學大小和20-60kDa的總PEG大小。在另一個實施方案中，本發明的PEG化蛋白平均可連接至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、17、20或更多個聚乙二醇分子。
在另一個實施方案中，抗體構建物含兩個或更多結合人TNFα的單免疫球蛋白可變結構域多肽。在另一個實施方案中，抗體構建物含結合人TNFα的單免疫球蛋白可變結構域多肽的同二聚體。在另一個實施方案中，抗體構建物含結合人TNFα的單免疫球蛋白可變結構域多肽的同三聚體。在另一個實施方案中，抗體構建物含結合人TNFα的單免疫球蛋白可變結構域多肽的同四聚體。
在另一個實施方案中，構建物還包含對非TNFα抗原有特異性的抗體多肽。在另一個實施方案中，對非TNFα抗原有特異性的抗體多肽包括單結構域抗體多肽。在另一個實施方案中，對非TNFα抗原有特異性的抗體多肽與非TNFα抗原的結合增加了抗體多肽構建物的體內半壽期。在另一個實施方案中，非TNFα抗原包括血清蛋白。在另一個實施方案中，血清蛋白選自纖維蛋白、α-2巨球蛋白、血清白蛋白、纖維蛋白原A、纖維蛋白原、血清澱粉樣蛋白A、七球蛋白(heptaglobin)、蛋白、泛素、子宮球蛋白和β-2-微球蛋白。在另一個實施方案中，非TNFα抗原包括HSA。
在另一個實施方案中，治療還包括給予至少一種另外的治療劑。
在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽CDR3的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少85％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少90％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少92％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少94％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少96％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少98％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少99％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
本發明進一步包括治療類風溼性關節炎的方法，該方法包括給予有需要的個體治療有效量的組合物，其包含拮抗人TNFα與受體結合的單結構域抗體多肽構建物，其中組合物在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時阻止關節炎記分增加，其中單結構域抗體多肽構建物以小於100nM的Kd結合人TNFα，其中據在標準L929細胞實驗中的檢測，單結構域抗體多肽構建物中和人TNFα，其中治療類風溼性關節炎。
本發明進一步包括含單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中單結構域抗體多肽構建物拮抗人TNFα與受體的結合，在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時防止關節炎記分增加，其中據在標準L929細胞實驗中的檢測，單結構域抗體多肽構建物中和人TNFα。
本發明進一步包括含單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中單結構域抗體多肽構建物拮抗人TNFα與受體的結合，在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時阻止關節炎記分增加，其中單結構域抗體多肽構建物抑制類風溼性關節炎進展。
本發明進一步包括含單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中單結構域抗體多肽構建物拮抗人TNFα與受體的結合，在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時阻止關節炎記分增加，其中單結構域抗體多肽構建物以小於100nM的Kd結合人TNFα。
本發明進一步包括含單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中單結構域抗體多肽構建物拮抗人TNFα與受體的結合，在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時阻止關節炎記分增加，其中據在標準L929細胞實驗中的檢測，單結構域抗體多肽構建物中和人TNFα，其中單結構域抗體多肽構建物抑制類風溼性關節炎進展，其中單結構域抗體多肽構建物以小於100nM的Kd結合人TNFα。
在前述3個實施方案的進一步的實施方案中，單結構域抗體多肽構建物含選自以下克隆的抗體多肽CDR3的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
在進一步的實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少85％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
在進一步的實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少90％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
在進一步的實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少92％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
在進一步的實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少94％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
在進一步的實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少96％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
在進一步的實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少98％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
在進一步的實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少98％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
在進一步的實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少99％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
本發明進一步包括治療類風溼性關節炎的方法，該方法包括給予有需要的個體治療有效量的組合物，其包含拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物，由此治療類風溼性關節炎。
在一個實施方案中，組合物在給予膠原蛋白誘導型關節炎(CIA)小鼠模型的小鼠時阻止關節炎記分增加。用鼠II型膠原蛋白免疫DBA/1小鼠誘發慢性復髮型多關節炎，其提供了人自身免疫性關節炎的強大模型。該模型描述於例如Courtenay等，1980，Nature 282666-668，Kato等，1996，Ann.Rheum.Dis.55535-539和Myers等，1997，Life Sci.611861-1878，其各自通過引用結合到本文中。
在一個實施方案中，給予小鼠組合物包括以下步驟a)每周一次腹膜內注射給予CIA小鼠組合物，b)每周一次稱步驟a)小鼠的重量，和c)按照以下系統每周一次記錄小鼠的關節炎宏觀表型病徵0＝無關節炎(正常外觀和屈曲狀態)，1＝輕度關節炎(關節扭曲)，2＝中度關節炎(腫脹，關節變形)，3＝重度關節炎(移動嚴重受損)。
在一個實施方案中，治療包括抑制類風溼性關節炎的進展。
在一個實施方案中，治療包括預防和延遲類風溼性關節炎發作。
在一個實施方案中，給予產生一種或多種RA指徵的統計學顯著變化。變化優選達至少10％或以上。
在一個實施方案中，一種或多種RA指徵包括以下的一種或多種紅細胞沉降率(ESR)、Ritchie關節指數(描述於Ritchie等，1968，Q.J.Med.37393-406)和晨僵持續時間、關節活動性、關節腫脹、一個或多個關節的x射線造影分析以及通過一個或多個關節固定化切片分析獲得的組織病理學指示。還可使用病情活動指數(DAS)和/或慢性關節炎系統指數(CASI)評價治療影響的病情活動和變化，參見Carotti等，2002，Ann.Rheum.Dis.61877-882，和Salaffi等，2000，Rheumatology 3990-96。
在一個實施方案中，一種或多種RA指徵包括在膠原蛋白誘導型關節炎小鼠模型的小鼠中關節炎宏觀表型病徵減退，其中給予小鼠組合物，其中記錄小鼠的關節炎宏觀表型病徵，其中按照以下系統記錄關節炎宏觀表型病徵0＝無關節炎(正常外觀和屈曲狀態)，1＝輕度關節炎(關節扭曲)，2＝中度關節炎(腫脹，關節變形)，3＝重度關節炎(移動嚴重受損)。
在一個實施方案中，一種或多種RA指徵包括在膠原蛋白誘導型關節炎小鼠模型的小鼠中的關節炎組織病理學病徵減退，其中給予小鼠組合物，其中記錄小鼠的關節炎組織病理學病徵，其中關節炎組織病理學病徵表現在關節上，並使用以下系統記錄0＝無可檢測的病理狀況，1＝滑膜增生和出現多形核白細胞浸潤，2＝血管翳和纖維組織形成以及病灶性軟骨下骨侵蝕，3＝關節軟骨破壞和骨侵蝕，4＝廣泛的關節軟骨破壞和骨侵蝕。
在一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包括人單結構域抗體多肽。
在一個實施方案中，人單結構域抗體多肽結合VEGF。
在一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物以小於100nM的Kd結合人VEGF。
在一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物以100nM至50pM範圍內的Kd結合人VEGF。
在一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物以30nM至50pM的Kd結合人VEGF。
在一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物以10nM至50pM的Kd結合人VEGF。
在一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物以1nM至50pM範圍內的Kd結合人VEGF。
在一個實施方案中，據在VEGF受體1實驗或VEGF受體2實驗中的檢測，單結構域抗體多肽構建物中和人VEGF。
本發明進一步包括治療類風溼性關節炎的方法，該方法包括給予有需要的個體治療有效量的組合物，其包含拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體構建物，其中單結構域抗體構建物抑制人VEGF與VEGF受體的結合，由此治療類風溼性關節炎。
在一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物特異性結合與細胞表面受體結合的人VEGF。
在一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物連接至PEG分子。
在一個實施方案中，PEG連接的單結構域抗體多肽構建物具有至少24kDa的流體動力學大小，其中總PEG大小為20-60kDa。
在一個實施方案中，PEG連接的單結構域抗體多肽構建物具有至少200kDa的流體動力學大小和20-60kDa的總PEG大小。
在一個實施方案中，本發明的PEG化蛋白平均可連接至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、17、20或更多個聚乙二醇分子。
在一個實施方案中，抗體構建物含兩個或更多結合人VEGF的單免疫球蛋白可變結構域多肽。
在一個實施方案中，抗體構建物含結合人VEGF的單免疫球蛋白可變結構域多肽的同二聚體。
在一個實施方案中，抗體構建物含結合人VEGF的單免疫球蛋白可變結構域多肽的同三聚體。
在一個實施方案中，抗體構建物含結合人VEGF的單免疫球蛋白可變結構域多肽的同四聚體。
在一個實施方案中，抗體構建物進一步含對非VEGF抗原具有特異性的抗體多肽。
在一個實施方案中，對非VEGF抗原具有特異性的抗體多肽包括單結構域抗體多肽。
在一個實施方案中，對非VEGF抗原具有特異性的抗體多肽與非VEGF抗原的結合增加抗體多肽構建物的體內半壽期。
在一個實施方案中，非VEGF抗原包括血清蛋白。
在一個實施方案中，血清蛋白選自纖維蛋白、α-2巨球蛋白、血清白蛋白、纖維蛋白原A、纖維蛋白原、血清澱粉樣蛋白A、七球蛋白、蛋白、泛素、子宮球蛋白和β-2-微球蛋白。
在一個實施方案中，非VEGF抗原包括HSA。
在一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有在15分鐘至12小時範圍內的體內tα半壽期。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有在1-6小時範圍內的體內tβ半壽期。
在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有在2-5小時範圍內的體內tβ半壽期。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有在3-4小時範圍內的體內tβ半壽期。
在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有在12-60小時範圍內的體內tβ半壽期。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有在12-48小時範圍內的體內tβ半壽期。
在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有在12-26小時範圍內的體內tβ半壽期。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有15mg.分鐘/ml至150mg.分鐘/ml的體內AUC半壽期值。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有15mg.分鐘/ml至100mg.分鐘/ml的體內AUC半壽期值。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有15mg.分鐘/ml至75mg.分鐘/ml的體內AUC半壽期值。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有15mg.分鐘/ml至50mg.分鐘/ml的體內AUC半壽期值。
在一個實施方案中，治療進一步包括給予至少一種另外的治療劑。
在一個實施方案中，治療劑選自依那西普、英利昔單抗和D2E7。
在一個實施方案中，治療劑選自皮質類固醇、蛋白水解酶、非甾體類抗炎藥物(NSAID)、乙醯水楊酸、吡唑酮、芬那酸(fenamate)、二氟尼柳、乙酸衍生物、丙酸衍生物、昔康(oxicams)、甲芬那酸、Ponstel、甲氯芬那酸、Meclomen、保泰松、Butazolidin、二氟尼柳、Dolobid、雙氯芬酸、扶他林、吲哚美辛(indomethacin)、消炎痛(Indocin)、舒林酸、奇諾力、依託度酸、羅丁、酮咯酸、Toradol、萘丁美酮、瑞力芬、託美丁、託來汀、布洛芬、美林、非諾洛芬、Nalfon、氟比洛芬、Anthe、卡洛芬、Rimadyl、酮洛芬、Orudis、萘普生、Anaprox、Naprosyn、吡羅昔康和Feldene。
在一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的CDR3的胺基酸序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
在一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少85％相同的胺基酸序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
在一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少90％相同的胺基酸序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
在一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少92％相同的胺基酸序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
在一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少94％相同的胺基酸序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
在一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少96％相同的胺基酸序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
在一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少98％相同的胺基酸序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
在一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少99％相同的胺基酸序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
本發明進一步包括含拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中單結構域抗體多肽構建物含選自以下的CDR3序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
本發明進一步包括含拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中單結構域抗體多肽構建物含選自以下的胺基酸序列或與其至少85％相同的序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
本發明進一步包括含拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中單結構域抗體多肽構建物含選自以下的胺基酸序列或與其至少90％相同的序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
本發明進一步包括含拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中單結構域抗體多肽構建物含選自以下的胺基酸序列或與其至少92％相同的序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
本發明進一步包括含拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中單結構域抗體多肽構建物含選自以下的胺基酸序列或與其至少94％相同的序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
本發明進一步包括含拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中單結構域抗體多肽構建物含選自以下的胺基酸序列或與其至少96％相同的序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
本發明進一步包括含拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中單結構域抗體多肽構建物含選自以下的胺基酸序列或與其至少98％相同的序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
本發明進一步包括含拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中單結構域抗體多肽構建物含選自以下的胺基酸序列或與其至少99％相同的序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
本發明進一步包括治療類風溼性關節炎的方法，該方法包括給予有需要的個體治療有效量的組合物，其中組合物包含拮抗人TNF-α與受體的結合併拮抗人VEGF與受體的結合的單結構域抗體構建物，由此治療類風溼性關節炎。
在一個實施方案中，組合物在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時，阻止關節炎記分增加。
在另一個實施方案中，給予Tg197轉基因小鼠組合物包括以下步驟a)每周一次腹膜內注射給予雜合Tg197轉基因小鼠組合物，b)每周一次稱步驟a)小鼠的重量，和c)按照以下系統每周一次記錄小鼠的關節炎宏觀表型病徵0＝無關節炎(正常外觀和屈曲狀態)，1＝輕度關節炎(關節扭曲)，2＝中度關節炎(腫脹，關節變形)，3＝重度關節炎(移動嚴重受損)。
在另一個實施方案中，組合物在Tg197轉基因小鼠關節炎實驗中具有的效力在統計顯著性範圍內大於或等於選自依那西普、英利昔單抗和D2E7的藥物的效力。
在另一個實施方案中，治療包括抑制類風溼性關節炎的進展。
在另一個實施方案中，治療包括預防或延遲類風溼性關節炎的發作。
在另一個實施方案中，給予產生一種或多種RA指徵的統計學顯著的變化。
在另一個實施方案中，一種或多種RA指徵包括以下的一種或多種紅細胞沉降率(ESR)、Ritchie關節指數和晨僵持續時間、關節活動性、關節腫脹、一個或多個關節的x射線造影和一個或多個關節固定化切片的組織病理學分析。
在另一個實施方案中，一種或多種RA指徵包括Tg197轉基因小鼠中的關節炎宏觀表型病徵減退，其中給予Tg197轉基因小鼠組合物，其中記錄Tg197轉基因小鼠的關節炎宏觀表型病徵，其中按照以下系統記錄關節炎宏觀表型病徵0＝無關節炎(正常外觀和屈曲狀態)，1＝輕度關節炎(關節扭曲)，2＝中度關節炎(腫脹，關節變形)，3＝重度關節炎(移動嚴重受損)。
在另一個實施方案中，一種或多種RA指徵包括Tg197轉基因小鼠中的關節炎組織病理學病徵減退，其中給予Tg197轉基因小鼠組合物，其中記錄Tg197轉基因小鼠的關節炎組織病理學病徵，其中關節炎組織病理學病徵表現在關節上，並使用以下系統記錄0＝無可檢測的病理狀況，1＝滑膜增生和出現多形核白細胞浸潤，2＝血管翳和纖維組織形成以及病灶性軟骨下骨侵蝕，3＝關節軟骨破壞和骨侵蝕，4＝廣泛的關節軟骨破壞和骨侵蝕。
在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包括人單結構域抗體多肽。
在另一個實施方案中，人單結構域抗體多肽結合TNFα和VEGF。
在另一個實施方案中，據在標準L929細胞實驗中的檢測，單結構域抗體多肽構建物中和人TNFα。
在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物連接至PEG分子。
在另一個實施方案中，PEG連接的單結構域抗體多肽構建物具有至少24kDa的流體動力學大小，其中總PEG大小為20-60kDa。
在另一個實施方案中，PEG連接的單結構域抗體多肽構建物具有至少200kDa的流體動力學大小和20-60kDa的總PEG大小。
在另一個實施方案中，抗體多肽構建物平均連接至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、17、20或更多個聚乙二醇分子。
在另一個實施方案中，抗體構建物含兩個或更多結合人TNFα的單免疫球蛋白可變結構域多肽和/或兩個或更多結合人VEGF的單免疫球蛋白可變結構域多肽。
在另一個實施方案中，抗體構建物含結合人TNFα的單免疫球蛋白可變結構域多肽的同二聚體和/或結合人VEGF的單免疫球蛋白可變結構域多肽的同二聚體。
在另一個實施方案中，抗體構建物含結合人TNFα的單免疫球蛋白可變結構域多肽的同三聚體和/或結合人VEGF的單免疫球蛋白可變結構域多肽的同三聚體。
在另一個實施方案中，抗體構建物含結合人TNFα的單免疫球蛋白可變結構域多肽的同四聚體和/或結合人VEGF的單免疫球蛋白可變結構域多肽的同四聚體。
在另一個實施方案中，抗體構建物進一步含對非TNFα或VEGF抗原具有特異性的抗體多肽。
在另一個實施方案中，對非TNFα或VEGF抗原具有特異性的抗體多肽包括單結構域抗體多肽。
在另一個實施方案中，對非TNFα或VEGF抗原具有特異性的抗體多肽與非TNFα或VEGF抗原的結合增加抗體多肽構建物的體內半壽期。
在另一個實施方案中，非TNFα或VEGF抗原包括血清蛋白。
在另一個實施方案中，血清蛋白選自纖維蛋白、α-2巨球蛋白、血清白蛋白、纖維蛋白原A、纖維蛋白原、血清澱粉樣蛋白A、七球蛋白、蛋白、泛素、子宮球蛋白和β-2-微球蛋白。
在另一個實施方案中，非TNFα抗原包括HSA。
在另一個實施方案中，治療還包括給予至少一種另外的治療劑。
本發明進一步包括含單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中單結構域抗體多肽構建物拮抗人TNFα與受體的結合以及拮抗人VEGF與受體的結合，在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時阻止關節炎記分增加，其中單結構域抗體多肽構建物抑制類風溼性關節炎進展。
本發明進一步包括含單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中單結構域抗體多肽構建物拮抗人TNFα與受體的結合以及拮抗人VEGF與受體的結合，在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時阻止關節炎記分增加，其中單結構域抗體多肽構建物以小於100nM的Kd結合人TNFα。
本發明進一步包括含單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中單結構域抗體多肽構建物拮抗人TNFα與受體的結合以及拮抗人VEGF與受體的結合，在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時阻止關節炎記分增加，其中據在標準L929細胞實驗中的檢測，單結構域抗體多肽構建物中和人TNFα，其中單結構域抗體多肽構建物抑制類風溼性關節炎進展，其中單結構域抗體多肽構建物以小於100nM的Kd結合人TNFα。
另一個方面是選擇單結構域抗體多肽構建物的方法，其中單結構域抗體多肽構建物拮抗人TNFα與受體的結合，在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時阻止關節炎記分增加，其中據在標準L929細胞實驗中的檢測，所述單結構域抗體多肽構建物中和人TNFα，其中所述單結構域抗體多肽構建物抑制類風溼性關節炎進展，其中所述單結構域抗體多肽構建物以小於100nM的Kd結合人TNFα，該方法包括以下步驟(1)突變編碼所述單結構域抗體多肽構建物的幾個高變區位點的核酸，以便各個位點均產生所有可能的氨基置換，(2)將在步驟(1)中產生的編碼突變高變區位點的核酸導入到噬菌粒展示載體中，以形成大量展示載體，其每個均能表達所述突變高變區位點中的一種，展示在噬菌粒表面展示蛋白上；(3)在絲狀噬菌體顆粒表面上表達突變的高變區位點，以便由此產生的突變高變區位點作為與各個顆粒中包裝的M13的基因III產物的融合體，由絲狀噬菌體顆粒以單價形式展示，(4)篩選表面表達的噬菌體顆粒結合TNFα的能力，(5)分離能夠結合TNFα的表面表達的噬菌體顆粒，(6)選擇能夠結合TNFα的步驟(5)的表面表達噬菌體顆粒，其在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時也阻止關節炎記分增加，據在標準L929細胞實驗中的檢測，其中和人TNFα，抑制所述類風溼性關節炎進展，以小於100nM的Kd結合人TNFα，由此選擇一種或多種含展示蛋白的噬菌粒，其中展示蛋白含拮抗人TNFα與受體結合的單結構域抗體多肽構建物。
另一個方面是治療類風溼性關節炎的方法，該方法包括給予有需要的個體治療有效量的組合物，其含拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物，由此治療所述類風溼性關節炎，其中所述單結構域抗體多肽構建物具有在15分鐘至12小時、1-6小時、2-5小時或3-4小時範圍內的體內tα半壽期。
另一個實施方案是治療類風溼性關節炎的方法，該方法包括給予有需要的個體治療有效量的組合物，其含拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物，由此所述單結構域抗體多肽構建物具有在12-60小時、12-48小時或12-26小時範圍內的體內tβ半壽期。
另一個實施方案是治療類風溼性關節炎的方法，該方法包括給予有需要的個體治療有效量的組合物，其含拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物，由此所述單結構域抗體多肽構建物具有15mg.分鐘/ml至150mg.分鐘/ml、15mg.分鐘/ml至100mg.分鐘/ml、15mg.分鐘/ml至75mg.分鐘/ml或15mg.分鐘/ml至50mg.分鐘/ml的體內AUC半壽期值。
另一個實施方案是治療類風溼性關節炎的方法，該方法包括給予有需要的個體治療有效量的組合物，其中所述組合物含拮抗人TNFα與受體結合以及拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物，由此治療所述類風溼性關節炎，其中所述組合物在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時阻止關節炎記分增加，其中所述單結構域抗體多肽構建物各以小於100nM的Kd結合人TNFα和VEGF，其中所述單結構域抗體多肽構建物各以100nM至50pm範圍內的Kd結合人TNFα和VEGF，其中所述單結構域抗體多肽構建物各以30nM至50pm的Kd結合人TNFα和VEGF，其中所述單結構域抗體多肽構建物各以10nM至50pm的Kd結合人TNFα和VEGF，或其中所述單結構域抗體多肽構建物各以1nM至50pm範圍內的Kd結合人TNFα和VEGF。
另一個實施方案是治療類風溼性關節炎的方法，該方法包括給予有需要的個體治療有效量的組合物，其含拮抗人TNFα與受體結合以及拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物，其中所述單結構域抗體多肽構建物抑制人TNFα與TNFα受體的結合以及人VEGF與VEGF受體的結合，由此治療所述類風溼性關節炎。
另一個實施方案是治療類風溼性關節炎的方法，該方法包括給予有需要的個體治療有效量的組合物，其含拮抗人TNFα與受體結合以及拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物，其中所述單結構域抗體多肽構建物抑制人TNFα與TNFα受體的結合以及人VEGF與VEGF受體的結合，由此治療所述類風溼性關節炎，其中所述單結構域抗體多肽構建物特異性結合與細胞表面受體結合的人TNFα。
另一個實施方案是治療類風溼性關節炎的方法，該方法包括給予有需要的個體治療有效量的組合物，其中所述組合物含拮抗人TNFα與受體結合以及拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物，由此治療所述類風溼性關節炎，其中所述單結構域抗體多肽構建物特異性結合與細胞表面受體結合的人TNFα。
本發明的另一個實施方案是治療類風溼性關節炎的方法，其包括給予TNFα特異性的抗體構建物，其中抗體構建物序列包含與本文提及的任一個抗TNFα克隆序列的同一性百分率大於或等於85、90、95、96、97、98、99或100％的序列或由其組成。
本發明的另一個實施方案是含TNFα特異性抗體構建物的組合物，其中抗體構建物序列包含與本文提及的任一個抗TNFα克隆序列的同一性百分率大於或等於85、90、95、96、97、98、99或100％的序列或由其組成。
本發明的另一個實施方案是治療類風溼性關節炎的方法，其包括給予VEGF特異性的抗體構建物，其中抗體構建物序列包含與本文提及的任一個抗VEGF克隆序列的同一性百分率大於或等於85、90、95、96、97、98、99或100％的序列或由其組成。
本發明的另一個實施方案是含對VEGF特異性的抗體構建物的組合物，其中抗體構建物序列包含與本文提及的任一個抗VEGF克隆序列的同一性百分率大於或等於85、90、95、96、97、98、99或100％的序列或由其組成。
在另一個實施方案中，提供四價雙特異性抗原結合多肽構建物，其含2個拷貝的、結合第一個抗原或表位的VH或VL單結構域抗體；和2個拷貝的、結合第二個抗原或表位的VH或VL單結構域抗體。第一個和第二個表位可存在於同一抗原上，或存在於不同抗原上。2個拷貝的、結合第一個抗原或表位的單結構域抗體各自均融合至各自的IgG重鏈恆定結構域，2個拷貝的、結合第二個抗原或表位的單結構域抗體各自均融合至各自的輕鏈恆定結構域。這些四價雙特異性多肽構建物是IgG樣的，因為其具有通過重鏈和輕鏈恆定結構域接合的兩個抗原結合臂。它們與天然IgG的不同之處在於藉助於在各個臂上存在的兩種不同抗原特異性單結構域抗體多肽，各個臂可結合兩種不同的抗原或表位，使構建物成為四價和雙特異性的。在一個實施方案中，第一個和第二個表位相同，使得有4個針對該表位的特異性結合位點存在於多肽構建物上。在另一個實施方案中，第一個和第二個表位不同，其存在於相同或不同的抗原上。
如本文所述的雙特異性四價多肽構建物可包括對任意兩個抗原或表位有特異性的單結構域抗體序列，但具體地說是對人TNF-α和VEGF有特異性的單結構域抗體序列，更具體地說是任何本文描述的單結構域抗體序列。在其它實施方案中，可使用Cκ或Cλ輕鏈恆定結構域，還可使用非IgG1的IgG重鏈恆定結構域。
本發明還包括含單結構域抗TNF-α抗體克隆和單結構域抗VEGF抗體克隆的這類構建物，單結構域抗TNF-α抗體克隆在作為單體給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時阻止關節炎記分增加，單結構域抗VEGF抗體克隆在作為單體給予膠原蛋白誘導型關節炎小鼠模型的小鼠時阻止關節炎記分增加。在進一步的實施方案中，所使用的單結構域抗TNF-α抗體克隆當用作單體時在本文描述的L929細胞毒性實驗中中和TNF-α，所使用的單結構域抗VEGF抗體克隆當用作單體時在本文描述的VEGF受體2結合實驗中拮抗VEGF受體結合。在進一步的實施方案中，所使用的單結構域抗體克隆以小於100nM的Kd結合其各自的抗原或表位。在進一步的實施方案中，雙特異性二價構建物以小於100nM的Kd結合其各自的抗原或表位，並在本文描述的Tg197和CIA關節炎模型的任一個中或二者中阻止關節炎記分增加。
就給予、劑量和效力監測而言，這種四價雙特異性構建物可以類似於本文所述其它構建物的方式用於治療類風溼性關節炎。可如上文所述，例如通過加入PEG部分，或通過與增加循環半壽期的蛋白(例如血清蛋白，如HSA)特異性結合部分(例如另外的單結構域抗體)的進一步融合，改變構建物的半壽期。
於是，在一個方面，描述了一種雙特異性抗原結合多肽，其含結合TNF-α的第一個抗體單結構域多肽和結合VEGF的第二個抗體單結構域多肽。這種多肽可用於例如治療類風溼性關節炎。
於是，在另一方面，描述了一種四價雙特異性抗原結合多肽構建物，其包含a)含結合第一個表位、融合至IgG重鏈恆定結構域的單結構域抗體多肽的第一個融合蛋白的第一個拷貝；b)所述第一個融合蛋白的第二個拷貝；c)含結合第二個表位、融合至輕鏈恆定結構域的單結構域抗體多肽的第二個融合蛋白的第一個拷貝；d)所述第二個融合蛋白的第二個拷貝；其中所述第一個融合蛋白的所述第一個和所述第二個拷貝經其各自的IgG重鏈恆定結構域彼此二硫鍵合，其中所述第二個融合蛋白的所述第一個拷貝的所述輕鏈恆定結構域二硫鍵合至所述第一個融合蛋白的所述第一個拷貝的IgG重鏈恆定結構域，其中第二個融合蛋白的所述第二個拷貝的所述輕鏈恆定結構域二硫鍵合至所述第一個融合蛋白的所述第二個拷貝的IgG重鏈恆定結構域，其中所述多肽構建物結合所述第一個和所述第二個表位。
在這種四價雙特異性抗原結合多肽構建物的一個實施方案中，結合第一個表位的單結構域抗體為選自VH和VL的V結構域。
在另一個實施方案中，結合第二個表位的單結構域抗體為選自VH和VL的V結構域。
在另一個實施方案中，IgG重鏈恆定結構域是IgG1重鏈恆定結構域。
在另一個實施方案中，輕鏈恆定結構域是Cκ或Cλ輕鏈恆定結構域。在另一個實施方案中，輕鏈恆定結構域是Cκ輕鏈恆定結構域。
在另一個實施方案中，第一個和第二個表位存在於同一抗原上。
在另一個實施方案中，第一個和第二個表位存在於不同的第一個和第二個抗原上。
在另一個實施方案中，所述結合第一個表位的單結構域抗體和所述結合第二個表位的單結構域抗體中的一個或兩個為人單結構域抗體。
在另一個實施方案中，結合所述第一個表位的單結構域抗體多肽和/或結合所述第二個表位的單結構域抗體多肽含以下的一個或多個由人種系VH基因序列編碼的FW1、由人種系VH基因序列編碼的FW2、由人種系VH基因序列編碼的FW3和由人種系VH基因序列編碼的FW4。
在另一個實施方案中，結合第一個表位的單結構域抗體多肽和結合第二個表位的單結構域抗體均為人單結構域抗體。
在另一個實施方案中，IgG重鏈恆定結構域為人IgG重鏈恆定結構域。
在另一個實施方案中，IgG重鏈恆定結構域包括CH1結構域。
在另一個實施方案中，輕鏈恆定結構域為人Cκ輕鏈恆定結構域。
在另一個實施方案中，構建物結合TNF-α和VEGF。在另一個實施方案中，結合VEGF的單結構域抗體融合至IgG1重鏈恆定結構域，結合TNF-α的單結構域抗體融合至Cκ輕鏈恆定結構域。
在另一個實施方案中，結合VEGF的單結構域抗體在給予膠原蛋白誘導型關節炎小鼠模型的小鼠時阻止關節炎記分增加。
在另一個實施方案中，拮抗人VEGF活性的單結構域抗體多肽部分以小於100nM的Kd結合人VEGF。
在另一個實施方案中，據在VEGF受體1實驗或VEGF受體2實驗中的檢測，拮抗人VEGF活性的單結構域抗體多肽部分中和人VEGF。
在另一個實施方案中，拮抗人VEGF活性的單結構域抗體多肽部分特異性結合與細胞表面受體結合的人VEGF。
在該方面的另一個實施方案中，結合TNF-α或拮抗人TNF-α活性的單結構域抗體在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時阻止關節炎記分增加。在另一個實施方案中，據在標準L929細胞毒性實驗中的檢測，單結構域抗體拮抗人TNF-α活性。在另一個實施方案中，單結構域抗體以小於100nM的Kd結合人TNF-α。
在該方面的任何實施方案中，拮抗人TNF-α活性的單結構域抗體多肽部分可包含例如選自以下克隆的抗體多肽的CDR3胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19，或包含與所述序列例如至少85％、替代性地至少90％、92％、94％、96％、98％、99％或100％相同的胺基酸序列。
在該方面的另一個實施方案中，拮抗人TNF-α活性的單結構域抗體多肽部分可包含例如選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19，或包含與所述序列例如至少85％、替代性地至少90％、92％、94％、96％、98％、99％或100％相同的胺基酸序列。
在該方面的任一個實施方案中，拮抗人VEGF與VEGF受體結合的單結構域抗體多肽部分可包含例如選自以下克隆的抗體多肽的CDR3胺基酸序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30，或包含與所述序列例如至少85％、替代性地至少90％、92％、94％、96％、98％、99％或100％相同的胺基酸序列。
在該方面的另一個實施方案中，拮抗人VEGF與VEGF受體結合的單結構域抗體多肽部分可包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30，或包含與所述序列例如至少85％、替代性地至少90％、92％、94％、96％、98％、99％或100％相同的胺基酸序列。
定義除非另有限定，否則本文使用的所有技術和科學術語都具有和本領域(例如在細胞培養、分子遺傳、核酸化學、雜交技術和生物化學領域)一般技術人員的通常理解相同的含義。使用分子、遺傳和生物化學方法(一般參見Sambrook等，Molecular CloningA LaboratoryManual，第2版，(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.和Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology(1999)第4版，John Wiley Sons，Inc，其通過引用結合到本文中)和化學方法的標準技術。
本文使用的術語「結構域」指獨立於蛋白的剩餘部分而保留其三級結構的摺疊蛋白結構。一般來說，結構域負責蛋白的分立功能特性，在許多情況下可被加入、去除或轉移至其它蛋白，而不喪失蛋白剩餘部分和/或結構域的功能。
所述「單免疫球蛋白可變結構域」或「單結構域抗體多肽」指含免疫球蛋白可變結構域的序列特徵並特異性結合抗原(即500nM或更低的解離常數)的摺疊多肽結構域。因此，「單結構域抗體多肽」包括完整抗體可變結構域以及修飾的可變結構域，例如其中一個或多個環被無抗體可變結構域特徵的序列取代的可變結構域，或已截短或含N-末端或C-末端延伸的抗體可變結構域，以及保留500nM或更低(例如450nM或更低、400nM或更低、350nM或更低、300nM或更低、250nM或更低、200nM或更低、150nM或更低、100nM或更低)的解離常數和全長結構域的靶抗原特異性的可變結構域摺疊片段。優選抗體單可變結構域選自VH和VL，包括Vκ和Vλ。
表述「單結構域抗體多肽構建物」不僅包括分離的單結構域抗體多肽，而且包括含一個或多個單免疫球蛋白可變結構域多肽序列單體的較大多肽構建物。要強調的是，為較大構建物一部分的單結構域抗體多肽能夠獨自地特異性結合靶抗原。因此，含一個以上單結構域抗體多肽的單結構域抗體多肽構建物不包括例如其中為形成特異性結合單抗原分子所必須的結合位點而共同需要VH和VL結構域的構建物。單結構域抗體多肽構建物中的單結構域抗體多肽之間的連接可為肽或多肽接頭，或者可為其它化學連接，例如通過多肽單體與多價PEG的連接。連接的單結構域抗體多肽可相同或不同，組成多肽的靶特異性也可相同或不同。
互補性在兩種免疫球蛋白結構域屬於形成關連對或組的結構家族或源自該家族並保留該特徵的情況下，這兩種免疫球蛋白結構域是互補的。例如，抗體的VH結構域和VL結構域是互補的；兩個VH結構域不是互補的，兩個V結構域不是互補的。互補結構域可存在於免疫球蛋白超家族的其它成員中，例如T細胞受體的Vα和Vβ(或γ和δ)結構域。在本發明的第二種構型背景下，非互補結構域不協同結合靶分子，但獨立地作用於可能位於相同或不同分子上的不同靶表位。人工結構域，例如基於蛋白支架(除工程改造後結合表位以外不結合表位)的結構域，是非互補的。同樣，基於(例如)免疫球蛋白結構域和纖連蛋白結構域的兩個結構域不是互補的。
免疫球蛋白其指保留抗體分子的免疫球蛋白摺疊特徵、含兩個β摺疊並通常含保守的二硫鍵的多肽家族。免疫球蛋白超家族成員涉及體內細胞和非細胞相互作用的多個方面，包括在免疫系統中的廣泛作用(例如抗體、T細胞受體分子等)、參與細胞粘附(例如ICAM分子)和胞內信號轉導(例如受體分子，如PDGF受體)。
本發明適用於所有具有結合結構域的免疫球蛋白超家族分子。優選地，本發明涉及抗體。
組合本發明的可變結構域組合形成一組結構域；例如，互補結構域可組合，例如VL結構域組合VH結構域。非互補結構域也可組合。結構域可以多種方式組合，包括通過共價或非共價方式連接結構域。
封閉構象多特異性配體該表述描述了一種如本文定義的多特異性配體，其含至少兩個本文所認為的表位結合結構域。術語『封閉構象』(多特異性配體)指配體的表位結合結構域排列得使一個表位結合結構域的表位結合與另一個表位結合結構域的表位結合競爭。即，各個表位結合結構域可獨立地但不同時地結合關連表位。可使用本文描述的方法獲得封閉構象的配體。
抗體抗體(例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)或片段(例如Fab、F(ab′)2、Fv、二硫鍵連接的FV、scFv、封閉構象的多特異性抗體、二硫鍵連接的scFv、雙功能抗體)，無論是源自天然產生抗體的任意物種，還是通過重組DNA技術產生；不管是分離自血清、B細胞、雜交瘤、轉染瘤、酵母還是細菌。
雙特異性配體含如本文定義的第一個免疫球蛋白單可變結構域和第二個免疫球蛋白單可變結構域的配體，其中可變區能夠結合同一抗原上一般不被單特異性免疫球蛋白結合的兩種不同抗原或兩種表位。例如，兩個表位可位於同一半抗原上，但不是相同的表位，或鄰接得不足以被單特異性配體結合。本發明的雙特異性配體由具有不同特異性的可變結構域組成，不合具有相同特異性的相互互補可變結構域對。
抗原由本發明的配體結合的分子。通常，抗原被抗體配體結合，能夠在體內產生抗體應答。其可為多肽、蛋白、核酸或其它分子。一般來說，根據對特定抗原的靶特異性選擇本發明的雙特異性配體。就常規抗體及其片段而言，由可變環(L1、L2、L3和H1、H2、H3)確定的抗體結合位點能夠結合抗原。
表位通常由免疫球蛋白的VH/VL對結合的結構單元。表位限定了抗體的最小結合位點，因此代表抗體的特異性靶。就單結構域抗體而言，表位代表由獨立的可變結構域結合的結構單元。
屬配體結合庫中所有成員的配體。一般來說，不通過如上定義的抗原結合位點結合。非限制性實例包括A蛋白、L蛋白和G蛋白。
選擇通過篩選獲得或通過Darwinian選擇方法獲得，其中在結構域和抗原或表位之間或在抗體和抗原或表位之間產生結合相互作用。因此，可在存在或不存在互補可變結構域的情況下選擇結合抗原或表位的第一個可變結構域。
通用構架對應於如Kabat(「Sequences of Proteins ofImmunological Interest」，美國健康和人類服務部)所定義的序列中的保守抗體區或對應於如Chothia和Lesk，(1987)J.Mol.Biol.196910-917所定義的人種系免疫球蛋白庫或結構的單個抗體構架序列。本發明提供了單個構架和一組這種構架的用途，已發現該用途通過單獨的高變區變異允許實際上任意結合特異性的衍化。
均相免疫實驗其中檢測分析物而不需要結合和未結合試劑分離步驟的免疫實驗。
基本相同的(或「基本同源的」)第一個胺基酸或核苷酸序列含有足夠數目的與第二個胺基酸或核苷酸序列相同或等同(例如具有相似的側鏈，例如保守的胺基酸取代)的胺基酸殘基或核苷酸，使得第一個和第二個胺基酸或核苷酸序列具有相似的活性。就抗體而言，第二個抗體具有相同的結合特異性，具有第一個抗體親合性的至少50％。
「結構域抗體」或「dAb」等同於本文使用的術語「單免疫球蛋白可變結構域多肽」或「單結構域抗體多肽」。
本文使用的表述「特異性結合」指根據使用例如BIAcoreTM表面等離子體共振系統和BIAcoreTM動力學評價軟體(例如2.1版)的表面等離子體共振分析的檢測，免疫球蛋白可變結構域以1μM或以下的解離常數(Kd)結合抗原。特異性結合相互作用的親合性或Kd優選為約500nM或更低，更優選約300nM或更低。
本文使用的術語「高親合性結合」指以低於或等於100nM的Kd結合。
本文使用的表述「人單結構域抗體多肽」指具有源自人種系免疫球蛋白V區的序列的多肽。當序列分離自人個體、分離自克隆的人抗體基因序列文庫(或人抗體V區基因序列的文庫)時，或當克隆的人種系V區序列用於產生一個或多個隨後選擇其與目標靶抗原的結合的多樣性序列(通過隨機或靶向誘變)時，該序列「源自人種系V區」。人免疫球蛋白可變結構域最低與天然人免疫球蛋白可變結構域序列具有至少85％的胺基酸相似性(包括例如87％、90％、93％、95％、97％、99％或更高相似性)。
或者或另外，「人免疫球蛋白可變結構域」是含4個人免疫球蛋白可變結構域構架區(W1-FW4)的可變結構域，所述構架區如Kabat等(1991，出處同上supra)所闡述。「人免疫球蛋白可變結構域構架區」包含a)人構架區的胺基酸序列，和b)含人構架區胺基酸序列的至少8個連續胺基酸的構架區。人免疫球蛋白可變結構域可包含FW1-FW4的胺基酸序列，其與由人種系抗體基因節段編碼的對應構架區的胺基酸序列相同，或者其還可含可變結構域，其中FW1-FW4序列相對於由人種系抗體基因節段編碼的對應構架區的胺基酸序列，總共含多達10個胺基酸序列差異、多達9個胺基酸序列差異、多達8個胺基酸序列差異、多達7個胺基酸序列差異、多達6個胺基酸序列差異、多達5個胺基酸序列差異、多達4個胺基酸序列差異、多達3個胺基酸序列差異、多達2個胺基酸序列差異或多達1個胺基酸序列差異。
本文定義的「人免疫球蛋白可變結構域」自身具有特異性結合抗原的能力，無論可變結構域是以單獨的單免疫球蛋白可變結構域存在，還是以與一個或多個另外的多肽序列一起的單免疫球蛋白可變結構域存在。本文使用的術語「人免疫球蛋白可變結構域」不包含「人源化」免疫球蛋白多肽，即已在恆定區中修飾而使其在人中免疫原性較小的非人(例如小鼠、駱駝等)免疫球蛋白。
本文使用的表述「免疫球蛋白可變結構域的序列特徵」指與免疫球蛋白可變結構域組成的序列在20個或更多個、25個或更多個、30個或更多個、35個或更多個、40個或更多個、45個或更多個乃至50個或更多個連續胺基酸內同源的胺基酸序列。
本文使用的術語「二價」指抗原結合抗體多肽具有兩個抗原特異性結合位點。抗原結合位點所識別的表位可相同或不同。當抗體多肽經各自的兩個抗原特異性結合位點結合兩種不同的表位(存在於不同的抗原上，或存在於同一抗原上)時，將抗體多肽稱為「雙特異性的」。
本文使用的術語「四價」指抗原結合多肽具有4個抗原特異性結合位點。抗原結合位點所識別的表位可相同或不同。「雙特異性」四價抗體多肽對一個表位或抗原具有兩個結合位點，對另一個不同表位或抗原具有兩個結合位點。
本文使用的「四價雙特異性抗原結合多肽構建物」具有類似於天然IgG的結構，即其具有兩個通過重鏈和輕鏈恆定結構域連接的抗原結合臂。但是，與天然IgG不同，各個臂均具有兩個抗原結合結構域，一個是第一個抗原特異性的，一個是第二個抗原特異性的。在本文描述的四價雙特異性抗原結合多肽構建物中，各個抗原結合結構域均為單結構域抗體，即抗原結合結構域不配對在一起形成單個結合位點，如在scFv中的單個結合位點。
本文使用的術語「IgG型」指人工抗原結合多肽，其具有的結構類似於天然IgG，即構建物具有兩個通過彼此結合的重鏈和輕鏈恆定結構域連接的抗原結合臂。如本文所述，IgG型的抗原結合多肽由4條多肽鏈組成含結合第一個抗原或表位、融合至IgG重鏈恆定結構域(例如含CH1-CH2-CH3的結構域)的單結構域抗體多肽的第一個融合蛋白的兩個拷貝；含結合第二個抗原或表位、融合至輕鏈恆定結構域(例如Cλ或Cκ)的單結構域抗體多肽的第二個融合蛋白的兩個拷貝。在該型中，當在細胞中共表達時，重鏈恆定結構域彼此二硫鍵合，這些重鏈恆定結構域各自還均二硫鍵合至輕鏈恆定結構域。當該術語在本文中使用時，IgG型的抗原結合多肽是四價的；可選擇融合至恆定結構域的單結構域抗體，以結合不同抗原(例如融合至重鏈恆定結構域、結合一種抗原的dAb1，融合至輕鏈恆定結構域、結合另一種抗原的dAb2)、相同抗原上的不同表位(例如融合至重鏈恆定結構域、結合抗原上的一種表位的dAb1，融合至輕鏈恆定結構域、結合相同抗原上的另一種表位的dAb2)，或者全部4個拷貝均可結合相同抗原上的相同表位(dAb1和dAb2結合相同抗原上的相同表位)。
本文使用的術語「Fab型」指二價抗體多肽構建物，其中一個單結構域抗體融合至輕鏈恆定結構域CL(例如Cλ或Cκ)，另一個單結構域抗體融合至重鏈CH1恆定結構域，各自的CH1和CL恆定結構域彼此二硫鍵合。可選擇單結構域抗體，以結合不同的抗原(產生雙特異性Fab型)、相同抗原上的不同表位(也是雙特異性的)或相同抗原上的相同表位。Fab型雙特異性抗體多肽的實例包括例如本文描述的融合至例如Cλ輕鏈的抗TNF-α單結構域抗體，以及如本文描述的融合至人重鏈CH1恆定結構域的抗VEGF單結構域抗體，其中兩種融合蛋白經其各自的恆定結構域彼此二硫鍵合。在該型的抗體多肽構建物中，抗原結合結構域不配對在一起形成單個結合位點，例如在scFv中的單個結合位點；相反，各個單結構域抗體自身均可結合抗原，使構建物成為二價的。
所述「類風溼性關節炎」(RA)指涉及關節和/或其它內部器官的襯層中炎症的疾病。RA通常影響許多不同的關節。其通常為慢性的，並可為驟發性疾病。RA是侵襲整個機體的系統性疾病，是最常見的關節炎形式之一。其特徵在於關節襯膜的炎症，引起疼痛、僵硬、暖感、充血和腫脹。發炎的關節襯層滑膜可侵襲和損傷骨和軟骨。炎性細胞釋放可消化骨和軟骨的酶。受影響的關節可失去其形狀和定位，導致疼痛和無法移動。症狀包括關節炎症、腫脹、難以移動和疼痛。其它症狀包括喪失食慾、發熱、精力損耗、貧血。其它特徵包括受壓區域(例如肘後)中皮膚下的腫塊(類風溼性結節)。類風溼性關節炎在臨床上基於幾種臨床認可的等級記分，例如描述於美國專利5,698,195的等級，該專利通過引用結合到本文中。簡而言之，臨床反應研究可評價以下參數1.觸痛關節的數目和疼痛/觸痛的評價使用以下的評分0＝無疼痛/觸痛1＝輕度疼痛。在詢問時患者訴其觸痛。
2＝中度疼痛。患者訴其觸痛和退縮。
3＝嚴重疼痛。患者訴其觸痛和退縮以及縮回。
2.腫脹關節的數目獨立地評價各個關節的觸痛和腫脹。
3.晨僵的持續時間(以分鐘計)4.握力5.視覺模擬疼痛評分(0-10cm)6.詢問患者和盲評價者，以評價對藥物的臨床反應。使用如下的主觀評分系統評價臨床反應5＝極佳的反應(最佳可能的預期反應)4＝良好反應(低於最佳可能的預期反應)3＝普通反應(明確改善但可較好)2＝無反應(無作用)1＝惡化(疾病惡化)迄今未知類風溼性關節炎的病因。但是，已知RA是自身免疫病，導致免疫系統攻擊健康關節組織，引起炎症和隨後的關節損傷。許多RA患者具有稱為HLA-DR4的某種遺傳標記。
本文使用的表述「TNF-α相關性疾病」指其中單獨或聯合一種或多種另外的藥物或治療，給予中和或拮抗TNF-α功能的藥物對治療該疾病有效的疾病或障礙，術語「治療」如本文所定義。
本文使用的術語「治療」指預防疾病或疾病症狀的發作、抑制疾病疾或病症狀的進展或逆轉疾病或疾病症狀。
本文使用的表述「預防疾病發作」指在傾向於患特定疾病(例如類風溼性關節炎)的個體中不出現該疾病的一種或多種症狀或可檢測參數。
本文使用的表述「抑制疾病的進展」指相對於沒有這種治療時的進展，採用藥物的治療停止或延緩了治療個體自身已表現出來的疾病症狀的嚴重性增加。
本文使用的表述「逆轉疾病」指相對於這種給予之前的症狀或參數，在給予藥物後，疾病的一種或多種症狀或可檢測參數改善。症狀或可檢測參數「改善」的證據為該可檢測參數的統計學顯著(但優選至少10％)的有利差異。
可檢測參數可包括例如可直接檢測的參數以及可間接檢測的參數。可直接檢測參數的非限制性實例包括關節大小、關節活動性、關節炎和組織病理學記分或指徵以及指示物(例如細胞因子)的血清水平。可間接檢測參數的實例包括例如患者的不舒服感覺或活動性欠缺或臨床認可的評定疾病嚴重性的等級。
本文使用的參數(例如關節炎記分或其它可檢測參數)「增加」指該參數的統計學顯著性增加。或者，「增加」指至少10％的增加。同樣，參數的「下降」指參數的統計學顯著性下降，或至少10％的下降。
本文使用的術語「拮抗」指藥物幹擾活性。當活性為例如TNF-α、VEGF或另一種生物活性分子或細胞因子的活性時，該術語包括抑制該分子或細胞因子的活性(達至少10％)，包括作為非限制性實例的與受體結合或相互作用(體外或在培養的細胞表面上或體內)、胞內信號轉導、細胞毒性、有絲分裂發生或其它由該分子或細胞因子介導的下遊作用或過程(例如基因活化)。拮抗作用包括幹擾因子(例如TNF、VEGF等)的受體結合以及當因子結合至細胞表面受體時幹擾因子的活性。
本文使用的術語「大於或等於」指一個值等於另一個值，或以統計學顯著方式(P＜0.1，優選p＜0.05，更優選p＜0.01)大於該值。當在例如疾病治療或受體結合拮抗中對比組合物的效力與另一種組合物的效力時，對比應在等摩爾的基礎上進行。
本文使用的「連接的」指聚合物部分(例如PEG)連接至抗體多肽(例如本文所述的單結構域抗體)的胺基酸殘基。PEG聚合物與抗體多肽(例如單結構域抗體)的胺基酸殘基的連接被稱為「PEG化」，可使用幾個PEG連接部分實現，這些PEG連接部分包括但不限於N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)活化酯、琥珀醯亞胺丙酸酯(SPA)、馬來醯亞胺(MAL)、乙烯碸(VS)或硫醇。PEG聚合物或其它聚合物可在預定位置連接至抗體多肽，或者可以隨機連接至抗體分子。但是，優選PEG聚合物在預定位置連接至抗體多肽。PEG聚合物可連接至抗體多肽中的任意殘基，但是，優選聚合物連接至賴氨酸或半胱氨酸，其或者是抗體多肽中天然的，或者通過例如將抗體多肽中的天然殘基誘變為半胱氨酸或賴氨酸而工程改造入抗體多肽中。本文使用的「連接的」還可指兩個或更多抗體單可變結構域單體的結合，以形成二聚體、三聚體、四聚體或其它多聚體。dAb單體可通過本領域已知的幾種方法連接形成多聚體，所述方法包括但不限於dAb單體作為融合蛋白表達、兩個或更多單體經單體之間肽接頭的連接，或通過翻譯後單體的彼此直接化學連接或利用二硫鍵的接頭的化學連接，或通過連接至二、三或多價連接部分(例如多臂PEG)。
就聚合物「直接連接」至抗體多肽(例如單可變結構域多肽)而言，本文使用的表述「直接連接」指聚合物連接至殘基的情況，其中所述殘基是可變結構域的天然組成部分，例如不包含在恆定區、鉸鏈區或接頭肽內。相反，本文使用的表述「間接連接」至抗體多肽指聚合物分子與抗體單可變結構域的連接，其中聚合物不連接至為天然可變區的組成部分的胺基酸殘基(例如可連接至鉸鏈區)。如果聚合物經連接肽連接至抗體多肽，則聚合物是「間接連接」的，即聚合物不連接至為抗體自身組成部分的胺基酸殘基。或者，如果聚合物連接至多肽的C-末端鉸鏈區，或連接至可作為抗體多肽的組成部分存在的恆定區任意殘基，則聚合物「間接連接」至抗體多肽。
本文使用的術語「同源性」或「相似性」指兩個核苷酸或胺基酸序列在結構上彼此相似的程度。本文使用的術語「相似性」是在序列比對時胺基酸序列在對應位置具有相似胺基酸殘基的程度的尺度。當其側鏈相似時胺基酸彼此相似。具體地說，「相似性」包括彼此為保守置換的胺基酸。「保守」置換是在blosum62置換矩陣(Hentikoff和Hentikoff，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915-10919)中具有正分的任意置換。所述「序列A與序列B n％相似」指序列A和B之間最優全局比對位置的n％由相同胺基酸或保守置換組成。可在Needleman-Wunsch比對算法中使用以下參數進行最優全局比對對於多肽置換矩陣blosum62。
空位記分函數-A-B*LG，其中A＝11(空位罰分)，B＝1(空位長度罰分)，LG是空位長度。
對於核苷酸序列置換矩陣匹配為10，不匹配為0。
空位記分函數-A-B*LG，其中A＝50(空位罰分)，B＝3(空位長度罰分)，LG是空位長度。
典型的保守置換為Met、Val、Leu和Ile之一；Ser和Thr之一；殘基Asp、Glu和Ash之一；殘基Gln、Lys和Arg之一；或芳香族殘基Phe和Tyr。
正如本文所使用的，當使用Needleman-Wunsch算法或Tatusova和Madden，1999，FEMS Microbiol Lett.174247-250描述的「BLAST 2序列」算法比對時，兩個序列彼此具有至少85％的序列相似性，這兩個序列是「同源的」或「相似的」。當使用「BLAST 2序列算法」比對胺基酸序列時，Blosum62矩陣是默認矩陣。
如本領域所知，「同一性」是兩個或更多多肽序列或兩個或更多核苷酸序列之間的關係，其通過對比序列測定。在本領域，「同一性」還指多肽或多核苷酸序列之間的序列相關性程度，其視情況通過這些序列鏈之間的匹配來測定。通過已知方法可容易地計算同一性百分率，這些方法包括但不限於描述於Computational MolecularBiology，Lesk，A.M.編輯，Oxford University Press，New York，1988；BiocomputingInformatics and Genome Projects，Smith，D.W.編輯，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.編輯，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，AcademicPress，1987；和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.編輯，M Stockton Press，New York，1991；和Carillo，H.和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，481073(1988)的方法。測定同一性的優選方法設計用於獲得所測試序列之間的最大匹配。測定同一性的方法在可公開獲得的電腦程式中編程。測定兩個序列之間的序列同一性的優選計算機編程方法包括但不限於GCG程序包(Devereux，J.等，Nucleic Acids Research 12(1)387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Atschul，S.F.等，J.Molec.Biol.215403-410(1990))。BLAST X程序可由NCBI和其它來源公開獲得(BLAST Manual，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，J.Mol.Biol.215403-410(1990))。作為說明，核苷酸序列與「SEQ ID NOA」的參比核苷酸序列具有至少例如95％「同一性」的多核苷酸，含義是除了該多核苷酸序列在「SEQ ID NOA」參比核苷酸序列的每100個核苷酸中可包含多達5個點突變以外，該多核苷酸的核苷酸序列與參比序列相同。換句話說，為獲得所具有的核苷酸序列與參比核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸，參比序列中最多5％的核苷酸可缺失或由另一種核苷酸置換，或可將參比序列總核苷酸中最多5％的若干核苷酸插入到參比序列中。參比序列的這些突變可出現在參比核苷酸序列的5或3末端位置或這些末端位置之間的任何位置，其獨立地散布在參比序列中的核苷酸中，或散布在參比序列中的一個或多個連續簇(contiguous group)中。類似地，就胺基酸序列與「SEQ IDNOB」的參比胺基酸序列具有至少例如95％同一性的多肽而言，含義是除了該多肽序列在「SEQ ID NOB」參比胺基酸的每100個胺基酸中可包含最多5個胺基酸變化以外，該多肽的胺基酸序列與參比序列相同。換句話說，為獲得所具有的胺基酸序列與參比胺基酸序列至少95％相同的多肽，參比序列中最多5％的胺基酸殘基可缺失或由另一種胺基酸置換，或可將最多參比序列中總胺基酸殘基5％的若干胺基酸插入到參比序列中。參比序列的這些變化可出現在參比胺基酸序列的氨基或羧基末端位置或這些末端位置之間的任何位置，其獨立地散布在參比序列中的殘基中，或散布在參比序列中的一個或多個連續簇中。
本文使用的術語「低嚴格性」、「中等嚴格性」、「高嚴格性」或「非常高的嚴格條件」描述了核酸雜交和漂洗的條件。關於實施雜交反應的指導可見於Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley和Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6，其通過引用整體結合到本文中。在該參考文獻中描述了含水和不含水的方法，可使用任一種。本文所指的特異性雜交條件為如下的條件(1)低嚴格雜交條件6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)、約45℃，接著以0.2X SSC、0.1％SDS於至少50℃(對於低嚴格雜交條件，漂洗溫度可增加至55℃)漂洗2次；(2)中等嚴格雜交條件6X SSC、約45℃，接著以0.2X SSC、0.1％SDS於60℃漂洗1次或多次；(3)高嚴格雜交條件6X SSC、約45℃，接著以0.2X SSC、0.1％SDS於65℃漂洗1次或多次；以及優選(4)非常高的嚴格雜交條件0.5M磷酸鈉、7％SDS，65℃，接著以0.2XSSC、1％SDS於65℃漂洗1次或多次。
本文使用的表述「於......濃度」指給定多肽以所提及的每單位體積質量或摩爾量溶解在溶液(優選水性溶液)中。因此，「於X濃度」或「於至少X的濃度」存在的多肽排除了多肽的乾燥和結晶製品。
本文使用的術語「庫」指不同變體的集合，例如其一級序列不同的多肽變體。用於本發明的文庫包括含至少1000個成員的多肽庫。
本文使用的術語「文庫」指異源多肽或核酸的混合物。文庫由各個均具有單一多肽或核酸序列的成員組成。就此而言，文庫與庫同義。文庫成員之間的序列差異是產生文庫中存在的多樣性的原因。文庫可採取多肽或核酸的簡單混合物的形式，或可為生物體或細胞的形式，例如用核酸文庫轉化的細菌、病毒、動物或植物細胞等。優選地，各個單獨的生物體或細胞都僅含有一個或少量的文庫成員。有利地，將核酸摻入到表達載體中，以便允許表達由核酸編碼的多肽。因此，在一個優選方面，文庫可採取宿主生物群的形式，各個生物均含有表達載體的一個或多個拷貝，該載體含核酸形式的文庫單個成員，可表達其以產生其對應的多肽成員。因此，宿主生物群具有編碼遺傳多樣性多肽變體大庫的潛力。
本文使用的「聚合物」指由重複單體單位組成的大分子，並可指非合成的或天然存在的聚合物，例如任選取代的直鏈或支鏈聚亞烷基、聚亞烯基或聚氧亞烷基，或分支或未分支的多糖。具體地說，本文使用的「聚合物」指任選取代的或分支的鏈聚(乙二醇)、聚(丙二醇)或聚(乙烯醇)及其衍生物。
本文使用的「PEG」或「PEG聚合物」指聚乙二醇，更具體地說可指衍生化形式的PEG，包括但不限於PEG的N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)活性酯例如琥珀醯亞胺丙酸酯、苯並三唑活性酯、用馬來醯亞胺、乙烯碸或巰基基團衍化的PEG。具體的PEG製品可包括PEG-O-CH2CH2CH2-CO2-NHS、PEG-O-CH2-NHS、PEG-O-CH2CH2-CO2-NHS、PEG-S-CH2CH2-CO-NHS、PEG-O2CNH-CH(R)-CO2-NHS、PEG-NHCO-CH2CH2-CO-NHS和PEG-O-CH2-CO2-NHS，其中R是(CH2)4)NHCO2(mPEG)。在本發明中有用的PEG聚合物可為線性分子，或者可為分支的，其中多個PEG部分存在於單個聚合物中。在本發明中有用的一些特別優選的PEG構象包括但不限於以下形式
本文使用的「巰基選擇性試劑」是用於將PEG聚合物連接至含巰基胺基酸的試劑。胺基酸殘基半胱氨酸上的巰基基團對與巰基選擇性試劑的相互作用特別有用。用於本發明的巰基選擇性試劑包括但不限於馬來醯亞胺、乙烯碸或硫醇。巰基選擇性試劑偶聯半胱氨酸殘基的用途是本領域已知的，可根據本發明的需要而採用(參見Eg.，Zalipsky，1995，Biocojug.Chem.6150；Greenwald等，2000，Crit. Rev.Ther.Drug Carrier Syst.17101；Herman等，1994，Macromol Chem.Phys.195203)。
本文使用的術語「抗原」指被抗體或抗體的結合區(例如可變結構域)結合的分子。通常，抗原能夠在體內產生抗體應答。抗原可為肽、多肽、蛋白、核酸、脂質、糖或其它分子。一般來說，根據對特定抗原的靶特異性選擇免疫球蛋白可變結構域。
本文使用的術語「表位」指通常由免疫球蛋白VH/VL對結合的結構單元。表位限定了抗體的最小結合位點，因此代表了抗體的特異性靶。就單結構域抗體而言，表位代表由分離的可變結構域結合的結構單元。
本文使用的術語「中和」當用於指代本文所述的單免疫球蛋白可變結構域多肽時，意指該多肽幹擾靶抗原的可檢測活性或功能。如果多肽將靶抗原的可檢測活性或功能降低至少50％，優選至少60％、70％、80％、90％、95％或更高，最高到並包括100％抑制(即無可檢測的靶抗原作用或功能)，則該多肽是「中和」多肽。靶抗原的可檢測活性或功能的這種降低可由本領域技術人員使用檢測該活性或功能的一種或多種指標的標準方法來評價。作為實例，當靶為TNF-α時，可使用標準L929細胞殺傷實驗或通過檢測單免疫球蛋白可變結構域抑制HUVEC上TNF-α誘導性ELAM-1表達(其檢測TNF-α誘導的細胞活化)的能力，評價中和活性。和本文使用的「中和」類似，本文使用的「抑制細胞的細胞毒性」指根據例如使用標準L929細胞殺傷實驗的檢測，細胞死亡下降，其中被抑制的細胞毒性為細胞死亡下降至少10％或以上。
本文使用的「靶抗原的可檢測活性或功能」包括但不限於例如細胞信號轉導、酶活性、結合活性、配體依賴性內化、細胞殺傷、細胞活化、提升細胞存活率和基因表達。本領域技術人員可實施檢測給定靶抗原的這些活性的實驗。優選地，如下確定本文使用的「活性」(1)細胞型實驗中的ND50；(2)對靶配體的親合性；(3)ELISA結合；或(4)受體結合實驗。實施這些測試的方法是本領域技術人員已知的，在下文進一步詳述。
本文使用的「保留活性」指PEG連接的抗體多肽(例如單可變結構域)的活性水平，其為非PEG連接的抗體多肽活性水平的至少10％，優選為相同序列的非PEG連接的抗體多肽活性的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％直到90％，優選達95％、98％直到100％，其中活性如本文所述測定。更具體地說，應當以抗體摩爾數為基準測定PEG連接的抗體多肽相比於非PEG連接的抗體多肽的活性；即在各個實驗中應使用摩爾數相等的各PEG連接抗體多肽和非PEG連接抗體多肽。在測定特定的PEG連接抗體多肽是否「保留活性」時，優選將PEG連接的抗體多肽的活性與無PEG時的相同抗體多肽的活性對比。
本文使用的術語「同二聚體」、「同三聚體」、「同四聚體」和「同多聚體」分別指含2、3或更多個(例如4、5等)給定單免疫球蛋白可變結構域多肽序列單體的分子。例如，同二聚體應包括兩個拷貝的相同VH序列。單免疫球蛋白可變結構域多肽的「單體」是特異性結合抗原的單個VH或VL序列。同二聚體、同三聚體、同四聚體或同多聚體中的單體可通過以下方式連接作為融合多肽表達(例如用單體之間的肽接頭)，或通過將翻譯後的單體彼此直接化學連接或通過利用二硫鍵的接頭化學連接，或通過連接至二、三或多價連接部分。在一個實施方案中，同二聚體、同三聚體、同四聚體或同多聚體中的單體可通過多臂PEG聚合物連接，其中二聚體、三聚體、四聚體或多聚體中的各個單體都如上所述連接至多臂PEG的PEG部分。
本文使用的術語「異二聚體」、「異三聚體」、「異四聚體」和「異多聚體」分別指含兩種或更多種不同單免疫球蛋白可變結構域多肽序列的2、3或更多個(例如4、5、6、7直到8個或更多個)單體的分子。例如，異二聚體應包括兩個VH序列，例如VH1和VH2，或者可替代地包括VH和VL的組合。和同二聚體、同三聚體或同四聚體相類似，異二聚體、異三聚體、異四聚體或異多聚體中的單體可通過以下方式連接作為融合多肽表達(例如用單體之間的肽接頭)，或通過將翻譯後的單體彼此直接化學連接或通過利用二硫鍵的接頭化學連接，或通過連接至二、三或多價連接部分。在一個實施方案中，異二聚體、異三聚體、異四聚體或異多聚體中的單體可通過多臂PEG聚合物連接，其中二聚體、三聚體、四聚體或多聚體中的各個單體都如上所述連接至多臂PEG的PEG部分。
本文使用的術語「半壽期」指配體(例如抗體多肽，如單免疫球蛋白可變結構域)的血清濃度例如由於配體降解和/或天然機制對配體的清除和螯合而在體內降低50％所耗費的時間。在體內穩定化抗體多肽，其半壽期通過結合至抵抗降解和/或清除或螯合的分子(例如PEG)而增加。如果抗體多肽(例如dAb)在體內的功能活性持續的周期長於未連接至PEG聚合物的相似dAb，則其半壽期增加。通常，PEG化dAb的半壽期相對於非PEG化dAb增加10％、20％、30％、40％、50％或更高。半壽期在2x、3x、4x、5x、10x、20x、30x、40x、50x或更高範圍內的增加是有可能的。或者或另外，半壽期在達30x、40x、50x、60x、70x、80x、90x、100x、150x範圍內的增加是有可能的。按照本發明，PEG連接的抗體單可變結構域具有0.25-170小時的半壽期，優選1-100小時，更優選30-100小時，再更優選50-100小時，高達170、180、190和200小時或更高。
本文使用的「對降解的抗性」或「抗降解」當針對PEG或其它聚合物連接的dAb單體或多聚體使用時，意指PEG或其它聚合物連接的dAb單體或多聚體在接觸pH 2.0的胃蛋白酶30分鐘時降解不超過10％，優選根本不降解。在具體提到連接PEG或其它聚合物連接的dAb多聚體(例如異或同二聚體、三聚體、四聚體等)時，抗降解的分子在pH 2.0的胃蛋白酶存在下於30分鐘內的降解低於5％，優選根本不降解。
本文使用的「流體動力學大小」指基於分子(例如蛋白分子)在水性溶液中的擴散的分子表觀大小。可處理蛋白在溶液中的擴散或運動，以得到蛋白的表觀大小，其中尺寸通過蛋白顆粒的「Stokes半徑」或「流體動力學半徑」獲得。蛋白的「流體動力學大小」取決於質量和形狀(構象)這二者，使得具有相同分子量的兩種蛋白可基於蛋白整體構象具有不同的流體動力學大小。PEG連接的抗體多肽(例如單可變結構域，包括本文描述的抗體可變結構域多聚體)的流體動力學大小可在24kDa至500kDa、30-500kDa、40-500kDa、50-500kDa、100-500kDa、150-500kDa、200-500kDa、250-500kDa、300-500kDa、350-500kDa、400-500kDa和450-500kDa的範圍內。優選本發明的PEG化dAb的流體動力學大小為30-40kDa、70-80kDa或200-300kDa。當需要將抗體可變結構域多聚體用於造影應用時，多聚體應具有50-100kDa的流體動力學大小。或者，當需要將抗體單結構域多聚體用於治療應用時，多聚體應具有200kDa以上的流體動力學大小。
附圖簡述

圖1顯示了VH/HSA在位置H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H96、H97、H98(分別由DVT或NNK編碼)處的多樣性，這些位置位於VH HSA的抗原結合位點。VK序列在位置L50、L53是多樣化的。胺基酸序列，SEQ ID NO219；核苷酸序列，上鏈，SEQID NO220。
圖2顯示了文庫1種系VK/DVT VH；文庫2種系VK/NNK VH；文庫3種系VH/DVT VK；文庫4種系VH/NNK VK。為噬菌體展示/ScFv形式。預先選擇結合屬配體A蛋白和L蛋白的這些文庫，以便大部分克隆和選擇的文庫有功能。針對HSA(第一輪)和β-gal(第二輪)或HSA β-gal選擇來選擇文庫，或針對β-gal(第一輪)和HSA(第二輪)β-gal HSA選擇來選擇文庫。按順序PCR擴增這些克隆的可溶性scFv。選擇一個編碼雙特異性抗體的克隆K8進行進一步研究。核苷酸序列SEQ ID NO221；胺基酸序列SEQ ID NO222。
圖3顯示了VH鏈和VK鏈的比對。VH模擬，SEQ ID NO1；K8，SEQ ID No 223(VH)和232(VK)；VH2，SEQ ID NO224；VH4，SEQ ID NO225；VHC11，SEQ ID NO226；VHA10sd，SEQ ID NO227；VHA1sd，SEQ ID NO228；VHA5sd，SEQ ID NO229；VHC5sd，SEQ ID NO230；VHC11sd，SEQ ID NO231；Vκ模擬，SEQ ID NO3；E5sd，SEQ ID NO233；C3，SEQ ID NO234。
圖4顯示了K8抗體結合特性的特徵，K8抗體結合特性的特徵在於單克隆噬菌體ELISA，發現雙特異性K8抗體結合HSA和β-gal，並展示在噬菌體表面上，吸收信號大於1.0。未檢測到與其它蛋白的交叉反應性。
圖5顯示了使用已知濃度的K8抗體片段實施的scFv ELISA。用100μg HSA、10μg/ml的BSA和β-gal和100μg/ml A蛋白以1μg/ml濃度包被96-孔板。施加50μg的K8 scFv的連續稀釋液，用L蛋白-HR檢測結合的抗體片段。ELISA結果證實了K8抗體的雙特異性性質。
圖6顯示了使用可溶性scFv ELISA分析的克隆K8VK/模擬VH的結合特徵。如Harrison等，Methods Enzymol.1996；26783-109所述用IPTG誘導可溶性scFv片段的產生，直接檢測含scFv的上清液。如實施例1所述進行可溶性scFv ELISA，用L蛋白-HRP檢測結合的scFv。ELISA結果揭示，該克隆仍能結合β-gal，而結合BSA被消除。
圖7顯示了可變結構域載體1和2的序列。核苷酸序列SEQ IDNO221；胺基酸序列SEQ ID NO222。
圖8是用於構建VH1/VH2多特異性配體的CH載體圖。
圖9是用於構建VK1/VK2多特異性配體的VK載體圖。
圖10對比了TAR1-5二聚體4、TAR1-5-19二聚體4和TAR1-5-19單體的TNF受體實驗。
圖11對比了TAR1-5二聚體1-6的TNF受體實驗。所有二聚體都已FPLC純化，顯示了優化的二聚化類型的結果。
圖12不同型的TAR1-519同二聚體的TNF受體實驗具有3U、5U或7U接頭的dAb接頭-dAb型、Fab型和半胱氨酸鉸連結頭型。
圖13文庫1的模擬VH序列。基於種系序列DP47-JH4b的VH構架序列。其中NNK隨機化(N＝A或T或C或G核苷酸；K＝G或T核苷酸)已摻入到文庫1中的位置用粗體下劃線文本表示。胺基酸序列SEQ ID NO1；核苷酸序列，上鏈，SEQ ID NO2。
圖14文庫2的模擬VH序列。基於種系序列DP47-JH4b的VH構架序列。其中NNK隨機化(N＝A或T或C或G核苷酸；K＝G或T核苷酸)已摻入到文庫2中的位置用粗體下劃線文本表示。胺基酸序列SEQ ID NO235；核苷酸序列，上鏈，SEQ ID NO236。
圖15文庫3的模擬VK序列。基於種系序列DPK9-J K1的VK構架5序列。其中NNK隨機化(N＝A或T或C或G核苷酸；K＝G或T核苷酸)已摻入到文庫3中的位置用粗體下劃線文本表示。胺基酸序列SEQ ID NO3；核苷酸序列，上鏈，SEQ ID NO4。
圖16抗MSA dAb MSA 16和MSA 26的核苷酸和胺基酸序列。MSA 16胺基酸序列，SEQ ID NO237；核苷酸序列，SEQ ID NO238。MSA 26胺基酸序列，SEQ ID NO239；核苷酸序列，SEQ IDNO240。
圖17MSA 16和26的抑制Biacore。通過測定Kd的抑制Biacore分析純化的dAb MSA16和MSA26。簡言之，測試dAb，以確定在高密度MSA包被的Biacore CM5晶片上獲得200RU應答所需的dAb濃度。一旦確定了所需的dAb濃度，就將在預期Kd附近的濃度範圍的MSA抗原與dAb預混合，並過夜溫育。然後以30μl/分鐘的高流速檢測各個預混合物中dAb與MSA包被Biacore晶片的結合。
圖18注射後的MSA16血清水平。在小鼠中測定dAb MSA16的血清半壽期。MSA16以約1.5mg/kg單劑靜脈注射入CD1小鼠中給藥。採用2區室模型的建模顯示MSA16具有0.98小時的t1/2β、36.5小時的t1/2β和913小時.mg/ml的AUC。和具有0.06小時的t1/2β和0.34小時的t1/2β的HEL4(抗雞蛋溶菌酶dAb)相比，MSA16具有被延長得相當長的半壽期。
圖19顯示抑制TNF與含MSA26Ck和TAR1-5-19CH的Fab樣片段結合的ELISA(a)和TNF受體實驗(c)。加入MSA和Fab樣片段降低了抑制水平。用雙特異性VK CH和VK CK Fab樣片段探測用1μg/ml TNF-α包被的ELISA板，另用經計算在ELISA上產生相似信號的濃度的對照TNF-α結合dAb探測該ELISA板。在有和沒有2mg/ml MSA的情況下，雙特異性和對照dAb均用於探測ELISA板。雙特異性孔中的信號降低超過50％，但dAb孔中的信號根本沒降低(參見圖19a)。另在有和無MSA的情況下，將相同的雙特異性蛋白置於受體實驗中，也表明MSA競爭(參見圖19c)。這表明，MSA與雙特異性的結合與其和TNF-α的結合競爭。
圖20TNF受體實驗顯示了TNF與TAR1-5-19 dAb和MSA16 dAb的二硫鍵合異二聚體結合的抑制劑。MSA和二聚體的加入以劑量依賴性方式降低抑制劑水平。在恆定濃度(18nM)的異二聚體和連續稀釋的MSA與HSA存在下進行TNF受體實驗。以一定濃度範圍(一直到2mg/ml)存在的HSA不引起二聚體抑制TNF-α能力的降低。但是，加入MSA使二聚體抑制TNF-α的能力劑量依賴性降低。這表明，MSA和TNF-α競爭結合MSA16二聚體-cys鍵合的TAR1-5-19。單獨的MSA和HSA不影響實驗中的TNF結合水平。
圖21顯示了人種系構架節段DP47的多核苷酸和胺基酸序列(另參見圖1)。胺基酸序列是SEQ ID NO1；上鏈的多核苷酸序列是SEQID NO2。
圖22顯示了人種系構架節段DPK9的多核苷酸和胺基酸序列。胺基酸序列是SEQ ID NO3；上鏈的多核苷酸序列是SEQ ID NO4。
圖23顯示了本文描述的TAR1克隆的胺基酸序列(參見例如實施例13)。TAR1-5，SEQ ID NO241；TAR1-27，SEQ ID NO242；TAR1-261，SEQ ID NO243；TAR1-398，SEQ ID NO244；TAR1-701，SEQID NO245；TAR1-5-2，SEQ ID NO246；TAR1-5-3，SEQ ID NO247；TAR1-5-4，SEQ ID NO248；TAR1-5-7，SEQ ID NO249；TAR1-5-8，SEQ ID NO250；TAR1-5-10，SEQ ID NO251；TAR1-5-11，SEQ IDNO252；TAR1-5-12，SEQ ID NO253；TAR1-5-13，SEQ ID NO254；TAR1-5-19，SEQ ID NO191；TAR1-5-20，SEQ ID NO255；TAR1-5-21，SEQ ID NO256；TAR1-5-22，SEQ ID NO257；TAR1-5-23，SEQ IDNO258；TAR1-5-24，SEQ ID NO259；TAR1-5-25，SEQ ID NO260；TAR1-5-26，SEQ ID NO261；TAR1-5-27，SEQ ID NO262；TAR1-5-28，SEQ ID NO263；TAR1-5-29，SEQ ID NO264；TAR1-5-34，SEQID NO265；TAR1-5-35，SEQ ID NO266；TAR1-5-36，SEQ ID NO267；TAR1-5-464，SEQ ID NO268；TAR1-5-463，SEQ ID NO269；TAR1-5-460，SEQ ID NO270；TAR1-5-461，SEQ ID NO271；TAR1-5-479，SEQ ID NO272；TAR1-5-477，SEQ ID NO273；TAR1-5-478，SEQ ID NO274；TAR1-5-476，SEQ ID NO275；TAR1-5-490，SEQ ID NO276；TAR1h-1，SEQ ID NO277；TAR1h-2，SEQ ID NO278；TAR1h-3，SEQ ID NO279。
圖24顯示了單劑靜脈注射後dAb單體型或Fc融合型的TAR1-5-19的血清半壽期的對比。
圖25概述了在使用TAR1-5-19的一系列Tg197模型實驗中給予的dAb構建物的劑量和給予時間。
圖26概述了在Tg197小鼠RA模型研究中使用的不同型的TAR1-5-19 dAb(Fc融合、PEG化、抗-TNF/抗-SA雙特異性)的每周一次的劑量。
圖27概述了在Tg197小鼠RA模型研究中給予的抗TNF dAb的型(Fc融合、PEG二聚體、PEG四聚體、抗-TNF/抗-SA雙特異性)、傳遞方式和劑量，該研究對比了抗TNF dAb構建物的效力和現有抗TNF產品的效力。
圖28顯示了研究的給藥方案和評分方案，該研究在Tg197小鼠RA模型中檢驗抗TNF dAb抵抗既有疾病症狀的效力。
圖29顯示了IgG樣雙特異性抗體的SDS PAGE凝膠分析，所述IgG樣雙特異性抗體含融合至人IgG1恆定結構域的人VEGF特異性Vκ可變結構域和融合至人Cκ恆定結構域的人TNF-α特異性Vκ可變結構域。泳道1InVitrogen Multimark分子量標記。泳道2在1X非還原性載樣緩衝液中的抗TNF x抗VEGF雙特異性抗體。泳道3在1X載樣緩衝液+10mM β-巰基乙醇中的抗TNF x抗VEGF雙特異性抗體。
圖30A和B顯示了在TNF-α活性和VEGF受體結合實驗中檢驗抗-TNF x抗VEGF雙特異性抗體的抑制作用的實驗結果。A.L929TNF-α細胞毒性中和實驗的結果。以方塊顯示數據點的曲線，對照抗TNF-α抗體。以尖朝上的三角形表示數據點的曲線，抗TNF x抗VEGF雙特異性抗體。以尖朝下的三角形表示數據點的曲線，抗TNF-α單體。B.人VEGF受體2結合實驗的結果。以方塊顯示數據點的曲線，抗TNF x抗VEGF雙特異性抗體。以尖朝上的三角形表示數據點的曲線，抗VEGF對照。以尖朝下的三角形表示數據點的曲線，陰性對照。
發明詳述雙特異性抗體多肽本發明的發明人在其國際專利申請WO 2004/003019中已描述了雙特異性配體的進一步改良，其中配體的一種特異性針對生物體體內存在的蛋白或多肽，可通過與其結合起增加配體半壽期的作用。WO2004/003019描述了含對第一種抗原或表位具有結合特異性的第一個免疫球蛋白單可變結構域和對第二種抗原或表位具有結合活性的第二個互補免疫球蛋白單可變結構域的雙特異性配體，其中所述抗原或表位中的一種或兩種起增加配體體內半壽期的作用，其中所述第一個和第二個結構域沒有共有相同特異性的相互互補結構域，前提是所述雙特異性配體不由抗HSA VH結構域和抗p半乳糖苷酶VK結構域組成。
有利地，如本文所述增加配體半壽期的抗原或表位存在於生物體體內可見的蛋白或多肽上。
實例包括胞外基質蛋白、血液蛋白和存在於生物體各種組織中的蛋白。蛋白例如通過充當填充劑或通過將配體錨定至需要的作用位點，起降低血液中配體清除速率的作用。下文的附件1給出了增加體內半壽期的抗原/表位的實例。
增加的半壽期對免疫球蛋白的體內應用有用，尤其是對抗體有用，最尤其是對小尺寸的抗體片段有用。這種片段(Fv，二硫鍵合的Fv、Fab、scFv、dAb)受到機體的快速清除；因此，儘管其能夠快速地到達機體的大多數組成部分，且快速生產和易於操作，但其體內應用受限於其僅短暫的體內保留時間。本發明通過提供體內半壽期增加的配體並因此提供在機體中保留較長時間的配體功能活性而解決了此問題。
配體半壽期的藥代動力學分析和測定方法是本領域技術人員熟知的。詳述可見於Kenneth，A等Chemical Stability of PharmaceuticalsA Handbook for Pharmacists和Peters等，Pharmacokinetc analysisAPractical Approach(1996)。還可參考「Pharmacokinetics」，M Gibaldi和D Perron，Marcel Dekker出版，第2修訂版(1982)，其描述了諸如tα和tβ半壽期以及曲線下面積(AUC)之類的藥代動力學參數。
可由配體血清濃度對時間的曲線測定半壽期(T1/2α和T1/2β)和AUC。例如，可使用WinNonlin分析軟體包(可由Pharsight Corp.，Mountain View，CA，USA獲得)建立曲線模型。在第一階段(α期)，配體在患者中主要經歷分布，某些被去除。第二階段(β期)是末期，此時配體已分布完，血清濃度隨著配體由患者中被清除而降低。tα半壽期是第一階段的半壽期，tβ半壽期是第二階段的半壽期。因此，有利地，本發明提供具有15分鐘或更高的範圍內的tα半壽期的本發明配體或含配體的組合物。在一個實施方案中，範圍的下限是30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、10小時、11小時或12小時。另外或或者，本發明的配體或組合物具有在高達並包括12小時範圍內的tα半壽期。在一個實施方案中，範圍的上限是11、10、9、8、7、6或5小時。合適範圍的實例是1-6小時、2-5小時或3-4小時。有利地，本發明提供具有在2.5小時或更高的範圍內的tβ半壽期的本發明配體或含配體的組合物。
在一個實施方案中，範圍的下限是3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、10小時、11小時或12小時。另外或或者，本發明的配體或組合物具有在高達並包括21天範圍內的tβ半壽期。在一個實施方案中，範圍的上限是12小時、24小時、2天、3天、5天、10天、15天或20天。有利地，本發明的配體或組合物具有在12-60小時範圍內的tβ半壽期。
在進一步的實施方案中，其在12-48小時的範圍內。在再進一步的實施方案中，其在12-26小時的範圍內。
在以上標準以外或作為替代，本發明提供具有在1mg.分鐘/ml或以上範圍內的AUC值(曲線下面積)的本發明配體或含配體的組合物。在一個實施方案中，範圍的下限是5、10、15、20、30、100、200或300mg.分鐘/ml。另外或或者，本發明的配體或組合物具有在高達600mg.分鐘/ml範圍內的AUC。
在一個實施方案中，範圍的上限是500、400、300、200、150、100、75或50mg.分鐘/ml。有利地，本發明的配體具有選自以下範圍內的AUC15-150mg.分鐘/ml、15-100mg.分鐘/ml、15-75mg.分鐘/ml和15-50mg.分鐘/ml。
在第一個實施方案中，雙特異性配體含2個互補可變結構域，即，即便兩個可變結構域在本發明背景下單獨地結合其關連表位，但在其天然環境中也能夠作為關連對或組有效在一起運作。例如，互補可變結構域可為免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變結構域(VH和VL)。VH和VL結構域有利地由scFv或Fab抗體片段提供。可通過例如以下方式將可變結構域連接在一起形成多價配體提供各個V結構域C末端的鉸鏈區和鉸鏈區中半胱氨酸之間的二硫鍵合；或提供每個均在結構域的C末端具有半胱氨酸的dAb，半胱氨酸二硫鍵合在一起；或產生V-CH和V-CL，以產生Fab型；或使用肽接頭(例如下文論述的Gly4Ser接頭)，以產生二聚體、三聚體和另外的多聚體。本發明的發明人已發現，使用互補可變結構域允許兩個結構域表面包裝在一起，與溶劑隔離。而且，互補結構域能夠彼此穩定化。另外，其允許建立雙特異性IgG抗體，而沒有現有技術中使用的雜合雜交瘤的缺點或在亞單位接合處工程改造重鏈或輕鏈的需要。
本發明第一方面的雙特異性配體具有至少1個VH/VL對。因此，本發明的雙特異性IgG包含兩個這種對，Y型分子的每個臂上有1對。因此，和所使用的鏈比率決定了其製備成功與否並導致操作困難的常規雙特異性抗體或雙功能抗體不同，本發明的雙特異性配體沒有鏈平衡的問題。常規雙特異性抗體中的鏈不平衡起因於兩條不同的VL鏈和兩條不同的VH鏈的結合，其中VL鏈1和VH鏈1一起能夠結合抗原或表位1，VL鏈2和VH鏈2一起能夠結合抗原或表位2，兩個正確的配對以某種方式相互連接。因此，只有在單個分子中VL鏈1與VH鏈1配對以及VL鏈2與VH鏈2配對時才產生雙特異性。這種雙特異性分子可以兩種不同方式建立。首先，其可通過結合兩個現有的各自結合不同抗原或表位的VH/VL配對(例如在雙特異性IgG中)來建立。在此情況下VH/VL配對必須全部以1∶1比率聚集在一起，以便建立全部為雙特異性的分子群。這永不會出現(即便在通過「洞中結(knobs into holes)」工程法增強互補CH結構域時)，結果產生雙特異性分子和僅能結合一種抗原或表位而不能結合另一種的分子的混合物。第二種建立雙特異性抗體的方式是藉助於兩種不同VH鏈與兩種不同VL鏈的同時結合(例如在雙特異性雙功能抗體中)。在此情況下，儘管VL鏈1與VL鏈1配對以及VL鏈2與VH鏈2配對(其可通過「洞中結(knobs into holes)」工程改造VL和VH結構域而增強)有優先傾向，但這種配對永不會在所有分子中都實現，結果產生混合製品，由此出現不能結合任一種抗原或表位的不正確配對。
按照本發明第一方面的雙特異性配體方法構建的雙特異性抗體克服了所有這些問題，因為與抗原或表位1的結合分別位於VH或VL結構域中，與抗原或表位2的結合分別位於互補VL或VH結構域中。因為VH和VL結構域以1∶1為基礎配對，所以全部VH/VL配對都是雙特異性的，因此使用這些VH/VL配對(Fv、scFv、Fab、微型抗體、IgG等)構建的所有型都具有100％雙特異性活性。
在本發明背景下，第一種和第二種表位被理解為不相同且不由單個單特異性配體結合的表位。在本發明的第一種構型中，其有利地處於不同抗原上，其中一個起增加配體體內半壽期地作用。同樣，第一個和第二個抗原有利地不相同。
本發明的雙特異性配體不包括如WO 02/02773所述的配體。因此，本發明的配體不包括協同結合任一種或多種抗原或表位的互補VH/VL對。相反，本發明第一方面的配體含VH/VL互補對，其中V結構域具有不同的特異性。
而且，本發明第一方面的配體含對非結構相關的表位或抗原具有不同特異性的VH/VL互補對。結構相關的表位或抗原是具有足夠的結構相似性、被以協同方式起結合抗原或表位作用的常規VH/VL互補對結合的表位或抗原，就結構相關的表位而言，表位在結構上相似得足以使其「符合」在VH/VL二聚體的抗原結合位點處形成的相同結合袋。
在第二方面，本發明提供含第一個免疫球蛋白可變結構域(具有第一種抗原或表位結合特異性)和第二個免疫球蛋白可變結構域(具有第二種抗原或表位結合特異性)的配體，其中所述第一個和第二個可變結構域中的一個或兩個結合增加配體體內半壽期的抗原，而可變結構域彼此不互補。
在一個實施方案中，與一個可變結構域的結合調節配體與第二個可變結構域的結合。
在該實施方案中，可變結構域可為例如VH結構域對或VL結構域對。抗原在第一個位點的結合可調節(例如增強或抑制)抗原在第二個位點的結合。例如，在第一個位點的結合至少部分地抑制抗原在第二個位點的結合。在該實施方案中，配體例如可通過結合增加配體半壽期的蛋白而保持在目標生物體體內，直至例如其結合第二種靶蛋白並與增加半壽期的蛋白解離的時刻。
在上文中的結合調節由於抗原結合位點彼此相對的結構鄰近性而得以實現。這種結構鄰近性可利用連接兩個或更多抗原結合位點的結構組分的性質而獲得，例如通過提供具有相對剛性結構(其將抗原結合位點緊鄰保持)的配體。有利地，兩個或更多抗原結合位點彼此物理緊鄰，使得一個位點通過涉及免疫球蛋白分子中的位阻和/或構象變化的過程調節另一個位點的抗原結合。
第一個和第二個抗原結合結構域可共價或非共價結合。在結構域共價結合的情況下，結合例如可由二硫鍵或多肽接頭(例如(Gly4Ser)n，其中n＝1-8，例如2、3、4、5或7)介導。
按照本發明該方面的配體可組合成非免疫球蛋白多配體結構，以形成多價複合物，其結合具有相同抗原的靶分子，由此提供優良的親合力，而至少一個可變結構域結合增加多聚體半壽期的抗原。例如，天然細菌報告分子如SpA已用作CDR移植支架，以產生特異性結合一個或多個表位的配體。該方法詳述於美國專利5,S31,012。其它合適的支架包括基於纖連蛋白和親合體(affibodies)的支架。適宜方法的細節描述於WO 98/58965。其它合適的支架包括如van denBeuken等，J.Mol.Biol.(2001)310，591-601所述的脂質運載蛋白(lipocallin)和CTLA4，以及如WO0069907(Medical Research Council)所述的支架，其基於例如細菌GroEL或其它伴侶多肽的環狀結構。
蛋白支架可組合，例如CDR可移植至CTLA4支架上，並和免疫球蛋白VH或VL結構域一起用於形成配體。
同樣，可組合纖連蛋白、脂質運載蛋白和其它支架。
在可變結構域選自例如使用本文所述的噬菌體展示技術選定的V基因庫的情況下，這些可變結構域可包含通用構架區，使得其可由本文定義的特異性屬配體識別。通用構架、屬配體等的使用描述於WO 99/20749。在本發明中，所提到的噬菌體展示包括噬菌體和/或噬菌粒的使用。
當使用V基因庫時，多肽序列的變化優選位於可變結構域的結構環中。任一個可變結構域的多肽序列都可通過DNA重排或突變改變，以便增強各個可變結構域與其互補對的相互作用。
在本發明的優選實施方案中，「雙特異性配體」是單鏈Fv片段。在本發明的替代實施方案中，『雙特異性配體』由抗體的Fab區組成。術語「Fab區」包括其中使用兩個VH或兩個VL結構域的Fab-樣區。
可變區可來源於抗靶抗原或表位的抗體。或者，其可來源於例如在絲狀噬菌體表面上表達的單抗體結構域的庫。可如下文和實施例所述進行選擇。
dAb的製備本發明的一個方面不僅涉及一般的雙特異性配體，而且涉及結合單獨TNF-α、TNF-α和HSA或其它延長半壽期的多肽的雙特異性形式配體的各種構建物，以及結合TNF-α和VEGF的雙特異性形式配體的各種構建物。還可製備結合VEGF和HSA或其它延長半壽期的多肽的配體。雙特異性TNF-α/VEGF構建物可另外包含HSA或另一種延長半壽期的分子的結合體。在這些實施方案的每一個中，單個配體，即結合TNF-α、HSA或VEGF的配體，可為並優選為dAb。這種dAb的生產論述於下文和實施例。
在各個方面中，本文公開的dAb可以單聚體形式、二聚體形式、三聚體形式、四聚體形式乃至更高多聚體形式存在。除了異二聚體形式如雙特異性構建物以外，多聚構建物可為同多聚物，即同二聚體、同三聚體、同四聚體等。還具體設想了異三聚體、異四聚體和更高級的異多聚體。各種dAb構象中的每一個均可另外與其餘的部分複合，例如聚乙二醇(PEG)，以便進一步延長多肽構建物的血清半壽期。PEG化是本領域已知的，並在本文有論述。
以多種方式製備單免疫球蛋白可變結構域或dAb。在一個優選方面，dAb是人單免疫球蛋白可變結構域。對於這些方法中的每一個，可使用眾所周知的核酸序列製備(例如擴增、突變等)和操作方法。
一種製備dAb的方法是擴增和表達已知結合目標抗原的克隆抗體的重鏈或輕鏈基因的VH或VL區。VH和VL結構域的邊界陳述於Kabat等，(1991，出處同上)。使用有關重鏈和輕鏈基因的VH和VL結構域邊界的信息設計PCR引物，由編碼已知結合給定抗原的抗體的克隆重鏈或輕鏈編碼序列擴增V結構域。將擴增的V結構域插入到合適的表達載體中，例如pHEN-1(Hoogenboom等，1991，Nucleic AcidsRes.194133-4137)，並單獨地或作為與另一個多肽序列的融合體表達。然後篩選在與重鏈或輕鏈多肽的剩餘部分分離時高親合性結合目標抗原的表達的VH或VL結構域。對於本發明的所有方面，如本領域所知曉的或如下文所述進行結合篩選。
通過例如噬菌體展示、相對於目標抗原的淘選，篩選VH或VL結構域庫。構建噬菌體展示文庫和λ噬菌體表達文庫的方法在本領域眾所周知，講述於例如McCafferty等，1990，Nature 348552；Kang等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，884363；Clackson等，1991，Nature 352624；Lowman等，1991，Biochemistry 3010832；Burton等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.8810134；Hoogenboom等，1991，Nucleic Acids Res.194133；Chang等，1991，J.Immunol.1473610；Breitling等，1991，Gene 104147；Marks等，1991，J.Mol.Biol.222；581；Barbas等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.894457；Hawkins和Winter(1992)J.Immunol.，22867；Marks等，(1992)J.Biol.Chem，26716007；和Lerner等，(1992)Science，2581313。scFv噬菌體文庫講述於例如Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.855879-5883；Chaudhary等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.871066-1070；McCafferty等，1990，出處同上；Clackson等，1991，出處同上；Marks等，1991，出處同上；Chiswell等，1992，Trends Biotech.1080；和Marks等，1992，出處同上。業已描述了展示在噬菌體外殼蛋白上的scFv文庫的各種實施方案。噬菌體展示方法的精要也是已知的，例如描述於WO 96/06213和WO 92/01047(Medical Research Council等)以及WO 97/08320(Morphosys，出處同上)。
VH或VL結構域庫可為免疫球蛋白序列的天然庫或合成庫。天然庫是例如由從一個或多個個體收集的免疫球蛋白表達細胞製備的庫。這種庫可為「原初」庫，即例如由人胎兒或新生兒免疫球蛋白表達細胞製備，或重排庫，即由例如成人B細胞製備。天然庫描述於例如Marks等，1991，J.Mol.Biol.222581和Vaughan等，1996，Nature Biotech.14309。如果有需要，就此而言，則可對由天然庫或結合靶抗原的任意庫鑑別的克隆進行誘變和進一步的篩選，以便生產和選擇具有改良結合特徵的變體。
通過人工將多樣性導入到克隆的V結構域中，製備單免疫球蛋白可變結構域的合成庫。合成庫描述於例如Hoogenboom和Winter，1992，J.Mol.Biol.227381；Barbas等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.894457；Nissim等，1994，EMBO J.13692；Griffiths等，1994，EMBO J.133245；DeKriuf等，1995，J.Mol.Biol.24897；和WO99/20749。
常規抗體的抗原結合結構域含兩個單獨的區重鏈可變結構域(VH)和輕鏈可變結構域(VL其可為Vκ或Vλ)。這種抗體的抗原結合位點由6個多肽環構成3個來自VH結構域(H1、H2和H3)，3個來自VL結構域(L1、L2和L3)。這些環的邊界描述於例如Kabat等(1991，出處同上)。通過組合重排基因節段體內生產編碼VH和VL結構域的V基因的多樣性主庫。VH基因通過3個基因節段VH、D和JH的重組產生。在人中，根據單倍型，有約51種功能性VH節段(Cook和Tomlinson(1995)Immunol Today，16237)、25種功能性D節段(Corbett等，(1997)J.Mol.Biol.，26869)和6種功能性JH節段(Ravetch等，(1981)Cell，27583)。VH節段編碼形成VH結構域的第一個和第二個抗原結合環(H1和H2)的多肽鏈區，而VH、D和JH節段組合形成VH結構域的第三個抗原結合環(H3)。
VL基因通過重組僅2種基因節段VL和JL產生。在人中，根據單倍型，有約40種功能性Vκ節段(Schable和Zachau(1993)Biol.Chem.Hoppe-Seyler，3741001)、31種功能性Vλ節段(Williams等，(1996)J.Mol.so Biol.，264220；Kawasaki等，(1997)Genome Res.，7250)、5種功能性Jκ節段(Hieter等，(1982)J.Biol.Chef，2571516)和4種功能性Jλ節段節段(Vasicek和Leder(1990)J.Exp.Med.，172609)。VL節段編碼形成VL結構域的第一個和第二個抗原結合環(L1和L2)的多肽鏈區，而VL和JL節段組合形成VL結構域的第三個抗原結合環(L3)。一般認為，選自該原始庫的抗體多樣化得足以以至少中等的親合力結合幾乎所有抗原。通過重排基因的「親合力突變」體內產生高親合性抗體，其中免疫系統以改善的結合為基準生產和選擇點突變。
抗體的結構和序列分析表明，6個抗原結合環中有5個(H1、H2、L1、L2、L3)具有有限量的主鏈構象或規範結構(Chothia和Lesk(1987)dMol.Biol.，196901；Chothia等，(1989)Nature，342877)。主鏈構象由(i)抗原結合環的長度和(ii)抗原結合環和抗體構架中的某些關鍵位置的特定殘基或殘基類型決定。環長和關鍵殘基的分析能使我們預測由大部分人抗體序列編碼的H1、H2、L1、L2和L3的主鏈構象(Chothia等，(1992)J.Mol.Biol.，227799；Tomlinson等，(1995)EMBOJ.，144628；Williams等，(1996)J.Mol.Biol.，264220)。儘管H3區就序列、長度和結構而言更加多樣化(原因在於使用D節段)，但其也形成有限量的短環長主鏈構象，其取決於環和抗體構架中關鍵位置的具體殘基的長度和存在情況或殘基類型(Martin等，(1996)J.Mol.Biol，263800；Shirai等，(1996)FEBS Letters，3991)。
然而，按照本發明的一個實施方案，可將多樣性加入到合成庫中各種抗原結合環CDR的任意位點，該方法產生更大比例的未正確摺疊的V結構域並因此使潛在結合抗原的分子的比例更小。了解了有助於抗原結合環主鏈構象的殘基使得可以鑑別VH或VL結構域合成庫中的多樣性的特異性殘基。即，最好在非保持主鏈構象所必須的殘基中引入多樣性。作為實例，對於環L2的多樣性，常規方法應是使如Kabat等(1991，出處同上)定義的對應CDR(CDR2)中的所有殘基(約7個殘基)都多樣化。但是，對於L2，已知50和53位在天然抗體中是多樣化的，並觀察到其與抗原接觸。優選方法應是僅使該環中的這兩個殘基多樣化。這表明，功能多樣性的顯著提升需要確立抗原結合特異性的範圍。
在一個方面，在VH或Vκ背景中，基於人工多樣化的種系VH或Vκ序列，製備合成的可變結構域庫。例如，VH結構域庫基於克隆的種系VH基因節段V3-23/DP47(Tomlinson等，1992，J.Mol.Biol.2277768)和JH4b(參見圖1和2)。Vκ結構域庫基於例如種系Vκ基因節段O2/O12/DPK9(Cox等，1994，Eur.J.Immunol.24827)和Jκ1(參見圖3)。通過例如PCR誘變將多樣性導入到這些或其它基因節段中。多樣性可通過例如錯配PCR(Hawkins等，1992，J.Mol.Biol.226889)或化學誘變隨機導入。但是，如上所述，優選多樣性導入的目標在於特定殘基。進一步優選通過使用誘變引物導入密碼子NNK(使用IUPAC命名法，其中N＝G、A、T或C，K＝G或T)靶向目標殘基，NNK編碼全部胺基酸和TAG終止密碼子。獲得相似末端的其它密碼子也是有用的，包括NNN密碼子(其導致產生另外的終止密碼子TGA和TAA)、DVT密碼子((A/G/T)(A/G/C)T)、DVC密碼子((A/G/T)(A/G/C)C)和DVY密碼子((A/G/T)(A/G/C)(C/T)。DVT密碼子編碼22％絲氨酸和11％酪氨酸、天冬醯胺、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸和半胱氨酸，這最緊密地模擬了天然人抗體的抗原結合位點的胺基酸殘基分布。使用在待多樣化的各個位置均具有一個或多個選定簡併密碼子的PCR引物製備庫。PCR誘變在本領域眾所周知；但是，在下文題為「PCR誘變」的章節中論述了用於本發明方法的引物設計和PCR誘變的考慮因素。
在一個方面，如圖1所示，在對應於CDR1、2和3中多樣性的位點H30、H31、H33、H35、H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H97和H98，使用NNK密碼子將多樣性導入到人種系VH基因節段V3-23/DP47(Tomlinson等，1992，J.Mol.Biol.2277768)和JH4b的序列中。
在另一方面，如圖2所示，在對應於CDR1、2和3中多樣性的位點H30、H31、H33、H35、H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H97、H98、H99、H100、H100a和H100b，例如使用NNK密碼子將多樣性導入到人種系VH基因節段V3-23/DP47和JH4b的序列中。
在另一方面，如圖3所示，在對應於CDR1、2和3中多樣性的位點L30、L31、L32、L34、L50、L53、L91、L92、L93、L94和L96，例如使用NNK密碼子將多樣性導入到人種系Vκ基因節段O2/O12/DPK9和Jκ1的序列中。
如本領域所知並如例如WO 99/20749所述將多樣化庫克隆入噬菌體展示載體中。一般來說，實施本發明所需的核酸分子和載體構建物可由本領域獲得，並如Sambrook等，(1989).Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbor，USA的標準實驗室方法所述構建和操作。
通常在重組載體中進行本發明核酸的操作。本文使用的「載體」指用於將異源DNA導入到用於其表達和/或複製的細胞中的分離元件。選擇或構建並隨後使用該載體的方法是本領域技術人員眾所周知的。許多載體可公開獲得，包括細菌質粒、噬菌體、人工染色體和游離型載體。這種載體可用於簡單克隆和誘變；或者，作為攜帶本發明庫(或前庫)成員的載體的代表，使用基因表達載體。選定按照本發明使用的載體，以容納長度通常為0.25千鹼基對(kb)至40kb的目標大小的多肽編碼序列。在體外克隆操作後用載體轉化合適的宿主細胞。各個載體均含有各種功能元件，其一般包括克隆(或「多接頭」)位點、複製起點和至少一個選擇標記基因。如果給定載體是表達載體，則其另外具有以下的一個或多個增強子元件、啟動子、轉錄終止子和信號序列，其每個均定位在克隆位點的附近，使得其有效連接至編碼本發明多肽庫成員的基因。
一般來說，克隆和表達載體這二者均含有能使載體在一個或多個選定的宿主細胞中複製的核酸序列。通常，在克隆載體中，該序列是能使載體獨立於宿主染色體DNA複製的序列，包括複製起點或自主複製序列。各種細菌、酵母和病毒的此類序列是眾所周知的。質粒pBR322的複製起點適於大部分革蘭氏陰性菌，2μ質粒起點適於酵母，而各種病毒起點(例如SV 40、腺病毒)用於哺乳動物細胞中的克隆載體。一般來說，哺乳動物表達載體不需要複製起點，除非這些起點用在能夠複製高水平DNA的哺乳動物細胞中，例如COS細胞。
有利地，克隆或表達載體還含有又被稱為選擇標記的選擇基因。該基因編碼的蛋白是在選擇性培養基中培養的轉化宿主細胞存活或生長所必需的。因此，未用含選擇基因的載體轉化的宿主細胞在該培養基中不能存活。典型的選擇基因編碼蛋白賦予對抗生素和其它毒素(例如氨苄青黴素、新黴素、氨甲蝶呤或四環素)的抗性、補充營養缺陷或提供生長培養基中不可獲得的關鍵營養物。
因為本發明載體的複製最通常在大腸桿菌中進行，所以使用大腸桿菌選擇標記，例如賦予對抗生素氨苄青黴素抗性的β-內醯胺酶基因。這些載體可得自大腸桿菌質粒(例如pBR322)或pUC質粒(例如pUC18或pUC19)。
表達載體通常含被宿主生物識別並有效連接至目的編碼序列的啟動子。這種啟動子可為誘導型或組成型啟動子。術語「有效連接的」指這種並列其中所述組分所處的關係允許其以預計方式起作用。「有效連接」至編碼序列的控制序列以在和控制序列相適的條件下實現編碼序列表達的方式連接。
適用於原核生物宿主的啟動子包括例如β-內醯胺酶和乳糖酶啟動子系統、鹼性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動子系統和雜合啟動子，例如tac啟動子。用於細菌系統的啟動子一般還包含有效連接至編碼序列的Shine-Dalgarno序列。
在本文所述的文庫或庫中，優選載體是能夠表達對應於多肽文庫成員的核苷酸序列的表達載體。因此，通過對表達多肽文庫成員的單個克隆進行單獨增殖和表達，或通過使用任一種選擇展示系統，進行選擇。如上所述，優選的選擇展示系統使用噬菌體展示。因此，可使用噬菌體或噬菌粒載體。優選的載體是噬菌粒載體，其具有大腸桿菌複製起點(用於雙鏈複製)，還具有噬菌體複製起點(用於生產單鏈DNA)。這種載體的操作和表達在本領域眾所周知(Hoogenboom和Winter(1992)，出處同上；Nissim等，(1994)，出處同上)。簡單地說，載體含賦予噬菌粒選擇性的β內醯胺酶或其它選擇標記基因和表達盒上遊的lac啟動子，該表達盒由pelB前導序列(其將表達的多肽引導入壁膜間隙)(N至C末端)、多克隆位點(用於克隆核苷酸形式的文庫成員)、任選的一個或多個肽標記(用於檢測)、任選的一個或多個TAG終止密碼子和噬菌體蛋白pIII組成。在使用大腸桿菌的各種抑制基因和非抑制基因菌株並加入葡萄糖、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)或輔助噬菌體如VCS M13的情況下，載體能夠作為不表達的質粒複製，產生大量的唯一的多肽文庫成員，或產生噬菌體，其中一些在其表面上含多肽-pIII融合體的至少一個拷貝。
優選載體的實例是pHEN1噬菌粒載體(Hoogenboom等，1991，Nucl.Acids Res.194133-4137；可獲得例如為WO 03/031611中的SEQID NO7的序列)，其中pIII融合蛋白的生產處於LacZ啟動子控制之下，該啟動子在葡萄糖存在下受到抑制，用IPTG誘導。當在大腸桿菌抑制基因菌株如TG1中生長時，產生基因III融合蛋白，並被包裝入噬菌體中，而在非抑制基因菌株如HB2151中生長時，允許可溶性融合蛋白分泌入細菌周質和分泌入培養基中。因為基因III的表達防止以後輔助噬菌體的感染，所以在葡萄糖存在下增殖具有噬菌粒載體的細菌，然後使用用於噬菌體拯救的VCSM 13輔助噬菌體感染。
本發明載體的構建使用常規連接技術。切割、修整分離的載體或DNA片段，並再連接成產生需要的載體所要求的形式。如果有需要，使用標準方法進行序列分析，以證實在構建的載體中存在正確的序列。適於構建表達載體、製備體外轉錄物、將DNA導入宿主細胞中以及進行表達和功能評價分析的方法是本領域技術人員已知的。檢測樣品中基因序列的存在情況，或通過常規方法定量其擴增和/或表達，例如DNA或RNA分析、蛋白質印跡、DNA、RNA或蛋白的點印跡、原位雜交、免疫細胞化學或核酸或蛋白分子的序列分析。本領域技術人員很容易設想到在有需要時可如何修改這些方法。
PCR誘變引物與靶分子的一部分互補，其存在於用於製備編碼多肽庫成員的核酸庫成員組的核酸分子池中。引物最經常由化學或酶學的合成方法製備。誘變寡核苷酸引物一般長15-100個核苷酸，理想地長20-40核苷酸，儘管可使用不同長度的寡核苷酸。
通常，當兩個核酸序列基本互補(在至少14-25個核苷酸的段內至少約65％互補，優選至少約75％互補，更優選至少約85％或90％互補)時，發生選擇性雜交。參見Kanehisa，1984，Nucleic Acids Res.12203，其通過引用結合到本文中。因此，預期容許在啟動位點有一定程度的錯配。這種錯配可很少，例如一個、兩個或三個核苷酸。或者，其可包含核苷酸環，核苷酸環在本文被定義為其中錯配包含不間斷地連續4個或更多個核苷酸的區域。
總的來說，5個因素影響引物與第二個核酸分子雜交的效力和選擇性。這些因素為(i)引物長度；(ii)核苷酸序列和/或組成；(iii)雜交溫度；(iv)緩衝液化學性質和(v)引物需要雜交的區中的位阻潛力，這些因素在設計非隨機啟動序列時是重要的考慮因素。
引物長度同引物與靶序列退火的效力和精確性之間存在正相關；較長序列具有高於較短序列的解鏈溫度(TM)，較不可能在給定靶序列中重複，由此使混雜的雜交最小。具有高G-C含量或含有迴文序列的引物序列傾向於自雜交，其預期的靶位點由於為單分子而不是雙分子也是如此，一般在溶液中有利於雜交動力學；同時，重要的是設計含足夠數量的G-C核苷酸配對的引物，以緊密結合靶序列，因為這些對每個均由3個氫鍵結合，而不是A和T鹼基配對時存在的2個氫鍵結合。雜交溫度與引物退火效力反向變化，與雜交混合物中可能包含的有機溶劑(例如甲醯胺)的濃度也是反向變化，而鹽濃度的增加利於結合。在嚴格雜交條件下，較長探針比在更有利條件下足以雜交的較短探針更有效地雜交。引物的嚴格雜交條件通常包括低於約1M的鹽濃度，更通常低於約500mM的鹽濃度，優選低於約200mM的鹽濃度。雜交溫度的範圍由低至0℃至高於22℃，高於約30℃，(最經常)超過約37℃。對於特異性雜交，較長的片段可能需要較高的雜交溫度。由於幾個因素影響雜交嚴格性，所以參數組合比單獨任一個的絕對度量更重要。
用這些考慮因素理性地設計引物。儘管本領域技術人員可憑頭腦評價眾多序列的相對優點，但已設計了電腦程式來幫助評價這幾個參數和優化引物序列。這些程序的實例是DNAStarTM軟體包(DNAStar，Inc.；Madison，WI)的「PrimerSelect」和OLIGO 4.0(NationalBiosciences，Inc.)。一旦設計完成，可通過合適的方法，例如Beaucage和Carruthers，1981，Tetrahedron Lett.221859描述的亞磷醯胺法或Matteucci和Caruthers，1981，J.Am.Chem.Soc.1033185的三酯法(這兩個文獻均通過引用結合到本文中)，或使用市售的自動化寡核苷酸合成儀或例如VLSIPSTM技術的其它化學方法，製備合適的寡核苷酸。
使用模板DNA(至少1fg；更通常1-1000ng)和至少25pmol寡核苷酸引物進行PCR；當引物池重度異源時，使用較大量的引物可能有利，因為各個序列由池中的僅一小部分分子代表，量在以後的擴增循環中變成限制性的。典型的反應混合物包含2μl DNA、25pmol寡核苷酸引物、2.5μl 10X PCR緩衝液1(Perkin-Elmer)、0.4μl的1.25μM dNTP、0.15μl(或2.5單位)Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer)和至總體積25μl的去離子水。覆蓋礦物油，並使用可編程熱循環儀進行PCR。
PCR循環各步的長度和溫度以及循環數按照實際所需要的嚴格性調節。由預期引物對模板的退火效力和容許的錯配程度這二者確定退火溫度和時間；顯然，當核酸分子同時擴增和誘變時，至少在第一輪合成中需要錯配。為嘗試使用混合的誘變引物池擴增分子群，相對於引物對靶點以外序列的混雜退火，衡量在嚴格(高溫)退火條件下潛在突變產物(其應僅由低解鏈溫度獲得)的損失。優化引物退火條件嚴格性的能力完全屬於本領域技術人員的知識範圍。使用30℃-72℃之間的退火溫度。一般以92℃-99℃、4分鐘發生模板分子的初始變性，接著是由變性(94-99℃，15秒至1分鐘)、退火(如上所述確定的溫度；1-2分鐘)和延伸(72℃，1-5分鐘，取決於擴增產物的長度)組成的20-40個循環。最後的延伸一般為72℃、4分鐘，可後接4℃的無定數(0-24小時)步驟。
篩選抗原結合的dAb在於噬菌體表面上表達dAb庫之後，使噬菌體庫與固定化靶抗原接觸，漂洗以去除未結合的噬菌體並增殖結合的噬菌體，由此進行選擇，整個過程經常被稱為「淘選」。或者，通過相對於僅由摺疊成員結合的固定化屬配體(例如A蛋白或L蛋白)淘選，預選表達正確摺疊的成員變體的噬菌體。這具有降低無功能成員比例、由此增加可能結合靶抗原的成員比例的優點。用屬配體預選教導於WO99/20749。噬菌體抗體文庫的篩選一般描述於例如Harrison等，1996，Meth.Enzymol.26783-109。
通常，使用固定在固體支持體(例如塑料管或孔)或層析基質(例如SepharoseTM(Pharmacia))上的純化抗原進行篩選。篩選或選擇也可在複合抗原上進行，例如細胞表面(Marks等，1993，BioTechnology 111145；de Kruif等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.923938)。另一個替代方法包括通過結合溶液中的生物素化抗原來選擇，接著捕獲在鏈黴抗生物素蛋白包被的珠上。
在一個優選方面，通過在管或板中孔(例如Nunc MAXISORPTM免疫管8孔條)上固定抗原(屬或特異性的)進行淘選。用150μl抗原(100μg/ml的PBS溶液)包被孔，並過夜溫育。然後用PBS漂洗孔3次，並用400μl PBS-2％脫脂乳(2％MPBS)於37℃封閉2小時。用PBS淋洗孔3次，在2％MPBS中加入噬菌體。混合物於室溫溫育90分鐘，去除含未結合噬菌體的液體。用PBS-0.1％Tween 20淋洗孔10次，然後用PBS淋洗10次，以去除變性劑。通過加入200μl新鮮製備的100mM三乙胺，混合孔並於室溫溫育10分鐘，洗脫結合的噬菌體。將洗脫的噬菌體轉移至含100μl的1M Tris-HCl、pH 7.4的管中，渦旋，以中和三乙胺。通過於37℃溫育30分鐘，用例如150ml洗脫的噬菌體感染指數生長的大腸桿菌宿主細胞(例如TG1)。旋轉下感染的細胞，重懸浮在新鮮培養基中，並平板接種於頂層瓊脂。將噬菌斑洗提入或拾取入宿主細胞的新鮮培養基中進行增殖，用於分析或下一輪篩選。如果需要確保選定的噬菌體的均一群，則對噬菌斑進行一輪或多輪純化。其它篩選方法描述於Harrison等，1996，出處同上。
在鑑別出表達結合目標靶的單免疫球蛋白可變結構域的噬菌體之後，如果使用了噬菌粒載體如pHEN1，則通過感染非抑制基因細菌菌株，例如允許分泌可溶性基因III融合蛋白的HB2151，可容易地生產可溶形式的可變結構域融合蛋白。或者，可將V結構域序列亞克隆入合適的表達載體中，以按照本領域已知的方法生產可溶性蛋白。
dAb的純化和濃縮按照已知方法收集和純化(Harrison等，1996，出處同上)分泌入壁膜間隙或細菌培養基的dAb多肽。Skerra和Pluckthun(1988，Science2401038)和Breitling等(1991，Gene 104147)描述了由周質收集抗體多肽，Better等(1988，Science 2401041)描述了由培養上清液收集。還可通過結合屬配體，例如A蛋白或L蛋白，實現純化。或者，可表達具有利於通過親合層析純化的肽標記(例如為Myc、HA或6X-His標記)的可變結構域。
通過本領域眾所周知的幾種方法濃縮多肽，這些方法包括例如超濾、滲濾和切向流過濾。超濾過程使用半透膜和壓力以基於尺寸和形狀分離分子類別。壓力由氣壓或離心提供。可廣為利用例如得自Millipore(Bedford，MA；實例包括CentriconTM和MicroconTM濃縮器)和Vivascience(Hannover，Germany；實例包括VivaspinTM濃縮器)的市售超濾產品。通過選擇小於目標多肽的截流分子量(通常為目標多肽分子量的1/3至1/6，儘管可成功使用低至10kD的差異)，當溶劑和較小的溶質穿過膜時，多肽得以保留。因此，約5kD的截留分子量對本文描述的dAb多肽濃縮是有用的。
在需要去除或更換多肽製品中的鹽或緩衝液時，使用滲濾，滲濾在「清洗」過程中使用超濾膜。通過使溶劑和小溶質穿過膜濃縮多肽，在持續超濾的同時，根據需要用新緩衝液或鹽溶液或水稀釋保留的多肽去除殘餘的鹽或緩衝液。在連續滲濾中，以和濾過液穿過膜的速率相同的速率加入新緩衝液。滲濾體積是滲濾開始前多肽溶液的體積—使用連續的滲濾，通過用6倍滲濾體積的新緩衝液清洗可去除全部可透過溶質的99.5％以上。或者，可以非連續方式實施該過程，其中反覆稀釋樣品，接著濾回其原體積，以去除或更換鹽或緩衝液，最終濃縮多肽。滲濾設備和其使用的詳細方法學可得自例如Pall Life Sciences(Ann Arbor，MI)和Sartorius AG/Vivascience(Hannover，Germany)。
切向流過濾(TFF)也稱為「交叉流過濾」，其也使用超濾膜。含目標多肽的流體被沿著膜表面切向泵入。壓力使一部分流體穿過膜，同時目標多肽保留在膜上。但是，與標準超濾相反，保留的分子不累積在膜表面上，而是被切向流帶走。可反覆地將不穿過濾膜的溶液(含目標多肽)在膜上循環，以獲得目標濃度。TFF設備及其使用的詳細方法學例如可得自Millipore(例如ProFlux M 12TMBenchtop TFF系統和PelliconTM系統)、Pall Life Sciences(例如MinimTM切向流過濾系統)。
以本領域眾所周知的眾多方式檢測蛋白濃度。這些方法包括例如胺基酸分析、280nm的吸收、「Bradford」和「Lowry」法以及SDS-PAGE。最精確的方法是完全水解，繼之以HPLC分析胺基酸，然後通過與已知的dAb多肽序列比較測定濃度。儘管該方法是最精確的，但其昂貴耗時。通過檢測280nm的UV吸收進行蛋白測定較快，花費低得多，還相對精確，優選作為胺基酸分析的折中方法。使用280nm的吸收測定在本文所述的實施例中報告的蛋白濃度。
「Bradford」和「Lowry」蛋白實驗(Bradford，1976，Anal.Biochem.72248-254；Lowry等，1951，J.Biol.Chem.193265-275)對比樣品蛋白濃度和最通常基於牛血清白蛋白(BSA)的標準曲線。這些方法不夠精確，往往低估了單免疫球蛋白結構域的濃度。但是，通過使用VH或Vκ單結構域多肽作為標準品可提升其精確性。
其餘的蛋白檢測方法是描述於美國專利第4,839,295號(通過引用結合到本文中)的雙辛可寧酸實驗，由Pierce Biotechnology(Rockford，IL)以「BCA Protein Assay」(例如Pierce目錄號23227)上市銷售。
SDS-PAGE法使用凝膠電泳和考馬斯藍染色，與已知濃度的標準品對比，例如已知量的單免疫球蛋白可變結構域多肽。定量可通過肉眼或光密度分析法進行。
在第三方面，本發明提供生產配體的方法，所述配體含具有第一種結合特異性的第一個免疫球蛋白單可變結構域和具有第二種(不同的)結合特異性的第二個免疫球蛋白單可變結構域，結合特異性中的一種或兩種對增加配體體內半壽期的抗原是特異性的，該方法包括以下步驟(a)根據其結合第一個表位的能力選擇第一個可變結構域；(b)根據其結合第二個表位的能力選擇第二個可變結構域；(c)組合可變結構域；和(d)根據其結合所述第一個表位和所述第二個表位的能力選擇配體。
配體可同時地結合第一個和第二個表位，或在用於表位結合的結合結構域之間存在競爭的情況下，一個結構域的結合可排除另一個結構域與其關連表位的結合。因此，在一個實施方案中，以上的步驟(d)需要同時結合第一個和第二個(以及可能存在的其它)表位；在另一個實施方案中，與第一個和第二個表位的結合不是同時的。
表位優選在分離的抗原上。
有利地，配體含如上所述的免疫球蛋白可變結構域的VH/VL組合或VH/VH或VL/VL組合。此外，配體可含駱駝科VHH結構域，前提是對增加配體體內半壽期的抗原有特異性的VHH結構域不結合雞蛋溶菌酶(HEL)、豬胰腺α-澱粉酶或NmC-A；hog，BSA連接的RR6ado 5染料或變異鏈球菌(S.mutates)HG982細胞，如Conrath等，(2001)JBC 2767346-7350和WO 99/23221所述，其中任一個都沒有描述使用針對增加半壽期的抗原的特異性來增加配體體內半壽期。
在一個實施方案中，在沒有互補可變結構域的情況下根據與所述第一個表位的結合選擇所述第一個可變結構域(即選擇其作為如上文所述的dAb)。在進一步的實施方案中，在存在第三個可變結構域的情況下根據與所述第一個表位/抗原的結合選擇所述第一個可變結構域，其中所述第三個可變結構域與所述第二個可變結構域不同，並與第一個結構域互補。同樣，可在沒有或有互補可變結構域的情況下選擇第二個結構域。
除了半壽期增強蛋白以外，本發明配體靶向的抗原或表位可為任意抗原或表位，但有利地為具有治療益處的目標抗原或表位。本發明提供配體，包括開放構象、封閉構象和分離的dAb單體配體，其對任意這種靶都是特異性的，尤其是本文進一步鑑別的靶。這種靶可為天然或合成的多肽、蛋白或核酸或其一部分。在此方面，本發明的配體可結合表位或抗原，並起拮抗劑或激動劑(例如EPO受體激動劑)的作用。本領域技術人員會意識到，選擇是大範圍和可變的。
例如，其可為人或動物蛋白、細胞因子、細胞因子受體、酶的酶輔因子或DNA結合蛋白。可由本文所述的單或雙特異性結合多肽靶向的合適細胞因子和生長因子包括但不限於ApoE、Apo-SAA、BDNF、BLyS、心營養素-1、EGF、EGF受體、ENA-78、嗜酸性粒細胞趨化因子、嗜酸性粒細胞趨化因子-2、Exodus-2、EpoR、酸性FGF、鹼性FGF、成纖維細胞生長因子-10、FLT3配體、Fractalkine(CX3C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-01、胰島素、IFN-y、IGF-I、IGF-II、IL-、IL-1p、20IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(72個胺基酸)、IL-8(77個胺基酸)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18(IGIF)、抑制素α、抑制素B IP-10、角化細胞生長因子2(KGF-2)、KGF、瘦素、LIF、淋巴細胞趨化因子、Mullerian抑制物、單核細胞集落抑制因子、單核細胞引誘蛋白、M-CSF、MDC(67個胺基酸)、MDC(69個胺基酸)、MCP-I(MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MIG、MIP1α、MIP1β、MIP3α、MEP3β、MIP-4、骨髓前體細胞抑制因子-1(MPIF-1)、NAP-2、Neurturin、神經生長因子、β-NGF、NT-3、NT-4、致瘤素M、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDF12、SDF1β、SCF、SCGF、幹細胞因子(SCF)、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-β2、TGF-β3、腫瘤壞死因子(TNF)、TNF-α、TNF-β、TNF受體I、TNF受體II、TNIL-1、TPO、VEGF、VEGF受體1、VEGF受體2、VEGF受體3、GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-8、HCC1、1-309、HER1、HER2、HER3、HER4、TACE識別位點、TNF BP-I和TNF BP-II，以及在附於本文的附件2或附件3中公開的任意靶，無論是以附件中所述的組合、不同的組合還是單獨的。
要注意的是，優選的配體包括單獨的、一起的和/或具有抗HSA結合活性的TNF-α和VEGF。
細胞因子受體包括前述細胞因子的受體。應當意識到，該羅列決不是詳盡的。
在本發明的一個實施方案中，可變結構域來源於抗抗原或表位的各自抗體。在一個優選實施方案中，可變結構域來源於單可變抗體結構域的庫。
在另一個方面，本發明提供編碼本文定義的至少雙特異性配體的一個或多個核酸分子。
雙特異性配體可在單個核酸分子上編碼；或者，各個結構域可由分離的核酸分子編碼。當配體由單個核酸分子編碼時，結構域可以scFv分子的方式表達為融合多肽，或者可以單獨地表達，隨後例如使用化學連接劑連接在一起。利用合適的方法將由單獨核酸表達的配體連接在一起。
核酸可進一步編碼用於在表達時由宿主細胞輸出多肽的信號序列，並可在表達時與絲狀噬菌體顆粒(或選擇展示系統的其它組分)的表面組分融合。
在另一方面，本發明提供含本發明雙特異性配體的編碼核酸的載體。
在再另一方面，本發明提供用編碼本發明雙特異性配體的載體轉染的宿主細胞。
可設計該載體的表達，以例如在噬菌體顆粒表面上生產用於選擇的可變結構域。這使得可以選擇展示的可變區，由此使用本發明的方法選擇『雙特異性配體』。
本發明進一步提供含至少本發明雙特異性配體的試劑盒。
本發明的雙特異性配體優選包含重鏈和輕鏈結構域的組合。例如，雙特異性配體可包含VH結構域和VL結構域，其可以scFv的形式連接在一起。另外，配體可包含一個或多個CH或CL結構域。例如，配體可包含CH1結構域、CH2或CH3結構域和/或CL結構域、Cμ、Cμ2、Cμ3或Cμ4結構域，或其任意組合。還可包括鉸鏈區結構域。這種結構域組合例如可模擬天然抗體，例如IgG或IgM或其片段，例如Fv、scFv、Fab或F(ab′)2分子。還設想了其它構建物，例如含VH、VL、CH1和CL結構域的IgG分子單臂。
在本發明的一個優選實施方案中，由單結構域V基因庫選擇可變區。一般來說，單抗體結構域庫展示在絲狀噬菌體表面上。在一個優選實施方案中，根據噬菌體庫與抗原的結合選擇各個單抗體結構域。
在本發明的一個優選實施方案中，可在沒有互補可變區的情況下根據與其靶抗原或表位的結合選擇各個單可變結構域。在一個替代實施方案中，可在存在互補可變區的情況下根據與其靶抗原或表位的結合選擇單可變結構域。因此，可在存在第三個互補可變結構域的情況下選擇第一個可變結構域，可在存在第四個互補可變結構域的情況下選擇第二個可變結構域。互補的第三個或第四個可變結構域可為與所測單結構域具有相同特異性的天然關連可變結構域，或為非關連互補結構域，例如「模擬」可變結構域。
優選地，本發明的雙特異性配體僅含兩個可變結構域，儘管可將幾個這種配體一起摻入到同一蛋白中，例如可將兩個這種配體摻入到IgG或多聚免疫球蛋白如IgM中。或者，在另一個實施方案中，組合多個雙特異性配體，以形成多聚體。例如，組合兩個不同的雙特異性配體，以建立四特異性分子。
本領域技術人員會意識到，按照本發明方法生產的雙特異性配體的輕鏈和重鏈可變區可位於同一多肽鏈上，或者位於不同多肽鏈上。對於可變區位於不同多肽鏈上的情況，其可經接頭(一般為彈性接頭(例如多肽鏈))、化學連接基團或本領域已知的任意其它方法連接。
在另一方面，本發明提供一種組合物，其含可通過本發明方法獲得的雙特異性配體和藥物可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
而且，本發明提供使用本發明的『雙特異性配體』或組合物治療和/或預防疾病的方法。
在第二種構型中，本發明提供含至少兩個非互補性可變結構域的多特異性配體。例如，配體可包含一對VH結構域或一對VL結構域。有利地，結構域為非駱駝科來源；優選為人結構域或含人構架區(FW)和一個或多個異源CDR。CDR和構架區是具有免疫學意義的蛋白序列Kabat資料庫中視為免疫球蛋白可變結構域的區。
優選的人構架區是由種系基因節段DP47和DPK9編碼的人構架區。有利地，VH或VL結構域的FW1、FW2和FW3具有DP47或DPK9的FW1、FW2或FW3序列。人構架區可任選地包含突變，例如在用於本發明配體的人構架區中總共有多達約5個胺基酸變化或多達約10個胺基酸變化。
本發明第二種構型的多特異性配體中的可變結構域可以開放或封閉構象排列；也就是說，其可排列得使可變結構域可獨立或同時結合其關連配體，或使僅其中一種可變結構域可在任一時刻結合其關連配體。
本發明的發明人已經認識到，在某些結構條件下，在配體中可存在非互補可變結構域(例如兩個輕鏈可變結構域或兩個重鏈可變結構域)，使得第一個表位與第一個可變結構域的結合抑制第二個表位與第二個可變結構域的結合，即便這種非互補結構域不作為關連對有效連接在一起。
有利地，配體含兩對或多對可變結構域；即其含至少4個可變結構域。有利地，4個可變結構域含人來源的構架。
在一個優選實施方案中，人構架與人種系序列的構架相同。
本發明的發明人認為，這種抗體在用於治療和其它用途的配體結合實驗中特別有用。
因此，在第二種構型的第一個方面，本發明提供生產多特異性配體的方法，其包含以下步驟(a)根據其結合第一個表位的能力選擇第一個表位結合結構域；(b)根據其結合第二個表位的能力選擇第二個表位結合結構域；(c)組合表位結合結構域；和(d)根據其結合所述第一個表位和所述第二個表位的能力選擇封閉構象的多特異性配體。
在第二種構型的另一個方面，本發明提供製備封閉構象的多特異性配體的方法，該配體含具有第一種表位結合特異性的第一個表位結合結構域和具有第二種表位結合特異性的非互補性第二個表位結合結構域，其中第一種和第二種結合特異性競爭表位結合，使得封閉構象的多特異性配體可不同時結合兩個表位，所述方法包括以下步驟(a)根據其結合第一個表位的能力選擇第一個表位結合結構域；(b)根據其結合第二個表位的能力選擇第二個表位結合結構域；(c)組合表位結合結構域，使結構域成為封閉構象；和(d)根據其結合所述第一個表位和所述第二個表位但不同時結合所述第一個和第二個表位的能力選擇封閉構象的多特異性配體。
而且，本發明提供封閉構象的多特異性配體，其含具有第一種表位結合特異性的第一個表位結合結構域和具有第二種表位結合特異性的非互補性第二個表位結合結構域，其中第一種和第二種結合特異性競爭表位結合，使得封閉構象的多特異性配體可不同時結合兩個表位。
本發明第二種構型的以上方面的替代實施方案任選地包含進一步的步驟(b1)，其包括選擇第三個或更多的表位結合結構域。以此方式生產或開放或封閉構象的多特異性配體，其含兩種以上的表位結合特異性。在本發明第二種構型的優選方面，當多特異性配體含兩個以上的表位結合結構域時，所述結構域中的至少兩個處於封閉構象中，並競爭結合；其它結構域可競爭結合，或者可獨立地與其關連表位自由結合。
按照本發明，術語「多特異性配體」指具有一種以上本文定義的表位結合特異性的配體。
本文定義的術語「封閉構象」(多特異性配體)指配體的表位結合結構域任選地通過蛋白骨架彼此連接或結合，使得一個表位結合結構域的表位結合與另一個表位結合結構域的表位結合競爭。即，各個表位結合結構域可獨立地但不同時結合關連表位。使用本文描述的方法可獲得配體的封閉構象。
「開放構象」指配體的表位結合結構域任選地通過蛋白骨架彼此連接或結合，使得一個表位結合結構域的表位結合不與另一個表位結合結構域的表位結合競爭。
本文所提到的術語「競爭」指當第二個表位與其關連表位結合結構域結合時，第一個表位與其關連表位結合結構域的結合受到抑制。例如，可通過例如物理封閉結合結構域或通過改變結合結構域的結構或環境，使得其對表位的親合力或親合力下降，在空間上抑制結合。
在本發明第二種構型的另一個實施方案中，表位在結合時可彼此替代。例如，第一個表位可存在於抗原上，其在結合其關連的第一個結合結構域時，引起第二個結合結構域的位阻或其中的構象變化，此第一個表位替代了結合第二個結合結構域的表位。
有利地，結合降低25％或以上，有利地40％、50％、60％、70％、80％、90％或以上，優選高達100％或接近100％，使得結合完全被抑制。可通過常規抗原結合實驗(如ELISA)、螢光型技術(包括FRET)或例如檢測分子質量的表面等離子體共振的技術，檢測表位結合。
有利地，按照本發明的方法，各個表位結合結構域具有不同的表位結合特異性。
在本發明背景下，第一個和第二個「表位」被理解為不相同且不被單個單特異性配體結合的表位。其可處於不同抗原上，或處於相同抗原上，但分開足夠的距離以使其不形成可被常規抗體的單個單特異性VH/VL結合對結合的單個實體。從經驗上來說，如果兩個單鏈抗體形式的單個可變結構域(結構域抗體或dAb)分別被抗兩個表位的單特異性VH/VL配體競爭，則這兩個表位遠離得不足以被認為是本發明的分離表位。
本發明的封閉構象多特異性配體不包括如WO 02/02773所述的配體。因此，本發明的配體不包含協同結合任一種或多種抗原或表位的互補VH/VL對。相反，本發明的配體優選包含非互補性VH或VL對。有利地，各個VH或VL對中的各個VH或VL結構域具有不同的表位結合特異性，表位結合位點排列使得一個位點的表位結合與另一個位點的表位結合競爭。
有利地，按照本發明，各個表位結合結構域包含免疫球蛋白可變結構域。更有利地，各個免疫球蛋白可變結構域為可變輕鏈結構域(VL)或可變重鏈結構域VH。在本發明的第二種構型中，免疫球蛋白結構域當存在於本發明配體上時是非互補的，即其不結合形成VH/VL抗原結合位點。因此，本發明的第二種構型所認可的多特異性配體含相同亞型的免疫球蛋白結構域，其為可變輕鏈結構域(VL)，或者為可變重鏈結構域(VH)。而且，當本發明的配體為封閉構象時，免疫球蛋白可為駱駝科VHH型。
在替代性實施方案中，本發明的配體不包含駱駝科VHH結構域。更具體地說，本發明的配體不包含與人VH結構域相比對駱駝科VHH結構域有特異性的一個或多個胺基酸殘基。
有利地，單可變結構域來源於根據對不同抗原或表位的結合活性選擇的抗體。例如，至少可部分地通過人體作用免疫分離可變結構域。替代的方法在本領域是已知的，包括由人抗體文庫分離和人工抗體基因合成。
可變結構域有利地結合超抗原，例如A蛋白或L蛋白。與超抗原結合是正確摺疊的抗體可變結構域的特性，並允許由例如重組或突變結構域文庫分離這種結構域。本發明的表位結合結構域包含蛋白支架和表位互作位點(其有利地位於蛋白支架表面上)。表位結合結構域還可基於免疫球蛋白結構域以外的蛋白支架或骨架。例如，天然細菌受體如SpA已用作CDR移植支架，以產生特異性結合一個或多個表位的配體。該方法詳述於美國專利5,831,012。其它合適的支架包括基於纖連蛋白和親合體(affibodies)的支架。適宜的方法詳述於WO 98/58965。其它合適的支架包括如van den Beuken等，J.Mol.Biol.(2001)310，591-601所述的脂質運載蛋白和CTLA4，以及如WO0069907(Medical Research Council)所述的支架，其基於例如細菌GroEL或其它伴侶多肽的環狀結構。蛋白支架可組合；例如CDR可移植至CTLA4支架上，並和免疫球蛋白VH或VL結構域一起用於形成多價配體。同樣，可組合纖連蛋白、脂質運載蛋白和其它支架。
本領域技術人員會認識到，按照本發明方法生產的封閉構象的多特異性配體的表位結合結構域可處於相同多肽鏈上，或處於不同多肽鏈上。對於可變區位於不同多肽鏈上的情況，其可經接頭(有利地為彈性接頭(例如多肽鏈))、化學連接基團或本領域已知的任意其它方法連接。
第一個和第二個表位結合結構域可共價或非共價連接。對於結構域共價連接的情況，例如可通過二硫鍵介導連接。
在本發明的第二種構型中，第一個和第二個表位優選是不同的。其可為天然或合成的多肽、蛋白或核酸或其一部分。在此方面，本發明的配體可結合表位或抗原，並起拮抗劑或激動劑(例如EPO受體激動劑)的作用。在一個實施方案中，配體的表位結合結構域具有相同的表位特異性，並在表位的多個拷貝存在於同一抗原上時例如可同時結合其表位。在另一個實施方案中，提供在不同抗原上的這些表位，使得配體可結合表位和橋接抗原。本領域技術人員會意識到，表位和抗原的選擇是大範圍和可變的。其可例如為人或動物蛋白、細胞因子、細胞因子受體、酶的酶輔因子或DNA結合蛋白。
可由本文所述的單或雙特異性結合多肽靶向的合適細胞因子和生長因子包括但不限於ApoE、Apo-SAA、BDNF、BLyS、心營養素-1、EGF、EGF受體、ENA-78、嗜酸性粒細胞趨化因子、嗜酸性粒細胞趨化因子-2、Exodus-2、EpoR、酸性FGF、鹼性FGF、成纖維細胞生長因子-10、FLT3配體、Fractalkine(CX3C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-01、胰島素、IFN-y、IGF-I、IGF-II、IL-、IL-1p、20IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(72個胺基酸)、IL-8(77個胺基酸)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18(IGIF)、抑制素α、抑制素B IP-10、角化細胞生長因子2(KGF-2)、KGF、瘦素、LIF、淋巴細胞趨化因子、Mullerian抑制物、單核細胞集落抑制因子、單核細胞引誘蛋白、M-CSF、MDC(67個胺基酸)、MDC(69個胺基酸)、MCP-I(MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MIG、MIP1α、MIP1β、MIP3α、MEP3β、MIP-4、骨髓前體細胞抑制因子-1(MPIF-1)、NAP-2、Neurturin、神經生長因子、β-NGF、NT-3、NT-4、致瘤素M、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDF12、SDF1β、SCF、SCGF、幹細胞因子(SCF)、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-β2、TGF-β3、腫瘤壞死因子(TNF)、TNF-α、TNF-β、TNF受體I、TNF受體II、TNIL-1、TPO、VEGF、VEGF受體1、VEGF受體2、VEGF受體3、GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-8、HCC1、1-309、HER1、HER2、HER3、HER4、TACE識別位點、TNF BP-I和TNF BP-II，以及在附於本文的附件2或附件3中公開的任意靶，無論其是所述的組合、不同的組合還是單獨的。
細胞因子受體包括前述細胞因子的受體，例如IL-1R1、IL-GR、IL-10R、IL-18R，以及附件2或附件3中陳述的細胞因子的受體，連同附件2和3中公開的受體。
應當認識到，該清單決不是詳盡的。當多特異性配體結合(相同或不同抗原上的)兩個表位時，可由該清單選擇抗原。
有利地，雙特異性配體可用於靶向在生物機體的治療情況中協同增效的細胞因子和其它分子。本發明因此提供協同增強兩種或更多細胞因子活性的方法，其包括給予能夠結合所述兩種或更多細胞因子的雙特異性配體。在本發明的該方面中，雙特異性配體可為任意雙特異性配體，包括由互補和/或非互補結構域組成的配體、開放構象的配體和封閉構象的配體。例如，本發明的該方面涉及VH結構域和VL結構域的組合、僅VH結構域和僅VL結構域。
可以多種方式實現治療背景下的協同增效。例如，只有在兩個靶同時被配體靶向時靶組合才可能有治療活性，而靶向單獨的一個靶在治療上無效。在另一個實施方案中，單獨的一個靶可提供稍微慢或小一些的療效，但和第二個靶一起的組合提供協同增加的療效。
優選地，由附件2所示的清單選擇本發明該方面的雙特異性配體結合的細胞因子。
而且，雙特異性配體可用於腫瘤學用途，在一種特異性針對由細胞毒性細胞表達的CD89時，另一種特異性為腫瘤特異性。附件3中給出了可靶向的腫瘤抗原的實例。
在本發明第二種構型的一個實施方案中，可變結構域來源於抗第一個和/或第二個抗原或表位的抗體。在一個優選實施方案中，可變結構域來源於單可變抗體結構域的庫。在一個實例中，該庫是未在動物中建立的庫或合成庫。在另一個實施例中，(至少部分地)未通過動物免疫作用來分離單可變結構域。因此，可由神經文庫分離單結構域。
在另一方面，本發明的第二種構型提供多特異性配體，其含具有第一種表位結合特異性的第一個表位結合結構域和具有第二種表位結合特異性的非互補性第二個表位結合結構域。第一種和第二種結合特異性可相同或不同。
在再一方面，本發明提供封閉構象的多特異性配體，其含具有第一種表位結合特異性的第一個表位結合結構域和具有第二種表位結合特異性的非互補性第二個表位結合結構域，其中第一種和第二種結合特異性能夠競爭表位結合，使得封閉構象的多特異性配體不能同時結合兩個表位。
在再另一方面，本發明提供開放構象的配體，其含非互補性結合結構域，其中結構域對同一靶上的不同表位是特異性的。這種抗體以增加的親合力結合靶。
同樣，本發明提供多價配體，其含對相同表位有特異性的非互補結合結構域，並導向含所述表位的多個拷貝的靶，例如IL-5、PDGF-AA、PDGF-BB、TGF β、TGF β2、TGF β3和TNFα，例如人TNF受體1和人TNFα。
在相似的方面，可將本發明的配體設計成以低親合性結合各個表位，使得對單個表位的結合沒有治療意義；但由與兩個表位結合產生的增加親合力提供治療利益。在一個具體實施方案中，可靶向這種表位其在正常細胞類型上單獨存在，但僅在異常或患病細胞如腫瘤細胞上一起存在。在這種情況下，本發明的雙特異性配體僅有效靶向異常或腫瘤病患細胞。對同一靶上的多個拷貝的相同表位或鄰近表位有特異性的配體(稱為螯合dAb)也可為三聚或多聚(四聚或以上)配體，其含有3、4或更多個非互補性結合結構域。例如，可構建含3或4個VH結構域或VL結構域的配體。
而且，提供結合多亞單位靶的配體，其中各個結合結構域對所述靶的亞單位是特異性的。配體可為二聚、三聚或多聚體。優選地，可利用本發明第一方面的方法獲得本發明以上方面的多特異性配體。
按照本發明第二種構型的以上方面，有利地，第一個表位結合結構域和第二個表位結合結構域是如本文定義的非互補性免疫球蛋白可變結構域。其為VH-VH可變結構域或VL-VL可變結構域。
具體地說，可按照本發明的優選方面製備螯合dAb，即使用錨定dAb，其中使用含接頭序列上遊或下遊恆定dAb的載體構建二聚、三聚或多聚dAb文庫，第二個、第三個和其餘dAb的庫插入到接頭的另一側。例如，錨定或導向dAb可為TAR1-5(VK)、TAR1-27(V)、TAR2h-5(VH)或TAR2h-6(VK)。
在替代的方法學中，可避免使用接頭，例如通過使用結合結構域(例如VH和VL)之間的非共價鍵合或天然親合性。本發明因此提供製備螯合多聚配體的方法，其包括以下步驟(a)提供含核酸序列的載體，該序列編碼對靶上的第一個表位有特異性的單結合結構域；(b)提供編碼庫的載體，該庫含對所述靶上的第二個表位有特異性的第二個結合結構域，該表位可與第一個表位相同或不同，所述第二個表位鄰近所述第一個表位；和(c)表達所述第一個和第二個結合結構域；和(d)分離第一個和第二個結合結構域的組合，這兩個結構域組合在一起產生結合靶的二聚體。
第一個和第二個表位是鄰近的，使得多聚配體能夠同時結合兩個表位。這提供了具有增加的結合親合力優勢的配體。當表位相同時，由在靶上存在的多個拷貝的表位獲得增加的親合力，使得可以同時結合至少兩個拷貝，以便獲得增加的親合力作用。
可通過幾種方法以及使用接頭連接結合結構域。
例如，結合結構域可包含cys殘基、抗生物素蛋白和鏈黴抗生物素蛋白組或其它用於合成後非共價連接的手段；分離有效結合靶的組合。或者，在第一個和第二個接頭結合結構域之間可存在接頭，這些結構域由單個載體表達為單個多肽，該多肽含例如如上所述的第一個結合結構域、接頭和第二個結合結構域的庫。
在一個優選方面，第一個和第二個結合結構域當結合至抗原時天然結合；例如，VH和VK結構域當結合至鄰近表位時，以三向的相互作用天然結合，以形成穩定二聚體。這種結合蛋白可在靶結合實驗中分離。該方法的一個優勢在於在正確的構象中，只有結合緊密相鄰的表位的結合結構域才結合，因此該結合結構域將由於其對靶的親合力增加而被分離。
在本發明第二種構型的以上方面的替代實施方案中，至少一個表位結合結構域包含本文定義的非免疫球蛋白『蛋白支架』或『蛋白骨架』。合適的非免疫球蛋白蛋白支架包括但不限於任何選自以下的蛋白支架如上陳述的SpA、纖連蛋白、GroEL和其它伴侶蛋白、脂質運載蛋白、CCTLA4和親合體(affibodies)。
按照本發明第二種構型的以上方面，有利地，表位結合結構域連接至『蛋白骨架』。
有利地，本發明的蛋白骨架是免疫球蛋白骨架。按照本發明，術語『免疫球蛋白骨架』指含至少一種免疫球蛋白摺疊並用作如本文定義的一個或多個表位結合結構域的核心的蛋白。
本文定義的優選「免疫球蛋白骨架」包括選自以下的任一種或多種免疫球蛋白分子，其至少含(i)抗體的CL(κ或λ亞型)結構域；或(ii)抗體重鏈的CH1結構域；含抗體重鏈的CH1和CH2結構域的免疫球蛋白分子；含抗體重鏈的CH1、CH2和CH3結構域的免疫球蛋白分子；或與抗體的CL(κ或λ亞型)結構域接合的(ii)小類中的任一種。還可包括鉸鏈區結構域。這種結構域組合例如可模擬天然抗體，例如IgG或IgM或其片段，例如Fv、scFv、Fab或F(ab′)2分子。
本領域技術人員應知曉，該清單無詳盡的含義。
可在多肽水平上實現本文定義的骨架與表位結合結構域的連接，即在表達編碼骨架和/或表位結合結構域的核酸之後。或者，可在核酸水平上實施連接步驟。將本發明的蛋白骨架連接至一個或多個表位結合結構域的方法包括使用本領域技術人員熟知的和本文公開的蛋白質化學和/或分子生物學技術。
有利地，封閉構象的多特異性配體可包含能夠結合靶分子的第一個結構域和能夠結合延長配體半壽期的分子或基團的第二個結構域。例如，所述分子或基團可為大物質(bulky agent)，例如HSA或細胞基質蛋白。本文使用的表述「延長配體半壽期的分子或基團」指以下分子或化學基團，相對於不結合該分子或基團的配體，其在結合本文所述雙特異性配體的情況下在給予動物時增加該雙特異性配體的體內半壽期。下文描述了延長配體半壽期的分子或基團的實例。在一個優選實施方案中，封閉構象的多特異性配體只有在替換增強半壽期的分子或基團時才可能結合靶分子。因此，例如，封閉構象的多特異性配體藉助於大分子(例如HSA)保持在受試者的血流循環中。當遇到靶分子時，封閉構象的多特異性配體的結合結構域之間的競爭導致HSA被替代以及與靶結合。
有利地，本發明任何方面的配體以及用於構建該配體的dAb單體可以300nM至5pM(即3×10-7至5×10-12M)的Kd和/或5×10-1至1×10-7S-1的Koff速率常數(據表面等離子體共振測定)與其關連的20個靶解離，Kd優選50nM-20pM，或5nM-200pM或1nM-100pM，1×10-7M或以下，1×10-8M或以下，1×10-9M或以下，1×10-10M或以下，1×10-11M或以下；Koff速率常數優選1×10-2至1×10-6S-1，或5×10-3至1×10-5S-1，或5×10-1S-1或以下，或1×10-2S-1或以下，或1×10-3S-1或以下，或1×10-4S-1或以下，或1×10-5S-1或以下，或1×10-6S-1或以下。Kd速率常數被定義為Koff/Kon。
具體地說，本發明提供抗TNF-αdAb單體(或含這種dAb的雙特異性配體)、同二聚體、異二聚體或同三聚體配體，其中各個dAb均結合TNF-α。配體以300nM至5pM(即3×10-7至5×10-12M)的Kd結合TNF-α，優選50nM-20pM，更優選5nM-200pM，最優選1nM-100pM；或以替代的方式表示，Kd為1×10-7M或以下，優選1×10-8M或以下，更優選1×10-9M或以下，有利地1×10-10M或以下，最優選1×10-11M或以下；和/或據表面等離子體共振測定，Koff速率常數為5×10-1至1×10-7S-1，優選1×10-2至1×10-6S-1，更優選5×10-3至1×10-5S-1，例如5×10-1S-1或以下，優選1×10-2S-1或以下，更優選1×10-3S-1或以下，有利地1×10-4S-1或以下，進一步有利地1×10-5S-1或以下，最優選1×10-6S-1或以下。
優選地，配體在標準L929實驗中以500nM-50pM的ND50中和TNF-α，優選100nM-50pM，有利地10nM-100pM，更優選1nM-100pM；例如50nM或以下，優選5nM或以下，有利地500pM或以下，更優選200pM或以下，最優選100pM或以下。
優選地，配體以500nM-50pM的IC50抑制TNF-α與TNF-α受體I(p55受體)的結合，優選100nM-50pM，更優選10nM-100pM，有利地1nM-100pM；例如50nM或以下，優選5nM或以下，更優選500pM或以下，有利地200pM或以下，最優選100pM或以下。優選地，TNF-α是人TNF-α。
此外，本發明提供抗TNF受體I dAb單體或含這種dAb的雙特異性配體，其以300nM至5pM(即3×10-7至5×10-12M)的Kd和/或5×10-1至1×10-7S-1的Koff速率常數(據表面等離子體共振測定)結合TNF受體I，Kd優選50nM-20pM，更優選5nM-200pM，最優選1nM-100pM；例如1×10-7M或以下，優選1×10-8M或以下，更優選1×10-9M或以下，有利地1×10-10M或以下，最優選1×10-11M或以下；Koff速率常數優選1×10-2至1×10-6S-1，更優選5×10-3至1×10-5S-1，例如5×10-1S-1或以下，優選1×10-2S-1或以下，更優選1×10-3S-1或以下，有利地1×10-4S-1或以下，進一步有利地1×10-5S-1或以下，最優選1×10-6S-1或以下。
優選地，dAb單體或配體在標準實驗(例如本文描述的L929或Hela實驗)中以500nM-50pM的ND50中和TNF-α，優選100nM-50pM，更優選10nM-100pM，有利地1nM-100pM；例如50nM或以下，優選5nM或以下，更優選500pM或以下，有利地200pM或以下，最優選100pM或以下。
優選地，dAb單體或配體以500nM-50pM的IC50抑制TNF-α與TNF-α受體I(p55受體)的結合，優選100nM-50pM，更優選10nM-100pM，有利地1nM-100pM；例如50nM或以下，優選5nM或以下，更優選500pM或以下，有利地200pM或以下，最優選100pM或以下。優選地，TNF受體I的靶是人TNF-α。
此外，本發明提供以1nM至500μM(即1×10-9至5×10-4)、優選100nM-10μM的Kd結合血清白蛋白(SA)的dAb單體(或含這種dAb的雙特異性配體)。優選地，對於含第一個抗SA dAb和針對另一個靶的第二個dAb的雙特異性配體，第二個dAb對其靶的親合力(例如通過使用BiaCore的表面等離子體共振檢測的Kd和/或Koff是第一個dAb對SA的親合力的1-100000倍(優選100-100000倍，更優選1000-100000倍或10000-100000倍)。例如，第一個dAb以約10μM的親合力結合SA，而第二個dAb以100pM的親合力結合其靶。優選地，血清白蛋白為人血清白蛋白(HSA)。
在一個實施方案中，第一個dAb(或dAb單體)以約50nM的Kd結合SA(例如HSA)，優選70nM，更優選100、150或200nM。
而且，本發明提供符合本發明前述方面的前述dAb單體的二聚體、三聚體和多聚體。
本發明的配體，包括dAb單體、二聚體和三聚體，可連接至抗體Fc區，其含CH2和CH3結構域中的一個或兩個，並任選地含鉸鏈區。例如，可使用作為單核苷酸序列編碼與Fc區連接的配體的載體製備這種多肽。
在本發明第二種構型的再一個方面，本發明提供一個或多個至少編碼本文定義的多特異性配體的核酸分子。在一個實施方案中，配體為封閉構象配體。在另一個實施方案中，其為開放構象配體。可在單個核酸分子上編碼多特異性配體；或者各表位結合結構域可由單獨的核酸分子編碼。當配體由單個核酸分子編碼時，結構域可作為融合多肽表達，或者可單獨表達，並隨後例如使用化學連接劑連接在一起。通過合適的方法將由單獨核酸表達的配體連接在一起。
核酸可進一步編碼用於在表達時由宿主細胞輸出多肽的信號序列，並可在表達時與絲狀噬菌體顆粒(或選擇展示系統的其它組分)的表面組分融合。可用於細菌表達和/或噬菌體或噬菌粒展示的前導序列包括pelB、stII、ompA、phoA、bla和pelA。
在本發明第二種構型的另一個方面，本發明提供含本發明核酸的載體。
在再另一方面，本發明提供用本發明的載體轉染的宿主細胞。
可設計這種載體的表達，以例如在噬菌體顆粒表面上生產用於選擇的表位結合結構域。這使得可以選擇展示的結構域，由此可使用本發明的方法選擇『多特異性配體』。
在本發明第二種構型的一個優選實施方案中，表位結合結構域是免疫球蛋白可變區，並由單結構域V基因庫選擇。一般來說，單抗體結構域庫展示在絲狀噬菌體表面上。在一個優選實施方案中，根據噬菌體庫與抗原的結合選擇各個單抗體結構域。
本發明進一步提供含至少本發明的多特異性配體的試劑盒，該配體可為開放構象或封閉構象配體。本發明的試劑盒可為例如診斷試劑盒、治療試劑盒、化學或生物物質的檢測試劑盒等。
在本發明第二種構型的再一方面，本發明提供使用本發明配體的均相免疫實驗。
在本發明第二種構型的再一方面，本發明提供一種組合物，其含通過本發明方法可獲得的封閉構象的多特異性配體和藥物可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。而且，本發明提供了使用本發明的封閉構象的多特異性配體或組合物治療疾病的方法。在本發明的一個優選實施方案中，所述疾病為癌症或炎性疾病，例如類風溼性關節炎、哮喘或Crohn病。
在本發明第二種構型的再一方面，本發明提供一種診斷方法，包括使用本發明的封閉構象的多特異性配體或組合物診斷疾病。
因此，一般來說，可利用分析物與封閉構象的多特異性配體的結合替換一種物質，這導致在替換時產生信號。例如，分析物(第二種抗原)的結合可替換結合抗體的酶(第一種抗原)，這提供了免疫實驗的基礎，尤其是在酶通過其活性位點保持抗體的情況下。
因此，在第二種構型的最後一個方面，本發明提供檢測靶分子的存在情況的方法，其包括(a)提供與物質結合的封閉構象的多特異性配體，所述配體對靶分子和所述物質是特異性的，其中被配體結合的所述物質在由配體中替換出來時導致產生可檢測信號；(b)使封閉構象的多特異性配體接觸靶分子；和(c)檢測由於替換該物質而產生的信號。
按照本發明第二種構型的以上方面，有利地，所述物質為酶，其在被封閉構象的多特異性配體結合時失活。或者，所述物質可為選自以下的任一種或多種酶的底物和在被配體結合時失活或被猝滅的螢光、發光或發色分子。
與本文公開的序列類似或同源(例如至少約70％序列同一性)的序列也是本發明的一部分。在某些實施方案中，在胺基酸水平上的序列同一性可為約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。在核酸水平上，序列同一性可為約70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。或者，當核酸節段在選擇性雜交條件(例如非常高的嚴格性雜交條件)下與鏈的互補物雜交時，存在顯著同一性。核酸可存在於完整細胞中、細胞裂解物中，或為部分純化或基本純化形式。
如下進行兩個序列之間「同源性」或「序列同一性」或「相似性」(這些術語在本文可互換使用)的計算。為最佳對比目的而比對序列(例如，為了最佳對比，可在第一個和第二個胺基酸或核酸序列中的一個或兩個中引入空位，為了比較目的，可忽略非同源序列)。
在一個優選實施方案中，用於比較目的而比對的參比序列長度為參比序列長度的至少30％，優選至少40％，更優選至少50％，再更優選至少60％，再更優選至少70％、80％、90％、100％。然後比較在對應胺基酸位置或核苷酸位置的胺基酸殘基或核苷酸。當第一個序列的位置被與第二個序列中的對應位置相同的胺基酸殘基或核苷酸佔據時，則分子在該位置時相同的(本文使用的胺基酸或核酸「同源性」等同於胺基酸或核酸「同一性」)。兩個序列之間的同一性百分率為序列共有的相同位置數的函數，並考慮為最優比對兩個序列而需要引入的空位數和各個空位的長度。
有利地，使用BLAST算法(2.0版)進行序列比對，參數設置為默認值。BLAST算法詳述於美國政府的國立衛生研究院國家生物技術信息中心的全球資訊網站點(「www.ncbi.nih.gov」)，在「/Blast！」目錄下的「blast_help.html」文件中。檢索參數如下定義，有利地設定為限定的默認參數。
BLAST(基本的局部比對檢索工具)是程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx使用的啟發式檢索算法；這些程序的意義歸結於使用有一些增強的Karlin和Altschul，1990，20 Proc.Natl.Acad.Sci.USA87(6)2264-8(參見如上所述的「blast_help.html」文件)的統計學方法獲得的結果。BLAST程序適合於序列相似性檢索，例如鑑別對查詢序列的同源性。該程序一般不用於基序型檢索。關於序列資料庫相似性檢索的基本問題的論述，參見Altschul等，(1994)。
可在美國國家生物技術信息中心網站獲得的5個BLAST程序執行以下任務「blastp」相對於蛋白序列資料庫比較胺基酸查詢序列；「blastn」相對於核苷酸序列資料庫比較核苷酸查詢序列；「blastx」相對於蛋白序列資料庫比較核苷酸查詢序列(兩條鏈)的6個讀框概念翻譯產物；「tblastn」相對於以全部6個讀框(兩條鏈)動態翻譯的核苷酸序列資料庫比較蛋白查詢序列。「tblastx」相對於核苷酸序列資料庫的6個讀框翻譯產物比較核苷酸查詢序列的6個讀框翻譯產物。
BLAST使用以下檢索參數直方圖(HISTOGRAM)顯示每次檢索評分的直方圖；默認為yes。(見BLAST指南中的參數H)。
描述(DESCRIPTIONS)將報告匹配序列的簡短描述條數限定在指定數；默認限值為100條描述。(見指南頁中的參數V)。另見EXPECT和CUTOFF。
對準(ALIGNMENTS)將報告高分值節段對(HSP)的資料庫序列限定於指定條數；默認限值為50。如果出現的滿足報告統計學顯著性閾值的資料庫序列超出該默認限值(見以下的EXPECT和CUTOFF)，則僅報告最具統計學顯著性的匹配。(見BLAST指南中的參數B)。
期望值(EXPECT)用於報告與資料庫序列匹配的統計學顯著性閾值，默認值為10，這使得按照Karlin和Altschul(1990)的隨機模型，預期僅偶然發現10個匹配。如果匹配具有的統計學顯著性大於EXPECT閾值，則不報告匹配。EXPECT閾值越低越嚴格，導致報告匹配的機會越少。可接受小數值。(見BLAST指南中的參數E)。
截斷值(CUTOFF)報告高分值節段對的截斷值。默認值由EXPECT值計算得出(見上文)。僅在其統計學顯著性和記分等於CUTOFF值的單獨HSP所具有的統計學顯著性至少一樣高時，才報告資料庫序列的HSP。CUTOFF值越高越嚴格，導致報告的匹配機會越少。(見BLAST指南的參數S)。通常，使用EXPECT可更直觀地處理顯著性閾值。
矩陣(MATRIX)為BLASTP、BLASTX、TBLASTN和TBLASTX指定一個交替記分矩陣。默認矩陣為BLOSUM62(Henikoff和Henikoff，1992，Proc.Natl.30Acad.Sci.USA 89(22)10915-9)。有效的替代選擇包括PAM40、PAM120、PAM250和IDENTITY。沒有用於BLASTN的交替記分矩陣；在BLASTN請求中指定MATRIX命令返回錯誤回應。
鏈(STRAND)將TBLASTN檢索限定在僅資料庫序列的上鏈或下鏈；或將BLASTN、BLASTX或TBLASTX檢索限定在僅查詢序列上鏈或下鏈的讀框。
過濾器(FILTER)根據Wootton和Federhen(1993)Computers andChemisty 17149-163的SEG程序的測定，屏蔽具有低組成複雜性的查詢序列節段，或根據Claverie和States，1993，Computers andChemistry 17191-201的XNU程序測定，或者對於BLASTN根據Tatusov和Lipman的DUST程序(參見NCBI的全球資訊網站點)測定，屏蔽由短周期性內部重複序列組成的節段。過濾可從blast輸出結果中消除統計學顯著但無生物學意義的報告(例如相對於常見的酸性、鹼性或脯氨酸富集區域的命中結果)，留下查詢序列中可獲得的對資料庫序列特異性匹配的更有生物學意義區域。在核苷酸序列中使用字母「N」(例如「N」重複13次)，在蛋白質序列中使用字母「X」(例如「X」重複9次)，置換過濾器程序發現的低複雜性序列。
過濾僅適用於查詢序列(或其翻譯產物)，不適用於資料庫序列。BLASTN的默認過濾器是DUST，其它程序的默認過濾器是SEG。當應用於SWISS-PROT中的序列時，用SEG、XNU或這二者屏蔽通常根本沒用，所以不能預期過濾總是產生效果。而且，在某些情況下，序列整個被屏蔽，這表明應當懷疑相對於未過濾查詢序列報告的任意匹配的統計學顯著性。
NCBI-gi在輸出結果中除了顯示登錄號和/或基因座名稱以外，還顯示NCBI gi標識號。
最優選使用在上述的NCBI全球資訊網站點的「/BLAST」目錄下提供的簡化BLAST檢索算法進行序列比較。
基於多特異性配體的免疫球蛋白的製備本發明的雙特異性配體，無論在本發明目標構型的構象中是開放的還是封閉的，都可按照先前建立的、在抗體工程領域用於scFv、「噬菌體」抗體或其它工程抗體分子製備的技術製備。抗體製備技術，具體地說是雙特異性抗體製備技術，描述於例如以下提及的綜述和參考文獻Winter和Milstein，(1991)Nature 349293-299；Pluckthun(1992)Immunological Reviews 5 130151-188；Wright等，(1992)Crit.Rev.Immunol.12125-168；Holliger，P.和Winter，G.，(1993)Curr.Op.Biotechn.4，446-449；Carter等，(1995)J.Hematother.4，463-470；Chester，K.A.和Hawkins，R.E.，(1995)Trends Biotechn.13，294-300；Hoogenboom，H.R.(1997)Nature Biotechnol.15，125-126；Fearon，D.，(1997)Nature Biotechnol.15，618-619；Pluckthun，A.和Pack，P.，(1997)Irnmunotechnology 3，83-105；Carter，P.和Merchant，A.M.，(1997)Curr.Opin.Biotechnol.8，449-454；Holliger，P.和Winter，G.，(1997)CancerImmunol.Immunother.45，128-130。
本發明提供相對於兩個不同抗原或表位的可變結構域選擇，和隨後可變結構域的組合。用於選擇可變結構域的技術使用本領域已知的文庫和選擇方法。使用由人B細胞收集的重排V基因的天然文庫(Marks等，(1991)J.Mol.Biol.，222581；Vaughan等，(1996)NatureBiotech.，14309)是本領域技術人員眾所周知的。通常使用PCR，通過克隆免疫球蛋白V基因製備合成文庫(Hoogenboom和Winter(1992)J.Mol.Biol.，227381；Barbas等，(1992)Proc.Nafl.Acad.Sci.USA，894457；Nissim等，(1994)EMBO J.，13692；Griffiths等，(1994)EMBO]，133245；De Kruif等，(1995)J.MoL Biol.，24897)。PCR過程中的錯誤可導致高度隨機化。可相對於靶抗原或表位單獨地(在該情況下直接選擇單結構域結合)或一起選擇VH和/或VL文庫。
製備本發明的雙特異性配體的優選方法包括使用選擇系統，其中根據其與第一個抗原或表位的結合選擇一個可變結構域庫，並根據其與第二個抗原或表位的結合選擇一個可變結構域庫。然後組合選定的第一個和第二個可變結構域，並根據其與第一個和第二個抗原或表位兩者的結合選擇雙特異性配體。根據其與第一個和第二個抗原或表位這二者單獨地但不同時結合選擇封閉構象的配體。
A.文庫載體系統適用於本發明的各種選擇系統是本領域已知的。下文描述了這種系統的實例。
可直接篩選為噬菌斑或溶原體集落的噬菌體λ表達系統，這二者先前均有描述(Muse等，(1989)20 Science，2461275；Caton和Koprowski，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87；Mullinax等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，878095；Persson等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，882432)，對本發明有用。儘管這種表達系統可用於篩選文庫的高達106個不同成員，但其確實不適於篩選較大數目(超過106個成員)。
在文庫構建中特別有用的是選擇展示系統，其能夠使核酸與其表達的多肽連接。本文使用的選擇展示系統是允許利用合適的展示方法通過結合屬配體和/或靶配體選擇文庫的單個成員的系統。
分離大文庫的目標成員的選擇方法是本領域已知的，以噬菌體展示技術為代表。在這種系統中，多樣化肽序列表達在絲狀噬菌體表面上(Scott和Smith(1990)Science，249386)，已證明這種系統可用於建立抗體片段(和編碼其的核苷酸序列)的文庫，其用於體外選擇和擴增結合靶抗原的特異性抗體片段(McCafferty等，WO 92/01047)。編碼VH和VL區的核苷酸序列連接至編碼前導信號的s基因片段，該片段將該核苷酸序列導向大腸桿菌的壁膜間隙；結果產生的抗體片段展示在噬菌體表面上，通常為與噬菌體外殼蛋白(例如pIII或pVIII)的融合體。
或者，抗體片段外部展示在λ噬菌體衣殼(phagebodies)上。噬菌體型展示系統的優勢在於由於其為生物系統，所以僅通過在細菌細胞中培養含選定文庫成員的噬菌體就可簡單擴增選定文庫成員。而且，因為編碼多肽文庫成員的核苷酸序列包含在噬菌體或噬菌粒載體上，所以測序、表達和隨後的遺傳操作相對簡易。
構建噬菌體抗體展示文庫和λ噬菌體表達文庫的方法在本領域眾所周知(McCafferty等，(1990)Nature，348552；Kang等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，884363；Clackson等，(1991)Nature，352624；Lowman等，(1991)Biochemistry，3010832；Burton等，20(1991)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.，8810134；Hoogenboom等，(1991)Nucleic AcidsRes.，194133；Chang等，(1991)J.Immunol.，1473610；Breitling等，(1991)Gene，104147；Marks等，(1991)，出處同上；Barbas等，(1992)，出處同上；Hawkins和Winter(1992)J.Immunol.，22867；Marks等，1992，J.Biol.Chem.，26716007；Lerner等，(1992)Science，2581313，其通過引用結合到本文中)。
一個特別有利的方法是使用scFv噬菌體文庫(Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.，855879-5883；Chaudhary等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.，871066-1070；McCafferty等，(1990)，出處同上；Clackson等，(1991)Nature，352624；Marks等，(1991)J.Mol.Biol.，222581；Chiswell等，30(1992)Trends Biotech.，1080；Marks等，(1992)J.Biol.Chem.，267)。業已描述了在噬菌體外殼蛋白上展示scFv文庫的各種實施方案。噬菌體展示方法的精要也是已知的，例如描述於WO 96/06213和WO 92/01047(Medical Research Council等)和WO97/08320(Morphosys)，其通過引用結合到本文中。
其它產生肽文庫的系統包括使用用於體外合成文庫成員的無細胞酶機器。在一個方法中，通過交替輪次的相對於目標配體的選擇和PCR擴增選擇RNA分子(Tuerk和Gold(1990)Science，249505；Ellington和Szostak(1990)Nature，346818)。可使用相似的技術鑑別結合既定人轉錄因子的DNA序列(Thiesen和Bach(1990)NucleicAcids Res.，183203；Beaudry和Joyce(1992)Science，257635；WO92/05258和WO 92/14843)。可以相似的方式使用體外翻譯作為生產大文庫的方法合成多肽。這些方法一般來說包括穩定化多核糖體複合物，這些方法進一步描述於WO 88/08453、WO 90/05785、WO90/07003、WO 91/02076、WO 91/05058和WO 92/02536。非噬菌體型的替代展示系統，例如在WO 95/22625和WO 95/11922(Affymax)中公開的系統，使用多核糖體以展示用於選擇的多肽。
再其它類型的技術包括選擇人工區室中的庫，其允許基因與其基因產物連接。例如，在WO 99/02671、WO 00/40712以及Tawfik和Griffiths(1998)Nature Biotechnol 16(7)，652-6中描述了選擇系統，其中可在通過油包水乳濁液形成的微囊體中選擇編碼目的基因產物的核酸。將編碼具有目標活性的基因產物的遺傳元件區室化入微囊體中，然後轉錄和/或翻譯，以在微囊體中產生其各自的基因產物(RNA或蛋白)。隨後分揀產生具有目標活性的基因產物的遺傳元件。該方法通過用各種方法檢測目標活性來選擇目的基因產物。
B.文庫構建可使用本領域已知的技術(例如上文陳述的技術)構建或者可由商業來源購買計劃用於選擇的文庫。用於本發明的文庫描述於例如WO99/20749。一旦選擇了載體系統並將一個或多個編碼目的多肽的核酸序列克隆入文庫載體中，人們就可通過在表達前進行誘變而在克隆的分子中產生多樣性；或者，可如上所述表達和選擇編碼蛋白，之後實施誘變和另外輪次的選擇。通過標準分子方法對編碼結構優化的多肽的核酸序列進行誘變。特別有用的是聚合酶鏈反應或PCR(Mullis和Faloona(1987)Methods E′nzymol.，155335，其通過引用結合到本文中)。PCR在本領域眾所周知，其使用由熱穩定的DNA依賴性DNA聚合酶催化的多個循環的DNA複製，擴增目標靶序列。各種抗體文庫的構建已論述於Winter等，(1994)Ann.Rev.Immunology12，433-55及其中提及的參考文獻。
使用模板DNA(至少1fg；最通常1-1000ng)和至少25pmol寡核苷酸引物進行PCR；引物池重異度源時其可有利地使用較大量的引物，因為各個序列僅佔池分子的一小部分，量在後續的擴增循環中變成限制性的。典型的反應混合物包括2μl DNA、25pmol寡核苷酸引物、2.5μl 10X PCR緩衝液1(Perkin-Elmer，Foster City，CA)、0.4μl的1.25μM dNTP、0.15μl(或2.5單位)Taq DNA聚合酶(PerkinElmer，Foster City，CA)和使總體積至25μl的去離子水。覆蓋礦物油，並使用可編程熱循環儀進行PCR。PCR循環各步的長度和溫度以及循環數按照實際所需要的嚴格性調整。通過預期引物對模板退火的效力和容許的錯配程度這二者確定退火溫度和時間；顯然，當核酸分子同時擴增和誘變時，至少在第一輪合成中需要錯配。優化引物退火條件嚴格性的能力完全屬於本領域普通技術人員的知識範圍。使用在30℃-72℃之間的退火溫度。一般以92℃-99℃、4分鐘發生模板分子的初始變性，接著是20-40個由變性(94-99℃，15秒至1分鐘)、退火(如上所述確定的溫度；1-2分鐘)和延伸(72℃，1-5分鐘，取決於擴增產物的長度)組成的循環。最後的延伸一般為72℃、4分鐘，可後接4℃的無定數(0-24小時)步驟。
C.組合單可變結構域一旦選定了用於本發明的結構域，其就可通過本領域已知的各種方法組合，包括共價和非共價法。
優選方法包括使用如所述例如與scFv分子連接的多肽接頭(Bird等，(1988)Science 242423-426)。Bird等，Science 242，423-426；Hudson等，Journal Immunol.Methods 231(1999)177-189；Hudson等，Proc NatAcad Sci USA 85，5879 5883提供了適宜接頭的論述。接頭優選是彈性的，使兩個單結構域可相互作用。一個接頭實例是(Gly4Ser)n接頭，其中n＝1-8，例如2、3、4、5或7。還可使用在雙功能抗體中使用的較少彈性的接頭(Holliger等，(1993)PNAS(USA)906444-6448)。
在一個實施方案中，使用的接頭不是免疫球蛋白鉸鏈區。
可使用接頭以外的方法組合可變結構域。例如，可利用通過天然或工程改造過的半胱氨酸殘基提供的二硫鍵，穩定VH-VH、VL-VL或VH-VL二聚體(Reiter等，(1994)Protein Eng.7697-704)，或通過重構可變結構域之間的相互作用，以改善「相適性」，並因此改善相互作用的穩定性(Ridgeway等，(1996)Protein Eng.7617-621；Zhu等，(1997)Protein Science 6781-788)。
適宜時，可使用連接或穩定免疫球蛋白可變結構域(具體地說為抗體VH結構域)的其它技術。
按照本發明，雙特異性配體可在溶液中為「封閉」構象。「封閉」構型是其中兩個結構域(例如VH和VL)以結合形式存在的構型，例如形成抗體結合位點的結合VL對的構型。例如，scFv可為封閉構象，這取決於用於連接VH和VL結構域的接頭的排列。如果接頭彈性足以允許結構域結合，或剛性地將結構域保持在結合部位，則結構域有可能採取封閉構象。
類似地，VH結構域對和VL結構域對可以封閉構象存在。一般而言，配體分子中結構域的緊密結合(例如藉助於剛性接頭)具有功能。封閉構象中的配體不能同時結合增加配體半壽期的分子和第二個靶分子。因此，配體通常僅在與增加配體半壽期的分子解離時才結合第二個靶分子。
而且，無接頭地VH/VH、VL/VL或VH/VL二聚體構建為結構域之間的競爭作準備。
此外，本發明的配體可為開放構象。在此構象中，配體能同時結合增加配體半壽期的分子和第二個靶分子。通常，就VH VL對而言，開放構型中的可變結構域保持得足夠遠，使結構域不相互作用和形成抗體結合位點，不競爭結合其各自的表位。就VH/VH或VI/VL二聚體而言，未通過剛性接頭將結構域強迫在一起。這種結構域對天然地不競爭抗原結合或形成抗體結合位點。
Fab片段和完整抗體主要以封閉構象存在，但要認識到，在不同環境下，開放和封閉的雙特異性配體有可能以各種平衡狀態存在。配體與靶的結合可能將平衡移向開放構型。因此，本發明的某些配體在溶液中可以兩種構象存在，其中一種(開放形式)可獨立地結合兩個抗原或表位，而另一種構象(封閉形式)僅可結合一種抗原或表位；因此在該構象中，抗原或表位競爭結合配體。
儘管開放形式的雙特異性配體因此可在溶液中以與封閉形式的平衡狀態存在，但感覺平衡狀態有利於封閉形式；而且，開放形式可通過靶結合而被螯合成封閉構象。因此，優選地，本發明的某些雙特異性配體以兩種(開放的和封閉的)構象之間的平衡狀態存在。
可修飾本發明的雙特異性配體，以便有利於開放或封閉構象。例如，用二硫鍵穩定VH-VL相互作用穩定了封閉構象。而且，可構建用於連接結構域(包括VH結構域和VL結構域對)的接頭，使得有利於開放形式；例如，接頭可在空間上阻礙結構域的結合，例如通過在恰當位置加入大胺基酸殘基，或設計保持結構域物理空間間距的合適剛性結構。
D.雙特異性配體的特徵可利用本領域技術人員熟知的、包括ELSIA在內的方法測試雙特異性配體與其特異性抗原或表位的結合。在本發明的一個優選實施方案中，使用單克隆噬菌體ELISA測試結合。
可按照任意合適的方法實施噬菌體ELISA代表性方法陳述於下文。
可通過ELISA篩選各輪選擇產生的噬菌體群對選定抗原或表位的結合情況，以鑑別「多克隆」噬菌體抗體。然後可通過ELISA篩選這些群的單一感染細菌菌落的噬菌體，以鑑別「單克隆」噬菌體抗體。還需要篩選結合抗原或表位的可溶性抗體片段，這還可通過使用例如針對C-或N-末端標記的試劑的ELISA進行(參見例如Winter等，(1994)Ann.Rev.Immunology 12，433-55和其中提及的參考文獻)。
還可通過PCR產物的凝膠5電泳(Marks等，1991，出處同上；Nissim等，1994，出處同上)、探測(Tomlinson等，1992)J.Mol.Biol.227，776)或載體DNA測序評價選定的噬菌體單克隆抗體的多樣性。
E.『雙特異性配體』的結構如上所述，抗體在本文被定義為以下抗體(例如IgG、IgM、IgA、IgA、IgE)或片段(Fab、Fv、二硫鍵合的Fv、scFv、雙功能抗體)其包含至少一個重鏈和輕鏈可變結構域、至少兩個重鏈可變結構域或至少兩個輕鏈可變結構域。(術語抗體還包括dAb)。其至少部分地來源於天然產生抗體的任意物種，或通過重組DNA技術建立；無論其分離自血清、B細胞、雜交瘤、轉染瘤、酵母還是細菌。
在本發明的一個優選實施方案中，雙特異性配體含抗體的至少一個20單重鏈可變結構域和一個抗體的單輕鏈可變結構域，或兩個單重鏈或輕鏈可變結構域。例如，配體可包含VH/VL對、一對VH結構域或一對VL結構域。
這種配體的第一個和第二個可變結構域可位於相同多肽鏈上。或者，其可位於單獨的多肽鏈上。在其位於相同多肽鏈上的情況下，其可通過接頭連接，接頭優選為如上所述的肽序列。
第一個和第二個可變結構域可共價或非共價連接。在其共價連接的情況下，共價鍵可為二硫鍵。
在可變結構域選自例如使用本文所述噬菌體展示技術選擇的V基因庫的情況下，這些可變結構域包含通用構架區，使得其可由本文定義的特異性屬配體識別。通用構架、屬配體等的使用描述於WO99/20749。
當使用V基因庫時，多肽序列的變化優選位於可變結構域的結構環中。任一個可變結構域的多肽序列都可通過DNA重排或突變改變，以便增強各個可變結構域與其互補對的相互作用。DNA重排在本領域是已知的，教導於例如Stemmer，1994，Nature 370389-391和美國專利第6,297,053號，這二者均通過引用結合到本文中。其它誘變方法是本領域技術人員眾所周知的。
在本發明的優選實施方案中，『雙特異性配體』是單鏈Fv片段。在本發明的替代實施方案中，『雙特異性配體』由Fab型組成。
在另一方面，本發明提供編碼至少如本文定義的『雙特異性配體』的核酸。
本領域技術人員會意識到，根據本發明的該方面，抗原或表位這二者可同時結合相同同一抗體分子。或者，其可競爭結合同一抗體分子。例如，當兩個表位被同時結合時，雙特異性配體的兩個可變結構域能夠獨立地結合其靶表位。在結構域競爭的情況下，一個可變結構域能夠結合其靶，但與其它可變結構域結合其關連靶不在同一時間；或者第一個可變結構域能夠結合其靶，但與第二個可變結構域結合其關連靶不在同一時間。
可變區可來源於抗目標抗原或表位的抗體。或者，其可來源於單抗體結構域庫，例如在絲狀噬菌體表面上表達的抗體結構域庫。可如下所述進行選擇。
一般來說，可如標準實驗室手冊(例如Sambrook等，(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，USA)的陳述構建和操作實施本發明所需的核酸分子和載體構建物。
用於本發明的核酸的操作通常在重組載體中進行。
因此，在另一方面，本發明提供載體，其含編碼至少如本文定義的『雙特異性配體』的核酸。
本文使用的載體指用於將異源DNA導入到用於其表達和/或複製的細胞中的分離元件。選擇或構建並隨後使用這種載體的方法是本領域一般技術人員眾所周知的。無數載體可公開獲得，包括細菌質粒、噬菌體、人工染色體和游離型載體。這種載體可用於簡單克隆和誘變；或者，使用基因表達載體。可選定按照本發明使用的載體，以容納長度通常為0.25千鹼基對(kb)至40kb或更長的目標大小的多肽編碼序列。在體外克隆操作後用載體轉化合適的宿主細胞。各個載體均含有各種功能元件，其一般包括克隆(或「多接頭」)位點、複製起點和至少一個選擇標記基因。如果給定載體是表達載體，則其另外具有以下的一個或多個增強子元件、啟動子、轉錄終止子和信號序列，每個均定位在克隆位點的附近，使得其有效連接至編碼本發明配體的基因。
一般來說，克隆和表達載體這二者均含有能使30載體在一個或多個選定宿主細胞中複製的核酸序列。通常，在克隆載體中，該序列是能使載體獨立於宿主染色體DNA複製的序列，包括複製起點或自主複製序列。各種細菌、酵母和病毒的此類序列是眾所周知的。質粒pBR322的複製起點適於大部分革蘭氏陰性細菌，2μ質粒起點適於酵母，而各種病毒起點(例如SV 40、腺病毒)用於哺乳動物細胞中的克隆載體。一般來說，哺乳動物表達載體不需要複製起點，除非這些起點用在能夠複製高水平DNA的哺乳動物細胞中，例如COS細胞。
有利地，克隆或表達載體還可含有又被稱為選擇標記的選擇基因。該基因編碼在選擇性培養基中培養的轉化宿主細胞的存活或生長必需的蛋白。因此，未用含選擇基因的載體轉化的宿主細胞在該培養基中不能存活。典型的選擇基因編碼蛋白賦予對抗生素和其它毒素(例如氨苄青黴素、新黴素、氨甲蝶呤或四環素)的抗性、補充營養缺陷或提供生長培養基中不可獲得的關鍵營養物。因為編碼本發明配體的載體的複製最通常在大腸桿菌中進行，所以使用大腸桿菌選擇標記，例如賦予對抗生素氨苄青黴素抗性的β-內醯胺酶基因。這些選擇標記可得自大腸桿菌質粒(例如pBR322)或pUC質粒(例如pUC18或pUC19)。
表達載體通常含宿主生物識別的啟動子，並有效連接至目的編碼序列。這種啟動子可為誘導型或組成型啟動子。術語「有效連接的」指這種並列其中所述組分所處的關係允許其以預計方式起作用。「有效連接」至編碼序列的控制序列以在與控制序列相容的條件下實現編碼序列表達的方式連接。
適用於原核生物宿主的啟動子包括例如β-內醯胺酶和乳糖酶啟動子系統、鹼性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動子系統和雜合啟動子，例如tac啟動子。一般來說，用於細菌系統的啟動子還包含有效連接至編碼序列的Shine-Dalgarno序列。優選載體是能夠表達對應於多肽文庫成員的核苷酸序列的表達載體。因此，可通過對表達多肽文庫成員的單個克隆進行單獨增殖和表達，或通過使用任一種選擇展示系統，用第一種和/或第二種抗原或表位進行選擇。如上所述，優選的選擇展示系統是噬菌體展示。因此，可使用噬菌體或噬菌粒載體，例如pIT1或pIT2。用於本發明的前導序列包括pelB、stII、ompA、phoA、bla和pelA。一個實例是噬菌粒載體，其具有大腸桿菌複製起點(用於雙鏈複製)，還具有噬菌體複製起點(用於生產單鏈DNA)。這種載體的操作和表達在本領域眾所周知(Hoogenboom和Winter(1992)，出處同上；Nissim等，(1994)，出處同上)。簡單地說，載體含賦予噬菌粒選擇性的β內醯胺酶基因和表達盒上遊的lac啟動子，該表達盒由(N至C末端)的pelB前導序列(其將表達的多肽引導入壁膜間隙)、多個克隆位點(用於克隆核苷酸形式的文庫成員)、任選的一個或多個肽標記(用於檢測)、任選的一個或多個TAG終止密碼子和噬菌體蛋白pIII組成。因此，在使用大腸桿菌的各種抑制基因和非抑制基因菌株並加入葡萄糖、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)或輔助噬菌體如VCSM13的情況下，載體能夠作為不表達的質粒複製，產生大量的唯一的多肽文庫成員，或產生噬菌體，其中一些在其表面上含多肽-pIII融合體的至少一個拷貝。
編碼本發明配體的載體的構建使用常規連接技術。切割、修整分離的載體或DNA片段，並再連接成所要求的形式，產生需要的載體。如果有需要，以已知方式進行分析，以證實在構建的載體中存在正確的序列。適於構建表達載體、製備體外轉錄物、將DNA導入宿主細胞中以及進行表達和功能評價分析的方法是本領域技術人員已知的。檢測樣品中基因序列的存在情況，或通過常規方法定量其擴增和/或表達，例如DNA或RNA分析、蛋白質印跡、DNA、RNA或蛋白的點印跡、原位雜交、免疫細胞化學或核酸或蛋白分子的序列分析。本領域技術人員易於設想在有需要時可如何修改這些方法。封閉構象的多特異性配體的結構按照本發明第二種構型的一個方面，連接兩個或更多非互補性表位結合結構域，使其成為如本文定義的封閉構象。有利地，其可進一步連接至骨架，該骨架作為替代或在添加本文所述接頭時可有利於形成和/或保持表位結合位點彼此的封閉構象。
(I)骨架骨架可基於免疫球蛋白分子，或可為上文陳述起源的非免疫球蛋白。本文定義的優選免疫球蛋白骨架包括選自以下的任一個或多個免疫球蛋白分子，其至少含(i)抗體的CL(κ或λ亞型)結構域；或(ii)抗體重鏈的CH1結構域；含抗體重鏈的CH1和CH2結構域的免疫球蛋白分子；含抗體重鏈的CH1、CH2和CH3結構域的免疫球蛋白分子；或與抗體的CL(κ或λ亞型)結構域接合的(ii)小類中的任一種。還可包括鉸鏈區結構域。這種結構域組合例如可模擬天然抗體，例如IgG或IgM或其片段，例如Fv、scFv、Fab或F(ab′)2分子。本領域技術人員應知曉，該清單無詳盡的含義。
(II)蛋白支架各個表位結合結構域均含蛋白支架以及一個或多個涉及結構域與一個或多個表位的特異性相互作用的CDR。有利地，本發明的表位結合結構域含3個CDR。合適的蛋白支架包括任何選自以下的支架基於免疫球蛋白結構域的蛋白支架、基於纖連蛋白的蛋白支架、基於親合體(affibodies)的蛋白支架、基於CTLA4的蛋白支架、基於分子伴侶如GroEL的蛋白支架、基於脂質運載蛋白的蛋白支架和基於細菌Fc受體SpA和SpD的蛋白支架。本領域技術人員應知曉，該清單無詳盡的含義。
F用於構建雙特異性配體的支架主鏈構象的選擇免疫球蛋白超家族成員的多肽鏈均具有相似的摺疊。例如，儘管抗體就其一級序列而言是高度多樣化的，但序列和晶體學對比揭示，和預期相反，抗體的6個抗原結合環中的5個(H1、H2、L1、L2、L3)採用有限量的主鏈構象或規範結構(Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.，196901；Chothia等，(1989)Nature，342877)。因此，環長度和關鍵殘基的分析能預示大部分人抗體中存在的H1、H2、L1、L2和L3主鏈構象(Chothia等，(1992)J.Mol.Biol，227799；Tomlinson等，(1995)EMBO J.，14204628；Williams等，(1996)J.Mol.Biol.，264220)。儘管H3區就序列、長度和結構而言多樣化得多(原因在於使用D節段)，但其也形成有限量的短環長主鏈構象，其取決於環和抗體構架中關鍵位置的具體殘基的長度和存在情況或殘基類型(Martin等，(1996)J.Mol.Biol，263800；Shirai等，(1996)FEBS Letters，3991)。
本發明的雙特異性配體有利地由結構域文庫組裝，例如VH結構域文庫和/或VL結構域文庫。而且，本發明的雙特異性配體自身可以文庫形式提供。在本發明的一個方面，設計雙特異性配體和/或結構域的文庫，其中選擇一定環長和關鍵殘基，以確保成員的主鏈構象已知。如上所述，有利地，這些文庫是天然存在的免疫球蛋白超家族分子的真正構象，以使其非功能化的機會最小。種系V基因節段用作一種適合於構建抗體或T細胞受體文庫的基本構架；其它序列也是有用的。可以低頻率發生變異，使得少量的有功能成員可具有改變的主鏈構象，該構象不影響其功能。
規範結構理論也可用於評價由配體編碼的大量不同主鏈構象，以預測基於配體序列的主鏈構象和選擇不影響規範結構的多樣化殘基。已知在人VK結構域中，L1環可採用4種規範結構中的一種，L2環具有單一規範結構，90％的人VK結構域採用L3環的4種或5種規範結構中的一種(Tomlinson等，(1995)，出處同上)；因此，在單獨的VK結構域中，可組合不同的規範結構，以建立一系列的不同主鏈構象。已知Vα結構域編碼L1、L2和L3環的不同系列的規範結構，VK和Vα結構域可與可編碼H1和H2環的幾種規範結構的任意VH結構域配對，對這5個環所觀察到的規範結構組合數非常大。這暗示，主鏈構象中多樣性的產生可能是產生廣泛的結合特異性所必需的。但是，和預期相反，通過基於單個已知主鏈構象構建抗體文庫，已發現主鏈構象的多樣性不是產生足以靶向基本所有抗原的多樣性所必須的。甚至更令人驚奇地是，單個主鏈構象不必是共有結構—單個天然構象可用作整個文庫的基礎。因此，在一個優選方面，本發明的雙特異性配體具有單個已知的主鏈構象。
選擇的單個主鏈構象優選是在所述免疫球蛋白超家族類型分子中常見的。當發現顯著數量的天然分子採用該構象時，該構象是常見的。因此，在本發明的一個優選方面，免疫球蛋白結構域各個結合環的不同主鏈構象的天然出現被認為是獨立的，於是選擇不同環具有所需主鏈構象組合的天然可變結構域。如果未獲得任何構象，則可選取最接近的等同構象。優選通過選擇編碼目標主鏈構象的種系基因節段，不同環建立主鏈構象的目標組合。更優選選擇的種系基因節段常常天然表達，最優選其為所有天然種系基因節段中最經常表達的。
在設計雙特異性配體或其文庫時，可單獨考慮6個抗原結合環中每一個的不同主鏈構象的出現率。對於H1、H2、L1、L2和L3，選擇20％-100％天然分子抗原結合環採用的已知構象。
通常，觀測到出現率在35％以上(即35％-100％之間)，理想地在50％以上乃至65％以上。因為大多數H3環不具有規範結構，所以優選選擇在確實展現出規範結構的環中常見的主鏈構象。因此，對於每個環，選擇在天然庫中最經常觀察到的構象。在人抗體中，各個環最普遍的規範結構(CS)如下H1-CS 1(表達庫的79％)、H2-CS 3(46％)、VK的L1-CS 2(39％)、L2-CS 1(100％)、VK的L3-CS 1(36％)(計算假定αk∶λ比率為70∶30，Hood等，(1967)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol，48133)。對於具有規範結構的H3環，具有殘基94至殘基101的鹽橋的7殘基CDR3長度(Kabat等，(1991)Sequences ofproteins of immunological interest，美國健康與人類服務部)似乎最常見。在EMBL資料庫中有至少16個人抗體序列具有形成該構象所要求的H3長度和關鍵殘基，在蛋白資料庫中有至少2個可用作抗體建模(2cgr和1tet)基礎的晶體學結構。最常表達這種規範結構組合的種系基因節段是VH節段3-23(DP-47)、JH節段JH4b、VK節段02/012(DPK9)和JK節段JK1。VH節段DP45和DP38也合適。因此，這些節段可組合用作構建具有所需單個主鏈構象的文庫的基礎。
或者，不基於不同主鏈構象的天然出現率為各個結合環單獨選擇單個主鏈構象，而是使用主鏈構象組合的天然出現率作為選擇單個主鏈構象的基礎。例如，對於抗體，可測定任意2、3、4、5或全部6個抗原結合環的規範結構組合的天然出現率。在此，優選選定的構象在天然抗體中是最常見的，最優選其是在天然庫中最經常被觀測到的。因此，例如在人抗體中，當考慮5個抗原結合環H1、H2、L1、L2和L3的天然組合時，確定最常見的規範結構組合，然後與最普遍的H3環構象組合，作為選擇單個主鏈構象的基礎。
ii.規範序列的多樣化如果選定了幾個已知主鏈構象或優選單個已知主鏈構象，則可通過改變分子的結合位點來構建本發明的雙特異性配體或用於本發明的文庫，以便產生具有結構和/或功能多樣性的庫。這意味著產生變體，使其在其結構和/或其功能上具有足夠的多樣性，以便其能夠提供一系列活性。
通過在一個或多個位置改變選擇的分子產生需要的多樣性。待改變的位置可隨機選擇，或優選是選擇性的。然後可通過隨機化實現改變，在隨機化過程中，原有的胺基酸被任意天然或合成的胺基酸或其類似物取代，產生非常大量的變化，或通過用一個或多個限定亞型的胺基酸取代原有的胺基酸實現改變，產生更有少量的變體。
業已報導了導入此多樣性的各種方法。可使用錯配PCR(Hawkins等，(1992)J.Mol.Biol.，226889)、化學誘變(Deng等，(1994)J.Biol.Chem.，2699533)或細菌增變株(Low等，(1996)J.Mol.Biol，260359)將隨機突變導入到編碼分子的基因中。突變選定位置的方法在本領域也是眾所周知的，包括在有或沒有使用PCR的情況下使用錯配的寡核苷酸或簡併寡核苷酸。例如，已通過將突變靶向至抗原結合環建立了幾個合成抗體文庫。已隨機化人破傷風類毒素結合性Fab的H3區，建立一系列新結合特異性(Barbas等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894457)。已將隨機或半隨機H3和L3區加至種系V基因節段，產生具有未突變的構架區的大文庫(Hoogenboom和Winter，(1992)JMol.Biol，227381；Barbas等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894457；Nissim等，(1994)EMBO J.，13692；Griffiths等，(1994)EMBO J.，133245；De Kruif等，(1995)J.Mol.Biol.，24897)。這種多樣性已擴展至包括其它抗原結合環的部分或全部(Crameri等，(1996)NatureMed.，5 2100；Riechmann等，(1995)Bio/Techrology，13475；Morphosys，WO 97/08320，出處同上)。因為環隨機化有潛力建立大約超過1015個單獨的H3結構和類似大量的其它5個環的變體，所以使用現行轉化技術乃至使用無細胞系統生產代表所有可能組合的文庫不可行。例如，在迄今構建的最大文庫之一中，產生6×1010種不同抗體(Griffiths等，(1994)，出處同上)，其僅是本設計文庫潛在多樣性的一部分。
在一個優選實施方案中，僅有直接參與建立或修飾分子的目標功能的殘基才被多樣化。對於許多分子來說，功能是結合靶，因此多樣性應當集中在靶結合位點，而避免改變對分子的整體包裝或保持選定的主鏈構象關鍵的殘基。
規範序列在應用抗體結構域時的多樣性對於抗體雙特異性配體，靶的結合位點最常見是抗原結合位點。因此，在高度優選的方面，本發明提供其中僅改變抗原結合位點中的殘基的抗體雙特異性配體文庫或用於該抗體雙特異性配體的組件。這些殘基在人抗體庫中極為多樣性，已知在高解析度抗體/抗原複合物中形成接觸。例如，在L2中，已知位置50和53在天然抗體中是多樣化的，觀測到該位置與抗原接觸。相反，常規方法會使如Kabat等(1991，出處同上)定義的對應互補決定區(CDR1)中的所有殘基多樣化，有約7個殘基，而與其相比按照本發明使用的文庫中兩個殘基多樣化。這表示建立一系列抗原結合特異性所需要的功能多樣性顯著提升。
實際上，抗體多樣性是兩個過程的結果種系V、D和J基因節段的體細胞重組，建立原初主庫(所謂的種系和連接多樣性)，以及所獲得的重排V基因的體細胞超突變。人抗體序列分析已經表明，主庫中的多樣性集中在抗原結合位點的中心，而體細胞超突變將多樣性擴展至抗原結合位點外圍的區域，這些區域在主庫中是高度保守的(參見Tomlinson等，(1996)J.Mol.Biol.，256813)。這種互補性或許已逐漸成為檢索序列空間的有效策略，儘管明顯是抗體獨有的，但其可容易地應用於其他多肽庫。改變的殘基是形成靶結合位點的殘基的一部分。如果有需要，在選擇過程中的不同階段多樣化靶結合位點中不同(包括重疊)部分的殘基。
對於抗體庫，在抗原結合位點中的某些但不是全部殘基多樣化的情況下，建立最初的『原初』庫。本文在此背景下使用的術語「原初」指不具有預定靶的抗體分子。這些分子類似於由未經歷免疫多樣化個體的免疫球蛋白基因編碼的分子，免疫系統還沒有受到大範圍的抗原性刺激物攻擊的胎兒和新生兒個體就是這種情況。然後相對一系列抗原或表位選擇該庫。如果有需要，則可將更多的多樣性導入初始庫中的多樣化區外。可根據改變的功能、特異性或親合性選擇這種成熟庫。
本發明提供結合結構域的兩種不同原初庫，用於構建雙特異性配體或雙特異性配體的原初庫，其中抗原結合位點中的部分或全部殘基已改變。「主」文庫模擬天然主庫，多樣性局限於在種系V基因節段中多樣化(種系多樣性)或在重組過程中多樣化(連接多樣性)的抗原結合位點中心的殘基。多樣化的殘基包括但不限於H50、H52、H52a、H53、H55、H56、HS8、H95、H96、H97、H98、L50、L53、L91、L92、L93、L94和L96。在「體細胞」文庫中，多樣性局限於重組過程中多樣化(連接多樣性)的殘基或高度體細胞突變的殘基。多樣化的殘基包括但不限於H31、H33、H35、H95、H96、H97、H98、L30、L31、L32、L34和L96。已知列於以上的適於在這些文庫中多樣化的所有殘基都接觸一個或多個抗體抗原複合物。因為在兩個文庫中不是抗原結合位點中的所有殘基都改變，所以通過改變剩餘的殘基在選擇過程中加入另外的多樣性，假如需要這樣。對本領域技術人員顯而易見的是，任意這些殘基(或組成抗原結合位點的其它殘基)的任意部分都可用於初始和/或隨後的抗原結合位點多樣化。
在用於本發明的文庫構建中，通常通過改變編碼序列在核酸水平上實現選定位置的多樣化，所述編碼序列確定了多肽序列，使得可在該位置加入眾多可能的胺基酸(全部20種或其部分)。使用IUPAC命名法，大部分多用途密碼子為NNK，其編碼全部胺基酸以及TAG終止密碼子。優選使用NNK密碼子，以便導入需要的多樣性。獲得相同末端的其它密碼子也是有用的，包括NNN密碼子，其導致產生另外的終止密碼子TGA和TAA。
人抗體的抗原結合位點中側鏈多樣性的特徵在於傾向於某些胺基酸殘基的明顯偏倚。如果將VH、Vκ和Vλ區中每一個的10個最多樣化位置的胺基酸組成相加，則側鏈多樣性的76％以上來自僅7個不同殘基，這些殘基是絲氨酸(24％)、酪氨酸(14％)、天冬醯胺(11％)、甘氨酸(9％)、丙氨酸(7％)、天冬氨酸(6％)和蘇氨酸(6％)。這種偏倚傾向與可提供主鏈彈性的親水性殘基和小殘基，主鏈彈性可能反映了傾向於結合廣泛抗原或表位的表面的演化，並可能有助於解釋主庫中需要的抗體混雜性。
因為優選模擬該胺基酸分布，所以待改變位置的胺基酸分布優選模擬在抗體的抗原結合位點中觀察到的分布。在胺基酸置換中的這種偏倚允許相對於一系列靶抗原選擇某些多肽(不僅僅是抗體多肽)，容易應用於任意多肽庫。有多種偏倚待改變位置的胺基酸分布的方法(包括使用三核苷酸誘變，參見WO 97/08320)，其中的優選方法使用常規簡併密碼子，原因在於易於合成。通過對比由全部簡併密碼子組合編碼的胺基酸分布(在各個位置具有相等比率的單、雙、三和四重簡併性)和天然胺基酸選擇，有可能計算出最有代表性的密碼子。密碼子(AGT)(AGC)T、(AGT)(AGC)C和(AGT)(AGC)(CT)—即使用IUPAC命名法分別為DVT、DVC和DVY，是最接近於目標胺基酸譜的密碼子其編碼22％絲氨酸和11％酪氨酸、天冬醯胺、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸和半胱氨酸。因此，優選地，在各個多樣化位置使用DVT、DVC或30 DVY密碼子中的任一個構建文庫。
G能夠增加配體半壽期的抗原本發明的雙特異性配體以其一種構型能夠結合一個或多個可增加配體體內半壽期的分子。通常，這種分子是體內天然存在並抗降解或去除的多肽，該降解或去除通過除去機體不需要物質的內源機制進行。例如，增加生物體半壽期的分子可選自胞外基質蛋白；例如膠原蛋白、層纖連蛋白、整聯蛋白和纖連蛋白。膠原蛋白是胞外基質的主要蛋白。目前已知約15種類型的膠原蛋白分子，存在於機體的不同部分中，例如存在於骨、皮膚、腱、韌帶、角膜、內臟器官中的I型膠原蛋白(佔機體膠原蛋白的90％)或存在於軟骨、無脊椎動物椎間盤、脊索、眼的玻璃狀液中的II型膠原蛋白。
存在於血液中的蛋白，包括血漿蛋白，例如纖維蛋白、α-2巨球蛋白、血清白蛋白、纖維蛋白原A、纖維蛋白原B、血清澱粉樣蛋白A、七球蛋白、蛋白、泛素、子宮球蛋白和β-2-微球蛋白；酶和抑制劑，例如纖維蛋白溶酶原、溶菌酶、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、α-1-抗胰蛋白酶和胰腺kypsin抑制劑。纖維蛋白溶酶原是胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶纖維蛋白溶酶的失活前體。一般發現其在整個血流中循環。當纖維蛋白溶酶原變得有活性並轉變為纖維蛋白溶酶時，其展開溶解纖維蛋白原纖維的有效酶結構域，纖維蛋白原纖維將血塊中的血細胞纏在一起。這叫做血纖蛋白溶解。
免疫系統蛋白，例如IgE、IgG、IgM。
轉運蛋白，例如視黃醇結合蛋白、α-1微球蛋白。
防衛素，例如β-防衛素1、嗜中性粒細胞防衛素1、2和3。
存在於血腦屏障或神經組織中的蛋白，例如促黑激素受體、髓磷脂、抗壞血酸轉運體。
轉鐵蛋白受體特異性配體-神經藥物融合蛋白(參見US5977307)；腦軟骨內皮細胞受體、轉鐵蛋白、轉鐵蛋白受體、胰島素、胰島素樣生長因子1(IGF 1)受體、胰島素樣生長因子2(IGF 2)受體、胰島素受體。
定位於腎臟的蛋白，例如多囊蛋白、IV型膠原蛋白、有機陰離子轉運體K1、Heymann抗原。
定位於肝臟的蛋白，例如醇脫氫酶、G250。
血液凝血因子Xα-1抗胰蛋白酶
HNF1α定位於肺的蛋白，例如分泌成分(結合IgA)。
定位於心臟的蛋白，例如HSP 27。其與擴張型心肌病有關。
定位於皮膚的蛋白，例如角蛋白。
骨特異性蛋白，例如骨形態發生蛋白(BMP)，其是轉化生長因子β超家族的一小類，表現出成骨活性。
實例包括BMP-2、-4、-5、-6、-7(也稱為成骨蛋白(OP-1))和-8(OP-2)。
腫瘤特異性蛋白，包括人滋養層抗原、Herceptin受體、雌激素受體、組織蛋白酶，例如組織蛋白酶B(存在於肝和脾中)。
疾病特異性蛋白，例如僅在活化的T細胞上表達的抗原包括LAG-3(淋巴細胞活化基因)；骨保護素配體(OPGL)，參見Nature 402，304-309，1999；OX40(TNF受體家族的一員，在活化T細胞上表達，是已知在產生人T細胞白血病病毒I型(HTLV-I)的細胞中被明確上調的唯一共刺激T細胞分子)—參見J.Immunol.2000年1月1日；16561)263-70；金屬蛋白酶(與關節炎/癌症相關)，包括CG6512 Drosophila、人Paraplegin、人FtsH、人AFG3L2、鼠ftsH；血管生成生長因子，包括酸性成纖維細胞生長因子(FGF-1)、鹼性成纖維細胞生長因子(FGF-2)、血管內皮細胞生長因子/血管通透性因子(VEGF/VPF)、轉化生長因子-α(TGF-α)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、血管生成素、白介素-3(IL-3)、白介素-8(IL-8)、血小板衍化內皮細胞生長因子(PD-ECGF)、胎盤生長因子(PlGF)、中期因子血小板衍化生長因子-BB(PDGF)、Fractalkine。
應激蛋白(熱休克蛋白)HSP一般存在於胞內。當其在胞外存在時，其是細胞已死亡並溢出其內容物的指示劑。這種非程序性細胞死亡(壞死)僅在由於外傷、疾病、損傷的影響時才發生，並因此在體內由胞外HSP觸發免疫系統對抗感染和疾病的反應。結合胞外HSP的雙特異性可定位於患病部位。
參與Fc轉運的蛋白Brambell受體(也稱為FcRB)該Fc受體具有兩個功能，這兩個功能均可潛在地用於傳遞。這兩個功能是(1)穿過胎盤，將IgG由母親轉運至胎兒；(2)保護IgG免於降解，由此延長IgG的血清半壽期。一般認為受體由核內體回收IgG。參見Holliger等，Nat Biotechnol 1997年7月；15(7)632-6。
可設計對以上靶特異性的本發明配體，而不需要體內半壽期的任何增加。例如，本發明的配體可對選自前述的組織特異性靶是特異性的，由此允許結合組織特異性治療相關靶的雙特異性配體或dAb單體的組織特異性靶向，與半壽期的任何增加無關，儘管這種增加可能發生。而且，在配體或dAb單體靶向腎臟或肝臟的情況下，這可能將配體或dAb單體變向為另一種體內清除途徑(例如，配體可能脫離肝臟清除而轉向腎臟清除)。
增加體內半壽期的其它方法除了設計其中一種特異性針對增加抗體多肽構建物血清半壽期的靶蛋白的雙特異性配體之外，可通過連接至增加血清半壽期的化學部分進一步穩定如本文所述的抗體多肽。為了提供抗體分子藥代動力學的改善，本發明提供單結構域可變區多肽，該多肽連接至提供增加的穩定性和半壽期的聚合物。聚合物分子(例如聚乙二醇；PEG)與蛋白的連接沿用已久，已表明其調節所修飾蛋白的藥代動力學特性。例如，已表明蛋白的PEG修飾改變蛋白的體內循環半壽期、抗原性、溶解性和對蛋白水解的抗性(Abuchowski等，J.Biol.Chem.1977，2523578；Nucci等，Adv.Drug Delivery Reviews 1991，6133；Francis等，Pharmaceutical Biotechnology，第3卷，(Borchardt，R.T.編輯)；和Stability of Protein Pharmaceuticalsin vivo Pathways of Degradation andStrategies for Ptotein Stabilization 1991 235-263頁，Plenum，NY)。
蛋白分子的位點特異性和隨機PEG化在本領域是已知的(參見例如Zalipsky和Lee，Poly(ethylene glycol) ChemistryBiotechnical andBiomedical Applications1992，347-370頁，Plenum，NY；Goodson和Katre，1990，Bio/Technology，8343；Hershfield等，1991，PNAS887185)。更具體地說，業已描述了抗體分子在賴氨酸殘基處的隨機PEG化和硫醇化衍生物(Ling和Mattiasson，1983，Immunol.Methods 59327；Wilkinson等，1987，Immunol.Letters，1517；Kitamura等，1991，Cancer Res.514310；Delgado等，1996 Br.J.Cancer，73175；Pedley等，1994，Br.J. Cancer，701126)。
下文描述了PEG化方法。在2004年6月30日提交的共同待審申請PCT/GB2004/002829(指定U.S)和2004年1月8日提交的美國臨時申請第60/535,076號中也提供了抗體多肽(具體的說為dAb)的PEG化實例，這些專利的每一個都整體通過引用結合到本文中。
親合性/活性測定本文所述的分離的單結構域抗體(例如dAb)多肽具有至少300nM或以下的親合性(解離常數，Kd＝Koff/Kon)，優選至少300nM-50pM、200nM-50pM，更優選至少100nM-50pM、75nM-50pM、50nM-50pM、25nM-50pM、10nM-50pM、5nM-50pM、1nM-50pM、950pM-50pM、900pM-50pM、850pM-50pM、800pM-50pM、750pM-50pM、700pM-50pM、650pM-50pM、600pM-50pM、550pM-50pM、500pM-50pM、450pM-50pM、400pM-50pM、350pM-50pM、300pM-50pM、250pM-50pM、200pM-50pM、150pM-50pM、100pM-50pM、90pM-50pM、80pM-50pM、70pM-50pM、60pM-50pM乃至低至50pM。
可使用BIAcore系統(Pharmacia Biosensor，Piscataway，NJ.)通過表面等離子體共振(SPR)常規檢測可變結構域多肽的抗原結合親合性。在該方法中，抗原以已知濃度偶聯至BIAcore晶片，導入可變結構域多肽。可變結構域多肽與固定化抗原之間的特異性結合導致晶片基質上的蛋白濃度增加和SPR信號改變。SPR信號改變記錄為共振單位(RU)，並沿著Sensorgram的Y軸相對於時間顯示。基線信號採用通入晶片的單獨溶劑(例如PBS)。基線信號和可變結構域多肽注射後的信號之間的淨差代表給定樣品的結合值。為測定離開速率(Koff)、結合速率(Kon)和解離速率(Kd)常數，使用BIAcore動力學評定軟體(例如2.1版)。
高親合性取決於抗原表面與抗體或抗體片段的CDR之間的互補性。互補性由部分靶和CDR之間可能存在的分子相互作用的類型和強度決定，例如，潛在的離子相互作用、van der Waals引力、氫鍵鍵合或可能發生的其它相互作用。CDR3往往比CDR 1和2更促進抗原結合相互作用，原因可能在於其一般較大的尺寸，這提供了有利於表面相互作用的更多機會(參見例如Padlan等，1994，Mol.Immunol.31169-217；Chothia和Lesk，1987，J.Mol.Biol.196904-917；和Chothia等，1985，J.Mol.Biol.186651-663)。高親合性表明，單免疫球蛋白可變結構域/抗原配對具有高度互補性，該互補性與可變結構域和靶的結構直接相關。
可使用允許用多肽結構對接抗原的分子建模軟體，突出顯示賦予單免疫球蛋白可變結構域多肽對給定抗原的高親合性的結構。一般來說，可用多肽或其它已知結構的靶抗原的計算機模型對接已知親合性的單免疫球蛋白可變結構域結構的計算機模型，以確定相互作用表面。已知此已知相互作用的相互作用表面的結構，人們就可以預測可變結構域序列中的保守或不太保守的置換對相互作用強度的正面或負面影響，由此允許合理設計改進的結合分子。
多聚形式的抗體單可變結構域在一個方面，將本文所述的抗體多肽構建物(例如dAb)多聚化為例如異或同二聚體、異或同三聚體、異或同四聚體或更高級的異或同多聚體(例如異或同五聚體到八聚體)。多聚化可通過親合力作用增加抗原結合強度，其中結合強度與多個結合位點的結合親合性的總和相關。
通過表達例如通過肽接頭融合的單結構域抗體製備異和同多聚體，產生構型dAb-接頭-dAb或更多重的該排列。多聚體還可連接至另外的部分，例如增加血清半壽期的多肽序列或另一個效應子部分，例如毒素或靶向部分；例如PEG。任意接頭肽序列都可用於產生異或同多聚體，例如本領域用於產生scFv的接頭序列。一個通常有用的接頭包含重複的肽序列(Gly4Ser)n(SEQ ID NO7)，其中n＝1至約10(例如n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。例如，接頭可為(Gly4Ser)3(SEQ ID NO8)、(Gly4Ser)5(SEQ ID NO9)、(Gly4Ser)7(SEQ ID NO10)或另一個多重的(Gly4Ser)(SEQ ID NO7)序列。
作為通過肽序列連接的單體表達多聚體的替代方法是通過例如二硫鍵合或其它化學連接，翻譯後連接單體免疫球蛋白可變結構域。例如，工程改造例如在單體多肽C末端的游離半胱氨酸，使單體之間二硫鍵合。在該方面或需要游離半胱氨酸的其它方面，通過將半胱氨酸密碼子(TGT、TGC)納入鄰接dAb序列最後一個密碼子(對於C-末端半胱氨酸，引物中的序列實際上是反向互補的，即ACA或GCA，因為其將要摻入到下遊PCR引物中)和就在一個或多個終止密碼子之前的PCR引物中，導入半胱氨酸。如果有需要，可將接頭肽序列如(Gly4Ser)n(SEQ ID NO7)置於dAb序列和游離半胱氨酸之間。具有游離半胱氨酸殘基的單體的表達以約1∶1混合物產生單體和二聚化形式的混合物。使用凝膠層析(例如使用鹽梯度洗脫的離子交換層析)分離二聚化和單體。
或者，使用工程改造過的游離半胱氨酸，通過硫醇鍵將單體偶聯至多價化學接頭，例如三聚馬來醯亞胺分子(例如Tris[2-馬來醯亞胺乙基]胺，TMEA)或雙馬來醯亞胺PEG分子(得自例如Nektar(Shearwater))。
在一個實施方案中，本發明的同二聚體或異二聚體包括分別以C-末端胺基酸共價連接至免疫球蛋白CH1結構域或CK結構域的VH或VL結構域。因此，異或同二聚體可為Fab樣分子，其中抗原結合結構域含分別以其C末端共價連接至CH1和CK結構域的結合VH和/或VL結構域。另外或或者，本發明的dAb多聚體可基於表達大部分全功能、高特異性、無輕鏈序列的抗體的駱駝科物種建模。駱駝科重鏈抗體以單個重鏈藉助其恆定區二聚化的同二聚體存在。這些駱駝科重鏈抗體的可變結構域被稱為VHH結構域，當其作為VH鏈的片段分離時，保留以高特異性結合抗原的能力(Hamers-Casterman等，1993，Nature 363446-448；Gahroudi等，1997，FEBS Lett.414521-526)。因此，可使用本領域已知的方法和上述方法構建本發明的抗體單可變結構域多聚體，以使其具有駱駝科物種重鏈抗體的VHH構象。
抗體多肽的PEG化本發明提供PEG化的抗體多肽(例如dAb)單體和多聚體，相對於未PEG化的抗體多肽，其提供增加的半壽期，抗降解，而不損失活性(例如結合親合性)。
可使用本領域已知的方法，將本文所述的抗體多肽分子偶聯至用於獲得增加的半壽期和降解抗性特性的聚合物分子(優選PEG)。可用於本發明的聚合物部分可為合成的或天然的，包括但不限於直鏈或支鏈聚亞烷基、聚亞烯基或聚氧亞烷基聚合物，或分支或未分支的多糖，例如同多糖或雜多糖。可用於本發明的合成聚合物的優選實例包括直鏈或支鏈聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚乙烯醇及其衍生物或取代的形式。用於連接至本文所述抗體多肽的特別優選的取代聚合物包括取代的PEG，包括甲氧基(聚乙二醇)。除PEG以外可使用的或代替PEG使用的天然聚合物部分包括乳糖、直鏈澱粉、葡聚糖或糖原，以及本領域技術人員公認的其衍生物。衍化形式的聚合物分子包括例如其中存在的另外部分或反應基允許與本文描述的抗體多肽的胺基酸殘基相互作用的衍生物。這種衍生物包括N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)活性酯、琥珀醯亞胺丙酸酯聚合物和巰基選擇性反應物，例如馬來醯亞胺、乙烯碸和硫醇。特別優選的衍化聚合物包括但不限於具有下式的PEG聚合物PEG-O-CH2CH2CH2-CO2-NHS、PEG-O-CH2-NHS、PEG-O-CH2CH2-CO2-NHS、PEG-S-CH2CH2-CO-NHS、PEG-O2CNH-CH(R)-CO2-NHS、PEG-NHCO-CH2CH2-CO-NHS和PEG-O-CH2-CO2-NHS；其中R是(CH2)4)NHCO2(mPEG)。PEG聚合物可為線性分子，或者可為分支的，其中多個PEG部分以單個聚合物存在。可用於本發明的一些特別優選的PEG衍生物包括但不限於以下物質
反應基(例如MAL、NHS、SPA、VS或硫醇)可直接連接至PEG聚合物，或者可經接頭分子連接至PEG。
用於本發明的聚合物的尺寸可在500Da-60kDa之間，例如1000Da-60kDa、10kDa-60kDa、20kDa-60kDa、30kDa-60kDa、40kDa-60kDa，直到50kDa-60kDa之間。用於本發明的聚合物，具體地說為PEG，可為直鏈聚合物，或者可具有支鏈構象。根據分子量和構象的組合，聚合物分子當連接至抗體構建物(例如dAb)單體或多聚體時，產生平均流體動力學大小在24-500kDa之間的分子。本文使用的聚合物分子的流體動力學大小指分子(例如蛋白分子)的表觀尺寸，其基於分子在整個水性溶液中的擴散。可處理蛋白在整個溶液中的擴散或運動，以得到蛋白的表觀大小，其中尺寸通過蛋白顆粒的Stokes半徑或流體動力學半徑獲得。蛋白的「流體動力學大小」取決於質量和形狀(構象)這二者，使得具有相同分子質量的兩種蛋白可具有基於蛋白整體構象的不同流體動力學大小。PEG連接的抗體單可變結構域(包括本文描述的單結構域抗體多聚體))的流體動力學大小可在24kDa至500kDa、30-500kDa、40-500kDa、50-500kDa、100-500kDa、150-500kDa、200-500kDa、250-500kDa、300-500kDa、350-500kDa、400-500kDa和450-500kDa的範圍內。優選PEG化dAb的流體動力學大小為30-40kDa、70-80kDa或200-300kDa。因此，連接至抗體多肽(例如dAb或dAb多聚體)的聚合物分子的大小可有所變化，這取決於目的用途。例如，當要使PEG化dAb離開循環並進入外周組織時，需要將所連接聚合物的大小保持在低水平，以利於由血流中滲出。或者，當需要將PEG化dAb在循環中保持更長的時間周期時，可使用較高分子量的聚合物(例如30-60kDa的聚合物)。
可使用本領域眾所周知的方法，將用於本發明的聚合物(PEG)分子連接至抗體多肽構建物。將PEG或其它聚合物部分連接至本發明的抗體多肽單體或多聚體的第一步是含親電官能團取代PEG聚合物的羥基末端基團。具體地說，將PEG聚合物連接至抗體多肽單體或多聚物中存在的半胱氨酸或賴氨酸殘基。半胱氨酸和賴氨酸殘基可為天然的，或者可工程改造入抗體多肽分子中。例如，可將半胱氨酸殘基重組工程入dAb多肽的C末端，或者可用半胱氨酸或賴氨酸取代在dAb或其它抗體多肽中特定溶劑可接近位置處的殘基。在一個優選實施方案中，PEG部分連接至存在於本文所述的dAb單體或多聚體C末端鉸鏈區中的半胱氨酸殘基。
在一個實施方案中，PEG聚合物連接至存在於dAb的構架區(FW)和一個或多個異源CDR中的一個或多個半胱氨酸或賴氨酸殘基。CDR和構架區是具有免疫學重要性的蛋白序列Kabat資料庫中定義為免疫球蛋白可變結構域的區域(Kabat等，(1991)Sequences of proteins ofimmunological interest，美國健康和人類服務部)。在一個優選實施方案中，PEG聚合物連接至VH構架節段DP47或Vκ構架節段DPK9中的半胱氨酸或賴氨酸殘基。可連接至PEG的DP47的半胱氨酸和/或賴氨酸殘基包括SEQ ID NO1(圖21)中位置22或96的半胱氨酸和位置43、65、76或98的賴氨酸。可按照本發明連接至PEG的DPK9的半胱氨酸和/或賴氨酸殘基包括SEQ ID NO2(圖22)中位置23或88的半胱氨酸殘基和位置39、42、45、103或107的賴氨酸殘基。另外，VH規範構架區DP38或DP45中的特定半胱氨酸或賴氨酸殘基可連接至PEG。
另外，dAb分子中非天然半胱氨酸或賴氨酸殘基的特異性溶劑可接近位點可突變為用於連接PEG聚合物的半胱氨酸或賴氨酸。可使用本領域已知的方法，例如分析給定dAb的晶體結構，確定任意給定dAb單體或多聚體中的溶劑可接近殘基。例如，使用VHdAb HEL4(其結合雞蛋溶菌酶；參見下文)的已闡明的晶體結構，HEL4(SEQ ID NO5)的一級胺基酸序列。
1 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFRIS DEDMGWVRQA PGKGLEWVSS51 IYGPSGSTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCASAL101 EPLSEPLGFW GQGTLVTVSSVκ模擬物(SEQ ID NO6)的一級胺基酸序列。
1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS SYLNWYQQKP GKAPKLLIYA51 ASSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ SYSTPNTFGQ101 GTKVEIKR已鑑別出殘基Gln-12、Pro-41、Asp-62、Glu-89、Gln-112、Leu-115、Thr-117、Ser-119和Ser-120為溶劑可接近的，應是突變為用於連接PEG聚合物的半胱氨酸或賴氨酸殘基的有吸引力候選者。另外，使用Vκ模擬物dAb的已闡明的晶體結構(參見上文)，已鑑別出殘基Val-15、Pro-40、Gly-41、Ser-56、Gly-57、Ser-60、Pro-80、Gly-71、Gln-100、Lys-107和Arg-108為溶劑可接近的，應是突變為用於連接PEG聚合物的半胱氨酸或賴氨酸殘基的有吸引力候選者。在一個實施方案中，PEG聚合物連接至多個溶劑可接近的半胱氨酸或賴氨酸殘基，或連接至已突變為半胱氨酸或賴氨酸殘基的溶劑可接近殘基。或者，在特定的抗體多肽構建物僅具有一個溶劑可接近的半胱氨酸或賴氨酸(或修改為半胱氨酸或賴氨酸的殘基)的情況下，或在特定溶劑可接近的殘基選自若干個這種PEG化殘基的情況下，僅一個溶劑可接近殘基連接至PEG。
Nektar公司(SanCarlos，CA)提供了幾種用於本發明的連接方案。例如，當需要將PEG或其它聚合物連接至賴氨酸殘基時，可使用已用N-羥基琥珀醯亞胺(例如琥珀醯亞胺丙酸酯)衍化的PEG聚合物的活性酯。當要連接至半胱氨酸殘基時，可使用已用巰基選擇性試劑(例如馬來醯亞胺、乙烯碸或硫醇)衍化的PEG聚合物。可用於按照本發明產生PEG化dAb的PEG衍生物的特定實施方案的其它實例可見於Nektar目錄(可在全球資訊網上nektar.com處獲得)。另外，可按照本發明使用幾種衍化形式的PEG，以利於PEG聚合物與本發明的dAb單體或多聚體的連接。用於本發明的PEG衍生物包括但不限於PEG-琥珀醯亞胺琥珀酸酯、尿烷連接的PEG、PEG苯碳酸酯、PEG琥珀醯亞胺碳酸酯、PEG-羧甲基疊氮化物、二甲基馬來酸酐PEG、PEG二硫代碳酸酯衍生物、PEG-三氟乙磺酸酯(2，2，2-三氟乙磺酸酯)、mPEG亞氨酯以及如Zalipsky和Lee，(1992)(「Use of functionalizedpoly(ethylene glycol)s for modification of peptides」，載於Poly(EthyleneGlycol)ChemistryBiotechnical and Biomedical Applications，J.MiltonHarris編輯，Plenum Press，NY)所述的其它PEG衍生物。
在以上實施方案的每一個中，PEG聚合物都可連接至存在於抗體多肽構建物肽中的任意適合殘基，或優選地，可將構建物的一個或多個殘基修飾或突變為半胱氨酸或賴氨酸殘基，然後可使用其作為PEG聚合物的連接點。優選地，以此方式修飾的殘基為溶劑可接近殘基；即當抗體多肽構建物為其天然摺疊構型時水性環境和衍化PEG聚合物能夠接近的殘基。一旦這些殘基中的一個或多個按照本發明突變為半胱氨酸殘基，其就可用於使用線性或分支的MAL衍化PEG(MAL-PEG)的PEG連接。
在一個實施方案中，提供含抗體單可變結構域和PEG聚合物的抗體構建物，其中PEG聚合物與抗體單可變結構域的比率為至少0.25∶1的摩爾比率。在另一個實施方案中，PEG聚合物與抗體單可變結構域的摩爾比率為0.33∶1或更高。在再另一個實施方案中，PEG聚合物與抗體單可變結構域的摩爾比率為0.5∶1或更高。
H本文所述的配體的用途1)本發明第二種構型的多特異性配體的用途本發明第二種構型方法的多特異性配體可用於體內治療和預防用途、體外和體內診斷用途、體外實驗和試劑用途等。例如，抗體分子可按照本領域技術人員已知的方法用於抗體型實驗技術，例如μELISA技術。
如上所示，本發明的特異性配體可用於診斷、預防和治療方法。本發明的特異性配體在利用標準免疫組化方法的蛋白質分析和原位蛋白檢測中具有診斷用途；為用於這些用途，可按照本領域已知的技術標記配體。另外，這種抗體多肽當複合至層析支持體如樹脂時，可製備性地用於親合層析方法。所有這些技術都是本領域技術人員眾所周知的。
本發明的封閉構象的多特異性配體的診斷用途包括用於分析的均相實驗，該實驗利用了封閉構象的多特異性配體競爭結合兩個靶使得兩個靶不能同時結合(封閉構象)的能力，或其同時結合兩個靶的能力(開放構象)。
用於藥物開發和發展的診斷和研究實驗系統生產商一直渴望尋找真正的均相免疫實驗形式。主要的診斷市場包括醫院、醫務室和診所、商業基準實驗室、血庫和家庭中的人體測試、非人診斷(例如食品檢驗、水檢驗、環境檢驗、生物防禦和獸醫檢驗)和最後的研究(包括藥物開發、基礎研究和學術研究)。
目前，所有這些市場都利用圍繞著化學發光、ELSIA、螢光或不常用的放射免疫實驗技術建立的免疫實驗系統。這些實驗形式的每一個均需要分離步驟(分離結合的和未結合的試劑)。在某些情況下，需要幾個分離步驟。增加這些額外的步驟增加試劑和自動化操作、耗費時間和影響實驗的最終結果。在人診斷中，分離步驟可自動化，其掩蓋了問題，但不能去除問題。機器人技術、額外的試劑、額外的溫育時間等增加了可觀的成本和複雜性。在藥物開發中，例如其中用非常低水平的測試分子一次檢測差不多數百萬樣品的高通量篩選，加入額外的分離步驟可消除進行篩選的能力。但是，取消分離在讀數結果中產生太多的噪音。因此，需要真正的均相形式，其在由該實驗形式可獲得的範圍內提供靈敏度。有利地，實驗具有完全定量的讀數結果，具有高靈敏度和大動力學範圍。靈敏度是一個重要要求，其降低了需要的樣品量。這兩個特徵是均相系統提供的特徵。這對小心檢驗和其中樣品珍貴的藥物開發而言非常重要。本領域目前可利用的多相系統需要大量的樣品和昂貴的試劑。
均相實驗的應用包括癌症測試，其中最大的實驗是用於前列腺特異性抗原的實驗，該實驗用於篩選前列腺癌男性。其它應用包括生育力檢驗，其為嘗試懷孕的婦女提供一系列檢驗，包括妊娠β-hcg。感染性疾病檢驗，包括肝炎、HIV、風疹以及其它病毒和微生物和性傳播疾病。血庫使用檢驗，尤其是HIV檢驗、甲型、乙型、丙型、非甲非B型肝炎檢測。治療型藥物監測檢驗包括監測處方藥物在患者中有效和避免毒性的水平，所述毒性例如為地高辛對心律失常的毒性，以及精神病病例中的苯巴比妥水平；茶鹼對於哮喘的毒性。而且，診斷實驗可用於濫用藥物檢驗，例如用於古柯鹼、大麻等的檢驗。代謝檢驗用於檢測甲狀腺功能、貧血和其它生理學障礙和功能。
而且，均相免疫實驗形式可用於標準臨床化學實驗的生產。在同一儀器上納入免疫實驗和化學實驗在診斷測試中是高度有利的。合適的化學實驗包括測試葡萄糖、膽固醇、鉀等。
均相免疫實驗的另外的主要應用是藥物發現和開發高通量篩選包括在超高體積中相對於靶檢驗組合化學文庫。檢測信號，然後將陽性組分成較小的組，最後在細胞中檢驗，然後在動物中檢驗。均相實驗可用於所有這些類型的檢驗。在藥物開發中，尤其是在動物研究和臨床實驗中，大量使用免疫實驗。均相實驗極大地加速和簡化了這些方法。其它應用包括食品和飲料檢驗檢驗肉和其它食物的大腸桿菌、沙門氏菌等；水檢驗，包括檢驗水生植物中所有類型的汙染物，包括大腸桿菌；和獸醫檢驗。
在廣義的實施方案中，本發明提供結合實驗，其包含結合至本發明的封閉構象的多特異性配體的可檢測物，通過將分析物結合至所述封閉構象的多特異性配體改變可檢測物的可檢測特性。這種實驗可以幾種不同方式配置，每種方式均利用封閉構象的多特異性配體的上述特性。
實驗依賴於分析物對可檢測物的直接或間接取代，使可檢測物的可檢測特性產生變化。例如，當可檢測物為能夠催化具有可檢測終點的反應的酶時，所述酶可被其配體結合，達到阻礙其活性位點的程度，由此使酶失活。也被封閉構象的多特異性配體結合的分析物置換酶，通過釋放活性位點使酶活化。然後酶能夠與底物反應，產生可檢測事件。在一個替代實施方案中，配體可結合活性位點外部的酶，影響酶的構象，由此改變其活性。例如，配體結合可限制活性位點結構，或者可防止活性必須的輔因子結合。
實驗的物理儀器可採用本領域已知的任何形式。例如，可在測試條上提供封閉構象的多特異性配體/酶複合物；可在測試條的不同區域提供底物，允許含分析物的溶劑遷移通過配體/酶複合物，取代酶，並將其帶入底物區，以產生信號。或者，可在測試棒或其它固相上提供配體/酶複合物，並浸在分析物/底物溶液中，在存在的分析物作用下將酶釋放入溶液中。
因為分析物的各個分子潛在地釋放一個酶分子，實驗是定量地，在給定時間產生的信號強度取決於溶液中的分析物濃度。
使用封閉構象的分析物的其它構型是可能的。例如，可設計封閉構象的多特異性配體，以在變構位點結合酶，由此活化酶。在此實施方案中，酶在沒有分析物時有活性。加入分析物取代酶，去除變構活化，由此失活酶。
在以上使用酶活性作為分析物濃度檢測方法的實施方案背景下，酶的活化或失活指酶活性的增加或降低，檢測為酶催化信號產生反應的能力。例如，酶可催化不可檢測的底物向其可檢測形式的轉變。例如，辣根過氧化物酶與市售的產色或化學發光底物一起廣泛用於本領域。酶活性增加或降低的水平可在10％-100％之間，例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％；在活性增加的情況下，增加可超過100％，即200％、300％、500％或更高，或者如果受抑制酶的基線活性不可檢測的話，則可能不可以百分率檢測。
在另外的構型中，封閉構象的多特異性配體可結合酶/底物對的底物，而不是酶。因此底物不可用於酶，直至通過分析物結合由封閉構象的多特異性配體中釋放出來。該構型的實現如同結合酶的構型的實現。
而且，可配置實驗，以結合螢光分子，例如螢光素或另一種螢光團，其構象使螢光在結合至配體時被猝滅。在此情況下，分析物與配體的結合將取代螢光分子，由此產生信號。用於本發明的螢光分子的替代品包括發光劑，例如螢光素/螢光素酶，以及發色劑，例如通常用於免疫實驗的物質，例如HRP。
按照本發明製備的多特異性配體的治療和預防用途包括將本發明的配體給予接受哺乳動物，例如人。多特異性可允許抗體以高親合力結合多聚抗原。多特異性配體可允許兩個抗原交聯，例如在募集細胞毒性T細胞時，以介導腫瘤細胞系的殺傷。
至少90-95％均一性的基本純的配體或其結合蛋白，例如dAb單體，優選給予哺乳動物，98-99％或更高均一性最優選用於藥用用途，尤其是在哺乳動物為人時。一旦部分地純化或純化至需要的均一性，可診斷性或治療性地(包括離體地)使用配體，或在開發和實施實驗方法、免疫螢光染色等時使用配體(Lefkovite和Pernis，(1979和1981)Immunological Methods，第I和II卷，Academic Press，NY)。
本發明的配體或其結合蛋白，例如dAb單體，通常可用於預防、抑制或治療炎性狀態、變態超敏反應、癌症、細菌或病毒感染和自身免疫疾病(其包括但不限於I型糖尿病、哮喘、多發性硬化、類風溼性關節炎、系統性紅斑狼瘡、Crohn病和重症肌無力)。
除了類風溼性關節炎以外，本文描述的抗-TNF-α多肽可用於治療自身免疫病，例如(括號中表示被感染的器官)但不限於Addison病(腎上腺)、耳的自身免疫病(耳)、眼的自身免疫病(眼)、自身免疫性肝炎(肝)、自身免疫性腮腺炎(腮腺)、Crohn病和炎性腸病(小腸)、I型糖尿病(胰腺)、附睪炎(附睪)、腎小球性腎炎(腎臟)、甲狀腺機能亢進(甲狀腺)、Guillain-Barre綜合症(神經細胞)、Hashimoto病(甲狀腺)、溶血性貧血(紅細胞)、系統性紅斑狼瘡(多個組織)、男性不孕症(精子)、多發性硬化(神經細胞)、重症肌無力(神經肌肉接點)、天皰瘡(主要是皮膚)、銀屑病(皮膚)、風溼熱(心臟和關節)、結節病(多個組織和器官)、硬皮病(皮膚和結締組織)、Sjogren綜合症(外分泌腺和其它組織)、脊柱關節病(中軸骨和其它組織)、甲狀腺炎(甲狀腺)、潰瘍性結腸炎(小腸)和血管炎(血管)。除了類風溼性關節炎和其它慢性炎病(例如Crohn病、銀屑病等)以外，本文所述的抗VEGF多肽可用於治療糖尿病、急性骨髓性白血病、白血病和眼科疾病，包括黃斑變性和糖尿病視網膜病。
在本申請中，術語『預防』包括在誘發疾病前給予保護性組合物。「抑制」指在誘導事件以後但在臨床表現出疾病之前給予組合物。
可獲得可用於篩選抗體或其結合蛋白在保護以免於患病或治療疾病方面的有效性的動物實驗模型。在易感小鼠中檢驗系統性紅斑狼瘡(SLE)的方法是本領域已知的(Knight等，(1978)J.Exp.Med.，1471653；Reinersten等，(1978)New Eng.J.Med.，299515)。通過用另一個物種的可溶性AchR蛋白誘發疾病在SJL/J雌性小鼠中檢驗重症肌無力(MG)(Lindstrom等，(1988)Adv.Immurzol.，42233)。通過注射II型膠原蛋白在易感小鼠品系中誘發關節炎(Stuart等，(1984)Ann.Rev.Immunol.，42233)。業已描述了通過注射分支桿菌熱休克蛋白在易感大鼠中誘發佐劑關節炎的模型(Van Eden等，(1988)Nature，331171)。通過給予所述的甲狀腺球蛋白在小鼠中誘發甲狀腺炎(Maron等，(1980)J.Exp.Med.，1521115)。胰島素依賴性糖尿病(IDDM)天然發生，或者可如Kanasawa等，(1984)Diabetologia，27113所述在某些小鼠品系中誘發。小鼠和大鼠中的EAE用作人中的MS模型。在該模型中，通過給予髓鞘鹼性蛋白誘發脫髓鞘病(參見Paterson(1986)Textbookof Immuopathology，Mischer等編輯，Grune and Stratton，New York，179-213頁；McFarlin等，(1973)Science，179478；和Satoh等，(1987)J.Immunol.，138179)。
一般來說，本發明的配體將以純化的形式與藥學上適宜的載體一起使用。通常，這些載體包括水性或含醇/水的溶液、乳濁液或懸浮液，其中任一個均包含鹽水和/或緩衝介質。腸道外載體包括氯化鈉溶液、Ringer葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉以及乳酸化Ringer。需要在懸浮液中保持多肽複合物時，可從增稠劑如羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、明膠和海藻酸鹽中選擇適宜的生理可接受輔藥。
靜脈內載體包括流體和營養補充物以及電解質補充物，例如基於Ringer葡萄糖的載體。還可存在防腐劑和其它填加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體(Mack，(1982)Remington′sPharmaceutical Sciences，第16版)。
本發明的配體可作為單獨給予的組合物使用，或與其它物質聯用。這些物質可包括各種免疫治療藥物，例如環孢菌素、氨甲蝶呤、阿黴素或順鉑，以及免疫毒素。藥物組合物可包括各種細胞毒性劑或其它物質連同本發明配體、乃至具有不同特異性的本發明配體組合(例如使用不同靶抗原或表位選擇的配體)的「混合物」，無論它們在給予前是否混合。
本發明的藥用組合物的給予途徑可為本領域一般技術人員通常已知的給予途徑中的任一種。就治療(包括但不限於免疫治療)而言，可按照標準技術將本發明的其選定配體給予任何患者。給予可為任意適宜方式，包括胃腸外、靜脈內、肌內、腹膜內、透皮、經肺部途徑，或此外在適宜時通過用導管直接灌輸。給予的劑量和頻率取決於患者的年齡、性別和身體狀況、其它藥物的同時給予、禁忌和其它臨床要考慮的參數。
正如技術人員所認識到的，給予途徑和/或方式取決於需要的結果。在某些實施方案中，可用保護化合物免遭快速釋放的載體製備活性化合物，例如控釋製劑，包括植入劑、透皮貼片和微囊化傳遞系統。單結構域抗體構建物完全適於配製成延長釋放的製劑，部分原因在於其小尺寸一每劑量的摩爾數可顯著高於例如完全大小抗體的劑量。可使用生物可降解、生物相容性聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。通過將延遲吸收的物質(例如一硬脂酸鹽和明膠)納入組合物中，可產生延遲吸收的注射組合物。製備這種製劑的許多方法都已取得專利，或者一般來說是本領域技術人員已知的。參見例如Sustained and ControlledRelease Drug Delivery Systems，J.R.Robinson編輯，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。適用於控制釋放或延長釋放多肽物質(例如本文公開的單免疫球蛋白可變結構域多肽)的其它方法描述於例如美國專利第6,306,406和6,346,274號，以及例如描述於美國專利申請US20020182254和US20020051808，這些文獻全部通過引用結合到本文中。
本文描述的配體可凍幹儲存，在使用前用合適的載體重建。已表明該技術對常規免疫球蛋白有效，可使用本領域已知的凍幹技術和重建技術。本領域技術人員會意識到，凍幹和重建可導致不定程度的抗體活性損失(例如就常規免疫球蛋白而言，IgM抗體往往具有比IgG抗體大的活性損失)，為了補償，不得不上調使用水平。
可給予含本發明配體或其混合物的組合物，用於預防性和/或治療性治療。在某些治療性應用中，足以實現對所選定細胞群的至少部分抑制、阻遏、調節、殺傷或一些其它可檢測參數的量被定義為「治療有效劑量」。獲得該劑量所需的量取決於疾病的嚴重性和患者自身免疫系統的一般狀態，但一般來說在0.005-5.0mg配體(例如抗體、受體(例如T細胞受體)或其結合蛋白)/kg體重之間，更通常使用0.05-2.0mg/kg/劑的劑量。對於預防性應用來說，還可以以相似或稍微降低的劑量給予含本發明配體或其混合物的組合物。
如果使用本文描述的組合物實施的治療使一種或多種症狀相對於治療之前存在的這種症狀或者相對於未用這種組合物治療的個體中的這種症狀減輕(例如達至少10％或臨床評價等級上的至少一個點)，則認為這種治療是「有效的」。症狀將明顯隨目標疾病或障礙而變化，但可由普通臨床醫師或技術人員檢測。例如可通過監測疾病或障礙的一種或多種生物化學指標的水平(例如與疾病相關的酶或代謝物的水平、被感染細胞數等)、監測身體表現(例如炎症、腫瘤大小等)或通過公認的臨床評價標準，例如擴展殘疾狀態評分(用於多發性硬化)、Irvine炎性腸病調查表(評價與腸功能、身體症狀、社會功能、情緒狀況有關的生活質量的32點評測一記分由32至224，較高的記分代表較好的生活質量)、類風溼性關節炎生活質量標準或本領域已知的其它公認臨床評價標準，檢測這種症狀。疾病或障礙症狀持續(例如1天或以上，優選更長)減輕達至少10％或達給定臨床評級上的一個或多個點，表明為「有效」治療。同樣，如果使用本文所述的組合物實施的預防使一種或多種症狀的發作或嚴重性相對於未用組合物治療的相似個體(人或動物模型)中的症狀延遲、減輕或消除，則該預防是「有效的」。
可在預防和治療背景下利用含本發明的配體或其混合物的組合物，以幫助改變、滅活、殺傷或去除哺乳動物中的選定靶細胞群。另外，本文描述的選定多肽庫可離體或體外使用，用於選擇性殺傷、減少或相反地由非均一性細胞收集物中有效取出靶細胞群。哺乳動物血液可離體與配體(例如抗體、細胞表面受體或其結合蛋白)組合，由此殺傷不需要的細胞，或相反，將其由血液中取出，用於按照標準技術返回到哺乳動物中。
2增強半壽期的本發明雙特異性配體的用途按照本發明方法的雙特異性配體可用於體內治療和預防用途、體內診斷用途等。
按照本發明製備的雙特異性配體的治療和預防用途包括將本發明的配體給予接受哺乳動物，例如人。本發明的雙特異性抗體包含至少一種對半壽期增強分子的特異性；一種或多種其它特異性可針對靶分子。例如，雙特異性IgG可為4種表位特異性的，其中一種特異性針對半壽期增強分子。雙特異性可允許抗體以大親合力結合多聚抗原。雙特異性抗體可允許兩種抗原交聯，例如在募集細胞毒性T細胞時，以介導腫瘤細胞系的殺傷。
優選給予哺乳動物至少90-95％均一性的基本純的配體或其結合蛋白，例如dAb單體，98-99％或更高均一性最優選用於藥用用途，尤其是在哺乳動物為人時。一旦部分地純化或純化至需要的均一性，可診斷性或治療性地(包括離體地)使用配體，或在開發和實施實驗方法、免疫螢光染色等時使用配體(Lefkovite和Pernis，(1979和1981)Immunological Methods，第I和II卷，Academic Press，NY)。
本發明的配體通常可用於預防、抑制或治療炎性狀態、變態超敏反應、癌症、細菌或病毒感染和自身免疫疾病(其包括但不限於I型糖尿病、多發性硬化、類風溼性關節炎、系統性紅斑狼瘡、Crohn病和重症肌無力)。
可獲得動物模型系統，其可用於篩選雙特異性配體在保護免於患病或治療疾病方面的有效性。在易感小鼠中檢驗系統性紅斑狼瘡(SLE)的方法是本領域已知的(Knight等，(1978)J.Exp.Med.，1471653；Reinersten等，(1978)New Eng.J.Med.，299515)。通過用另一個物種的可溶性AchR蛋白誘發疾病在SJL/J雌性小鼠中檢驗重症肌無力(MG)(Lindstrom等，(1988)Adv.Immurzol.，42233)。通過注射II型膠原蛋白在易感小鼠品系中誘發關節炎(Stuart等，(1984)Ann.Rev.Immunol.，42233)。業已描述了通過注射分支桿菌熱休克蛋白在易感大鼠中誘發佐劑關節炎的模型(Van Eden等，(1988)Nature，331171)。通過給予所述的甲狀腺球蛋白在小鼠中誘發甲狀腺炎(Maron等，(1980)J.Exp.Med.，1521115)。胰島素依賴性糖尿病(IDDM)天然發生，或者可在例如Kanasawa等，(1984)Diabetologia，27113所述的某些小鼠品系中誘發。小鼠和大鼠中的EAR用作人中的MS模型。在該模型中，通過給予髓鞘鹼性蛋白誘發脫髓鞘病(參見Paterson(1986)Textbook of Immuopathology，Mischer等編輯，Grune and Stratton，NewYork，179-213頁；McFarlin等，(1973)Science，179478；和Satoh等，(1987)J.Immunol.，138179)。
本發明的雙特異性配體和dAb單體能夠結合參與胞吞作用的胞外靶(例如網格蛋白)，這些靶能使雙特異性配體被胞吞，能使能夠結合胞內靶的另一種特異性被傳遞入胞內環境。這種策略需要具有能夠使其在細胞內保留功能的物理特性的雙特異性配體。或者，如果最終的目標胞內區室正在氧化，則良好摺疊的配體可能不必是無二硫鍵的。
一般來說，本發明的雙特異性配體將以純化的形式與藥學上適宜的載體一起使用。通常，這些載體包括水性或含醇/水的溶液、乳濁液或懸浮液，其中任一個均包括鹽水和/或緩衝介質。胃腸外載體包括氯化鈉溶液、Ringer葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉以及乳酸化Ringer。如果需要保持多肽複合物在懸浮液中，可由增稠劑如羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、明膠和海藻酸鹽中選擇適宜的生理學可接受輔藥。靜脈內載體包括流體和營養補充物以及電解質補充物，例如基於Ringer葡萄糖的載體。還可存在防腐劑和其它填加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體(Mack，(1982)Remington′sPharmaceutical Sciences，第16版)。
本發明的配體可作為單獨給予的組合物使用，或與其它物質聯用。這些物質可包括各種免疫治療藥物，例如環孢菌素、氨甲蝶呤、阿黴素或順鉑，以及免疫毒素。藥物組合物可包括各種細胞毒性劑或其它物質連同本發明配體的「混合物」。
本發明的藥用組合物的給予途徑可為本領域一般技術人員通常已知的給予途徑中的任一種。就治療(包括但不限於免疫治療)而言，可按照標準技術將本發明的配體給予任意患者。給予可為任意適宜方式，包括胃腸外、靜脈內、肌內、腹膜內、透皮、經肺部途徑或者適宜時通過用導管直接灌輸。給予的劑量和頻率取決於患者的年齡、性別和身體狀況、其它藥物的同時給予、禁忌和臨床要考慮的其它參數。
本發明的配體可凍幹儲存，在使用前用合適的載體重建。已經表明，該技術對常規免疫球蛋白有效，可使用本領域已知的凍幹技術和重建技術。本領域技術人員會意識到，凍幹和重建可導致不定程度的抗體活性損失(例如就常規免疫球蛋白而言，IgM抗體往往具有比IgG抗體大的活性損失)，為了補償，不得不上調使用水平。
可給予含本發明配體或其混合物的組合物，用於預防性和/或治療性治療。在某些治療性應用中，足以實現對所選定細胞群的至少部分抑制、阻遏、調節、殺傷或一些其它可檢測參數的量被定義為「治療有效劑量」。獲得該劑量所需的量取決於疾病的嚴重性和患者自身免疫系統的一般狀態，但一般來說在0.005-5.0mg配體/kg體重之間，更通常使用0.05-2.0mg/kg/劑的劑量。對於預防性應用來說，還可以以相似或稍微降低的劑量給予含本發明配體或其混合物的組合物。
可在預防和治療背景下利用含本發明的配體的組合物，以幫助改變、滅活、殺傷或去除哺乳動物中的選定靶細胞群。
另外，本文描述的選定多肽庫可離體或體外選擇性殺傷、減少或相反地由非均一性細胞收集物中有效取出靶細胞群。哺乳動物血液可離體與配體(例如抗體、細胞表面受體或其結合蛋白)組合，由此殺傷不需要的細胞，或相反，將其由血液中取出，用於按照標準技術返回到哺乳動物中。僅為了說明目的，在以下實施例中進一步描述了本發明。為了給dAb命名的目的，本文使用的人TNF-α被稱為TAR1，人TNFα受體1(p55受體)被稱為TAR2。
3.類風溼性關節炎的治療在一個優選實施方案中，本文所述配體可用於治療類風溼性關節炎。
在一個方面，本發明提供治療類風溼性關節炎的方法，其包括使用一種或多種單結構域抗體多肽構建物，其中一種或多種構建物拮抗人TNFα與受體的結合。本發明包括含一種或多種拮抗人TNFα與受體結合的單結構域抗體多肽構建物和雙特異性配體的組合物，在雙特異性配體中，配體的一種特異性是針對TNFα的單結構域抗體，第二種特異性是針對VEGF或HSA的單結構域抗體。本發明進一步包括雙特異性配體，其中配體的一種特異性針對VEGF，第二種特異性針對HSA。
在一個實施方案中，本發明提供治療類風溼性關節炎的方法，其包括給予含一種或多種單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中一種或多種構建物拮抗人TNFα與受體的結合，和/或當給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時防止關節炎記分增加，和/或在L929細胞毒性實驗中中和TNF-α。具體地說，治療關節炎的方法包括給予含一種或多種單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中一種或多種構建物拮抗人TNFα與受體的結合，其中給予Tg197轉基因小鼠組合物防止關節炎記分增加。
a)受體結合實驗治療類風溼性關節炎的配體可幹擾TNF-α與TNF-α受體的結合。受體可為分離的(通常為膜結合的)受體，或者其可為在體外或體內存在於細胞上的受體。
在下文的實施例6中描述了檢測TNF-α受體結合和配體對該結合的幹擾的實驗。這些實驗包括ELISA(實施例6，章節1.3.1)、BIAcore分析(實施例6，章節1.3.2)以及使用分離的(或膜結合的)受體(實施例6，章節1.3.3)和表達在培養細胞表面上的受體(實施例6，章節1.3.3)的生物化學受體結合實驗。
本文使用的術語「拮抗(受體的)結合」指給定抗體多肽構建物幹擾TNF-α(或VEGF或其它因子)與關連受體結合的能力和作用。使用一個或多個如本文所述的體外、細胞型或體內實驗檢測拮抗作用。因此，受體可為分離的、膜結合的或存在於細胞表面上。如果在構建物存在時檢測到的結合相比於沒有構建物時有統計學顯著的下降，則構建物幹擾或拮抗與關連受體(例如TNFR1、TNFR2、VEGFR1、VEGFR2)的結合。或者，如果在構建物存在時檢測到的結合相比於其不存在時有至少10％的下降，則構建物幹擾結合。
b)L929細胞毒性實驗用於類風溼性關節炎治療的配體可在L929細胞毒性實驗中幹擾TNF-α的細胞毒性作用。該實驗描述於實施例6的章節1.3.3，其基於Evans等，2000，Molecular Biotechnology 15243-248描述的實驗。用於治療類風溼性關節炎的抗TNF-α配體可在該細胞實驗中中和TNF-α的活性。
本文使用的術語「中和」當用於指本文所述的抗體或dAb多肽時，指多肽幹擾靶抗原的可檢測活性或功能。如果多肽將靶抗原的可檢測活性或功能降低達至少50％，優選至少60％、70％、80％、90％、95％或以上，一直到並包括100％抑制(即無可檢測的靶抗原作用或功能)，則多肽「中和」多肽。因此，當靶為TNF-α時，可使用本文所述的標準L929細胞殺傷實驗或通過檢測抗TNF-α多肽構建物抑制HUVEC上TNF-α誘導性ELAM-1表達的能力(該能力檢測TNF-α誘導的細胞活化)評價中和活性。
抗體多肽幹擾TNF-α的受體結合活性的其它實驗包括HeLa IL-8實驗，其也描述於實施例6的章節1.3.3。
c)體內實驗可使用Tg197轉基因小鼠關節炎模型評價本文描述的抗TNF-α配體的效力。Tg197小鼠是人TNF-球蛋白雜合基因的轉基因動物，雜合子在4-7周齡發展成具有與類風溼性關節炎相同的組織學特徵的慢性、進行性多關節炎(Keffer等，1991，EMBO J.104025-4031)。可通過評價關節活動性和關節腫脹對關節炎表型記分。可通過關節的X射線造影以及通過膝和踝/爪關節固定切片的組織病理學分析記分關節的關節炎表型。
如下實施實驗治療，以評價給定抗體多肽構建物的效力。
1)為測試抗體多肽構建物對關節炎的預防，如下治療動物a)將雜合Tg197小鼠分為具有相等數目的雄性和雌性的10隻動物小組。治療在3周齡時開始，每周腹膜內給予抗體多肽的PBS溶液，或在對照動物中給予單獨的PBS；b)每周稱小鼠重量；c)按照以下系統記分小鼠的關節炎宏觀表型病徵0＝無關節炎(正常外觀和屈曲狀態)，1＝輕度關節炎(關節扭曲)，2＝中度關節炎(腫脹，關節變形)，3＝重度關節炎(移動嚴重受損)。
應最佳地實施研究，以使個體得分對測試組是盲的。用於該實驗的優選抗體傳遞機制是IP注射。但是，實驗可採用皮下注射、IV注射(例如經尾靜脈)、肌內注射或口服、吸入或局部給予。
如果治療組的平均關節炎記分低於(依據統計學顯著量)僅載體的對照組的記分，則治療在Tg197模型系統中是有效的。如果平均關節炎記分比僅載體的對照動物低至少0.5單位、至少1.0單位、至少1.5單位或至少2單位，則治療也被認為是有效的。或者，如果在整個治療方案過程中平均關節炎記分保持在或低至0-0.25，則治療是有效的。
如果治療組中的平均關節炎記分在實驗過程中增加，但當與僅載體的對照相比時這種增加的啟動延遲，則治療在Tg197模型中是有效的。如果與僅載體的對照相比時治療組的平均關節炎記分增加的啟動延遲0.5周、至少1周、至少1.5周、至少2周或超過3周，則治療也被看作是有效的。
作為對宏觀表型記分的替代，可以治療過程中的不同間隔固定踝/爪和膝關節，並使用以下系統對其進行組織病理學分析0＝無可檢測的病理學；1＝滑膜增生和出現多形核白細胞浸潤；2＝血管翳和纖維組織形成以及病灶性軟骨下骨侵蝕；4＝廣泛的關節軟骨破壞和骨侵蝕。如果平均組織病理學記分低於(依據統計學顯著量)僅載體的對照組，則治療被認為是有效的。如果平均組織病理學記分比僅載體的對照組低至少0.5單位、至少1.0單位、至少1.5單位、至少2.0單位、至少2.5單位、至少3.0單位或至少3.5單位，則治療也被認為是有效的。或者，如果在整個治療方案過程中平均組織病理學記分保持在或低至0-0.5，則治療是有效的。
2)為測試抗體多肽構建物(抗TNF-α、抗VEGF等)對既有關節炎的作用，可如上所述對Tg197動物實施實驗，只是在6周齡開始治療，該時間是動物具有顯著關節炎表型的時間。記分和效力分析也如上所述。本文所述的抗TNF-αdAb構建物可在一個或多個所述模型系統中終止或逆轉既有關節炎的進展。
任一種形式的治療方法均包括單體、二聚體或其它多聚體形式的抗TNF-α(例如本文所述的抗TNF-αdAb)，單體、二聚體或其它多聚體形式的抗VEGF(例如本文所述的抗VEGF dAb，還包括駱駝科抗VEGF dAb)，雙特異性形式的抗TNF/抗VEGF，攜帶抗HSA、PEG或其它半壽期修改部分的單或雙特異性構建物。另外，本文描述的抗VEGF組合物可與其它抗TNF組合物(例如依那西普(Enbrel)、D2E7(Humira)和英利昔單抗(Remicade))組合給予。可使用例如細胞培養物和本文描述的體內模型系統評價這種聯合治療的有效性。
其它公認的關節炎動物模型包括膠原蛋白誘發的關節炎(CIA)，其由例如Horsfall等，1997，J.of Immunol.1595687描述，和姥鮫烷誘發的關節炎，其由例如Stasluk等，1997，Immunol.9081描述。抗VEGF多肽構建物有效性的實驗a)VEGF受體2結合實驗該方法描述了VEGF受體結合實驗，其用於檢測可溶性結構域抗體(dAb)阻止VEGF165結合VEGF受體2的能力。
VEGF是體外內皮細胞的特異性促分裂原和體內的有效血管生成因子，該蛋白在各種類型的腫瘤中高水平表達。其是45kDa的糖蛋白，作為同二聚體有活性。迄今為止，業已描述了5種通過可變mRNA剪接產生的不同同種型。其中同種型VEGF121和VEGF165是最豐富的。
VEGF對內皮細胞的特異性作用主要受到兩種類型的受體酪氨酸激酶(RTK)-VEGF R1(FIt-1)和VEGF R2(KDR/Flk-1)的調節。但是，似乎VEGF R2介導VEGF活性，例如促有絲分裂性、趨化性和誘導形態學變化，即便兩種受體都在結合VEGF時經歷磷酸化。
在該實驗中使用重組人VEGF R2/Fc嵌合體，其包含融合至人IgG1的Fc區的人VEGF R2胞外結構域。簡單地講，將受體捕獲在ELISA板上，然後封閉板，以防止非特異性結合。然後加入VEGF165和dAb蛋白的混合物，漂洗板，使用生物素化抗VEGF抗體和綴合HRP的抗生物素抗體檢測VEGF165結合的受體。使用比色底物顯色板，並讀取450nm的OD。如果dAb封閉VEGF與受體的結合，則無顏色可檢測。
如下實施實驗。以每孔100μl重組人VEGF R2/Fc(RD Systems，目錄號357-KD-050)的0.5μg/ml碳酸鹽緩衝液於4℃過夜包被96孔Nunc Maxisorp實驗板。用0.05％Tween/PBS漂洗孔3次，並用PBS漂洗3次。加入200μl/孔的2％BSA的PBS溶液，以封閉板，將板於室溫溫育最少1小時。
漂洗孔(如上所述)，然後將50μl/孔的純化dAb蛋白加入到每個孔，然後將50μl VEGF的6ng/ml稀釋液(終濃度3ng/ml)加入到每個孔，將板於室溫溫育2小時(用於上清液實驗；將80μl上清液加至各個孔，然後加入20μl的15ng/ml VEGF)。
應包括以下的對照0ng/ml VEGF(僅稀釋液)；3ng/ml VEGF(RD Systems，目錄號293-VE-050)；3ng/ml VEGF，含0.1μg/ml抗VEGF中和抗體(RD Systems，目錄號MAB293)。
漂洗板(如上所述)，然後加入100μl生物素化抗VEGF抗體(RDSystems，目錄號BAF293)的0.5μg/ml稀釋液，並於室溫溫育2小時。
漂洗孔(如上所述)，然後加入100μl綴合HRP的抗生物素抗體(1∶5000稀釋的稀釋液；Stratech，目錄號200-032-096)，然後於室溫溫育1小時。
漂洗孔(如上所述)，確保已去除了任何殘留的Tween-20，以限制隨後的過氧化物實驗中的背景，有助於防止實驗板孔中的氣泡，氣泡將產生不準確的OD讀數。
將100μl SureBlue 1-Compent TMB MicroWell過氧化物酶溶液加入至每個孔，將板置於室溫達20分鐘。由於結合HRP的標記綴合物與底物反應，顯現出深藍色的溶解性產物。通過加入100μl 1M鹽酸終止反應(藍色將變為黃色)。應在加入酸的30分鐘內，用96孔板讀數器讀取450nm的板OD。OD450nm與結合的鏈黴抗生物素蛋白-HRP綴合物的量成比例。
由對照獲得的預期結果如下0ng/ml VEGF應獲得＜0.15OD的低信號；3ng/ml VEGF應獲得＞0.5OD的信號；與0.1μg/ml中和抗體預溫育的3ng/ml VEGF應產生＜0.2OD的信號。
b)VEGF受體1結合實驗該實驗檢測VEGF165與VEGF R1的結合和dAb阻斷該相互作用的能力。
本文使用重組人VEGF R1/Fc嵌合體，其包含融合至人IgG1的Fc區的人VEGF R1胞外結構域。將受體捕獲在ELISA板上，然後封閉板，以防止非特異性結合。然後加入VEGF165和dAb蛋白的混合物，漂洗板，使用生物素化抗VEGF抗體和綴合HRP的抗生物素抗體檢測VEGF165結合的受體。使用比色底物顯色板，並讀取450nm的OD。如果dAb阻斷VEGF與受體的結合，則沒有顏色顯現。
如下實施實驗。以每孔100μl重組人VEGF Rl/Fc(RD Systems，目錄號321-FL-050)的0.1μg/ml碳酸鹽緩衝液於4℃過夜包被96孔Nunc Maxisorp實驗板。用0.05％Tween/PBS漂洗孔3次，並用PBS漂洗3次。
加入200μl/孔的2％BSA的PBS溶液，以封閉板，將板於室溫溫育最少1小時。
漂洗孔(如上所述)，然後將50μl/孔的純化dAb蛋白加入到每個孔。然後將50μl VEGF的1ng/ml稀釋液(終濃度500pg/ml)加入到每個孔，將板於室溫溫育1小時(上清液實驗；將80μl上清液加入至各個孔，然後加入20μl 2.5ng/ml的VEGF)。
應包括以下的對照0ng/ml VEGF(僅稀釋液)；500pg/ml VEGF；和500pg/ml VEGF，含1μg/ml抗VEGF中和抗體(RD Systems，目錄號MAB293)。
漂洗板(如上所述)，然後加入100μl生物素化抗VEGF抗體的50ng/ml稀釋液，並於室溫溫育1小時。
漂洗孔(如上所述)，然後加入100μl綴合HRP的抗生物素抗體(1∶5000稀釋的稀釋液)，然後於室溫溫育1小時。
漂洗板(如上所述)，確保已去除了任何殘留的Tween-20，以限制隨後的過氧化物酶實驗中的背景，有助於防止實驗板孔中的氣泡，氣泡將產生不準確的OD讀數。
將100μl SureBlue 1-Compent TMB Micro Well過氧化物酶溶液加入至每個孔，將板置於室溫達20分鐘。由於結合HRP的標記綴合物與底物反應，顯現出深藍色的溶解性產物。通過加入100μl 1M鹽酸終止反應(藍色將變為黃色)。應在加入酸的30分鐘內，用96孔板讀數器讀取450nm的板OD。OD450nm與結合的鏈黴抗生物素蛋白-HRP綴合物的量成比例。
由對照獲得的預期結果0ng/ml VEGF應獲得＜0.15OD的低信號；500pg/ml VEGF應獲得＞0.8OD的信號；與1μg/ml中和抗體預溫育的500pg/ml VEGF應產生＜0.3OD的信號。
c)用於VEGF活性的細胞型實驗該生物實驗檢測抗體多肽(例如dAb)和其它抑制劑中和VEGF誘導的HUVE細胞增殖的能力。將接種在96孔板中的HUVE細胞與預平衡的VEGF和dAb蛋白溫育72小時。然後使用細胞生存力染料檢測細胞數。
如下實施實驗。由未匯合的175cm2燒瓶胰蛋白酶化HUVE細胞。吸出培養基，用5ml胰蛋白酶清洗細胞，然後將細胞與2ml胰蛋白酶於室溫溫育5分鐘。一般通過對著手敲擊，輕柔地將細胞由燒瓶底部移開。然後將8ml誘導培養基加入到燒瓶中，抽吸細胞，以分離任何群集細胞。使用錐蟲藍染色計數存活細胞。
旋轉沉降細胞，用誘導培養基清洗2次，旋轉沉降細胞，在每次清洗後吸出培養基。在最後一次吸出後，將細胞稀釋至105細胞/ml(用誘導培養基)，並以100μl/孔平板接種入96孔板(10,000細胞/孔)中。將板於37℃溫育2小時以上，以允許細胞粘附。
將60μl dAb蛋白和含40ng/ml VEGF165(終濃度10ng/ml)的60μl誘導培養基加入到V型底的96孔板中，用薄膜密封。然後將dAb/VEGF混合物於37℃溫育0.5-1小時。
將dAb/VEGF板由培養箱中取出，向含HUVEC的板的每個孔加入100μl溶液(終體積200μl)。然後將該板回放到37℃培養箱中，放置至少72小時的一段時間。
對照孔包括含細胞但不含VEGF的孔；含細胞、中和性抗VEGF抗體的陽性對照和VEGF的孔；和僅含細胞和VEGF的對照孔。
通過加入20μl/孔Celltiter96試劑評價細胞存活力，將板於37℃溫育2-4小時，直至出現褐色。通過加入20μl/孔的10％(w/v)SDS終止反應。然後使用Wallac微板讀數器讀取490nm的吸光度。
將無VEGF的對照孔的吸光度由所有其它值中扣除。吸光度與細胞數成比例。含對照抗VEGF抗體的對照孔還應當表現出最小的細胞增殖。僅含VEGF的孔應當具有最大的細胞增殖。
d)用於VEGF活性的體內實驗還可在關節炎疾病的Tg197轉基因小鼠模型中檢驗抗VEGF多肽構建物(單體、多聚體或雙特異性或多特異性)的效力。給藥方案和記分與抗TNF-α多肽構建物的描述基本相同。
4.Crohn病的治療本文描述的抗TNF-α多肽可用於在人中治療Crohn病。在一個實施方案中，本發明提供治療其中涉及TNF-α的Crohn病或其它炎性腸病(IBD)的方法。該方法包括給予含一種或多種單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中一種或多種構建物拮抗人TNFα與受體的結合，和/或當在給予IBD的TnfΔARE轉基因小鼠模型的小鼠時防止急性或慢性炎性腸病記分的增加，和/或在L929細胞毒性實驗中中和TNF-α。具體地說，治療Crohn病或其它炎性腸病的方法包括給予含一種或多種單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中一種或多種構建物拮抗人TNFα與受體的結合，其中給予TnfΔARE轉基因小鼠組合物防止急性或慢性炎性腸病記分的增加或使記分減少。
Crohn病的TnfΔARE轉基因小鼠模型最初由Kontoyiannis等，1999，Immunity 10387-398描述；另參見Kontoyiannis等，2002，J.Exp.Med.1961563-1574。這些小鼠在TNF-αmRNA的3′AU富集元件(ARE)中具有被靶向的缺失突變。AU-富集元件參與保持低mRNA穩定性，其破壞導致鼠TNF-α在這些動物中過表達。動物出現與4-8周齡間開始出現與Crohn病明顯相似的IBD表型。基本組織病理學特徵包括絨毛變鈍和黏膜下炎症，具有普遍的PMN/巨噬細胞和淋巴細胞滲出液，繼續發展為斑駁狀整層發炎，出現淋巴樣聚合和未成熟的肉芽腫(Kontoyiannis等，2002，出處同上)。這些動物還出現關節炎表型，因此也可用於單獨地評價抗TNF-α治療對RA的效力。
在要評價治療在預防IBD中的效力時，以給定抗體多肽構建物的初始每周IP劑量在例如3周齡時開始治療。本領域技術人員可根據初始研究的結果選擇更高或更低頻率的給藥間隔。然後可按照Kontoyiannis等，2002，出處同上所述的標準等級監測動物的炎性腸病。按照以下等級以盲方式組織學評價迴腸的石蠟包埋小腸組織切片如下以最小8高倍視野(hpf)單獨地評價急性和慢性炎症—急性炎症記分0＝0-1多形核細胞(PMN)/hpf(PMN/hpf)；1＝黏膜內2-10PMN/hpf；2＝黏膜內11-20PMN/hpf；3＝黏膜內21-30PMN/hpf或擴展至鞘肌黏膜下11-20PMN/hpf；和4＝＞黏膜內30PMN/hpf或擴展至鞘肌黏膜下＞20PMN/hpf。慢性炎症記分0＝黏膜內0-10單核淋巴細胞(ML)/hpf(ML/hpf)；1＝黏膜內11-20ML/hpf；2＝黏膜內21-30ML/hpf或擴展至鞘肌黏膜下11-20ML/hpf；3＝黏膜內31-40ML/hpf或擴展至鞘肌黏膜下21-30ML/hpf或濾泡增生；和4＝＞黏膜內40ML/hpf或擴展至鞘肌黏膜下＞30ML/hpf或濾泡增生。通過相加各只小鼠的急性炎症或慢性炎症記分計算每隻小鼠的總疾病記分。
為評價治療對既有疾病的作用，治療可在6-8周齡時開始，以相同的方式進行記分。
如果治療動物中的平均組織病理學疾病記分低於(依據統計學顯著量)僅載體的對照組，則治療被認為是有效的。如果平均組織病理學記分比僅載體的對照組低至少0.5單位、至少1.0單位、至少1.5單位、至少2.0單位、至少2.5單位、至少3.0單位或至少3.5單位，則治療也被認為是有效的。或者，如果在整個治療方案過程中平均組織病理學記分保持在或低至0-0.5，則治療是有效的。
其它IBD模型包括例如BALB/c小鼠中的慢性結腸炎DSS(葡萄糖硫酸鈉)模型。DSS模型最初由Okayasu等，1990，Gastroenterology 98694-702描述，由Kojouharoff等，1997，Clin Exp.Immunol.107353-358改良(另參見指定美國的WO 2004/041862，其通過引用結合到本文中)。在7天治療和12天無DSS的恢復間隔的循環中，通過在其飲水中以5％w/v給予DSS處理重21-22g的BALB/c小鼠，以誘發慢性結腸炎。第4個恢復期可延長至12-21天，以表現出慢性炎症狀態，而不是以較短的恢復模擬的急性狀態。在最後的恢復期之後，給予抗體多肽治療，例如本文所述的抗TNF-α多肽。開始時推薦每周給予一次，但本領域技術人員可根據需要調整(尤其是例如評價具有不同半壽期修改部分的劑型時)。在治療當中每隔一段時間處死動物，解剖小腸，如本文所述或如Kojouharoff等，1997，出處同上所述評價組織病理學記分。
炎性腸病的其它動物模型包括直腸滴注2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS；Neurath等，1995，J.Exp.Med.1821281描述的方法；另參見美國專利6,764,838，其通過引用結合到本文中)誘發的慢性腸炎。可使用上述的相同標準進行組織病理學記分。
與其它抗TNF-α物質的對比本文公開了有效治療RA、Crohn病和其它TNF-α介導疾病的抗TNF-α dAb構建物。在一個方面，抗TNF-α dAb構建物的有效性大於或等於選自以下的物質的有效性依那西普(ENBREL)、英利昔單抗(REMICADE)和D2E7(HUMIRA；參見美國專利第6,090,382號，其通過引用結合到本文中)。
連接至人IgG1的Fc部分的重組形式可溶性TNFR(p75)(sTBFR(p75):Fc，ENBREL，Immunex)的臨床實驗已經表明，其給予使RA疾病活性產生顯著和快速的下降(Moreland等，1997，N.Eng.J.Med.，337141-147)。另外，sTNFR(p75):Fc的兒科臨床實驗的初步安全數據表明，青年類風溼性關節炎(JRA)患者一般良好耐受該藥物(Garrison等，1998，Am.College of Rheumatology meeting，1998年11月9日，摘要584)。
如上所示，ENBREL是由連接至人IgG1的Fc部分的人75kDa(p75)TNFR(GenBank登錄號P20333)的胞外配體結合部分組成的二聚化融合蛋白。ENBREL的Fc組分含CH2結構域、CH3結構域和鉸鏈區，但不含IgG1的CH1結構域。ENBREL在中國倉鼠卵巢(CHO)哺乳動物細胞表達系統中生產。其由934個胺基酸組成，具有約150kDa的表觀分子量(Smith等，1990，Science 2481019-1023；Mohler等，1993，J.Immunol.1511548-1561；美國專利第5,395,760號(ImmunexCorporation，Seattle，Wash.；其通過引用結合到本文中)；美國專利第5,605,690號(Immunex Corporation，Seattle，Wash.；其通過引用結合到本文中)。
有和沒有氨甲蝶呤時給予抗TNF-α的單克隆抗體(英利昔單抗，REMICADE，Centocor)已表現出治療RA的臨床效力(Elliott等，1993，Arthritis Rheum.361681-1690；Elliott等，1994，Lancet 3441105-1110)。這些數據表明，在第4、12和26周，Paulus 20％和50％標準顯著降低。靜脈內給予該治療，在兩個月的時間內抗-TNF單克隆抗體從循環中消失。重複劑量的效力持續時間似乎下降。患者可產生針對抗TNF抗體的抗體，其限制了該治療的有效性和持續時間(Kavanaugh等，1998，Rheum.Dis.Clin.North Am.24593-614)。給予氨甲蝶呤和英利昔單抗的組合有助於防止抗英利昔單抗抗體的出現(Maini等，1998，Arthritis Rheum.411552-1563)。英利昔單抗也已經表現出治療炎性腸病Crohn病的臨床效力(Baert等，1999，Gastroenterology 11622-28)。
如在背景章節中的論述，英利昔單抗是攜帶人IgG4恆定區和小鼠可變區的嵌合單克隆IgG抗體。英利昔單抗多肽描述於美國專利第5,698,195和5,656,272號，其通過引用結合到本文中。
為比較這些或其它抗TNF-α組合物的效力，人們僅需要使用抗TNF-α dAb構建物連同現有的組合物，進行一個或多個如上文所述的受體結合、細胞型或體內實驗。因此，該方法鑑別抗TNF-α dAb構建物，其在一個或多個實驗中表現出的TNF-α抑制作用的有效性等於或大於(以統計學顯著量)對比組合物的有效性。實施例中提供了這種構建物的實例和表明相等或更高有效性的分析方法。
實施例實施例1.抗人血清白蛋白(HSA)和β-半乳糖苷酶(β-gal)的雙特異性scFv抗體(K8)的選擇該實施例闡明了製備抗β-gal和HAS的雙特異性抗體的方法，其中根據對β-gal的結合選擇連接至種系(模擬)VH結構域的VK可變結構域庫，根據對HSA的結合選擇連接至種系(模擬)VK結構域的VH可變結構域庫。然後組合選定的可變VH HSA和VκB-gal結構域，根據對β-gal和HSA的結合選擇抗體。HSA是人血中存在的增加半壽期的蛋白。
在該實驗中使用4種人噬菌體抗體文庫。
文庫1種系Vκ/DVT VH8.46×107文庫2種系Vκ/NNK VH9.64×107文庫3種系VH/DVT Vκ1.47×108文庫4種系VH/NNK Vκ1.45×108所有文庫都基於VH(V3-23/DP47和JH4b)和Vκ(O12/O2/DPK9和Jκ1)單個人構架，側鏈多樣性摻入互補決定區(CDR2和CDR3)中。
文庫1和文庫2含模擬Vκ序列，而VH序列在位點H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H97和H98多樣化(分別由DVT或NNK編碼)(圖1)。文庫3和文庫4含模擬VH序列，而Vκ序列在位點L50、L53、L91、L92、L93、L94和L96多樣化(分別由DVT或NNK編碼)(圖1)。文庫為噬菌粒pIT2/ScFv形式(圖2)，並以對屬配體A蛋白和L蛋白的結合預選擇，使得未選擇文庫中的大部分克隆是有功能的。以上所示的文庫的大小對應於預選後的大小。混合文庫1和文庫2，然後對抗原選擇，以產生單個VH/模擬Vκ文庫，混合文庫3和文庫4，以形成單個Vκ/模擬VH文庫。
使用Vκ/模擬VH文庫對β-gal進行3輪選擇，使用VH/模擬Vκ文庫對HSA進行3輪選擇。對於β-gal，噬菌體滴度由第一輪的1.1×106上升至第三輪的2.0×108。對於HSA，噬菌體滴度由第一輪的2×104上升至第三輪的1.4×109。如Griffith等，(1993)所述進行選擇，例外之處是使用KM13輔助噬菌體(其含有在D2和D3結構域之間具有蛋白酶切割位點的pIII蛋白)，並用1mg/ml胰蛋白酶的PBS溶液洗脫噬菌體。加入的胰蛋白酶切割源自輔助噬菌體的pIII蛋白(但不切割來自噬菌粒的蛋白)，並通過在c-myc標記處切割洗脫結合的scFv-噬菌體融合體(圖2)，由此提供噬菌體表達的功能性scFv的進一步富集和背景的相應下降(Kristensen和Winter，Folding Design 3321-328，1998年7月9日)。使用100μg/ml濃度的HSA或β-gal包被的免疫管進行選擇。
為檢驗結合，通過單克隆噬菌體ELISA篩選各個選擇第三輪的24個菌落。如Harrison等，Methods Enzymol.1996；26783-109所述生產噬菌體顆粒。用10μg/ml濃度的100μl HSA或β-gal的PBS溶液於4℃過夜包被96孔ELISA板。按照標準ELISA方法(Hoogenboom等，1991)，用抗M13-HRP綴合物檢測結合的噬菌體。選擇的克隆以50μl上清液產生大於1.0的ELISA信號。
接著，使用QIAprep Spin Miniprep試劑盒(Qiagen)，由針對HSA選擇的VH/模擬Vκ文庫和針對β-gal選擇的Vκ/模擬VH文庫製備DNA製品。
為獲取大部分多樣性，由每個第三輪選擇製備DNA製品，然後將各個抗原的DNA製品合在一起。接著用SalI/NotI於37℃過夜消化DNA製品。在凝膠純化片段之後，連接針對β-gal選擇的Vκ/模擬VH文庫的Vκ鏈，代替針對HSA選擇的VH/模擬Vκ文庫的模擬Vκ鏈，建立3.3×109克隆的文庫。
然後針對HSA(第一輪)和β-gal(第二輪)選擇該文庫(HSA/β-gal選擇)，或者針對β-gal(第一輪)和HSA(第二輪)選擇該文庫(β-gal/HSA選擇)。如上所述進行選擇。在每種情況下，在第二輪選擇後，通過單克隆噬菌體ELISA(如上所述)和可溶性scFv片段ELISA檢驗48個克隆與HSA和β-gal的結合。如Harrison等，(1996)所述生產可溶性抗體片段，並實施標準ELISA法(Hoogenboom等，(1991)NucleicAcids Res.，194133)，例外之處是使用2％Tween/PBS作為封閉緩衝液，並用L蛋白-HRP檢測結合的scFv。HSA/β-gal選擇的3個克隆(E4、E5和E8)和β-gal/HSA選擇的2個克隆(K8和K10)能夠結合兩種抗原。使用引物LMB3和pHENseq，PCR擴增這些克隆的scFv，如Ignatovich等，(1999)J.Mol.Biol.1999Nov.26；294(2)457-65所述測序。序列分析揭示，所有的克隆都是相同的。因此，僅選擇一個編碼雙特異性抗體的克隆(K8)進行進一步研究(圖3)。
實施例2.K8抗體結合特性的特徵首先，利用單克隆噬菌體ELISA表徵K8抗體的結合特性。用100μl HSA和β-gal連同鹼性磷酸酶(APS)、牛血清白蛋白(BSA)、花生凝集素、溶菌酶和細胞色素c(以檢測交叉反應性)的10μg/ml濃度PBS溶液一起於4℃過夜包被96孔板。如Harrison等，(1996)所述用KM13拯救K8克隆的噬菌粒，直接檢測含噬菌體的上清液(50μl)。按照標準ELISA法(Hoogenboom等，1991)，用抗M13-HRP綴合物檢測結合的噬菌體。發現雙特異性K8抗體當展示在噬菌體表面上時結合HSA和β-gal，吸光度信號大於1.0(圖4)。還觀察到與BSA的強結合(圖4)。
因為HSA和BSA在胺基酸水平上76％同源，所以K8抗體識別這兩種結構相關的蛋白並不令人意外。未檢測到與其它蛋白的交叉反應性(圖4)。
其次，以可溶性scFvELISA檢驗K8抗體的結合特性。如Harrison等，(1996)所述利用IPTG誘導可溶性scFv片段的生產。為測定K8 scFV的表達水平，如Harlow和Lane，Antibodiesa Laboratory Manual，(1988)Cold Spring Harbor所述，使用A蛋白Sepharose柱由50ml誘導物的上清液純化可溶性抗體片段。然後檢測OD280，如Sambrook等，(1989)所述計算蛋白濃度。以19mg/l在上清液中產生K8 scFv。
然後使用已知濃度的K8抗體片段進行可溶性scFv ELISA。用100μl的10μg/ml濃度的HSA、BSA和β-gal以及100μl的1μg/ml濃度的A蛋白包被96孔板。施加50μl K8 scFv的連續稀釋液，用L蛋白-HRP檢測結合的抗體片段。ELISA結果證實了K8抗體的雙特異性性質(圖5)。
為證實與β-gal的結合由K8 scFv抗體的Vκ結構域決定以及與HSA/BSA的結合由K8 scFv抗體的VH結構域決定，通過SalI/NotI消化由K8 scFv DNA上切下Vκ結構域，並連接至含模擬VH結構域的SalI/NotI消化的pIT2載體中(圖1和2)。通過可溶性scFv ELISA分析所獲得的克隆K8Vκ/模擬VH的結合特徵。如Harrison等，(1996)所述用IPTG誘導可溶性scFv片段的生產，直接檢測含scFv的上清液(50μl)。如實施例1所述實施可溶性scFv ELISA，用L蛋白-HRP檢測結合的scFv。ELISA結果揭示，該克隆仍能結合β-gal，而與BSA的結合被消除(圖6)。
實施例3.抗抗原A和B的單VH結構域抗體以及抗抗原C和D的單Vκ結構域抗體的選擇該實施例描述了一種方法，該方法通過在沒有互補可變結構域的情況下選擇結合抗原A、B、C和D的初始單抗體可變結構域庫，製備抗抗原A和B的單VH結構域抗體和抗抗原C和D的單Vκ結構域抗體。
如先前所述(參見實施例5，PCT/GB 02/003014)進行結合克隆的選擇和表徵。選擇4個克隆進行進一步的研究VH1-抗AVHVH2-抗BVHVK1-抗CVκVK2-抗DVκ可以類似於所述的方式使用實施例1-3中的上述方法，以生產含VH結構域(即VH配體)組合和VL結構域(VL-VL配體)組合的二聚體分子。
實施例4.建立和表徵雙特異性ScFv抗體(抗抗原A和B的VH1/VH2以及抗抗原C和D的VK1/VK2)該實施例表明，可通過在抗ScFv載體中組合對各抗原選定的Vκ和VH單結構域，建立雙特異性ScFv抗體(抗抗原A和B的VH1/VH2和抗抗原C和D的VK1/VK2)。為建立雙特異性抗體VH1/VH2，通過NcoI/XhoI消化由可變結構域載體1(圖7)中切下VH1單結構域，並連接入NcoI/XhoI消化的可變結構域載體2(圖7)中，以建立VH1/可變結構域載體2。使用引物由可變結構域載體1 PCR擴增VH2單結構域，以在5′末端引入SalI限制位點和在3′末端引入NotI限制位點。然後用SalI/NotI消化PCR產物，並連接入SalI/NotI消化的VH1/可變結構域載體2，以建立VH1/VH2/可變結構域載體2。
以相似方式建立VK1/VK2/可變結構域載體2。如前所述(參見實施例6，PCT/GB02/003014)以可溶性ScFv ELISA檢驗所產生的VH1/VH2 ScFv和VK1/VK2 ScFv的雙特異性性質。如前所述實施競爭性ELISA(參見實施例8，PCT/GB02/003014)。
可能的結果-VH1/VH2 ScFv能夠同時結合抗原A和B。
-VK1/VK2 ScFv能夠同時結合抗原C和D。
-VH1/VH2 ScFv結合是競爭性的(當結合抗原A時，VH1/VH2ScFv不能結合抗原B)。
-VK1/VK2 ScFv結合是競爭性的(當結合抗原C時，VK1/VK2ScFv不能結合抗原D)。
實施例5.雙特異性VH1/VH2 Fab和VK1/VK2 Fab的構建及其結合特性的分析為建立VH1/VH2 Fab，將VH1單結構域連接入NcoI/XhoI消化的CH載體(圖8)中，以建立VH1/CH，將VH2單結構域連接入SalI/NotI消化的CK載體(圖9)中，以建立VH2/CK。如先前所述(參見實施例8，PCT/GB02/003014)，使用得自VH1/CH和VH2/CK的質粒DNA共轉化感受態大腸桿菌細胞。
然後，如前所述(參見實施例8，PCT/GB02/003014)，利用IPTG誘導含VH1/CH和VH2/CK質粒的克隆，以產生可溶性VH1/VH2Fab。
以相似方式產生VK1/VK2 Fab。
如前所述(參見實施例8，PCT/GB02/003014)通過競爭性ELISA檢驗所產生的Fab的結合特性。
可能的結果-VH1/VH2 Fab能夠同時結合抗原A和B。
-VK1/VK2 Fab能夠同時結合抗原C和D。
-VH1/VH2 Fab結合是競爭性的(當結合抗原A時，VH1/VH2 Fab不能結合抗原B)。
-VK1/VK2 Fab結合是競爭性的(當結合抗原C時，VK1/VK2 Fab不能結合抗原D)。
實施例6.螯合dAb二聚體概述使用彈性多肽接頭建立dAb-接頭-dAb型的VH和VK同二聚體。建立的dAb-接頭-dAb型的載體含不同長度的甘氨酸-絲氨酸接頭3U:(Gly4Ser)3、5U:(Gly4Ser)5、7U:(Gly4Ser)7。使用接頭TAR1-5(VK)、5TAR1-27(VK)、TAR2-5(VH)或TAR2-6(VK)上遊的引導dAb和對應於接頭後的第二個dAb的文庫建立二聚體文庫。使用該方法選擇新二聚化dAb。通過ELISA和BIAcore研究並以細胞中和和受體結合實驗確定二聚化對抗原結合的作用。TAR1-5和TAR1-27這二者的二聚化都對結合親合性和中和水平產生顯著提升。
1.0方法1.1文庫產生1.1.1載體設計pEDA3U、pEDA5U和pEDA7U載體，以導入和dAb-接頭-dAb型相容的不同接頭長度。對於pEDA3U，使用慢退火程序(95℃-5分鐘、80℃-10分鐘、70℃-15分鐘、56℃-15分鐘、42℃直至使用)，在含0.1M NaCl、10mM Tris-HCl pH7.4的緩衝液中退火有義和反義的73個鹼基對的寡核苷酸接頭，並使用XhoI和NotI限制性位點克隆。
接頭包含3個(Gly4Ser)(SEQ ID NO7)單位和一個位於SalI和NotI克隆位點之間的填充片段區(流程1)。為了降低噬菌體展示選擇單體dAb的可能性，設計填充片段區，以包含3個終止密碼子、SacI限制位點和讀框移碼突變，以在不存在第二個dAb時將該區置於讀框外。對於pEDA5U和7U，由於需要的接頭長度，設計每個載體的重疊寡聚接頭，退火，使用Klenow延伸。然後使用合適的酶純化和消化片段，之後使用XhoI和NotI限制位點克隆。
1.1.2文庫製備使用NcoI和XhoI限制位點克隆接頭上遊對應於引導dAb的N-末端V基因。VH基因具有現有的相容位點，但是克隆VK基因需要導入合適的限制位點。這可通過使用SuperTaq(HTBiotechnology Ltd)和pfu turbo(Stratagene)的2∶1混合物，在30個周期的PCR擴增中使用修改的PCR引物(VK-DLIBF5′cggccatggcgtcaacggacat-3′；VKXhoIR5′atgtgcgctcgagcgtttgattt-3′)實現。這在5′末端保留NcoI位點，同時破壞了鄰接的SalI位點，並在3′末端導入XhoI位點。將5個引導dAbTAR1-5(VK)、TAR1-27(VK)、TAR2-5(VH)、TAR2-6(VK)和TAR2-7(VK)克隆入3個二聚體載體的每一個中。所有構建物都通過序列分析驗證。
在各個載體(pEDA3U、5U和7U)中的接頭上遊克隆了引導dAbTAR1-5(VK)、TAR1-27(VK)、TAR2-5(VH)或TAR2-6(VK)之後，在接頭後克隆對應於第二個dAb的文庫。為實現此目標，由第一輪選擇的抗人TNF-α的VK文庫(在第1輪後約為1×106密度)(在TAR1-5或TAR1-27為引導dAb時)或抗人p55 TNF受體的VH或VK文庫(在第1輪後均約為1×105密度)(在TAR2-5或TAR2-6分別為引導dAb時)回收的噬菌體PCR擴增互補dAb文庫。對於VK文庫，使用SuperTaq和pfu turbo的2∶1混合物，在30個周期的PCR擴增中使用引物進行PCR擴增。使用引物PCR擴增VH文庫，以便在基因的5′末端引入SalI限制位點。用合適的限制酶消化dAb文庫PCR，並使用SalI/NotI限制位點連接入對應載體的接頭下遊，電穿孔入新鮮製備的感受態TG1細胞中。
各個文庫獲得的滴度如下TAR1-5pEDA3U＝4×108，pEDA5U＝8×107，pEDA7U＝1×108TAR1-27pEDA3U＝6.2×108，pEDA5U＝1×108，pEDA7U＝1×109TAR2h-5pEDA3U＝4×107，pEDA5U＝2×108，pEDA7U＝8×107TAR2h-6pEDA3U＝7.4×108，pEDA5U＝1.2×108，pEDA7U＝2.2×1081.2選擇1.2.1TNF-α使用被動包被在免疫管上的人TNFα進行選擇。簡單地講，用1-4ml所需抗原過夜包被免疫管。然後用PBS漂洗免疫管3次，用2％奶粉的PBS溶液封閉1-2小時，再用PBS漂洗3次。用2％奶粉的PBS溶液稀釋噬菌體溶液，並於室溫溫育2小時。然後用PBS漂洗管，用1mg/ml胰蛋白酶-PBS洗脫噬菌體。對於TAR1-5二聚體文庫，研究了3種選擇策略。第1輪選擇在使用1μg/ml或20μg/ml的人TNFα包被並用PBS 0.1％Tween漂洗20次的免疫管中進行。用洗脫的噬菌體感染TG1細胞，並測定滴度(例如Marks等，J Mol Biol.1991年12月5日；222(3)581-97，Richmann等，Biochemistry.1993年8月31日；32(34)8848-55)。
回收的滴度為pEDA3U＝2.8×107(1μg/ml TNF)，1.5×108(20μg/ml TNF)，
pEDA5U＝1.8×107(1μg/ml TNF)，1.6×108(20μg/ml TNF)，pEDA7U＝8×106(1μg/ml TNF)，7×107(20μg/ml TNF)。
使用3種不同方法進行第2輪選擇。
1.在免疫管中，漂洗20次和過夜溫育，之後再漂洗10次。
2.在免疫管中，漂洗20次，之後在含1μg/ml TNF-α的漂洗緩衝液中於室溫溫育1小時，再漂洗10次。
3.使用33pmol生物素化人TNF-α在鏈黴抗生物素蛋白珠上選擇(Henderikx等，2002，Selection of antibodies against biotinylatedantigens.Antibody Phage DisplayMethods and protocols，O′Brien和Atkin編輯，Humana Press)。將第2輪選擇的單個克隆揀選入96孔板中，以2ml 96孔板形式製備粗上清液製品。
對於TAR1-27，如前所述用以下修飾進行選擇。第1輪選擇在使用1μg/ml或20μg/ml的人TNFα包被並用PBS 0.1％Tween漂洗20次的免疫管中進行。第2輪選擇在使用20次漂洗和過夜溫育之後再漂洗20次的免疫管中進行。將第2輪選擇的單個克隆揀選入96孔板中，以2ml 96孔板形式製備粗上清液製品。
TAR1-27滴度如下
1.2.2TNF受體1(p55受體；TAR2)如前所述僅對TAR2h-5文庫進行選擇。在免疫管中進行3輪選擇，所述免疫管使用1μg/ml人p55 TNF受體或10μg/ml人p55 TNF受體，用PBS 0.1％Tween漂洗20次，過夜溫育，之後再漂洗20次。將第2輪和第3輪選擇的單個克隆揀選入96孔板中，以2ml 96孔板形式製備粗上清液製品。
TAR2h-5滴度如下
1.3篩選在適宜的情況下由用不同選擇方法獲得的每個3U、5U和7U文庫中揀選第2輪或第3輪選擇的單個克隆。將克隆在含100μg/ml氨苄青黴素和1％葡萄糖的2xTY中於37℃過夜培養。將1/100稀釋的該培養物以2ml、96孔板形式接種入2ml含100μg/ml氨苄青黴素和1％葡萄糖的2xTY中，並於37℃振搖培養，直至OD600約為0.9。然後用1mM IPTG於30℃過夜誘導培養物。
通過在Sorval平板離心機中於4000rpm離心15分鐘澄清上清液。上清液製品用於初始篩選。
1.3.1 ELISA通過A/L蛋白ELISA或通過抗原ELISA對比二聚化重組蛋白和單體的結合活性。簡而言之，用抗原或A/L蛋白於4℃過夜包被96孔板。用0.05％Tween-PBS漂洗板，並用2％Tween-PBS封閉2小時。將樣品加入板中，於室溫溫育1小時。漂洗板，並將板與第二試劑於室溫溫育1小時。漂洗板，用TMB底物顯色。使用A/L蛋白HRP或India-HRP作為第二試劑。對於抗原ELISA，使用的抗原濃度為1μg/ml人TNFα和人TNF受體1的PBS溶液。由於在大多數情況下存在引導dAb，所以二聚體產生陽性ELISA信號—因此以BIAcore檢驗離開速率測定值。
1.3.2 BIAcore對TAR1-5和TAR2h-5克隆進行BIAcore分析。為進行篩選，以高密度(約10,000RU)將人TNF-α偶聯至CM5晶片。
將50μl人TNFα(50μg/ml)以5μl分鐘偶聯至在乙酸緩衝液pH5.5中的晶片。由於人TNF-α的不穩定性，所以在分析後不可能使用標準方法再生晶片。因此，在分析每個樣品後，用緩衝液漂洗晶片10分鐘。
對於TAR1-5，通過BIAcore篩選第2輪選擇的克隆上清液。由使用以下選擇方法獲得的3U、5U和7U文庫的每一個中篩選出48個克隆R11μg/ml人TNF-α免疫管，R2 1μg/ml人TNF-α免疫管，過夜漂洗。
R120μg/ml人TNF-α免疫管，R2 20μg/ml人TNF-α免疫管，過夜漂洗。
R11μg/ml人TNF-α免疫管，R2 33pmol生物素化人TNF-α珠。
R120μg/ml人TNF-α免疫管，R2 33pmol生物素化人TNF-α珠。
為進行篩選，以高密度(約4,000RU)將人p55 TNF受體偶聯至CM5晶片。將100μl人p55 TNF受體(10μg/ml)以5μl/分鐘偶聯至在乙酸緩衝液pH5.5中的晶片。檢驗標準再生條件(甘氨酸pH2或pH3)，但在每種情況下抗原均由晶片表面上被去除—因此，同TNF-α的情況一樣，在分析每個樣品後，用緩衝液漂洗晶片10分鐘。
對於TAR2-5，篩選該輪選擇的克隆上清液。
使用以下的選擇方法，由3U、5U和7U文庫的每一個中均篩選出48個克隆R11μg/ml人p55 TNF受體免疫管，R2 1μg/ml人p55 TNF受體免疫管，過夜漂洗。
R110μg/ml人p55 TNF受體免疫管，R2 10μg/ml人p55 TNF受體免疫管，過夜漂洗。
1.3.3受體和細胞實驗如下實施二聚體在受體實驗中的中和能力受體結合檢驗抗TNF dAb抑制TNF與重組TNF受體1(p55)結合的能力。簡而言之，將Maxisorp板與30mgml抗人Fc小鼠單克隆抗體(Zymed，San Francisco，USA)過夜溫育。用含0.05％Tween-20的磷酸緩衝鹽水(PBS)漂洗孔，然後用1％BSA的PBS溶液封閉，之後與100ng/ml TNF受體1Fc融合蛋白(RD Systems，Minneapolis，USA)溫育。將抗TNFdAb與以10ng/ml終濃度加入至漂洗孔的TNF混合。用0.2mg/ml生物素化抗TNF抗體(HyCuIt biotechnology，Uben，Netherlands)，後接1∶500稀釋的辣根過氧化物酶標記的鏈黴抗生物素蛋白(AmershamBiosciences，UK)，然後與TMB底物(KPL，GaitherSburg，USA)溫育檢測TNF結合。通過加入HCl終止反應，於450nm讀取吸光度。抗TNFdAb活性導致TNF結合下降，因此導致吸光度比僅TNF的對照增加。
L929細胞毒性實驗還測試了抗TNF dAb中和TNF對小鼠L929成纖維細胞的細胞毒活性的能力(Evans，T.(2000)Molecular Biotechnology 15，243-248)。簡而言之，將在微量滴定板中平板接種的L929細胞與抗TNFdAb、100pg/ml TNF和1mg/ml放線菌素D(Sigma，Poole，UK)過夜溫育。通過在與[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑_(Promega，Madison，USA)溫育後讀取490nm的吸光度檢測細胞存活力。抗TNF dAb活性導致TNF細胞毒性下降，因此導致吸光度比僅TNF的對照增加。
在初始篩選中，還在受體實驗中使用如上所述為BIAcore分析而製備的上清液。還使用純化蛋白在受體和細胞實驗中進行選定二聚體的進一步分析。
HeLa IL-8實驗測試抗TNFR1或抗TNFα dAb在HeLa細胞中中和TNF誘導的IL-8分泌的能力(採用的方法得自Akeson，L.等，(1996)Journal ofBiological Chemistry 271，30517-30523，其描述了IL-1在HUVEC中對IL-8的誘導；在此我們考察人TNFα的誘導，我們使用Hela細胞代替HUVEC細胞系)。簡而言之，將在微量滴定板中平板接種的HeLa細胞與dAb和300pg/ml TNF過夜溫育。溫育後由細胞中吸出上清液，利用夾心ELISA(RD Systems)檢測IL-8濃度。抗TNFR1 dAb活性導致分泌入上清液中的IL-8比僅TNF的對照下降。
在以下實驗過程中始終使用L929實驗；但是，優選使用HeLa IL-8實驗檢測抗TNF受體1(p55)配體；L929實驗中存在的小鼠p55對其應用產生一定限制。
1.4序列分析對證實在BIAcore和受體實驗篩選中具有目標特性的二聚體測序。序列詳述於下文的序列表、附圖和實施例中。
1.5定型1.5.1 TAR1-5-19二聚體重排已表明具有良好中和特性的TAR1-5二聚體，並在細胞和受體實驗中進行分析。用親合力成熟的克隆TAR1-5-19取代TAR1-5引導dAb。為實現此目標，將TAR1-5克隆出單個二聚體對之外，並用已通過PCR擴增的TAR1-5-19置換。另外，還在3U、5U和7U載體中構建TAR1-5-19同二聚體。通過PCR擴增基因的N末端拷貝，並如上所述克隆，使用現有的SalI和NotI限制位點克隆C-末端基因片段。
1.5.2誘變通過定點誘變將TAR1-5二聚體對中的C-末端dAb之一dAb2中存在的琥珀終止密碼子突變為穀氨醯胺。
1.5.3 Fab將含TAR1-5或TAR1-5-19的二聚體重排入Fab表達載體中。使用SfiI和NotI限制位點將dAb克隆入含CK或CH基因的表達載體中，並通過序列分析檢驗。CK載體源自pUC型氨苄青黴素抗性載體，CH載體源自pACYC氯黴素抗性載體。對於Fab表達，將dAb-CH和dAb-CK構建物共轉化入HB2151細胞中，並在含0.1％葡萄糖、100μg/ml氨苄青黴素和10μg/ml氯黴素的2xTY中培養。
1.5.3鉸鏈區二聚化檢驗經半胱氨酸鍵形成的dAb二聚化。將改良形式的人IgGC1鉸鏈-胺基酸短序列EPKSGDKTHTCPPCP(SEQ ID NO11)工程改造在dAb的C末端區。如前所述合成和退火編碼該序列的寡聚接頭。使用XhoI和NotI限制位點將接頭克隆入含TAR1-5-19的pEDA載體中。二聚化在周質中原位發生。
1.6表達和純化1.6.1表達如前所述以用於初始篩選的2ml、96孔板形式製備上清液。在初始篩選過程之後進一步分析選定的二聚體。在TOP10F′或HB2151細胞中作為上清液表達二聚體構建物。簡而言之，將得自新鮮劃線平板的單個菌落在含100μg/ml氨苄青黴素和1％葡萄糖的2xTY中於37℃過夜培養。將1/100稀釋的該培養物接種入含100μg/ml氨苄青黴素和0.1％葡萄糖的2xTY中，於37℃振搖培養，直至OD600約為0.9。然後用1mM IPTG於30℃過夜誘導培養物。通過離心去除細胞，用A或L蛋白瓊脂糖純化上清液。
在HB2152細胞中作為周質蛋白表達Fab和半胱氨酸鉸鏈二聚體。
將1/100稀釋的過夜培養物接種入含0.1％葡萄糖和合適抗生素的2xTY中，並於37℃振搖培養，直至OD600約為0.9。然後用1mMIPTG於30℃誘導培養物3-4小時。通過離心收集細胞，將沉澱重懸浮在周質製備緩衝液(30mM Tris-HCl pH8.0、1mM EDTA、20％蔗糖)中。在離心後保留上清液，將沉澱重懸浮在5mM MgSO4中。再通過離心收集上清液，混合併純化。
1.6.2A/L蛋白純化檢驗由L蛋白瓊脂糖(Affitech，Norway)或A蛋白瓊脂糖(Sigma，UK)純化的二聚體蛋白的最佳條件。使用蠕動泵通過分批洗脫或柱洗脫洗脫蛋白。檢驗3種緩衝液0.1M磷酸鹽-檸檬酸鹽緩衝液pH 2.6；0.2M甘氨酸pH 2.5；和0.1M甘氨酸pH 2.5。確定的優化條件為在蠕動泵條件下使用0.1M甘氨酸pH 2.5，通過10個柱體積。使用0.1M甘氨酸pH 2.5在蠕動泵條件下由A蛋白進行純化。
1.6.3 FPLC純化通過在AKTA Explorer 100系統(Amersham Biosciences Ltd)上的FPLC分析進行進一步的純化。通過用0-1M NaCl梯度的50mM乙酸緩衝液pH4洗脫的陽離子交換層析(1ml Resource S-AmershamBiosciences Ltd)，分級分離TAR1-5和TAR1-5-19二聚體。通過用0-1M NaCl梯度的25mM Tris HCl pH 8.0洗脫的離子交換層析(1mlResource Q Amersham Biosciences Ltd)純化鉸鏈二聚體。通過使用Superose 12(Amersham Biosciences Ltd)柱的分子排阻層析，用含0.05％Tween的PBS以0.5ml/分鐘流速運行，純化Fab。在純化後，使用Vivaspin 5K截流分子量濃縮器(Vivascience Ltd)濃縮樣品。
2.0結果2.1 TAR1-5二聚體由第2輪選擇中揀選出6×96個克隆，其包含所有文庫和選擇條件。製備上清液製品，通過抗原和L蛋白ELISA、BIAcore和受體實驗檢測。在EUSA中，鑑別各個選擇方法的陽性結合克隆，其分布在3U、5U和7U文庫之間。但是，由於總是存在引導dAb，所以利用該方法不可能辨別高和低親合性結合體-因此進行BIAcore分析。
使用2ml上清液進行BIAcore分析。BIAcore分析揭示，二聚體Koff速率相比單體TAR1-5有極大提升。單體Koff速率在10-1M範圍內，相比之下二聚體Koff速率在10-3-10-4M範圍內。選擇16個看起來具有很慢離開速率的克隆，這些克隆來自3U、5U和7U文庫，對其測序。另外，分析上清液在受體實驗中中和人TNF-α的能力。
6個引導克隆(以下的d1-d6)在這些實驗中中和，對其測序。結果表明，在所獲得的6個克隆之外僅有3個不同的第二dAb(dAb1、dAb2和dAb3)，但是，當不止一次觀察到第二dAb時，其與不同長度的接頭連接。
TAR1-5d13U接頭第二dAb＝dAb1-1μg/ml Ag免疫管，過夜漂洗。
TAR1-5d23U接頭第二dAb＝dAb2-1μg/ml Ag免疫管，過夜漂洗。
TAR1-5d35U接頭第二dAb＝dAb2-1μg/ml Ag免疫管，過夜漂洗。
TAR1-5d45U接頭第二dAb＝dAb3-20μg/ml Ag免疫管，過夜漂洗。
TAR1-5d55U接頭第二dAb＝dAb1-20μg/ml Ag免疫管，過夜漂洗。
TAR1-5d67U接頭第二dAb＝dAb1-R11μg/ml Ag免疫管，過夜漂洗，R2珠進一步檢驗6個引導克隆。由周質和上清液生產蛋白，用L蛋白瓊脂糖純化，並在細胞和受體實驗中檢驗。中和水平是可變的(表1)。確定蛋白製備的最優條件。由HB2151細胞作為上清液生產的蛋白獲得最高產量(約10mg/L培養物)。將上清液與L蛋白瓊脂糖於室溫溫育2小時或於4℃過夜溫育。用PBS/NaCl漂洗珠，並使用蠕動泵裝載至FPLC柱上。用10柱體積的PBS/NaCl漂洗珠，用0.1M甘氨酸pH 2.5洗脫。一般來說，二聚體蛋白在單體之後被洗脫下來。
通過FPLC純化TAR1-5d1-6二聚體。通過FPLC純化獲得3種物質，通過SDS PAGE鑑別。1種物質對應於單體，另2種物質對應於不同大小的二聚體。兩種物質中較大的一個可能源於存在C末端標記。在受體實驗中檢驗這些蛋白。表1中提供的數據代表由兩個二聚體類別獲得的最優結果(圖11)。將二聚體對的3種第二dAb(即dAb1、dAb2和dAb3)克隆為單體，並通過ELISA以及細胞和受體實驗檢驗。全部3種dAb均通過抗原ELISA特異性結合TNF，不與塑料或BSA交叉反應。至於單體，沒有一個dAb在細胞或受體實驗中中和。
2.1.2 TAR1-5-19二聚體用TAR1-5-19置換6個引導克隆中的TAR1-5。除非另有說明(表2)，否則使用總蛋白(僅L蛋白純化的)對細胞和受體實驗中的全部TAR1-5-19二聚體進行分析。TAR1-5-19d4和TAR1-5-19d3在細胞實驗中具有最佳ND50(約5nM)，這與受體實驗結果一致，比TAR1-5-19單體(ND50約30nM)有改善。儘管純化的TAR1-5二聚體在受體和細胞實驗中得到可變的結果，但TAR1-5-19二聚體更一致。當在蛋白純化過程中使用不同的洗脫緩衝液時顯示出存活力。使用0.1M磷酸鹽-檸檬酸鹽緩衝液pH 2.6或0.2M甘氨酸pH 2.5洗脫，儘管在大多數情況下由L蛋白瓊脂糖中脫下了所有蛋白，但使蛋白基本無功能。
在發酵罐中表達TAR1-5-19d4，並在陽離子交換FPLC上純化，產生完全純的二聚體。同TAR1-5d4一樣，通過FPLC純化獲得3種物質，對應於單體和兩種二聚體。對該二聚體進行胺基酸測序。然後在受體實驗中檢驗TAR1-5-19單體和TAR1-5-19d4，獲得的單體IC50為30nM，二聚體的IC50為5nM。
對比TAR1-5-19單體、TAR1-5-19d4和TAR1-5d4的受體實驗的結果示於圖10。
在3U、5U和7U載體中製備TAR1-5-19同二聚體，表達，並用L蛋白純化。在細胞和受體實驗中檢驗蛋白，測定所產生的IC50(對於受體實驗)和ND50(對於細胞實驗)(表3，圖12)。
2.2 Fab另將TAR1-5和TAR1-5-19二聚體克隆成Fab型，表達，並用L蛋白瓊脂糖純化。以受體實驗評價Fab(表4)。結果表明，對於TAR1-5-19和TAR1-5二聚體這二者，中和水平類似於產生其的原始Gly4Ser接頭二聚體。表達其中TAR1-5-19同時在CH和CK上展示的TAR1-5-19Fab，L蛋白純化，並用受體實驗評價。獲得的IC50約為1nM。
2.3 TAR1-27二聚體由第2輪選擇中揀選出3×96個克隆，其包含所有文庫和選擇條件。製備2ml上清液製品，用於ELISA和生物實驗分析。抗原ELISA產生71個陽性克隆。粗上清液的受體實驗產生42個具有抑制特性的克隆(TNF結合0-60％)。在大部分情況下，抑制特性與強ELISA信號相關。測序42個克隆，其中39個具有獨特的第二dAb序列。進一步分析12個產生最佳抑制特性的二聚體。
將12個中和性克隆表達為200ml上清液製品，並在L蛋白上純化。通過L蛋白和抗原ELISA、BIAcore和用受體實驗評價這些克隆。在所有情況下都獲得強陽性ELISA信號。BIAcore分析揭示，所有克隆都具有快速的結合和離開速率。離開速率相比於單體TAR1-27有改善，但TAR1-27二聚體的離開速率(Koff約在10-1-10-2M的範圍內)比先前檢驗的TAR1-5二聚體(Koff約在10-3-10-4M的範圍內)更快。純化的二聚體的穩定性是個問題，因此為了提升穩定性，在純化2種TAR1-27二聚體(d2和d16)時包括加入5％甘油、0.5％Triton X100或0.5％NP40(Sigma)。加入NP40或Triton X100將純化產物的產量提升約2倍。在受體實驗中評價兩種二聚體。在所有純化條件下，TAR1-27d2產生的IC50約為30nM。當不使用穩定劑純化時，TAR1-27d16未顯示出中和作用，但當在穩定條件下純化時產生約50nM的IC50。未進行進一步分析。
2.4 TAR1-5二聚體由第2輪選擇中揀選出3×96個克隆，其包含所有文庫和選擇條件。製備2m1上清液製品用於分析。對每塊板進行A蛋白和抗原ELISA。通過BIAcore鑑別出30個具有良好離開速率(Koff在10-2-10-3範圍內)的目標克隆。測序克隆，通過序列分析鑑別出13個獨特的二聚體。
表1TAR1-5二聚體
*注釋二聚體2和二聚體3具有相同的第二dAb(叫做dAb2)，但是具有不同的接頭長度(d2＝(Gly4Ser)3，d3＝(Gly4Ser)3)。dAb1是二聚體1、5和6的配偶體dAb。dAb3是二聚體4的配偶體dAb。沒有一個配偶體dAb獨自中和。除非另有說明，否則均通過陽離子交換進行FPLC純化。在這些實驗中確定通過FPLC獲得的各個二聚體的最優二聚體種類。
表2TAR1-5-19二聚體
表3TAR1-5-19同二聚體
表4TAR1-5/TAR1-5-19Fab
TAR1-5-19CYS二聚體的PCR構建物參見描述dAb三聚體的實施例8。三聚體方法產生單體、二聚體和三聚體的混合物。
TAR1-5-19CYS二聚體的表達和純化如實施例8所概述，通過捕獲在L蛋白瓊脂糖上，由培養物上清液純化二聚體。
TAR1-5-19CYS單體與TAR1-5-19CYS二聚體的分離在陽離子交換分離之前，按照生產商的指引，使用PD-10柱(Amersham Pharmacia)，將混合的單體/二聚體樣品緩衝交換入50mM檸檬酸鈉緩衝液pH 4.0中。然後將樣品上樣至1mL Resource S陽離子交換柱(Amersham Pharmacia)，該柱已用50mM檸檬酸鈉pH 4.0預平衡。使用在50mM檸檬酸鈉pH 4.0中的以下鹽梯度分離單體和二聚體
150-200mM氯化鈉，通過15個柱體積200-450mM氯化鈉，通過10個柱體積450-1000mM氯化鈉，通過15個柱體積。
使用SDS-PAGE鑑別僅含二聚體的級分，然後合併，通過加入1/5體積的1M Tris pH 8.0將pH增加至8。
體外功能結合實驗TNF受體實驗和細胞實驗使用TNF受體和細胞實驗測定二聚體對人TNFcz的親合性。受體實驗中的IC50約為0.3-0.8nM；細胞實驗中的ND50約為3-8nM。
其它可能的TAR1-5-19CYS二聚體形式PEG二聚體和定製合成的馬來醯亞胺二聚體Nektar(Shearwater)提供一系列雙馬來醯亞胺PEG[mPEG2-(MAL)2或mPEG-(MAL)2]，其允許用分隔dAb的小接頭使單體形成為二聚體，二者均連接至5-40kDa大小的PEG。已經表明，5kDamPEG-(MAL)2(即[TAR1-5-19]-Cys-馬來醯亞胺-PEG×2，其中馬來醯亞胺在二聚體中連接在一起)在TNF受體實驗中具有約1-3nM離開速率的親合力。另外，還可使用TMEA(Tris[2 5-馬來醯亞胺乙基]胺)(Pierce Biotechnology)或其它雙功能接頭生產二聚體。
還有可能使用採用2，2′-二硫代二吡啶(Sigma Aldrich)和還原單體的化學偶聯法生產二硫鍵二聚體。
向dAb的C末端加入多肽接頭或鉸鏈可在dAb和末端半胱氨酸殘基之間工程改造一個小接頭，其為(Gly4Ser)n，其中n＝1-10，例如1、2、3、4、5、6或7，或者為免疫球蛋白(例如IgG鉸鏈區)，或者為隨機肽序列(例如選自隨機肽序列文庫)。然後可如以上概述使用其製備二聚體。
實施例8.dAb三聚化概述對於dAb三聚化，在蛋白的C末端需要游離半胱氨酸。半胱氨酸殘基一旦被還原產生游離巰基，就可用於將蛋白特異性偶聯至三聚化馬來醯亞胺分子，例如TMEA(Tris[2-馬來醯亞胺乙基]胺)。
TAR1-5-19CYS的PCR構建以下的寡核苷酸用於特異性PCR具有用於克隆的SalI和BamHI位點的TAR1-5-19，還用於導入C-末端半胱氨酸殘基Sal ITrp Ser Ala Ser Thr Asp*Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser ValTGG AGC GCG TCG ACG GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCT CTG TCT GCA TCT GTAACC TCG CGC AGC TGC CTG TAG GTC TAC TGG GTC AGA GGT AGG AGA GAC AGA CGT AGA CATGly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Ser Tyr Leu His TrpGGA GAC CGT GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT GAT AGT TAT TTA CAT TGGCCT CTG GCA CAG TGG TAG TGA ACG GCC CGT TCA GTC TCG TAA CTA TCA ATA AAT GTA ACCTyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Glu Leu GlnTAC CAG CAG CCA CCA GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT AGT GCA TCC GAG TTG CAAATG GTC GTC TTT GGT CCC TTT CGG GGA TTC GAG GAC TAG ATA TCA CGT AGG CTC AAC GTTSer Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr IleAGT GGG GTC CCA TCA CGT TTC AGT GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATCTCA CCC CAG GGT AGT GCA AAG TCA CCG TCA CCT AGA CCC TGT CTA AAG TGA GAG TGG TAGSer Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Val Trp Arg ProAGC AGT CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCT ACG TAC TAC TGT CAA CAG GTT GTG TGG CGT CCTTCG TCA GAC GTT GGA CTT CTA AAA CGA TGC ATG ATG ACA GTT GTC CAA CAC ACC GCA GGABamHIPhe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Cys *** *** Gly Ser GlyTTT ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA CGG TGC TAA TAA GGA TCC GGCAAA TGC AAG CCG GTT CCC TGG TTC CAC CTT TAG TTT GCC ACG ATT ATT CCT AGG CCG
(*TAR1-5-19CYS序列的起點；胺基酸序列＝SEQ ID NO12；核苷酸序列＝SEQ ID NO13)正向引物5′-TGGAGCGCGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCA-3′(SEQ ID NO14)反向引物5′-TTAGCAGCCGGATCCTTATTAGCACCGTTTGATTTCCAC-3′(SEQ ID NO15)如下配製PCR反應物(50μL體積)200μM dNTP，0.4μM的各種引物，5μL 10x PfuTurbo緩衝液(Stratagene)，100ng模板質粒(編碼TAR1-5-19)，1μL PfuTurbo酶(Stratagene)，並使用無菌水將體積調整至50μL。使用以下的PCR條件初始變性步驟94℃、2分鐘，然後94℃、30秒；64℃、30秒和72℃、30秒的循環。最後的延伸步驟還包括72℃、5分鐘。純化PCR產物，用SalI和BamHI消化，並連接入也已用絲氨酸限制酶切割的載體中。通過DNA測序驗證正確的克隆。
TAR1-5-19CYS的表達和純化按照生產商的方法，將TAR1-5-19CYS載體轉化入BL21(DE3)pLysS化學感受態細胞(Novagen)中。使用100μg/mL羧苄青黴素和37μg/mL氯黴素選擇攜帶dAb質粒的細胞。將培養物在2L含500mLTerrific Broth(Sigma-Aldrich)、100μg/mL羧苄青黴素和37μg/mL氯黴素的帶擋板燒瓶(baffled flask)中培養。於30℃以200rpm將培養物培養至O.D.6001-1.5，然後用1mM IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，得自Melford Laboratories)誘導。使dAb表達於30℃持續12-16小時。發現大部分dAb存在於培養基中。因此，通過離心(8,000×g，30分鐘)分離細胞和培養基，使用上清液純化dAb。每升上清液加入30mL L蛋白瓊脂糖(Afftech)，在攪拌下使dAb分批結合2小時。然後使樹脂在重力下再沉降1小時，之後虹吸抽出上清液。然後將瓊脂糖裝入XK 50柱(Amersham Phamacia)，用10柱體積PBS流洗。用100mM甘氨酸pH 2.0洗脫結合的dAb，然後通過加入1/5體積的1M Tris pH 8.0中和含蛋白的級分。每升培養上清液分離出20mg純蛋白，其含有50∶50比率的單體∶二聚體。
TAR1-5-19CYS的三聚化用5mM二硫蘇糖醇還原2.5ml的100M TAR1-5-19CYS，將其置於室溫20分鐘。然後使用PD-10柱(Amersham Pharmacia)緩衝交換樣品。用5mM EDTA、50mM磷酸鈉pH 6.5預平衡柱，按照生產商的指引將樣品上樣和洗脫。將樣品置於冰上，直至需要時。TMEA(Tris[2-馬來醯亞胺乙基]胺)購自Pierce Biotechnology。配製100％DMSO(二甲基亞碸)中的20mM TMEA母液。發現高於3∶1(dAb∶TMEA的摩爾比率)的TMEA濃度引起蛋白快速沉澱和交聯。另外，沉澱和交聯速率隨pH增加而增大。因此，使用100μM還原的TAR1-5-19CYS，加入25μM TMEA，以三聚化蛋白，使反應於室溫進行2小時。發現隨著偶聯反應進行，加入添加劑如甘油或乙二醇至20％(v/v)顯著降低了三聚體沉澱。在偶聯後，SDS-PAGE分析表明，在溶液中存在單體、二聚體和三聚體。
三聚化TAR1-5-19CYS的純化每mL TMEA-TAR1-5-19cys反應物加入40μL 40％冰醋酸，以將pH減低至4。然後將樣品上樣至1mL Resource S陽離子交換柱(Amersham Pharmacia)，該柱用50mM乙酸鈉pH 4.0預平衡。使用340-450nM氯化鈉鹽梯度、50mM乙酸鈉pH 4.0通過30個柱體積部分地分離二聚體和三聚體。使用SDS-PAGE鑑別僅含三聚體的級分，然後合併，通過加入1/5體積的1M Tris pH 8.0將pH增加至8。為防止濃縮步驟(使用5K截流分子量的Viva旋轉濃縮器；Vivascience)中的三聚體沉澱，向樣品中加入10％甘油。
體外功能性結合實驗TNF受體實驗和細胞實驗使用TNF受體和細胞實驗測定三聚體對人TNF-α的親合力。受體實驗中的IC50為0.3nM；細胞實驗中的ND50在3-10nM範圍內(例如3nM)。
其它可能的TAR1-5-19CYS三聚體形式還使用以下試劑將TAR1-5-19CYS製成三聚體PEG三聚體和定製合成的馬來醯亞胺三聚體Nektar(Shearwater)提供一系列多臂PEG，可在PEG末端對其化學修飾。因此使用在每個臂末端具有馬來醯亞胺官能團的PEG三聚體，能以與以上概述的使用THEA三聚化類似的方式三聚化dAb。PEG還可具有增加三聚體溶解性、由此防止凝集問題的優勢。因此，人們可生產dAb三聚體，其中每個dAb均具有連接至馬來醯亞胺官能團的C-末端半胱氨酸，馬來醯亞胺官能團連接至PEG三聚體。
向dAb的C末端加入多肽接頭或鉸鏈可在dAb和末端半胱氨酸殘基之間工程改造一個小接頭，其為(Gly4Ser)n，其中n＝1-10，例如1、2、3、4、5、6或7，或者為免疫球蛋白(例如IgG鉸鏈區)，或者為隨機肽序列(例如選自隨機肽序列文庫)。當用於製備多聚體(例如二聚體或三聚體)時，這又能在單個單體之間導入更高程度的彈性和距離，這種更高程度的彈性和距離可改善對靶的結合特性，所述靶例如為多亞單位靶，如人TNF-α。
實施例9.抗人血清白蛋白(HSA)和小鼠血清白蛋白(MSA)的單結構域抗體(dAb)收集物的選擇該實施例闡述了製備抗血清白蛋白的單結構域抗體(dAb)的方法。描述了對抗小鼠血清白蛋白(MSA)和人血清白蛋白(HSA)兩者的dAb的選擇。在該實驗中使用3種人噬菌體展示抗體文庫，每個均基於單個人VH(參見圖13基於V3-23/DP47和JH4b的模擬VH序列)或Vκ(參見圖15基於012/02/DPK9和Jk1的模擬Vκ序列)構架，具有由在互補決定區(CDR1、CDR2和CDR3)中摻入的NNK密碼子編碼的側鏈多樣性。
文庫1(VH)在以下位置的多樣性H30、H31、H33、H35、H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H97、H98文庫大小6.2×109文庫2(VH)在以下位置的多樣性H30、H31、H33、H35、H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H97、H98、H99、H100、H100a、H100b文庫大小4.3×109文庫3(Vκ)在以下位置的多樣性L30、L31、L32、L34、L50、L53、L91、L92、L93、L94、L96文庫大小2×109分別根據對屬配體A蛋白和L蛋白的結合預選擇VH和Vκ文庫，使得在未選擇文庫中的大部分克隆有功能。以上所示文庫的大小對應於預選擇後的大小。分別使用各個文庫對血清白蛋白進行兩輪選擇。對於每輪選擇，以在4ml PBS中的100μg/ml濃度將抗原包被在免疫管(nunc)上。在第一輪選擇中，分別對HSA(Sigma)和MSA(Sigma)淘選3個文庫中的每一個。在第二輪選擇中，(i)再次針對相同抗原(例如第1輪MSA，第2輪MSA)，和(ii)針對對等抗原(例如第1輪MSA，第2輪HSA)，淘選6個第一輪選擇中每一個的噬菌體，產生總共12個第2輪選擇。在每種情況下，在第2輪選擇之後，測試48個克隆與HSA和MSA的結合。如Harrison等，MethodsEnzymol.1996；26783-109對scFv片段的描述生產可溶性dAb片段，執行標準ELISA方法(Hoogenboom等，(1991)Nucleic Acids Res.，194133)，例外之處是2％Tween PBS用作封閉緩衝液，用L蛋白-HRP(Sigma)(對於Vκ)和A蛋白-HRP(Amersham Pharmacia Biotech)(對於VH)檢測結合的dAb。
以ELISA不溶形式檢驗產生背景以上信號(代表結合MSA、HSA或這二者)的dAb對單獨塑料的結合，但其全部都是血清白蛋白特異性的。然後測序克隆(參見下表)，結果揭示鑑別出21個獨特dAb序列。選定的VK dAb克隆之間的最小相似性(在胺基酸水平上)為86.25％((69/80)×100；全部多樣化殘基不同時的結果，例如克隆24和34)。選定的VHdAb克隆之間的最小相似性為94％((127/136)×100)。
接著，檢驗結合血清白蛋白的dAb捕獲溶液中的生物素化抗原的能力。實施ELISA法(如上所述)，例外之處是用1μg/ml L蛋白(對於Vκ克隆)和1μg/ml A蛋白(對於VH克隆)包被ELISA板。如在方法中所述捕獲溶液中的可溶性dAb，並用生物素化MSA或HSA和鏈黴HRP檢測。已按照生產商的說明製備生物素化MSA和HSA，目的是每個血清白蛋白分子平均獲得2個生物素。鑑別出24個在ELISA中捕獲溶液中的生物素化MSA的克隆。其中2個(以下的克隆2和38)還捕獲生物素化HSA。接著，測試dAb結合包被在CM5 Biacore晶片上的MSA的能力。發現8個克隆結合Biacore上的MSA。

在所有情況下構架均與對應模擬序列中的構架相同，CDR中的多樣性如上表所示。
在8個結合BIAcore上的MSA的克隆中有2個克隆在大腸桿菌中高度表達(克隆MSA16和MSA26)，選擇其進行進一步的研究(參見實施例10)。
在圖16中給出了MSA16和26的完整核苷酸和胺基酸序列。實施例10.測定結合MSA的dAb MSA16和MSA26在小鼠中的親合力和血清半壽期在大腸桿菌的周質中表達dab MSA16和MSA26，並使用分批吸附至L蛋白-瓊脂糖親合樹脂(Affitech，Norway)接著用甘氨酸pH 2.2洗脫進行純化。然後通過抑制性BIAcore分析純化的dAb，以測定Kd。簡單地講，測試純化的MSA16和MSA26，以測定在用高密度MSA包被的BIAcore CM5晶片上獲得200RU反應所需的dAb濃度。一旦確定了所需的dAb濃度，就將在預期Kd附近的濃度範圍的MSA抗原與dAb預混合，並過夜溫育。然後以30μl/分鐘的高流速檢測各個預混合物中dAb與MSA包被BIAcore晶片的結合。使用所獲得的曲線建立Klotz圖，該圖對MSA16給出的估算Kd為200nM，MSA26的估算Kd為70nM(圖17A和B)。
接著，將克隆MSA16和MSA26克隆入具有HA標記(核酸序列TATCCTTATGATGTTCCTGATTATGCA(SEQ ID NO91)和胺基酸序列YPYDVPDYA(SEQ ID NO92))的表達載體中，在大腸桿菌中表達2-10mg的量，用L蛋白-瓊脂糖親合樹脂(Affitech，Norway)由上清液純化，並用甘氨酸pH 2.2洗脫。測定小鼠中的dAb血清半壽期。MSA26和MSA16以約1.5mg/kg單劑靜脈注射入CD1小鼠中。
通過山羊抗HA(Abeam，UK)捕獲和用4％Marvel封閉的L蛋白-HRP(Invitrogen)檢測ELISA分析血清水平。漂洗採用0.05％TweenPBS。在1x小鼠血清存在下建立已知濃度dAb的標準曲線，以確保與測試樣品的可比性。用2種區室模型模擬顯示，MSA-26具有0.16小時的t1/2α，14.5小時的t1/2β，465小時mg/ml的曲線下面積(AUC)(數據未列出)，MSA-16具有0.98小時的t1/2α，36.5小時的t1/2β，913小時.mg/ml的AUC(圖18)。和具有0.06小時的t1/2α和0.34小時的t1/2β的HEL4(抗雞蛋溶菌酶dAb)相比，兩種抗MSA克隆具有延長得相當長的半壽期。
實施例11.VH-VH和Vκ-Vκ雙特異性Fab樣片段的建立該實施例描述了製備作為Fab樣片段的VH和Vκ雙特異性的方法。在構建所述的各Fab樣片段之前，首先由類似於實施例9描述的文庫的dAb文庫選擇結合選定靶的dAb。分離結合雞蛋溶菌酶(Sigma)的VHdAb-HEL4，又分離結合TNF-α受體(R D Systems)的第二個VHdAb(TAR2h-5)。序列表中給出了這些序列。通過選擇和親合力成熟分離結合TNF-α(TAR1-5-19)的VκdAb，該序列也示於序列表中。在這些實驗中還使用描述於實施例9的第二個VκdAb(MSA 26)，其序列在圖17B中。
用酶SalI和NotI消化含上述4個dAb的表達載體的DNA，以切除編碼dAb的DNA。通過在瓊脂糖凝膠上電泳消化物並切除條帶，接著使用Qiagen凝膠純化試劑盒(Qiagen，UK)凝膠過濾，純化預期大小(300-400bp)的條帶。然後將編碼dAb的DNA插入到如下表所示的CH或CK載體(圖8和9)中。
將VH CH和VH Cκ構建物共轉化入HB2151細胞中。獨立地將VκCH和VκCκ構建物共轉化入HB2151細胞中。過夜培養各個共轉化細胞系的培養物(在含5％葡萄糖、10μg/ml氯黴素和100μg/ml氨苄青黴素的2x TY中培養，以保持對CH和Cκ質粒的抗生素選擇性)。使用過夜培養物接種新鮮培養基(2x TY，10μg/ml氯黴素和100μg/ml氨苄青黴素)，並培養至OD 0.7-0.9，然後通過加入IPTG誘導，以表達其CH和Cκ構建物。
然後通過A蛋白純化(用於共轉化的VH CH和VH Cκ)和MSA親合樹脂純化(用於共轉化的VκCH和VκCκ)，由周質純化表達的Fab樣片段。
VH-VH雙特異性通過在凝膠上電泳蛋白檢驗VH CH和VH Cκ雙特異性的表達。印跡凝膠，可通過myc標記和flag標記這二者在蛋白質印跡上檢測為預期大小Fab片段的條帶，這表明同時存在Fab樣片段的VH CH和VH Cκ部分。接著，為了測定同一Fab樣片段中是否存在兩個一半雙特異性，用100μl/孔的雞蛋溶菌酶(HEL)的3mg/ml碳酸氫鈉緩衝液於4℃過夜包被ELISA板。然後用2％Tween PBS封閉(如實施例1所述)該板，接著與VH CH/VH Cκ雙特異性Fab樣片段溫育。使用9e10(結合myc標記的單克隆抗體，Roche)和抗小鼠IgG-HRP(Amersham Pharmacia Biotech)，通過非關連鏈檢測雙特異性抗體與HEL的結合。VH CH/VH Cκ雙特異性Fab樣片段的信號為0.154，相比之下單獨表達的VH Cκ鏈的背景信號為0.069。這表明Fab樣片段對靶抗原具有結合特異性。
Vκ-Vκ雙特異性在MSA親合樹脂上純化共轉化的VκCH和VκCκ雙特異性Fab樣片段之後，使用所獲得的蛋白探測用1μg/ml TNF-α包被的ELISA板和用10μg/ml MSA包被的ELISA板。正如所料，當用L蛋白-HRP在兩種ELISA板上檢測時出現背景以上的信號(數據未列出)。這表明，蛋白部分能夠結合MSA(並因此在MSA親合柱上純化)，又能夠在隨後的ELISA中結合TNF-α，證實了抗體片段的雙特異性。然後將此蛋白部分用於兩個隨後的實驗。首先，用雙特異性VκCH和VκCκFab樣片段探測用1μg/ml TNF-α包被的ELISA板，還用結合TNF-α的對照dAb以經計算在ELISA上產生相似信號的濃度探測該板。在有和沒有2mg/ml MSA的情況下，使用雙特異性和對照dAb兩者探測ELISA板。雙特異性孔中的信號降低超過50％，但dAb孔中的信號根本沒有下降(參見圖19a)。還將相同蛋白置於有和沒有MSA的受體實驗中，又顯示了MSA的競爭(參見圖19c)。這表明MSA與雙特異性的結合與其和TNF-α的結合競爭。
實施例12.建立對小鼠血清白蛋白和TNFα具有特異性的Vκ-Vκ雙特異性cys鍵合的雙特異性該實施例描述了經二硫鍵通過化學偶聯製備對小鼠血清白蛋白和TNF-α均具有特異性的雙特異性抗體片段的方法。將MSA16(得自實施例1)和TAR1-5-19 dAb這二者再克隆入具有C末端半胱氨酸和無標記的pET型載體中。兩種dAb以4-10mg水平表達，並使用L蛋白-瓊脂糖親合樹脂(Affitiech，Norway)由上清液純化。然後用二硫蘇糖醇還原半胱氨酸標記的dAb。接著將TAR1-5-19 dAb與二硫代二吡啶偶聯，以阻斷二硫鍵再形成，導致形成PEP 1-5-19同二聚體。然後於pH 6.5混合兩種不同的dAb，以促進二硫鍵形成和產生TAR1-5-19、MSA16 cys鍵合的異二聚體。此生產兩種不相似蛋白的綴合物的方法最初由King等(King TP，Li Kochoumian L Biochemistry.1978 17卷1499-506 Preparation of protein conjugates via intermoleculardisulfide bond formation)描述。通過陽離子交換分離異二聚體和單體物質。由在SDS凝膠上存在預期大小的條帶證實分離。以TNF受體實驗檢驗產生的異二聚化物質，發現其具有約18nM的中和TNF的IC50。接著，用恆定濃度的異二聚體(18nM)和系列稀釋的MSA和HSA重複受體實驗。一定範圍濃度(最高到2mg/ml)的HSA其存在不會導致二聚體抑制TNF-α的能力下降。
但是，加入MSA使二聚體抑制TNF-α的能力劑量依賴性下降(圖20)。這表明，MSA和TNF-α競爭結合cys鍵合的TAR1-19、MSA16二聚體。
數據匯總在前述實施例中陳述的實驗所獲得的數據匯總示於附件4。
實施例13抗TNF-αdAb的核酸和多肽序列的匯總在有關本文描述的抗TNF-αdAb的研究的整個過程中，鑑別出許多結合人和/或小鼠TNF-α的不同dAb。下文提供了序列和更多的信息。
結合小鼠TNF-α的克隆以下提供了4種抗小鼠TNF-αdAb的核苷酸和胺基酸序列。其中兩種(TAR1-2m-9和TAR1-2m-30)抑制小鼠TNF-α活性，兩種結合但不抑制(TAR1-2m-1和TAR1-2m-2)。
TAR1-2m-9TAR-2m-9是Vκ克隆，IC50為6μM，ND50為5μM。在L蛋白交聯時IC50和ND50未改善。該克隆對人TNF-α無作用(已以兩個濃度在細胞實驗中評價了種交叉反應性)，但對大鼠TNF-α具有相似的中和活性。
胺基酸序列(CDR3為粗體)(SEQ ID NO93)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGSFLWWYQQKPGKAPKLLIYYSSYLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYRWHPNTFGQGTKVEIKRNucleotide sequence(SEQ ID NO94)核苷酸序列(SEQ ID NO94)1gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagaccgtgtcacc61atcacttgccgggcaagtcagcctattgggagttttttatggtggtaccagcagaaacca121gggaaagcccctaaactcctgatctattatagttcctatttgcaaagtggggtcccatca181cgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacct241gaagattttgctacgtactactgtcaacagtatcgttggcatcctaataccttcggccaa301 gggaccaaggtggaaatcaaacggTAR1-2m-30
TAR1-2m-30是Vκ克隆，ND50為10μM。在L蛋白交聯時ND50未改善。該克隆對人TNF-α無作用(已以兩個濃度在細胞實驗中評價了種交叉反應性)，但和小鼠相比對大鼠TNF的有效性稍微降低。
胺基酸序列(CDR3為粗體)(SEQ ID NO95)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIYSWLNWYQQKPGKAPKLLIYRASHLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAlYYC FGQGTKVEIKR核苷酸序列(SEQ ID NO96)1gacatceagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagaccgtgtcacc61atcacttgccgggcaagtcagtcgatttatagttggttaaattggtaccagcagaaaCca121gggaaagcccctaagctcctgatctatagggcgtcccatttgcaaagtggggtcccatca181cgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacct241gaagattttgctacgtactactgtcaacagatttggaatatgccttttacgttcggccaa301 gggaecaaggtggaaatcaaacggTAR1-2m-1該克隆結合小鼠TNF-α，但不抑制受體結合活性。
胺基酸序列(SEQ ID NO97)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIGYDLFWYQQKPGKAPKLLIYRGSVLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRWRWPFTFGQGTKVEIKR核苷酸序列(SEQ ID NO98)1gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagaccgtgtcacc61atcacttgccgggcaagtcagcctattggttatgatttattttggtaccagcagaaacca121gggaaagcccctaagctcctgatctatcggggttccgtgttgcaaagtggggtcccatca181cgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacct241gaagattttgctacgtactactgtcaacagcggtggcgttggccttttacgttcggccaa301ggcaccaaggtggaaatcaaacggTAR1-2m-2該克隆結合小鼠TNF-α，但不抑制受體結合活性。
胺基酸序列(SEQ ID NO99)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTTTCRASLPIGRDLWWYQQKPGKAPKLLIYRGSFLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRWYYPHTFGQGTKVEIKR核苷酸序列(SEQ ID NO100)1gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagaccgtgtcacc61atcacttgccgggcaagtctgcctattggtcgtgatttatggtggtatcagcagaaacca121gggaaagcccctaagctcctgatctatcgggggtcctttttgcaaagtggggtcccatca181cgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacct241gaagattttgctacgtactactgtcaacagaggtggtattatcctcatacgttcggccaa301 gggaccaaggtggaaatcaaacgg結合人TNF-α的dAb克隆以下列出了鑑別出結合人TNF-α的dAb的核苷酸序列。對應的胺基酸序列提供於圖23中。
TAR1-5(SEQ ID NO101)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTTTTATGAATTTATTGTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAATGCATCCGTGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGGTTGTGTGGCGTCCTTTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGCTAR1-27(SEQ ID NO102)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTTGGACGAAGTTACATTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATATGGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGTGGTTTAGTAATCCTAGTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACG
TAR1-261(SEQ ID NO103)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGAGCATTATTTATGGTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCTATTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGAGTTTGGCGTGTCCTCCTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGTAR1-398(SEQ ID NO104)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTTATGGTCATTTATTGTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGCCTTTGGTGCGGCCTTTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGTAR1-701(SEQ ID NO105)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGCTAAGTTGTTATATTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCATCCTCTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGTGGTGGGGGTATCCTGGTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGTAR1-5-2(SEQ ID NO106)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTTTTCCTGCTTTACTTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATCATGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATATTGCTACGTACTACTGTCAACAGGTTGTGTGGCGTCCTTTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGTAR1-5-3(SEQ ID NO107)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGATAATGCGTTACATTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATCAGGCATCCATTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGGTTGTGTGGCGTCCTTTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGTAR1-5-4(SEQ ID NO108)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTTTTATGAATTTATTGTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAATGCATCCGTGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGGTTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGGTTGTGTGGCGTCCTTTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGTAR1-5-7(SEQ ID NO109)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTTTGAATTCTTTAC
ATTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATCATGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGGTTGTGTGGCGTCCTTTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGTAR1-5-8(SEQ ID NO110)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTTTGAATTCTTTACATTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATCATGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGGTTGTGTGGCGTCCTTTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGTAR1-5-10(SEQ ID NO111)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGATAATTATTTACATTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCCATTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGGTTGTGTGGCGTCCTTTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGTAR1-5-11(SEQ ID NO112)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAATGAGTATTTACATTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCGTGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGGTTGTGTGGCGTCCTTTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGTAR1-5-12(SEQ ID NO113)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAATTATGCTTTACATTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATCAGGCATCCATTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGGTTGTGTGGCGTCCTTTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGTAR1-5-13(SEQ ID NO114)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGATAGTTTTTTACATTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAGTGCATCCGAGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCATCCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGGTTGTGTGGCGTCCTTTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGTAR1-5-19(SEQ ID NO115)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCTCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGATAGTTATTTACATTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAGTGCATCCGAGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGGTTGTGTGGCGTCCTTTTACGTTCGGCCAA
GGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGTAR1-5-20(SEQ ID NO116)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGATCAGTATTTACATTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAATTTGCAAAGTGAGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGGTTGTGTGGCGTCCTTTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGTAR1-5-21(SEQ ID NO117)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGATAGTTTTTTACATTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAGTGCATCCGAGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCATCCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGGTTGTGTGGCGTCCTTTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGTAR1-5-22(SEQ ID NO118)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGATTCTTATTTACATTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAGTGCATCCCTGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGGTTGTGTGGCGTCCTTTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGTAR1-5-23(SEQ ID NO119)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGATCAGTATTTACATTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCCTTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACATACTACTGTCAACAGGTTGTGTGGCGTCCTTTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGTAR1-5-24(SEQ ID NO120)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAAAGCATTGATGAGTTTTTACATTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTGTGCATCCCAGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTACATCCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGGTTGTGTGGCGTCCTTTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGTAR1-5-25(SEQ ID NO121)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGATGCGTATTTACATTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCCTGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGGTTGTGTGGCGTCCTTTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGTAR1-5-26(SEQ ID NO122)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGA
CCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGATAGGTATTTACATTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAGTGCATCCGTGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACCCTCACCATCAGCAGTCTGCAGCCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGGTTGTGTGGCGTCCTTTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGTAR1-5-27(SEQ ID NO123)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGATAAGTATTTACATTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAGTGCATCCTCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGGTTGTGTGGCGTCCTTTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGTAR1-5-28(SEQ ID NO124)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGATCATTATTTACATTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAGTGCATCCGTTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACGTACTACTGTCAACAGGTTGTGTGGCGTCCTTTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGTAR1-5-29(SEQ ID NO125)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGATGAGTTTTTACATTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAGTGCATCCATTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGGTTGTGTGGCGTCCTTTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGTAR1-5-34(SEQ ID NO126)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTCAGACTGCGTTACTGTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAATGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACATACTACTGTCAACAGGTTGTGTGGCGTCCTTTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGTAR1-5-35(SEQ ID NO127)GACATCCAGAGGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGATCAGTATTTACATTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAATTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGGTTGTGTGGCGTCCTTTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGTAR1-5-36(SEQ ID NO128)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGATAATTATTTACATTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAGTGCATCCCAGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTG
CTACGTACTACTGTCAACAGGTTGTGTGGCGTCCTTTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGTAR1-5-464(SEQ ID NO129)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGATAATTTTTTACATTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAGTGCATCCGAGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGGTTGTGTGGCGTCCTTTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGTAR1-5-463(SEQ ID NO130)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGATGAGTATTTACATTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAACCCCCTAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGGTTGTGTGGCGTCCTTTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGTAR1-5-460(SEQ ID NO131)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGATCATTTTTTACATTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAGTGCATCCGAGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGGTTGTGTGGCGTCCTTTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGTAR1-5-461(SEQ ID NO132)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGATAATTATTTACATTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTCGGCATCCATGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGGTTGTGTGGCGTCCTTTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGTAR1-5-479(SEQ ID NO133)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGATGAGTATTTACATTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCCAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCATTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGCATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGGTTGTGTGGCGTCCTTTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGTAR1-5-477(SEQ ID NO134)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGATGAGTTTTTACATTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTCGGCATCCGCTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGGTTGTGTGGCGTCCTTTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGTAR1-5-478(SEQ ID NO135)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGATGAGTATTTACATTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCATTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCACCCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGGTTGTGTGGCGTCCTTTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGTAR1-5-476(SEQ ID NO136)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGATAATTATTTACATTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGATGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGGTTGTGTGGCGTCCTTTTGCGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGTAR1-5-490(SEQ ID NO137)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGATAGTTATTTACATTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAGTGCATCAAATTTAGAAACAGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGGTTGTGTGGCGTCCTTTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGTAR1h-1(SEQ ID NO138)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGTGATTTGGGATGCGTTAGATTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAGTGCGTCCCGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCATCCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGTATGCTGTGTTTCCTGTGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGTAR1h-2(SEQ ID NO139)GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGACTATTTATGATGCGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGGTTCCAGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCGGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGTATAAGACTAAGCCTTTGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGTAR1h-3(SEQ ID NO140)GACATCCAGATGACCCAGTCCCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGACTATTTATGATGCGTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGGTTCCAGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGTAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCCGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAACAGTATGCTCGTTATCCTCTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG另外的抗人TNF-αdAb克隆包括以下克隆幾個克隆已經歷親合力成熟。克隆TAR1-100-47是親合力成熟的克隆，在L929細胞實驗中的ND50為30-50nM，當與L蛋白交聯時ND50為3-5nM。TAR1-100-47與恆河猴TNF交叉反應。以下提供了其胺基酸序列和許多其它克隆的胺基酸序列。TAR1-2-100和TAR1-2-109是用於構建文庫的親代克隆。在該組中優良的TAR1克隆具有以下共有序列D/E30、W32、R94和F96在TAR1-100-47中以粗體顯示。
TAP1-100-29(SEQ ID NO141)，DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIEEWLMWYQQKPGKAPKLLIYNSSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDYATYYCQQPLSRRFTFGQGTKVEIKRTAR1-100-35(SEQ ID NO142)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQHIDDWLFWYQQKPGKAPKLLIYRASFLQSGVPSKFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKRTAP1-100-43(SEQ ID NO143)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQFIEDWLFWYQQKPGKAPKLLIYQASKLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKRTAR1-100-47(SEQ ID NO144)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIDSWLMWYQQKPGKAPKLLIYQASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ TGQGTKVEIKRTAR1-100-52(SEQ ID NO145)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQHIDDWLFWYQQKPGKAPKLLIYRASFLQSGVPPRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKRTAR1-109(SEQ ID NO146)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIDDHLMWYQQKPGKAPKLLIYSSSILQSGVPPRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKRTAR1-100(SEQ ID NO147)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIDHALLWYQQKPGKAPRLLIYNGSMLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVLRRPFTFGQGTKVEIKRTAR1-100-34(SEQ ID NO148)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQHIGDWLLWYQQKPGKAPMLLIYQSSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFILTISSLQPEDFATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKRTAR1-100-36(SEQ ID NO149)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQHIDSYLMWYQQKPGKAPKLLIYNTSVLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKRTAR1-100-38(SEQ ID NO150)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIDDHLFWYQQKPGKAPKLLIYNTSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFILTISSLQPEDFATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKRTAR1-100-39(SEQ ID NO151)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQFIDEHLMWYQQKPGKAPKLLIYRSSELQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKRTAR1-100-40(SEQ ID NO152)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWINNWLLWYQQKPGKAPKLLIYESSNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKRTAR1-100-41(SEQ ID NO153)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQLIDDHFWYQQKPGKAPTLLIYNSSVLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKRTAR1-100-45(SEQ ID NO154)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIDQWLMWYQQKPGKAPKLLIYQSSMLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKRTAR1-100-60(SEQ ID NO155)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIDNWLLWYQQKPGKAPKLLIYQASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKRTAR1-100-62(SEQ ID NO156)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIDSWLMWYQQKPGKAPKLLIYQASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPLSGPFTFGQGTKVEIKRTAR1-100-64(SEQ ID NO157)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTTTCRASQYIDYGLMWYQQKPGKAPKLLIYRTSELQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKRTAR1-100-65(SEQ ID NO158)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIDSFLMWYQQKPGKAPKLLIYNGSVLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKRTAR1-100-75(SEQ ID NO159)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGPWLMWYQQKPGKAPKLLIYQGSRLQSGVPLRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIRRTAR1-100-76(SEQ ID NO160)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQHIDSWLLWYQQKPGKAPKLLIYNGSVLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPLSGPFTFGQGTKVEIKRTAR1-100-77(SEQ ID NO161)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQHIDTHLFWYQQKPGKAPKLLIYNTSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKRTAR1-100-78(SEQ ID NO162)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQFIDTHLMWYQQKPGKAPRLLIYNTSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKRTAR1-100-80(SEQ ID NO163)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIDDWLLWYQQKPGKAPKLLIYQGSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDRATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKRTAR1-100-82(SEQ ID NO164)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIDDTLMWYQQKPGKAPKLLIYRSSMLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPLSRPFIFGQGTKVEIKRTAR1-100-83(SEQ ID NO165)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQYIDSHLMWYQQKPGKAPKLLIYDTSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKRTAR1-100-84(SEQ ID NO166)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQHIDQHLFWYQQKPGKAPKLLIYNSSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKRTAR1-100-89(SEQ ID NO167)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQHIERWLLWYQQKPGKAPKLLIYNSSKLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKRTAR1-100-90(SEQ ID NO168)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTISCRASQHIERWLLWYQQKPGKAPKLLIYNSSKLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKRTAR1-100-91(SEQ ID NO169)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGSWLMWYQQKSGKAPKLLIYNGSALQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKRTAR1-100-92(SEQ ID NO170)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQHIDKWLMWYQQKPGKAPKLLIYQASKLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKRTAR1-100-93(SEQ ID NO171)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIEEWLMWYQQKPGKAPKLIYNSSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFILTISSLQPEDFATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKRTAR1-100-94(SEQ ID NO172)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRRASQYIDYGLMWYQQKPGKAPKLLIYRTSELQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPLSRPFTFGQTAR1-100-95(SEQ ID NO173)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIDIHLMWYQQKPGKAPKLLIYQSSNLQSGVPSPFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKR
TAR1-100-96(SEQ ID NO174)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGPWLLWYQQKPGKAPKLLIYQSSELQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDLATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKRTAR1-100-97(SEQ ID NO175)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQEIGVWLMWYQQKPGKAPKLLIYEGSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPLSRPFVFGQGTKVEIKRTAR1-100-98(SEQ ID NO176)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGKWLMWYQQKPGKAPKLLIYQSSLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKRTAR1-100-99(SEQ ID NO177)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTIICRASQDIDTWLFWYQQKPGKAPKLLIYNGSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDFATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKRTAR1-100-100(SEQ ID NO178)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIDSWLMWYQQKPGKAPKLLIYQASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKRTAR1-100-101(SEQ ID NO179)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIEGWLLWYQQKPGKAPKLLIYNSSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKRTAR1-100-102(SEQ ID NO180)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQHIDDWLFWYQQKPGKAPKLLIYRASFLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKRTAR1-100-103(SEQ ID NO181)DIQMTQSPSSLSASVGDRYTITCRASQDIDTWLFWYQQKPGKAPKLLIYNGSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDFATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKRTAR1-100-105(SEQ IDNO182)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIEEWLLWYQQKPGKAPKLLIYNGSHLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKRTAR1-100-106(SEQ ID NO183)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQHIDKWLMWYQQKPGKAPKLLIYQASKLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKRTAR1-100-107(SEQ ID NO184)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDUEEWLMWYQQKPGKAPKLLIYNSSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDYATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKRTAR1-100-108(SEQ ID NO185)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIDYGLMWYQQKPGKAPKLLIYRSSQLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKR
TAR1-100-109(SEQ ID NO186)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTTTCRASQEIGSWLMWYQQKPGKAPKLLIYQSSKLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKRTAR1-100-110(SEQ ID NO187)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPIDSWLLWYQQKPGKAPKLLIYNASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKRTAR1-100-111(SEQ ID NO188)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGPWLMWYQQKPGKAPKLLIYQASALQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKRTAR1-100-112(SEQ ID NO189)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIHEWLMWYQQKPGKAPKLLIYQGSRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKRTAR1-100-113(SEQ ID NO190)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGPWLMWYQQKPGKAPKLLIYQASALQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYCQQPLSRPFTFGQGTKVEIKR在這些實施例中適於各種形式的TAR1-5-19抗人TNF-αdAb的序列如下TAR1-5-19胺基酸(SEQ ID NO191)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVKEFLWWYQQKPGKAPKLLIYMASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKFKLPRTFGQGTKVEIKR核苷酸(SEQ ID NO115)gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagaccgtgtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcgttaaggagtttttatggtggtaccagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatatggcatccaatttgcaaagtggggtcccatcacgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgctacgtactactgtcaacagaagtttaagctgcctcgtacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaacgg實施例14PEG化TAR1-5-19在關節炎預防模型中的效力研究Tg197小鼠是人TNF-球蛋白雜合基因轉基因的，雜合子在4-7周齡時出現具有和類風溼性關節炎一樣的組織學特徵的慢性進行性多關節炎[Keffer，J.，Probert，L，Cazlaris，H.，Georgopoulos，S.，Kaslaris，E.，Kioussis，D.，Kollias，G.(1991).Transgenic mice expressing humantumor necrosis factora predictive genetic model of arthritis.EMBO J.，第10卷，4025-4031頁]。
為測試PEG化dAb(為具有兩個dAb連接位點的2×20k分支的PEG形式，[即40K mPEG2 MAL2]，dAb為TAR1-5-19cys)在Tg197模型中預防關節炎的效力，將雜合子轉基因小鼠分為每組具有等數目雄性和雌性的10隻動物的組。治療在3周齡時開始，每周腹膜內注射測試物質。TAR1-5-19cys單體的表達和PEG化概述於實施例1的1.3.3節。所有蛋白製品都在磷酸緩衝鹽水中，測試所有蛋白製品的可接受的內毒素水平。
進行盲研究。每周稱重動物並按照以下系統記錄關節炎宏觀表型病徵0＝無關節炎(正常外觀和屈曲狀態)，1＝輕度關節炎(關節扭曲)，2＝中度關節炎(腫脹，關節變形)，3＝重度關節炎(移動嚴重受損)。
研究結果清晰表明，10mg/kg PEG化TAR1-5-19抑制關節炎發展，鹽水對照和治療組之間的關節炎記分有顯著差異。1mg/kg劑量的PEG化TAR1-5-19還產生統計學上顯著低於鹽水對照組的中值關節炎記分(P＜0.05％，使用Wilcoxon檢驗的正態近似)。
實施例15PEG化TAR1-5-19在關節炎治療模型中的效力研究為測試PEG化dAb在Tg197模型中對關節炎治療模型的效力，將雜合子轉基因小鼠分為每組具有等數目雄性和雌性的10隻小鼠的組別。治療在6周齡時開始，此時小鼠具有顯著關節炎表型。每周兩次以4.6mg/kg腹膜內注射測試物質進行治療。樣品製備和疾病記分如以上實施例14所述進行。
關節炎記分清晰表明，PEG化TAR1-5-19抑制治療模型中的關節炎發展。4.6mg/kg劑量的PEG化TAR1-5-19在第9周產生統計學上顯著低於鹽水對照組的中值關節炎記分(P＜0.01％，使用Wilcoxon檢驗的正態近似)。
實施例16緩釋形式的dAb效力為測試緩釋形式的dAb的效力，將具有小PEG分子的dAb(其中PEG為4×5k，4個dAb連接位點具有含C-末端cys殘基，dAb為TAR1-5-19[即20K PEG4臂MAL])加載至0.2ml滲透泵中。該泵在4周周期內具有0.2ml的釋放速率，在第6周將該泵皮下植入如上所述的治療性Tg197模型中。和植入鹽水加載泵的動物相比，這些動物的關節炎記分以明顯較慢的速率增加。這表明，dAb在由緩釋形式傳遞時是有效的。
實施例17半壽期穩定的抗人TNF-αdAb防止RA在Tg197小鼠模型中發作本文描述的dAb單體TAR1-5-19是親合力成熟的dAb單體，來源於使用被動包被的TNF-α初始選擇的dAb。初始克隆在L929TNF-細胞毒性中和實驗中具有大於5μM的ND50。TAR1-5-19具有小於30nM的ND50。當製成本文描述的Fc融合體時，TAR1-5-19克隆在L929實驗中具有小於5nM的ND50。
在將TAR1-5-19 dAb Fc-融合體注射入小鼠中後檢驗其血清半壽期。結果示於圖24。當TAR1-5-19 dAb單體具有約20分鐘的t1/2β時，該dAb的Fc-融合體構型形式具有超過24小時的t1/2β，表明血清半壽期增加超過70倍。
在上文描述的Tg197小鼠RA模型中測試TAR1-5-19 dAb Fc融合體構建物。將小鼠分為5組，每組10隻，具有等數量的雄性和雌性小鼠。每周兩次IP注射TAR1-5-19 dAb Fc融合體、ENBREL或鹽水進行治療，治療在3周齡時開始，3周齡是RA症狀還沒有表現出來的時間。研究進行7周。如圖25所示，給予1mg/kg和10mg/kg的兩劑TAR1-5-19 dAb Fc融合體。陰性對照動物每周接受兩次10mg/kg的陰性對照抗-β-gal Fc融合體，1組每周兩次用鹽水注射治療。為進行對比，1組每周接受兩次10mg/kg ENBREL。
如本文所述以盲方式評價動物的關節炎記分。在7周治療時程結束時，每周接受兩次10mg/kg劑量的TAR1-5-19 dAb Fc融合體的動物其具有的關節炎記分低於接受10mg/kg ENBREL的動物，並且，和接受陰性對照dAb Fc融合體的未治療動物相比，經歷基本徹底的關節炎疾病預防。
TNF-α與惡病質相關。在抗TNF-αdAb治療的整個過程中對動物稱重。接受TAR1-5-19 dAb Fc融合體的動物的體重顯著高於接受陰性對照dAb Fc融合體和未治療的動物的體重，並類似於接受ENBREL注射的動物體重。
總之，10mg/kg TAR1-5-19在Tg197模型中完全預防關節炎發作。這種反應是劑量依賴性的，1mg/kg劑量產生部分作用，反應優於用相似劑量的現有抗TNF-α藥物ENBREL觀測到的反應。該研究表明了dAb作為治療劑在臨床公認的人疾病模型中的效力。
動物關節固定化切片的組織病理學分析與這些數據(未列出)一致。
實施例18對不同的延長半壽期形式的體內研究在一個系列的研究中，檢驗3種不同的延長半壽期的抗TNF-αdAb形式對關節炎記分的作用。這些形式是抗TNF-αdAb Fc融合體(通過融合至人IgG CH2/CH3區同二聚化的兩個抗人TNF-αdAb)、兩個不同的PEG連接的抗TNF-αdAb構建物(2個相同dAb與2×20K分支PEG通過cys-馬來醯亞胺鍵形成的同二聚體和4個相同dAb與4×10K分支PEG通過cys-馬來醯亞胺鍵形成的同四聚體)和雙特異性抗TNF-α/抗SA dAb，其包含2個相同的後接抗小鼠血清白蛋白dAb的抗TNF-αdAb。
在獨立的研究中，如圖26所示以10mg/kg或1mg/kg每周給予1次藥物組合物，或以改變的劑量每周給予兩次藥物組合物，給予在3周齡時開始，並持續7周。
根據關節炎記分，在每周一次的注射方案中，10mg/kg的PEG化抗TNF dAb同二聚體對徹底預防關節炎有效。用於對比的現有抗TNF-α藥物相比於未治療動物關節炎記分下降，但記分以統計學顯著方式高於PEG化dAb構建物獲得的記分。抗TNF-α/抗SA雙特異性和Fc融合體相比於未治療顯示有效。
在1mg/kg每周一次的注射方案中，儘管沒有一個治療對預防疾病發作100％有效，但相比於未治療和現有抗TNF-α藥物，PEG化抗TNF-αdAb構建物仍對預防疾病症狀進展高度有效。在此給藥方案中，抗TNF-αdAb Fc融合體和雙特異性構建物也比現有藥物更有效。
總之，用3種不同形式的半壽期延長dAb進行的每周一次的給藥方案研究進一步驗證了治療在臨床公認的人疾病模型中的效力。
實施例19和現有的抗TNF-α治療劑相比抗人TNF-αdAb在Tg197小鼠RA模型中對既有疾病的效力在該研究中，以Tg197模型對比各種形式和給藥方案的抗TNF-αdAb構建物抗既有疾病的效力與等摩爾劑量的現有抗TNF-α治療劑ENBREL、HUMIRA和REMICADE的效力。在第6周而不是第3周時開始給予動物治療劑，使得關節炎症狀已表現出來。以盲方式通過組織學(第9周)和關節炎記分(每周1次)監測症狀。
圖27顯示了每周給予兩次的各種劑型和劑量。劑型包括Fc融合體(通過融合至人IgG1 CH2/CH3區同二聚化的兩個拷貝的TAR1-5-19 dAb)、TAR1-5-19 dAb PEG二聚體(2個相同dAb與2×20K分支PEG通過cys-馬來醯亞胺鍵形成的同二聚體)、TAR1-5-19 dAb PEG四聚體(4個相同dAb與4×10K分支PEG通過cys-馬來醯亞胺鍵形成的同四聚體)和TAR1-5-19 dAb/抗小鼠SA雙特異性(後接抗小鼠血清白蛋白dAb的兩個相同抗THF-αdAb的線性融合體)。給藥方案圖示於圖28。還評價了通過植入的滲透泵持續給予的4×5k PEG化TAR1-5-19構建物。
研究結果表明，沒有一種現有生物製劑可觀地逆轉關節炎記分達9周。和鹽水對照相比，TAR形式全部都較高或較低程度地穩定關節炎記分，這是統計學顯著的。而且，當與第6周記分相比時，有疾病逆轉的跡象。
當檢查組織病理學疾病狀態時，和第6周的關節相比，第9周的關節炎性關節也顯示出在用TAR形式治療後疾病嚴重性下降。這證實了TAR形式可激發既有疾病關節炎表型的逆轉。
這些研究證實了所測試的抗TNF-αdAb構建物對既有疾病的有效性，包括TNF-αdAb至少部分地逆轉病程的能力。
實施例20抗TNF dAb作為與抗血清白蛋白dAb的融合體的效力A TAR1-5-19/抗血清白蛋白dAb融合體在預防性關節炎模型中的效力研究Tg197小鼠是人TNF-球蛋白雜合基因轉基因的，雜合子在4-7周齡時出現具有和類風溼性關節炎一樣的組織學特徵的慢性進行性多關節炎[Keffer，J.，Probert，L，Cazlaris，H.，Georgopoulos，S.，Kaslaris，E.，Kioussis，D.，Kollias，G.(1991).Transgenic mice expressing humantumor necrosis factora predictive genetic model of arthritis.EMBO J.，第10卷，4025-4031頁]。
為測試TAR1-5-19/抗血清白蛋白dAb融合體(3個dAb的直列式三聚體，3個dAb為TAR1-5-19、TAR1-5-19和抗小鼠血清白蛋白dAb)在Tg197模型中預防關節炎的效力，將雜合子轉基因小鼠分為具有等數目雄性和雌性的每組10隻動物的組。治療在3周齡時開始，每周一次腹膜內注射測試物質。在大腸桿菌中表達具有C-末端6組氨酸標記的TAR1-5-19/抗血清白蛋白dAb融合體，並通過Ni親合層析、IEX和凝膠過濾純化。所有蛋白製品都在磷酸緩衝鹽水中，測試所有蛋白製品的可接受的內毒素水平。
進行盲研究。每周稱重動物並按照以下系統記錄關節炎宏觀表型病徵0＝無關節炎(正常外觀和屈曲狀態)，1＝輕度關節炎(關節扭曲)，2＝中度關節炎(腫脹，關節變形)，3＝重度關節炎(移動嚴重受損)。
研究結果清楚表明，10mg/kg TAR1-5-19/抗血清白蛋白dAb融合體抑制關節炎發展，鹽水對照和治療組之間的關節炎記分有顯著差異。1mg/kg劑量的TAR1-5-19/抗血清白蛋白dAb融合體還產生統計學上顯著低於鹽水對照組的中值關節炎記分(P＜2％，使用Wilcoxon檢驗的正態近似)。
B TAR1-5-19/抗血清白蛋白dAb融合體在治療性關節炎模型中的效力研究為測試TAR1-5-19/抗血清白蛋白dAb融合體在Tg197模型中對關節炎治療模型的效力，將雜合子轉基因小鼠分為具有等數目雄性和雌性的每組10隻小鼠的組。治療在6周齡時開始，此時小鼠具有顯著關節炎表型。每周兩次以2.7mg/kg腹膜內注射測試物質進行治療。樣品製備和疾病記分如上所述進行。
關節炎記分清楚表明，TAR1-5-19/抗血清白蛋白dAb融合體抑制治療模型中的關節炎發展。2.7mg/kg劑量的TAR1-5-19/抗血清白蛋白dAb融合體在第9周產生統計學上顯著低於鹽水對照組的中值關節炎記分(P＜0.05％，使用Wilcoxon檢驗的正態近似)。
這清楚表明，與抗SA dAb一起成型的抗TNF dAb有效，抗-SAdAb將抗TNF dAb的血清半壽期由單獨的抗TNF dAb的預期半壽期延長。
實施例21檢驗本文公開的抗TNF-αdAb在Tg197小鼠RA模型中對關節炎和組織病理學記分的作用進行兩個另外的研究，檢驗抗TNF-αdAb在Tg197小鼠RA模型中對關節炎和組織病理學記分的作用。
在第一個研究中，在RA症狀出現前的3周齡時開始每周兩次以10mg/kg給予如上所述的TAR1-5-19 dAb Fc融合體。和相同方案的鹽水、ENBREL和對照Fc融合體注射相比較判斷結果。
根據關節炎記分和組織學切片分析判斷，TAR1-5-19 dAb Fc融合體在小鼠中預防RA症狀發作比ENBREL更有效。
在第二個研究中，在3周齡時開始以10或1mg/kg每周注射一次抗TNF-αdAb Fc融合體、PEG二聚體和雙特異性抗TNF/抗SA，將其作用與ENBREL和HUMIRA對比。
當與鹽水對照相比時，以1mg/kg或10mg/kg劑量給予的所有TAR形式的關節炎記分都下降。而且，有證據表明疾病發作延遲。與Humira和Enbrel相比，PEG化和抗SA雙特異性形式在降低關節炎嚴重性方面更有效。另外，第10周的關節組織學分析也表明，和鹽水對照相比，TAR形式是有效的，降低疾病嚴重性。
總之，Fc融合體、PEG化和抗SA雙特異性形式的TAR1-5-19抗TNF-dAb在Tg197模型中全都有效抗RA症狀，無論是在關節炎症狀發作前還是後給予。在所有研究中，最有效的抗TNF dAb形式與HUMIRA等效或更有效，最有效的抗TNF dAb形式明顯比ENBREL更有效。
實施例22抗人VEGF dAbTAR15(抗人VEGF)以下描述了結合人VEGF的VK dAb。RBA指本文描述的VEGF受體2結合實驗。
當以各種濃度在低密度BIAcore晶片上測試時，TAR15-1克隆具有50-80nM的Kd。其它VK克隆以某一濃度(50nM)經過低密度晶片。不同的克隆顯示出不同的動力學模式。
胺基酸序列共有序列W28、G30、E32、S34、H50和Y93。
其它的TAR15抗人VEGF dAb克隆具有共有序列W28、G30、E32、S34、H50和Y93，如以下的TAR15-10所示。
TAR15-1(SEQ ID NO192)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGPELSWYQQKPGKAPKLIYHGSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRMYRPATFGQGTKVEIKRTAR15-3(SEQ ID NO193)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGRELKWYQQKPGKAPRLLIYHGSVLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDFFVPDTFGQGTKVEIKRTAR15-4(SEQ ID NO194)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIANDLMWYQQKPGKAPKLLIYRNSRLQGGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLVHRPYTIGQGTKVEIKRTAP15-9(SEQ ID NO195)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQFIGPHLTWYQQKPGKAPKLLIYHSSLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYMYYPSTFGQGTKVKIKPTAR15-10(SEQ ID NO196)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGPELSWYQQKPGKAPKLLIYHTSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYMFQPRTFGQGTKVEIRRTAR15-11(SEQ ID NO197)DIQMIQSPSSLSASVGDRVTITCRASQFIGNELSWYQQKPGKAPKLLIYHASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVLGYPYTFGQGTKVEIKRTAR15-12(SEQ ID NO198)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGPELSWYQQKPGKAPKLLIYHGSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVLYSPLTFGQGTKVEIKRTAR15-13(SEQ ID NO199)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGNELKWYQQKPGKAPKLLIYMSSLLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDLATYYCQQTLLLPFTFGQGTKVEIKRTAR15-14(SEQ ID NO200)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGPELSWYQQKPGKAPKLLIYHGSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRLYYPGTFGQGTKVEIKR
TAR15-15(SEQ ID NO201)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGRELSWYQQKPGKAPMLLIYHSSNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGMYWPYTFGQGTKVEIKRTAR15-16(SEQ ID NO202)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIKPALHWYQQKPGKAPKLLIYHGSILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTLFMPYTFGQGTKVEIKRTAR15-17(SEQ ID NO203)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTTTCRASQSISTALLWYQQKPGKAPKLLIYNGSMLPNGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTWDTPMTFGQGTKVEIKRTAR15-18(SEQ ID NO204)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGHDLSWYQQKPGKAPKLLIYHSSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQLMGYPFTFGQGTKVEIKRTAR15-19(SEQ ID NO205)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGGLLVWYQQKPGKAPKLLIYRSSYLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTWGIPHTFGQGTKVEIkRTAR15-20(SEQ ID NO206)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQKIFNGLSWYQQKPGKAPKLLIYHSSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVLLYPYTFGQGTKVEIKRTAR 15-22(SEQ ID NO207)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGTNLSWYQQKPGKAPRLLIYRTSMLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQQFFWPHTFGQGTKVEIKR以下描述了結合人VEGF的VH dAb。這些克隆在上清液PBA(R2)中產生下降(超過50％)
VH克隆以某一濃度(50nM)經過BIAcore上的低密度VEGF晶片。不同的克隆產生不同的動力學模式。
胺基酸序列TAR15-5(SEQ ID NO208)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRLYDMVWVRQAPGKGLEWVSYISSGGSGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAGGRASFDYWGQGTLVTVSSTAR15-6_(SEQ ID NO209)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFHLYDMMWVRQAPGKGLEWVSFIGGDGLNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAGTQFDYWGQGTLVTVSSTAR15-7(SEQ ID NO210)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNKYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGQDTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAETAVYYCAKNPQILSNFDYWGQGTLVTVSSTAR15-8(SEQ ID NO211)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFQWYPMWWVRQAPGKGLEWVSLIEGQGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAGDRTAGSRGNSFDYWGQGTLVTVSSTAR15-23(SEQ ID NO212)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKAYEMGWVRQAPGKGLEWVSGISPNGGWTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKESISPTPLGFDYWGQGTLVTVSSTAR15-24(SEQ ID NO213)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTGYEMGWVRQAPGKGLEWVSYISRGGRWTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSDTMFDYWGQGTLVTVSSTAR15-2S(SEQ ID NO214)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAYEMGWVRQAPGKGLEWVSFISGGGRWTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLFRAEDTAVYYCAKYSEDFDYWGQGTLVTVSSTAR15-26(SEQ ID NO215)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGAYPMMWVRQAPGKGLEWVSEISPSGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPRKFDYWGQGTLVTVSS
TAR15-27(SEQ ID NO216)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFQFYKMGWVRQAPGKGLEWVSSISSVGDATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKMGGGPPTYVVYFDYWGQGTLVTVSSTAR15-29(SEQ ID NO217)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGEYGMYWVRQAPGKGLEWVSSISERGRLTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNNLRAEDTAVYYCAKSALSSEGFSRSFDYWGQGTLVTVSSTAR15-30(SEQ ID NO218)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMYWVRQAPGKGLEWVSSITARGFITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSGFPHKSGSNYFDYWGQGTLVTVSS實施例23用抗VEGF dAb進行的其它研究可如上對各種抗TNF-αdAb所述，測試本文所述的各種形式抗VEGF dAb的效力，這些形式包括例如Fc融合體、Fab、PEG化形式、二聚體、四聚體和抗SA雙特異性形式。另外，不僅用本文描述的抗TNF-αdAb評價抗VEGF dAb，而且用其它抗TNF-α製品如HUMIRA、ENBREL和/或REMICADE評價抗VEGF dAb。
可進行其它的研究，以檢驗抗VEGF dAb在Tg197 RA模型中對例如關節炎和組織病理學記分的作用。
例如，在3周齡(RA症狀發作前)或6周齡(症狀發作後)時開始每周一次或兩次以1mg/kg或10mg/kg IP給予類似於上文描述的TAR1-5-19Fc融合體的TAR15 dAb Fc融合體，並持續達7周或以上。優選以等摩爾量，相比於鹽水、對照Fc融合體(抗β-gal)、單獨的TAR1-5-19、ENBREL、REMICADE和/或HUMIRA判斷結果。
如上所述記錄動物的宏觀表型指徵(例如關節炎記分)和組織病理學記分。由以下的任一項證實效力i)當在3周齡開始給予動物時不能出現疾病病徵(以關節炎或組織病理學記分為依據)，ii)相比於對照動物，當在3周齡開始給予時出現的疾病病徵嚴重性減弱，iii)相比於對照動物，當在6周齡開始給予時不能發展為更嚴重的疾病或以較低速率發展，
iv)當在6周齡開始給予動物時在7、8、9、10、11、12或14周中的任一周逆轉症狀(再次利用關節炎記分或組織病理學記分)。
可用上述不同形式(例如Fab、PEG化形式、二聚體、四聚體和抗SA雙特異性形式)的每一種進行相似的研究。
抗VEGF dAb(例如TAR15 dAb)還可與HUMIRA、ENBREL和/或REMICADE一起聯合給予Tg197小鼠模型。以和上述相同的方式進行這種研究，用於測試單獨的VEGF dAb，並以相同方式測定效力。
實施例24以Crohn病模型評價抗TNF-αdAb為評價抗TNF-αdAb(和/或抗VEGF dAb)在Crom病中的有效性，使用最初由Kontoyiannis等，1999，Immunity 10387-398描述的TNFΔARE轉基因小鼠Crohn病模型(還可以相似方式使用DSS模型)。動物出現IBD表型，與在4-8周齡之間開始的Crohn病具有相似性。因此，在3周齡(以測試疾病預防)或6周齡(以測試疾病症狀的穩定、預防發展或逆轉)時給予抗TNF-αdAb，例如各種形式的TAR1-5-19(Fc融合體、Fab、PEG化(二聚體、四聚體等)、與VEGF的雙特異性、與SA的雙特異性等)，如本文所述通過體重和組織學對動物記分。初始研究使用1mg/kg和10mg/kg的IP劑量，按照這些初始研究的結果進行調整。每周給予一次或兩次測試組合物，或者可連續給予，例如使用滲透泵。或者，還可使用口服傳遞劑型，例如用Zantac經口管飼或利用腸溶包衣製劑。研究一開始就持續達7周或以上。
以下的任一項均表明了在TNFΔARECrohn病模型中的效力i)當在3周齡開始給予動物時不能出現疾病症狀，ii)相比於對照動物，當在3周齡開始給予時出現的疾病症狀嚴重性減弱，iii)相比於對照動物，當在6周齡開始給予時不能發展為更嚴重的疾病或以較低速率發展，iv)當在6周齡開始給予動物時在7、8、9、10、11、12或14周中的任一周逆轉症狀。
具體地說，如果治療動物中的平均組織病理學疾病記分低於(依據統計學顯著量)載體對照組的記分，則治療被認為是有效的。如果平均組織病理學記分比僅載體的對照組低至少0.5單位、至少1.0單位、至少1.5單位、至少2.0單位、至少2.5單位、至少3.0單位或至少3.5單位，則治療也被認為是有效的。或者，如果在整個治療方案過程中平均組織病理學記分保持在或低至0-0.5，則治療是有效的。
同RA模型一樣，還以該模型評價了與VEGF特異性dAb或其它抗TNFα組合物(例如ENBREL、REMICADE和/或HUMIRA)的聯合治療的作用。
實施例25抗人TNF-α和人VEGF的雙特異性IgG在以下描述的工程改造的IgG樣雙特異性形式中，將兩種不同特異性的dAb分別融合至重鏈和輕鏈恆定結構域。當在細胞中共表達時，產生雙臂的IgG樣分子，其中能夠結合兩種治療靶(例如一種特異性針對TNF-α，一種特異性針對VEGF)的兩種可變結構域存在於雙靶向IgG的每個臂上。
DNA構建物使用的哺乳動物表達載體基於Invitrogen pcDNA3.1骨架，其有利於哺乳動物細胞中經CMV立即早期啟動子的基因表達。對於重鍊表達，將由人CD33信號肽和人IgG1重鏈恆定結構域組成的表達盒插入到載體pcDNA3.1(+)的NheI和XbaI限制位點中，使用HindIII和NotI限制位點，將VEGF特異性的並作為重鏈多肽的一部分表達的可變結構域克隆入CD33信號肽和IgG1重鏈恆定結構域之間的該表達盒中。對於輕鍊表達，將由人CD33信號肽和人Cκ恆定結構域組成的表達盒插入到載體pcDNA3.1zeo(+)的NheI和XbaI限制位點中，使用HindIII和NotI限制位點，將TNF-α特異性的並作為輕鏈多肽的一部分表達的可變結構域克隆入CD33信號肽和Cκ恆定結構域之間的該表達盒中。
蛋白表達和純化使用Qiagen EndoFree質粒Mega試劑盒，按照生產商的說明製備重鏈和輕鍊表達載體的DNA，並用Roche轉染試劑Fugeneó，按照生產商的說明，使用該DNA轉染HEK293(得自歐洲細胞培養物保藏中心)或Cos-7細胞(得自美國典型培養物保藏中心)。在5天後，通過離心收集培養培養上清液，並使用兩步親合純化來純化分泌的雙特異性抗體。首先，用磷酸緩衝鹽水(PBS)補加培養上清液至終濃度為1.5×PBS，將抗體捕獲在Amersham Streamline A蛋白樹脂上。用2×PBS清洗樹脂，接著用10mM Tris pH 8清洗樹脂，使用0.1M甘氨酸pH 2洗脫結合的抗體。通過加入25％體積的1M TrispH8中和洗脫液，將重組抗體捕獲在Affitech L蛋白瓊脂糖樹脂上。再使用2×PBS清洗樹脂，接著用10mM Tris pH 8清洗樹脂，使用0.1M甘氨酸pH 2洗脫結合的重組抗體，通過加入25％體積的1M Tris pH8中和洗脫液。
重組抗體的分析。在分光光度計上使用於280nm讀取的吸光度定量純化的重組抗體，並使用Invitrogen NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝膠和SilverQuest染色，按照生產商的說明，通過SDS-PAGE分析該純化的重組抗體。圖29顯示了含人VEGF特異性κ可變結構域(其融合至人IgG1重鏈恆定結構域)和人TNF-α特異性κ可變結構域(其融合至人Cκ恆定結構域)的雙特異性抗體的SDS-PAGE分析。泳道1加載Invitrogen MultiMark分子量標記，泳道2加載在1×InvitrogenNuPAGE LDS樣品緩衝液中的雙特異性抗體，泳道3加載在補加10mM β-巰基乙醇的1×Invitrogen NuPAGE LDS樣品緩衝液中的雙特異性抗體。在泳道3中，重鏈被視為50kDa條帶，輕鏈被視為25kDa條帶。
雙特異性的檢驗。通過檢測各個純化批次的抗體在人TNF細胞實驗和人VEGF受體結合實驗中的效力，證實表達的抗體的雙特異性性質。
使用的人TNF細胞型實驗為Evans(2000，MolecularBiotechnology 15，243-248)描述的L929細胞毒性實驗。簡單地講，將在微量滴定板上平板接種的L929細胞與雙特異性抗體、100pg/mlTNF和1mg/ml放線菌素D(Sigma，Poole，UK)過夜溫育。通過在與[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑_(Promega，Madison，USA)溫育後讀取490nm的吸光度檢測細胞存活力。抗TNF活性導致TNF細胞毒性下降，因此導致吸光度比僅TNF的對照增加。
使用基本如上文題為「免疫球蛋白型多特異性配體的製備」的章節描述的VEGFR2結合實驗，檢測VEGF活性。簡單地講，用0.5μg/ml重組人VEGF R2/Fc(RD Systems，目錄號357-KD-050)的碳酸鹽緩衝液過夜包被96孔Nunc Maxisorp實驗板。用0.05％Tween/PBS後接PBS重複地漂洗孔。加入2％BSA的PBS溶液，以封閉板。漂洗孔(如上所述)，然後將純化的雙特異性抗體加入至每個孔中。然後向每個孔中加入6ng/ml VEGF的稀釋液(終濃度3ng/ml)，將板於室溫溫育2小時。如上所述清洗孔，然後加入0.5μg/ml生物素化抗VEGF抗體(RD Systems，目錄號BAF293)的稀釋液，並於室溫溫育2小時。如上所述漂洗孔，接著加入HRP綴合的抗生物素抗體(1∶5000稀釋的稀釋液；Stratech，目錄號200-032-096)。然後將板於室溫溫育1小時。如上所述漂洗板，確保已去除了任何殘留的Tween-20。為進行檢測，向各個孔加入100μl SureBlue 1-Component TMB MicroWell過氧化物酶溶液。通過加入1M鹽酸終止反應，接著使用平板讀數器讀取OD450。
圖30顯示了含人VEGF特異性κ可變結構域(其融合至人IgG1重鏈恆定結構域)和人TNF-α特異性κ可變結構域(其融合至人Cκ恆定結構域)的雙特異性抗體的結果。雙特異性抗體(表示抗TNF-α×抗-VEGF)同時結合人TNF-α和人VEGF。抗體對兩種靶是雙價的對TNF-α的ND50(24nM)顯著低於在雙特異性分子中作為可變結構域融合至融合至Cκ的抗TNF-α單體(200nM)。VEGF的EC50(75pM)遠低於在雙特異性分子中作為可變結構域融合至重鏈恆定結構域的抗VEGF單體(12nM，未顯示)，也低於通過L蛋白交聯寡聚化的抗VEGF單體(以方塊顯示數據點的線，990pM)。
該實施方案的構建物是4價的雙特異性抗原結合多肽構建物，其包含結合第一個表位的2個拷貝的VH或VL單結構域抗體；和結合第二個表位的2個拷貝的VH或VL單結構域抗體。結合第一個表位的2個拷貝的單結構域抗體中的每一個都融合至IgG重鏈恆定結構域，結合第二個表位的2個拷貝的單結構域抗體中的每一個都融合至輕鏈恆定結構域。
本領域技術人員可使用例如其它抗TNF-α和抗VEGF抗體序列(例如本文描述的任一種)，產生類似於該實施例描述的構建物的其它雙特異性4價多肽構建物。在其它實施方案中，可使用Cκ或Cλ輕鏈恆定結構域，還可使用非IgG1的IgG重鏈恆定結構域。最令人感興趣的用於開發該類構建物的物質是單結構域抗TNF-α抗體克隆(其在作為dAb單體給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時防止關節炎記分增加)和單結構域抗VEGF抗體克隆(其在作為dAb單體給予膠原蛋白誘發的關節炎小鼠模型的小鼠時防止關節炎記分增加)。還優選單結構域抗TNF-α抗體克隆的單體在本文所述的L929細胞毒性實驗中中和人TNF-α，單結構域抗VEGF抗體克隆的單體在本文所述的VEGF受體2結合實驗中拮抗VEGF受體結合。優選使用的單結構域抗體克隆以小於100nM的Kd結合各自的表位。還優選此雙特異性4價構建物以小於100nM的Kd結合各自的表位，並在本文描述的任何Tg197和CIA關節炎模型或兩者中防止關節炎記分增加。
這種構建物可在給予、劑量和效力監測方面以和本文描述的其它構建物相似的方式用於治療類風溼性關節炎。可如上文所述修改構建物的半壽期，例如通過加入PEG部分和/或通過進一步融合對增加循環半壽期的蛋白(例如血清蛋白，如HSA)有特異性的結合部分(例如另一個單結構域抗體)。
本說明書中提及的所有出版物、專利和公開專利申請以及所述出版物中提及的參考文獻，都通過引用結合到本文中。本發明所述方法和系統的各種修飾和改變對本領域技術人員是顯而易見的，而不偏離本發明的範圍和精神。儘管已結合具體優選的實施方案描述的本發明，但應當理解的是，不應將要求保護的本發明過度不當地局限於這種具體實施方案。實際上，所描述的本發明實施方式的各種修改對分子生物學或相關領域的技術人員是顯而易見的，這些修改意在屬於以下權利要求的範圍。
附件1增強體內半壽期的多肽α-1糖蛋白(血清類粘蛋白)(AAG)α-1抗糜蛋白酶(ACT)α-1抗胰蛋白酶(AAT)α-1微球蛋白(蛋白HC)(AIM)α-2巨球蛋白(A2M)抗凝血酶III(AT III)載脂蛋白A-1(Apo A-1)載脂蛋白B(Apo B)β-2-微球蛋白(β2M)血漿銅藍蛋白(Cp)補體成分(C3)補體成分(C4)C1酯酶抑制劑(C1 INH)C-反應蛋白(CRP)半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(Cys C)鐵蛋白(FER)纖維蛋白原(FIB)纖連蛋白(FN)觸珠蛋白(Hp)血紅素結合蛋白(HPX)免疫球蛋白A(IgA)免疫球蛋白D(IgD)免疫球蛋白E(IgE)免疫球蛋白G(IgG)免疫球蛋白M(IgM)免疫球蛋白輕鏈(κ/λ)脂蛋白(a)[Lp(a)]
甘露糖結合蛋白(MBP)肌紅蛋白(Myo)纖維蛋白溶酶原(PSM)前白蛋白(轉甲狀腺素蛋白)(PAL)視黃醇結合蛋白(RBP)類風溼因子(RF)血清澱粉樣蛋白A(SAA)可溶性轉鐵受體(sTfR)轉鐵蛋白(Tf)
附件2
附件3腫瘤學組合
附件4數據總結
序列表110Domantis Ltd.
Ignatovich，OlgaDeWildt，Rudolph M.T.
Benjamin，WoolvenGrant，StevenJones，PhilipBasran，AmrikBrewis，Neil120用於治療炎性疾病的組合物和方法130P59456L-WO；8039/2108140還未指定1412005-06-30150PCT/GB2004/0028291512004-06-30150US 10/925,3661512004-08-24150US 11/098,7581512005-04-04160351170PatentIn版本3.12101
211116212蛋白質213人4001Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Ser Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110Thr Val Ser Ser1152102211348212DNA213人4002gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc60tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct120
ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac180gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgtgaca attccaagaa cacgctgtat240ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaagttat300ggtgcttttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 3482103211108212蛋白質213人4003Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr20 25 30Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Asn85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 1052104211324212DNA213人
4004gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc60atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtacca gcagaaacca120gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt ggcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag agttacagta cccctaatac gttcggccaa300gggaccaagg tggaaatcaa acgg 3242105211120212蛋白質213人工序列220
223人工抗體結構域序列4005Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Ile Ser Asp Glu20 25 30Asp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ser Ile Tyr Gly Pro Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Ser Ala Leu Glu Pro Leu Ser Glu Pro Leu Gly Phe Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 1202106211108212蛋白質213人工序列220
223人工抗體結構域序列4006Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr20 25 30Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Asn85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 10521072115212蛋白質
213人工序列220
223合成的接頭序列4007Gly Gly Gly Gly Ser1 5210821115212蛋白質213人工序列220
223合成的接頭序列4008Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5 10 15210921125212蛋白質213人工序列220
223合成的接頭序列4009Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser20 252101021135212蛋白質213人工序列220
223合成的接頭序列40010Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly1 5 10 15Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly20 25 30Gly Gly Ser352101121115212蛋白質213人工序列220
223合成的接頭序列40011Glu Pro Lys Ser Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro1 5 10 15
21012211119212蛋白質213人工序列220
223人工抗體結構域序列220
221其它特徵222(115)..(116)223X＝終止密碼子40012Trp Ser Ala Ser Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu1 5 10 15Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln20 25 30Ser Ile Asp Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala35 40 45Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Glu Leu Gln Ser Gly Val Pro50 55 60Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile65 70 75 80Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val85 90 95Val Trp Arg Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110Arg Cys Xaa Xaa Gly Ser Gly115
21013211357212DNA213人工序列220
223編碼人工抗體結構域序列的DNA40013tggagcgcgt cgacggacat ccagatgacc cagtctccat cctctctgtc tgcatctgta 60ggagaccgtg tcaccatcac ttgccgggca agtcagagca ttgatagtta tttacattgg 120taccagcaga aaccagggaa agcccctaag ctcctgatct atagtgcatc cgagttgcaa 180agtggggtcc catcacgttt cagtggcagt ggatctggga cagatttcac tctcaccatc 240agcagtctgc aacctgaaga ttttgctacg tactactgtc aacaggttgt gtggcgtcct 300tttacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaacggt gctaataagg atccggc 3572101421139212DNA213人工序列220
223合成的PCR引物40014tggagcgcgt cgacggacat ccagatgacc cagtctcca 3921015
21139212DNA213人工序列220
223合成的PCR引物40015ttagcagccg gatccttatt agcaccgttt gatttccac 39210162115212蛋白質213人工序列220
223合成抗體結構域的CDR序列220
221其它特徵222(1)..(3)223X＝任意胺基酸220
221其它特徵222(1)..(3)223X＝任意胺基酸
220
221其它特徵222(5)..(5)223X＝任意胺基酸40016Xaa Xaa Xaa Leu Xaa1 5210172117212蛋白質213人工序列220
223人工CDR2序列220
221其它特徵222(1)..(1)223X＝任意胺基酸220
221其它特徵222(4)..(4)223X＝任意胺基酸
40017Xaa Ala Ser Xaa Leu Gln Ser1 5210182119212蛋白質213人工序列220
223人工CDR3序列220
221其它特徵222(3)..(6)223X＝任意胺基酸220
221其它特徵222(8)..(8)223X＝任意胺基酸40018Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr1 5210192115
212蛋白質213人工序列220
223人工CDR1序列40019Ser Ser Tyr Leu Asn1 5210202117212蛋白質213人工序列220
223人工CDR2序列40020Arg Ala Ser Pro Leu Gln Ser1 5210212119212蛋白質213人工序列220
223人工CDR3序列40021
Gln Gln Thr Tyr Ser Val Pro Pro Thr1 5210222115212蛋白質213人工序列220
223人工CDR1序列40022Ser Ser Tyr Leu Asn1 5210232117212蛋白質213人工序列220
223人工CDR2序列40023Arg Ala Ser Pro Leu Gln Ser1 5210242119212蛋白質
213人工序列220
223人工CDR3序列40024Gln Gln Thr Tyr Arg Ile Pro Pro Thr1 5210252115212蛋白質213人工序列220
223人工CDR1序列40025Phe Lys Ser Leu Lys1 5210262117212蛋白質213人工序列220
223人工CDR2序列40026Asn Ala Ser Tyr Leu Gln Ser
1 5210272119212蛋白質213人工序列220
223人工CDR3序列40027Gln Gln Val Val Tyr Trp Pro Val Thr1 5210282115212蛋白質213人工序列220
223人工CDR1序列40028Tyr Tyr His Leu Lys1 5210292117212蛋白質213人工序列
220
223人工CDR2序列40029Lys Ala Ser Thr Leu Gln Ser1 5210302119212蛋白質213人工序列220
223人工CDR3序列40030Gln Gln Val Arg Lys Val Pro Arg Thr1 5210312115212蛋白質213人工序列220
223人工CDR1序列40031Arg Arg Tyr Leu Lys1 5
210322117212蛋白質213人工序列220
223人工CDR2序列40032Gln Ala Ser Val Leu Gln Ser1 5210332119212蛋白質213人工序列220
223人工CDR3序列40033Gln Gln Gly Leu Tyr Pro Pro Ile Thr1 5210342115212蛋白質213人工序列
220
223人工CDR1序列40034Tyr Asn Trp Leu Lys1 5210352117212蛋白質213人工序列220
223人工CDR2序列40035Arg Ala Ser Ser Leu Gln Ser1 5210362119212蛋白質213人工序列220
223人工CDR3序列40036Gln Gln Asn Val Val Ile Pro Arg Thr1 521037
2115212蛋白質213人工序列220
223人工CDR1序列40037Leu Trp His Leu Arg1 5210382117212蛋白質213人工序列220
223人工CDR2序列40038His Ala Ser Leu Leu Gln Ser1 5210392119212蛋白質213人工序列220
223人工CDR3序列40039Gln Gln Ser Ala Val Tyr Pro Lys Thr1 5210402115212蛋白質213人工序列220
223人工CDR1序列40040Phe Arg Tyr Leu Ala1 5210412117212蛋白質213人工序列220
223人工CDR2序列40041His Ala Ser His Leu Gln Ser1 521042
2119212蛋白質213人工序列220
223人工CDR3序列40042Gln Gln Arg Leu Leu Tyr Pro Lys Thr1 5210432115212蛋白質213人工序列220
223人工CDR1序列40043Phe Tyr His Leu Ala1 5210442117212蛋白質213人工序列220
223人工CDR2序列40044Pro Ala Ser Lys Leu Gln Ser1 5210452119212蛋白質213人工序列220
223人工CDR3序列40045Gln Gln Arg Ala Arg Trp Pro Arg Thr1 5210462115212蛋白質213人工序列220
223人工CDR1序列40046Ile Trp His Leu Asn1 5210472117
212蛋白質213人工序列220
223人工CDR2序列40047Arg Ala Ser Arg Leu Gln Ser1 5210482119212蛋白質213人工序列220
223人工CDR3序列40048Gln Gln Val Ala Arg Val Pro Arg Thr1 5210492115212蛋白質213人工序列220
223人工CDR1序列40049
Tyr Arg Tyr Leu Arg1 5210502117212蛋白質213人工序列220
223人工CDR2序列40050Lys Ala Ser Ser Leu Gln Ser1 5210512119212蛋白質213人工序列220
223人工CDR3序列40051Gln Gln Tyr Val Gly Tyr Pro Arg Thr1 5210522115212蛋白質
213人工序列220
223人工CDR1序列40052Leu Lys Tyr Leu Lys1 5210532117212蛋白質213人工序列220
223人工CDR2序列40053Asn Ala Ser His Leu Gln Ser1 5210542119212蛋白質213人工序列220
223人工CDR3序列40054Gln Gln Thr Thr Tyr Tyr Pro Ile Thr
1 5210552115212蛋白質213人工序列220
223人工CDR1序列40055Leu Arg Tyr Leu Arg1 5210562117212蛋白質213人工序列220
223人工CDR2序列40056Lys Ala Ser Trp Leu Gln Ser1 5210572119212蛋白質213人工序列
220
223人工CDR3序列40057Gln Gln Val Leu Tyr Tyr Pro Gln Thr1 5210582115212蛋白質213人工序列220
223人工CDR1序列40058Leu Arg Ser Leu Lys1 5210592117212蛋白質213人工序列220
223人工CDR2序列40059Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser1 5
210602119212蛋白質213人工序列220
223人工CDR3序列40060Gln Gln Val Val Tyr Trp Pro Ala Thr1 5210612115212蛋白質213人工序列220
223人工CDR1序列40061Phe Arg His Leu Lys1 5210622117212蛋白質213人工序列
220
223人工CDR2序列40062Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser1 5210632119212蛋白質213人工序列220
223人工CDR3序列40063Gln Gln Val Ala Leu Tyr Pro Lys Thr1 5210642115212蛋白質213人工序列220
223人工CDR1序列40064Arg Lys Tyr Leu Arg1 521065
2117212蛋白質213人工序列220
223人工CDR2序列40065Thr Ala Ser Ser Leu Gln Ser1 5210662119212蛋白質213人工序列220
223人工CDR3序列40066Gln Gln Asn Leu Phe Trp Pro Arg Thr1 5210672115212蛋白質213人工序列220
223人工CDR1序列
40067Arg Arg Tyr Leu Asn1 5210682117212蛋白質213人工序列220
223人工CDR2序列40068Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser1 5210692119212蛋白質213人工序列220
223人工CDR3序列40069Gln Gln Met Leu Phe Tyr Pro Lys Thr1 5210702115
212蛋白質213人工序列220
223人工CDR1序列40070Ile Lys His Leu Lys1 5210712117212蛋白質213人工序列220
223人工CDR2序列40071Gly Ala Ser Arg Leu Gln Ser1 5210722119212蛋白質213人工序列220
223人工CDR3序列40072
Gln Gln Gly Ala Arg Trp Pro Gln Thr1 5210732115212蛋白質213人工序列220
223人工CDR1序列40073Tyr Tyr His Leu Lys1 5210742117212蛋白質213人工序列220
223人工CDR2序列40074Lys Ala Ser Thr Leu Gln Ser1 5210752119212蛋白質
213人工序列220
223人工CDR3序列40075Gln Gln Val Arg Lys Val Pro Arg Thr1 5210762115212蛋白質213人工序列220
223人工CDR1序列40076Tyr Lys His Leu Lys1 5210772117212蛋白質213人工序列220
223人工CDR2序列40077Asn Ala Ser His Leu Gln Ser
1 5210782119212蛋白質213人工序列220
223人工CDR3序列40078Gln Gln Val Gly Arg Tyr Pro Lys Thr1 5210792115212蛋白質213人工序列220
223人工CDR1序列220
221其它特徵222(5)..(5)223X＝任意胺基酸40079Phe Lys Ser Leu Xaa1 5
210802117212蛋白質213人工序列220
223人工CDR2序列40080Asn Ala Ser Tyr Leu Gln Ser1 5210812119212蛋白質213人工序列220
223人工CDR3序列40081Gln Gln Val Val Tyr Trp Pro Val Thr1 5210822116212蛋白質213人工序列
220
223VH文庫1中的共有CDR1220
221其它特徵222(1)..(2)223X＝任意胺基酸220
221其它特徵222(4)..(6)223X＝任意胺基酸40082Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa1 52108321117212蛋白質213人工序列220
223VH文庫1中的共有CDR2220
221其它特徵222(1)..(1)
223X＝任意胺基酸220
221其它特徵222(3)..(5)223X＝任意胺基酸220
221其它特徵222(7)..(8)223X＝任意胺基酸220
221其它特徵222(10)..(10)223X＝任意胺基酸40083Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15Gly2108421111212蛋白質
213人工序列220
223VH文庫1中的共有CDR3220
221其它特徵222(1)..(8)223X＝任意胺基酸40084Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Asp Tyr1 5 10210852116212蛋白質213人工序列220
223VH文庫1中的共有CDR140085Trp Val Tyr Gln Met Asp1 52108621117212蛋白質
213人工序列220
223VH文庫1中的共有CDR240086Ser Ile Ser Ala Phe Gly Ala Lys Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15Gly210872117212蛋白質213人工序列220
223VH文庫1中的共有CDR340087Leu Ser Gly Lys Phe Asp Tyr1 5210882116212蛋白質213人工序列220
223VH文庫1中的共有CDR1
40088Trp Ser Tyr Gln Met Thr1 52108921117212蛋白質213人工序列220
223VH文庫1中的共有CDR240089Ser Ile Ser Ser Phe Gly Ser Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15Gly2109021111212蛋白質213人工序列220
223VH文庫1中的共有CDR340090Gly Arg Asp His Asn Tyr Ser Leu Phe Asp Tyr1 5 1021091
21127212DNA213人工序列220
223HA標記的核酸序列40091tatccttatg atgttcctga ttatgca27210922119212蛋白質213人工序列220
223HA標記的胺基酸序列40092Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala1 521093211108212蛋白質213人工序列220
223合成的抗體結構域
40093Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Pro Ile Gly Ser Phe20 25 30Leu Trp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Tyr Ser Ser Tyr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Trp His Pro Asn85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 10521094211324212DNA213人工序列220
223編碼合成的抗體結構域的核酸序列40094gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc60atcacttgcc gggcaagtca gcctattggg agttttttat ggtggtacca gcagaaacca120gggaaagccc ctaaactcct gatctattat agttcctatt tgcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tatcgttggc atcctaatac cttcggccaa300gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324
21095211108212蛋白質213人工序列220
223合成的抗體結構域40095Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Ser Trp20 25 30Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Arg Ala Ser His Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ile Trp Asn Met Pro Phe85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 10521096211324212DNA213人工序列
220
223編碼合成的抗體結構域的核酸序列40096gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc60atcacttgcc gggcaagtca gtcgatttat agttggttaa attggtacca gcagaaacca120gggaaagccc ctaagctcct gatctatagg gcgtcccatt tgcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag atttggaata tgccttttac gttcggccaa300gggaccaagg tggaaatcaa acgg 32421097211108212蛋白質213人工序列220
223合成的抗體結構域40097Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Pro Ile Gly Tyr Asp20 25 30Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Arg Gly Ser Val Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Trp Arg Trp Pro Phe
85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 10521098211324212DNA213人工序列220
223編碼合成的抗體結構域的核酸序列40098gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60atcacttgcc gggcaagtca gcctattggt tatgatttat tttggtacca gcagaaacca 120gggaaagccc ctaagctcct gatctatcgg ggttccgtgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag cggtggcgtt ggccttttac gttcggccaa 300ggcaccaagg tggaaatcaa acgg 32421099211107212蛋白質213人工序列220
223合成的抗體結構域40099Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Leu Pro Ile Gly Arg Asp20 25 30Leu Trp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Arg Gly Ser Phe Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Trp Tyr Tyr Pro His85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105210100211324212DNA213人工序列220
223編碼合成的抗體結構域的核酸序列400100gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc60atcacttgcc gggcaagtct gcctattggt cgtgatttat ggtggtatca gcagaaacca120gggaaagccc ctaagctcct gatctatcgg gggtcctttt tgcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag aggtggtatt atcctcatac gttcggccaa300gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324210101
211324212DNA213人工序列220
223編碼合成的抗體結構域的核酸序列400101gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc60atcacttgcc gggcaagtca gagcattttt atgaatttat tgtggtacca gcagaaacca120gggaaagccc ctaagctcct gatctataat gcatccgtgt tgcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gttgtgtggc gtccttttac gttcggccaa300gggaccaagg tggaaatcaa acgc 324210102211323212DNA213人工序列220
223編碼合成的抗體結構域的核酸序列400102gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc60atcacttgcc gggcaagtca gagcatttgg acgaagttac attggtacca gcagaaacca120gggaaagccc ctaagctcct gatctatatg gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tggtttagta atcctagtac gttcggccaa300
gggaccaagg tggaaatcaa acg323210103211324212DNA213人工序列220
223編碼合成的抗體結構域的核酸序列400103gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc60atcacttgcc gggcaagtca gagcattgag cattatttat ggtggtacca gcagaaacca120gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatcctatt tgcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag agtttggcgt gtcctcctac gttcggccaa300gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324210104211324212DNA213人工序列220
223編碼合成抗體的核酸序列400104gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc60atcacttgcc gggcaagtca gagcatttat ggtcatttat tgtggtacca gcagaaacca120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag cctttggtgc ggccttttac gttcggccaa300gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324210105211324212DNA213人工序列220
223編碼合成的抗體結構域的核酸序列400105gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc60atcacttgcc gggcaagtca gagcattgct aagttgttat attggtacca gcagaaacca120gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat gcatcctctt tgcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tggtgggggt atcctggtac gttcggccaa300gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324210106211324212DNA213人工序列220
223編碼合成的抗體結構域的核酸序列
400106gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc60atcacttgcc gggcaagtca gagcattttt cctgctttac tttggtacca gcagaaacca120gggaaagccc ctaagctcct gatctatcat gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240gaagatattg ctacgtacta ctgtcaacag gttgtgtggc gtccttttac gttcggccaa300gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324210107211224212DNA213人工序列220
223編碼合成的抗體結構域的核酸序列400107attggtacca gcagaaacca gggaaagccc ctaagctcct gatctatcag gcatccattt60tgcaaagtgg ggtcccatca cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca120ccatcagcag tctgcaacct gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gttgtgtggc180gtccttttac gttcggccaa gggaccaagg tggaaatcaa acgg 224210108211324212DNA213人工序列220
223編碼合成的抗體結構域的核酸序列
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220
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210179211108212蛋白質213人工序列220
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223合成的抗體結構域400217Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Glu Tyr20 25 30Gly Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ser Ile Ser Glu Arg Gly Arg Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Ser Ala Leu Ser Ser Glu Gly Phe Ser Arg Ser Phe Asp Tyr100 105 110Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120210218211123212蛋白質213人工序列220
223合成的抗體結構域400218Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr20 25 30Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ser Ile Thr Ala Arg Gly Phe Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Lys Ser Gly Phe Pro His Lys Ser Gly Ser Asn Tyr Phe Asp Tyr100 105 110Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120210219211240212蛋白質213人工序列220
223VH和VL通過Gly4Ser接頭連接的合成抗體序列，400219Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Ser Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly115 120 125Gly Gly Ser Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser130 135 140
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser145 150 155 160Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro165 170 175Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser180 185 190Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser195 200 205Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr210 215 220Ser Thr Pro Asn Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg225 230 235 240210220211720212DNA213人工序列220
223編碼VH和VL通過Gly4Ser接頭連接的合成抗體序列的核苷酸序列，400220gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct120ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac180gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgtgaca attccaagaa cacgctgtat240ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaagttat300ggtgcttttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcgagcgg tggaggcggt360tcaggcggag gtggcagcgg cggtggcggg tcgacggaca tccagatgac ccagtctcca420tcctccctgt ctgcatctgt aggagaccgt gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagc480
attagcagct atttaaattg gtaccagcag aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc540tatgctgcat ccagttggca aagtggggtc ccatcacgtt tcagtggcag tggatctggg600acagatttca ctctcaccat cagcagtctg caacctgaag attttgctac gtactactgt660caacagagtt acagtacccc taatacgttc ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgg720210221211359212DNA213人工序列220
223噬菌體載體表達盒核苷酸序列400221caggaaacag ctatgaccat gattacgcca agcttgcatg caaattctat ttcaaggaga 60cagtcataat gaaataccta ttgcctacgg cagccgctgg attgttatta ctcgcggccc120agccggccat ggccgaggtg tttgactact ggggccaggg aaccctggtc accgtctcga180gcggtggagg cggttcaggc ggaggtggca gcggcggtgg cgggtcgacg gacatccaga240tgacccaggc ggccgcagaa caaaaactcc atcatcatca ccatcacggg gccgcaatct300cagaagagga tctgaatggg gccgcataga ctgttgaaag ttgtttagca aaacctcat 35921022221196212蛋白質213人工序列220
223表達盒胺基酸序列
400222Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala1 5 10 15Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr20 25 30Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser35 40 45Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln Ala Ala Ala Glu50 55 60Gln Lys Leu His His His His His His Gly Ala Ala Ile Ser Glu Glu65 70 75 80Asp Leu Asn Gly Ala Ala Thr Val Glu Ser Cys Leu Ala Lys Pro His85 90 95210223211116212蛋白質213人工序列220
223克隆K8的VH序列400223Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser His Ile Ser Pro Tyr Gly Ala Asn Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Gly Leu Arg Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110Thr Val Ser Ser115210224211116212蛋白質213人工序列220
223克隆VH2的VH序列400224Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Asp Ile Gly Ala Thr Gly Ser Lys Thr Gly Tyr Ala Asp Pro Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Lys Val Leu Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110
Thr Val Ser Ser115210225211115212蛋白質213人工序列220
223克隆VH4的VH序列400225Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Arg Ile Asn Gly Pro Gly Ala Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu65 70 75 80Gln Ile Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Lys His Gly Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr100 105 110Val Ser Ser115210226211116212蛋白質
213人工序列220
223克隆VHC11的VH序列400226Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ser Ile Pro Ala Ser Gly Leu His Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Pro Gly Leu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110Thr Val Ser Ser115210227211115212蛋白質213人工序列220
223克隆VHA10sd的VH序列400227
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Asp Ile Glu Arg Thr Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu65 70 75 80Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Lys Lys Val Leu Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr100 105 110Val Ser Ser115210228211116212蛋白質213人工序列220
223克隆VHA1sd的VH序列400228Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
Ser Glu Ile Ser Ala Asn Gly Ser Lys Thr Gln Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Lys Val Leu Gln Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110Thr Val Ser Ser115210229211115212蛋白質213人工序列220
223克隆VHA5sd的VH序列400229Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Thr Ile Pro Ala Asn Gly Val Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu65 70 75 80Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95
Lys Ser Leu Leu Gln Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr100 105 110Val Ser Ser115210230211116212蛋白質213人工序列220
223克隆VHC5sd的VH序列400230Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Asp Ile Ala Ala Thr Gly Ser Ala Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Lys Ile Leu Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110Thr Val Ser Ser115210231
211116212蛋白質213人工序列220
223克隆VHC11的VH序列sd400231Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Thr Ile Ser Ser Val Gly Gln Ser Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Asn Leu Met Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110Thr Val Ser Ser115210232211108212蛋白質213人工序列
220
223克隆K8的Vk序列400232Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr20 25 30Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Arg Ala Ser His Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Pro Trp Arg Ser Pro Gly85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105210233211108212蛋白質213人工序列220
223克隆E5sd的Vk序列400233Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Leu Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Trp Trp Leu Pro Pro85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105210234211107212蛋白質213人工序列220
223克隆C3的Vk序列400234Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr20 25 30Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ala Ser Leu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Val Tyr Asp Pro Leu Thr85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105210235211120212蛋白質213人工序列220
223文庫的模擬VH220
221其它特徵222(103)..(106)223103-106位的Xaa是由NNK密碼子編碼的胺基酸，其中N是G、A、T或C中的任一個400235Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Ser Tyr Gly Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120210236211360212DNA213人工序列220
223文庫的模擬VH的核苷酸序列220
221其它特徵222(307)..(317)223N是G、A、T或C400236gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct120ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac180gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgtgaca attccaagaa cacgctgtat240ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaagttat300ggtgctnnkn nknnknnktt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcgagc360210237211108212蛋白質
213人工序列220
223抗鼠血清白蛋白結構域抗體的序列400237Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ile Lys His20 25 30Leu Lys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Gly Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ala Arg Trp Pro Gln85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105210238211324212DNA213人工序列220
223編碼抗鼠血清白蛋白結構域抗體的核苷酸序列400238gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60atcacttgcc gggcaagtca gagcattatt aagcatttaa agtggtacca gcagaaacca120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatggt gcatcccggt tgcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag ggggctcggt ggcctcagac gttcggccaa300gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324210239211108212蛋白質213人工序列220
223抗鼠血清白蛋白結構域抗體的序列400239Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Tyr His20 25 30Leu Lys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Arg Lys Val Pro Arg85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105210240
211324212DNA213人工序列220
223編碼抗鼠血清白蛋白結構域抗體的核苷酸序列400240gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60atcacttgcc gggcaagtca gagcatttat tatcatttaa agtggtacca gcagaaacca120gggaaagccc ctaagctcct gatctataag gcatccacgt tgcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gttcggaagg tgcctcggac gttcggccaa300gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324210241211324212DNA213人工序列220
223抗鼠血清白蛋白結構域抗體的核苷酸序列400241gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60atcacttgcc gggcaagtca gagcattttt atgaatttat tgtggtacca gcagaaacca120gggaaagccc ctaagctcct gatctataat gcatccgtgt tgcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gttgtgtggc gtccttttac gttcggccaa300
gggaccaagg tggaaatcaa acgc 324210242211323212DNA213人工序列220
223抗鼠血清白蛋白結構域抗體的核苷酸序列400242gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60atcacttgcc gggcaagtca gagcatttgg acgaagttac attggtacca gcagaaacca120gggaaagccc ctaagctcct gatctatatg gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tggtttagta atcctagtac gttcggccaa300gggaccaagg tggaaatcaa acg323210243211324212DNA213人工序列220
223抗鼠血清白蛋白結構域抗體的核苷酸序列400243gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60atcacttgcc gggcaagtca gagcattgag cattatttat ggtggtacca gcagaaacca120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatcctatt tgcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag agtttggcgt gtcctcctac gttcggccaa300gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324210244211324212DNA213人工序列220
223抗鼠血清白蛋白結構域抗體的核苷酸序列400244gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60atcacttgcc gggcaagtca gagcatttat ggtcatttat tgtggtacca gcagaaacca120gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag cctttggtgc ggccttttac gttcggccaa300gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324210245211324212DNA213人工序列220
223抗鼠血清白蛋白結構域抗體的核苷酸序列
400245gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60atcacttgcc gggcaagtca gagcattgct aagttgttat attggtacca gcagaaacca120gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat gcatcctctt tgcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tggtgggggt atcctggtac gttcggccaa300gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324210246211324212DNA213人工序列220
223抗鼠血清白蛋白結構域抗體的核苷酸序列400246gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60atcacttgcc gggcaagtca gagcattttt cctgctttac tttggtacca gcagaaacca120gggaaagccc ctaagctcct gatctatcat gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240gaagatattg ctacgtacta ctgtcaacag gttgtgtggc gtccttttac gttcggccaa300gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324210247211324212DNA213人工序列
220
223抗鼠血清白蛋白結構域抗體的核苷酸序列400247gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60atcacttgcc gggcaagtca gagcattgat aatgcgttac attggtacca gcagaaacca120gggaaagccc ctaagctcct gatctatcag gcatccattt tgcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gttgtgtggc gtccttttac gttcggccaa300gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324210248211324212DNA213人工序列220
223抗鼠血清白蛋白結構域抗體的核苷酸序列400248gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60atcacttgcc gggcaagtca gagcattttt atgaatttat tgtggtacca gcagaaacca120gggaaagccc ctaagctcct gatctataat gcatccgtgt tgcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacaggt ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gttgtgtggc gtccttttac gttcggccaa300gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324210249
211324212DNA213人工序列220
223抗鼠血清白蛋白結構域抗體的核苷酸序列400249gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60atcacttgcc gggcaagtca gagcattttg aattctttac attggtacca gcagaaacca120gggaaagccc ctaagctcct gatctatcat gcatccactt tgcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gttgtgtggc gtccttttac gttcggccaa300gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324210250211324212DNA213人工序列220
223抗鼠血清白蛋白結構域抗體的核苷酸序列400250gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60atcacttgcc gggcaagtca gagcattttg aattctttac attggtacca gcagaaacca120gggaaagccc ctaagctcct gatctatcat gcatccactt tgcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gttgtgtggc gtccttttac gttcggccaa300
gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324210251211324212DNA213人工序列220
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223抗鼠血清白蛋白結構域抗體的核苷酸序列400252gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60atcacttgcc gggcaagtca gagcattaat gagtatttac attggtacca gcagaaacca120
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223抗鼠血清白蛋白結構域抗體的核苷酸序列
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223抗鼠血清白蛋白結構域抗體的核苷酸序列
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223抗鼠血清白蛋白結構域抗體的核苷酸序列
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223結構域抗體的胺基酸序列400286Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Trp Tyr20 25 30Trp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Val Lys Leu Gly Gly Gly Pro Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120210287211362212DNA213人工序列220
223結構域抗體的核苷酸序列400287gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60tcctgtgcag cctccggatt cacctttgag tggtattgga tgggttgggt ccgccaggct120ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac180gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat240ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagttaag300ttgggggggg ggcctaattt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcgagc360gc 362210288211108212蛋白質213人工序列220
223結構域抗體的胺基酸序列400288Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Ser Tyr20 25 30Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ser Ala Ser Glu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Val Trp Arg Pro Phe85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105210289211324212DNA213人工序列220
223結構域抗體的核苷酸序列400289gacatccaga tgacccagtc tccatcctct ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60atcacttgcc gggcaagtca gagcattgat agttatttac attggtacca gcagaaacca120gggaaagccc ctaagctcct gatctatagt gcatccgagt tgcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gttgtgtggc gtccttttac gttcggccaa300gggaccaagg tggaaatcaa acgc 324210290
211108212蛋白質213人工序列220
223結構域抗體的胺基酸序列400290Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Phe Met Asn20 25 30Leu Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Asn Ala Ser Val Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Val Trp Arg Pro Phe85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105210291211324212DNA213人工序列220
223結構域抗體的核苷酸序列
400291gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc60atcacttgcc gggcaagtca gagcattttt atgaatttat tgtggtacca gcagaaacca120gggaaagccc ctaagctcct gatctataat gcatccgtgt tgcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gttgtgtggc gtccttttac gttcggccaa300gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324210292211108212蛋白質213人工序列220
223結構域抗體的胺基酸序列400292Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Asp Ala20 25 30Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Thr Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Met Gln Arg Pro Val85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
210293211324212DNA213人工序列220
223結構域抗體的核苷酸序列400293gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc60atcacttgcc gggcaagtca gagcatttat gatgcgttag agtggtacca gcagaaacca120gggaaagccc ctaagctcct gatctatact gcatcccggt tgcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gttatgcagc gtcctgttac gttcggccaa300gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324210294211108212蛋白質213人工序列220
223結構域抗體的胺基酸序列220
221其它特徵222(34)..(34)223終止密碼子
400294Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Asp Ala20 25 30Leu Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Thr Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Val Met Gln Arg Pro Val85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105210295211324212DNA213人工序列220
223結構域抗體的核苷酸序列400295gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc60atcacttgcc gggcaagtca gagcatttat gatgctttac agtggtacca gcagaaacca120gggaaagccc ctaagctcct gatctatact gcatcccggt tgcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240
gaagattttg ctacgtacca ctgtcaacag gttatgcagc gtcctgttac gttcggccaa300gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324210296211108212蛋白質213人工序列220
223結構域抗體的胺基酸序列400296Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Lys Glu Phe20 25 30Leu Trp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Met Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Lys Phe Lys Leu Pro Arg85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105210297211324212DNA213人工序列
220
223結構域抗體的核苷酸序列400297gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc60atcacttgcc gggcaagtca gagcgttaag gagtttttat ggtggtacca gcagaaacca120gggaaagccc ctaagctcct gatctatatg gcatccaatt tgcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag aagtttaagc tgcctcgtac gttcggccaa300gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324210298211108212蛋白質213人工序列220
223結構域抗體的胺基酸序列400298Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Trp Thr Lys20 25 30Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Met Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Phe Ser Asn Pro Ser85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105210299211324212DNA213人工序列220
223結構域抗體的核苷酸序列400299gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc60atcacttgcc gggcaagtca gagcatttgg acgaagttac attggtacca gcagaaacca120gggaaagccc ctaagctcct gatctatatg gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tggtttagta atcctagtac gttcggccaa300gggaccaagg tggaaatcaa acgc 324210300211108212蛋白質213人工序列220
223結構域抗體的胺基酸序列
220
221其它特徵222(30)..(30)223終止密碼子400300Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Xaa Pro Ile20 25 30Leu Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ile Gln His Ile Pro Val85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105210301211324212DNA213人工序列220
223結構域抗體的核苷酸序列400301gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc60
atcacttgcc gggcaagtca gagcatttag ccgattttat gttggtacca gcagaaacca120gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag attcagcata ttcctgtgac gttcggccaa300gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324210302211108212蛋白質213人工序列220
223結構域抗體的胺基酸序列220
221其它特徵222(31)..(31)223終止密碼子400302Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Xaa Asp20 25 30Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Thr Ala Ser Leu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gln Ser Ala Phe Pro Asn85 90 95Thr Leu Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105210303211324212DNA213人工序列220
223結構域抗體的核苷酸序列400303gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc60atcacttgcc gggcaagtca gagcattggg taggatttac attggtacca gcagaaacca120gggaaagccc ctaagctcct gatctatacg gcatcccttt tgcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag cagagtgctt ttcctaatac gctcggccaa300gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324210304211108212蛋白質213人工序列220
223結構域抗體的胺基酸序列
220
221其它特徵222(50)..(50)223終止密碼子400304Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Thr Lys Asn20 25 30Leu Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Xaa Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Arg His Lys Pro Pro85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105210305211324212DNA213人工序列220
223結構域抗體的核苷酸序列400305
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ccgtaggaga ccgtgtcacc60atcacttgcc gggcaagtca gagcataacg aagaatttac tttggtacca gcagaaacca120gggaaagccc ctaagctcct gatctattag gcatcctctt tgcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag cttcgtcata agcctccgac gttcggccaa300gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324210306211108212蛋白質213人工序列220
223結構域抗體的胺基酸序列220
221其它特徵222(30)..(30)223終止密碼子400306Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Xaa Lys Ser20 25 30Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr His Ala Ser Asp Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Met Val Asn Ser Pro Val85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105210307211324212DNA213人工序列220
223結構域抗體的核苷酸序列400307gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc60atcacttgcc gggcaagtca gagcatttag aagtctttaa ggtggtacca gcagaaacca120gggaaagccc ctaagctcct gatctatcat gcatccgatt tgcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag atggttaata gtcctgttac gttcggccaa300gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324210308211108212蛋白質213人工序列220
223結構域抗體的胺基酸序列220
221其它特徵222(30)..(30)223終止密碼子400308Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Xaa Thr Ala20 25 30Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Phe Leu Pro Phe85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105210309211324212DNA213人工序列220
223結構域抗體的核苷酸序列
400309gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc60atcacttgcc gggcaagtca gagcatttag acggcgttac attggtacca gcagaaacca120gggaaagccc ctaagctcct gatctattct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tcgagttttt tgccttttac gttcggccaa300gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324210310211108212蛋白質213人工序列220
223結構域抗體的胺基酸序列400310Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Pro Ash20 25 30Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gln Met Gly Arg Pro Arg85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105
210311211324212DNA213人工序列220
223結構域抗體的核苷酸序列400311gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc60atcacttgcc gggcaagtca gagcattggg ccgaatttag agtggtacca gcagaaacca120gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag cagatggggc gtcctcggac gttcggccaa300gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324210312211108212蛋白質213人工序列220
223結構域抗體的胺基酸序列220
221其它特徵222(32)..(32)223終止密碼子
400312Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Lys His Xaa20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Lys Ala Ser Val Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Arg Arg Arg Pro Thr85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105210313211324212DNA213人工序列220
223結構域抗體的核苷酸序列400313gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc60atcacttgcc gggcaagtca gagcattaag cattagttag cttggtacca gcagaaacca120gggaaagccc ctaagctcct gatctataag gcatccgtgt tgcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240
gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag cttaggcgtc gtcctactac gttcggccaa300gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324210314211108212蛋白質213人工序列220
223結構域抗體的胺基酸序列220
221其它特徵222(32)..(32)223終止密碼子400314Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Lys Ala Xaa20 25 30Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Ser Ser Arg Pro Tyr85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105210315211324212DNA213人工序列220
223結構域抗體的核苷酸序列400315gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc60atcacttgcc gggcaagtca gagcgttaag gcttagttaa cttggtacca gcagaaacca120gggaaagccc ctaagctcct gatctataag gcatccactt tgcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag catagttcta ggccttatac gttcggccaa300gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324210316211108212蛋白質213人工序列220
223結構域抗體的胺基酸序列220
221其它特徵222(50)..(50)
223終止密碼子400316Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Glu Asn Arg20 25 30Leu Gly Glu Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Xaa Ala Ser Leu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Ser Tyr Phe Pro Arg85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105210317211324212DNA213人工序列220
223結構域抗體的核苷酸序列400317gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc60atcacttgcc gggcaagtca gagcattgag aatcggttag gttggtacca gcagaaacca120gggaaagccc ctaagctcct gatctattag gcgtccttgt tgcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240
gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gattcgtatt ttcctcgtac gttcggccaa300gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324210318211108212蛋白質213人工序列220
223結構域抗體的胺基酸序列220
221其它特徵222(50)..(50)223終止密碼子400318Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Met Asp Lys20 25 30Leu Lys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Xaa Ala Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Ser Gly Gly Pro Asn85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105210319211324212DNA213人工序列220
223結構域抗體的核苷酸序列400319gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc60atcacttgcc gggcaagtca gagcattatg gataagttaa agtggtacca gcagaaacca120gggaaagccc ctaagctcct gatctattag gcatccattt tgcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gatagtgggg gtcctaatac gttcggccaa300gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324210320211108212蛋白質213人工序列220
223結構域抗體的胺基酸序列400320Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Arg Asn20 25 30Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Asp Ala Ser His Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg Glu Leu Pro Arg85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105210321211324212DNA213人工序列220
223結構域抗體的核苷酸序列400321gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc60atcacttgcc gggcaagtca gagcattggg aggaatttag agtggtacca gcagaaacca120gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat gcatcccatt tgcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tcgcgttggc ttcctcgtac gttcggccaa300gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324210322211108
212蛋白質213人工序列220
223結構域抗體的胺基酸序列400322Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Lys Met20 25 30Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Arg Ala Ser Tyr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Phe Arg Arg Pro Arg85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105210323211324212DNA213人工序列220
223結構域抗體的核苷酸序列400323gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagg aagatgttag tttggtacca gcagaaacca120gggaaagccc ctaagctcct gatctatcgg gcatcctatt tgcaaagtgg ggtcccatca180cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct240gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gcttttcggc ggcctaggac gttcggccaa300gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324210324211115212蛋白質213人工序列220
223結構域抗體的胺基酸序列400324Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Leu Tyr20 25 30Asn Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Phe Ile Ser Gln Thr Gly Arg Leu Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Thr Leu Glu Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110Thr Val Ser
115210325211345212DNA213人工序列220
223結構域抗體的核苷酸序列400325gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc60tcctgtgcag cctccggatt cacctttgat ctttataata tgttttgggt ccgccaggct120ccagggaagg gtctagagtg ggtctcattt attagtcaga ctggtaggct tacatggtac180gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat240ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaacgctg300gaggattttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcg345210326211119212蛋白質213人工序列220
223結構域抗體的胺基酸序列400326Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Pro Val Tyr
20 25 30Met Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ser Ile Asp Ala Leu Gly Gly Arg Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Thr Met Ser Asn Lys Thr His Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser115210327211357212DNA213人工序列220
223結構域抗體的核苷酸序列400327gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc60tcctgtgcag cctccggatt cacctttccg gtttatatga tgggttgggt ccgccaggct120ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatcg attgatgctc ttggtgggcg gacaggttac180gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat240ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaactatg300tcgaataaga cgcatacgtt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcg 357210328
211115212蛋白質213人工序列220
223結構域抗體的胺基酸序列220
221其它特徵222(57)..(57)223終止密碼子400328Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Val Ala Tyr20 25 30Asn Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ser Ile Asn Thr Phe Gly Asn Xaa Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Gly Ser Arg Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110Thr Val Ser115
210329211345212DNA213人工序列220
223結構域抗體的核苷酸序列400329gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc60tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtg gcttataata tgacttgggt ccgccaggct120ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaagt attaatactt ttggtaatta gacaaggtac180gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat240ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaggtagt300aggccttttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcg345210330211119212蛋白質213人工序列220
223結構域抗體的胺基酸序列220
221其它特徵222(30)..(30)223終止密碼子
400330Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Xaa Gly Tyr20 25 30Arg Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Trp Ile Thr Arg Thr Gly Gly Thr Thr Gln Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Pro Ala Lys Leu Val Gly Val Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser115210331211357212DNA213人工序列220
223結構域抗體的核苷酸序列400331gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc60tcctgtgcag cctccggatt caccttttag gggtatcgta tgggttgggt ccgccaggct120ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatgg attacgcgta ctggtgggac gacacagtac180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat240ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaccggcg300aagcttgttg gggttgggtt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcg 357210332211119212蛋白質213人工序列220
223結構域抗體的胺基酸序列220
221其它特徵222(33)..(33)223終止密碼子400332Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Lys Tyr20 25 30Xaa Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Gln Ile Gly Ala Lys Gly Gln Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Ash Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Lys Lys Lys Arg Gly Glu Asn Tyr Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser115210333211357212DNA213人工序列220
223結構域抗體的核苷酸序列400333gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc60tcctgtgcag cctccggatt cacctttcgg aagtattaga tggggtgggt ccgccaggct120ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag attggtgcga agggtcagtc tacagattac180gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat240ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaaagaag300aggggggaga attatttttt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcg 357210334211119212蛋白質213人工序列220
223結構域抗體的胺基酸序列400334
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Arg Tyr20 25 30Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Asp Ile Ser Arg Ser Gly Arg Tyr Thr His Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Arg Ile Asp Ser Ser Gln Asn Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser115210335211357212DNA213人工序列220
223結構域抗體的核苷酸序列400335gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc60tcctgtgcag cctccggatt cacctttcgg cggtatagta tgtcgtgggt ccgccaggct120ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagat atttctcgtt ctggtcggta tacacattac180gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat240ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacgtatt300
gattcttctc agaatgggtt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcg 357210336211115212蛋白質213人工序列220
223結構域抗體的胺基酸序列220
221其它特徵222(30)..(30)223終止密碼子400336Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Xaa Gly Tyr20 25 30Lys Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Gln Lys Glu Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110
Thr Val Ser115210337211345212DNA213人工序列220
223結構域抗體的核苷酸序列400337gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc60tcctgtgcag cctccggatt caccttttag gggtataaga tgttttgggt ccgccaggct120ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac180gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat240ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacagaag300gagaattttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcg345210338211119212蛋白質213人工序列220
223結構域抗體的胺基酸序列400338Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr20 25 30Ala Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Val Ile Ser Ser Asn Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ash Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Arg Val Arg Lys Arg Thr Pro Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser115210339211357212DNA213人工序列220
223結構域抗體的核苷酸序列400339gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc60tcctgtgcag cctccggatt cacctttggg gattatgcta tgtggtgggt ccgccaggct120ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagtg attagttcga atggtgggag tacattttac180gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat240ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacgtgtt300cgtaagagga ctcctgagtt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcg 357
210340211119212蛋白質213人工序列220
223結構域抗體的胺基酸序列400340Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Arg Tyr20 25 30Lys Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ala Ile Gly Arg Ash Gly Thr Lys Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ash Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Ile Tyr Thr Gly Lys Pro Ala Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser115210341211357212DNA213人工序列
220
223結構域抗體的核苷酸序列400341gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc60tcctgtgcag cctccggatt cacctttagg aggtataaga tgggttgggt ccgccaggct120ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagcg attgggagga atggtacgaa gacaaattac180gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat240ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaatttat300acggggaagc ctgctgcgtt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcg 357210342211119212蛋白質213人工序列220
223結構域抗體的胺基酸序列220
221其它特徵222(33)..(33)223終止密碼子400342Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Lys Tyr
20 25 30Xaa Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Met Leu Arg Thr Lys Asn Lys Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser115210343211357212DNA213人工序列220
223結構域抗體的核苷酸序列400343gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc60tcctgtgcag cctccggatt cacctttaag aagtattaga tgtcttgggt ccgccaggct120ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac180gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat240ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaatgctg300aggactaaga ataaggtgtt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcg 357210344
211119212蛋白質213人工序列220
223結構域抗體的胺基酸序列400344Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Arg Tyr20 25 30Lys Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ala Ile Gly Arg Asn Gly Thr Lys Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Ash Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Ile Tyr Thr Gly Lys Pro Ala Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser115210345211357212DNA213人工序列
220
223結構域抗體的核苷酸序列400345gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc60tcctgtgcag cctccggatt cacctttagg aggtataaga tgggttgggt ccgccaggct120ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagcg attgggagga atggtacgaa gacaaattac180gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat240ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaatttat300acggggaagc ctgctgcgtt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcg 357210346211119212蛋白質213人工序列220
223結構域抗體的胺基酸序列220
221其它特徵222(30)..(30)223終止密碼子400346Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Xaa Ser Tyr20 25 30
Arg Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ser Ile Ser Ser Arg Gly Arg His Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Arg Val Pro Gly Arg Gly Arg Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser115210347211357212DNA213人工序列220
223結構域抗體的核苷酸序列400347gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc60tcctgtgcag cctccggatt caccttttag agttatcgga tgggttgggt ccgccaggct120ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaagt atttcgtcga ggggtaggca tacatcttac180gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat240ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaagggtt300ccgggtcggg ggcgttcttt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcg 357210348211119
212蛋白質213人工序列220
223結構域抗體的胺基酸序列400348Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Arg Arg Tyr20 25 30Arg Met Arg Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Gly Ile Ser Pro Gly Gly Lys His Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Gly Glu Gly Gly Ala Ser Ser Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser115210349211357212DNA213人工序列220
223結構域抗體的核苷酸序列
400349gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc60tcctgtgcag cctccggatt cccctttcgt cggtatcgga tgaggtgggt ccgccaggct120ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaggt atttctccgg gtggtaagca tacaacgtac180gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat240ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaggtgag300gggggggcga gttctgcgtt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcg 357210350211119212蛋白質213人工序列220
223結構域抗體的胺基酸序列220
221其它特徵222(30)..(30)223終止密碼子400350Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Xaa Arg Tyr20 25 30Gly Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Arg His Ser Ser Glu Ala Arg Gln Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Leu Val Thr Val Ser115210351211357212DNA213人工序列220
223結構域抗體的核苷酸序列400351gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc60tcctgtgcag cctccggatt caccttttag cggtatggga tggtttgggt ccgccaggct120ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac180gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat240ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacggcat300agttctgagg ctaggcagtt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcg 35權利要求
1.含單結構域抗體多肽構建物的組合物用於製備藥物的用途，所述構建物體外拮抗人TNFα結合受體，所述藥物用於治療、預防類風溼性關節炎、抑制其進展或延遲其發作。
2.含單結構域抗體多肽構建物的組合物用於製備藥物的用途，所述構建物體外拮抗人TNFα結合受體，所述藥物用於誘發一種或多種類風溼性關節炎指徵的統計學顯著變化。
3.權利要求1或2的用途，其中所述組合物在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時防止關節炎記分增加。
4.權利要求3的用途，其中所述給予導致一種或多種RA指徵的統計學顯著變化。
5.權利要求4的用途，其中所述一種或多種RA指徵包括以下的一種或多種紅細胞沉降率(ESR)、Ritchie關節指數和晨僵持續時間、關節活動性、關節腫脹、一個或多個關節的x射線造影和一個或多個關節固定化切片的組織病理學分析。
6.權利要求4的用途，其中所述一種或多種RA指徵包括Tg197轉基因小鼠中的關節炎宏觀表型病徵減退，其中給予Tg197轉基因小鼠所述組合物，其中記錄所述Tg197轉基因小鼠的所述關節炎宏觀表型病徵，其中按照以下系統記錄所述關節炎宏觀表型病徵0＝無關節炎(正常外觀和屈曲狀態)，1＝輕度關節炎(關節扭曲)，2＝中度關節炎(腫脹，關節變形)，3＝重度關節炎(移動嚴重受損)。
7.權利要求4的用途，其中所述一種或多種RA指徵包括Tg197轉基因小鼠中的關節炎組織病理學病徵減退，其中給予Tg197轉基因小鼠所述組合物，其中記錄所述Tg197轉基因小鼠的所述關節炎組織病理學病徵，其中在關節上表現出所述關節炎組織病理學病徵，並使用以下系統記錄0＝無可檢測的病理狀況，1＝滑膜增生和出現多形核白細胞浸潤，2＝血管翳和纖維組織形成以及病灶性軟骨下骨侵蝕，3＝關節軟骨破壞和骨侵蝕，4＝廣泛的關節軟骨破壞和骨侵蝕。
8.權利要求3的用途，其中給予Tg197轉基因小鼠所述組合物包括以下步驟a)每周一次腹膜內注射給予雜合Tg197轉基因小鼠所述組合物，b)每周稱重一次步驟a)的小鼠，和c)按照以下系統每周記錄一次所述小鼠的關節炎宏觀表型病徵0＝無關節炎(正常外觀和屈曲狀態)，1＝輕度關節炎(關節扭曲)，2＝中度關節炎(腫脹，關節變形)，3＝重度關節炎(移動嚴重受損)。
9.權利要求3的用途，其中在表現出關節炎症狀發作之前給予所述小鼠所述組合物。
10.權利要求3的用途，其中當所述小鼠為3周齡時第一次給予所述組合物。
11.權利要求3的用途，其中當所述小鼠為6周齡時第一次給予所述組合物。
12.前述權利要求中任一項的用途，其中所述組合物在Tg197轉基因小鼠關節炎實驗中所具有的效力高於或等於選自依那西普、英利昔單抗和D2E7的物質的效力。
13.前述權利要求中任一項的用途，其中所述組合物在Tg197轉基因小鼠關節炎實驗中有效，使得治療產生0-0.5的關節炎記分。
14.前述權利要求中任一項的用途，其中所述組合物在Tg197轉基因小鼠關節炎實驗中有效，使得治療產生0-1.0的關節炎記分。
15.前述權利要求中任一項的用途，其中所述組合物在Tg197轉基因小鼠關節炎實驗中有效，使得治療產生0-1.5的關節炎記分。
16.前述權利要求中任一項的用途，其中所述組合物在Tg197轉基因小鼠關節炎實驗中有效，使得治療產生0-2.0的關節炎記分。
17.一種治療類風溼性關節炎方法，所述方法包括給予有需要的個體治療有效量的組合物，所述組合物含有拮抗人TNFα結合受體的單結構域抗體多肽構建物，由此治療所述類風溼性關節炎。
18.一種治療類風溼性關節炎方法，所述方法包括給予有需要的個體治療有效量的組合物，所述組合物含有拮抗人TNFα結合受體的單結構域抗體多肽構建物，其中所述單結構域抗體多肽構建物抑制人TNFα與TNFα受體的結合，由此治療所述類風溼性關節炎。
19.權利要求17或18的方法，其中所述治療包括抑制所述類風溼性關節炎的進展。
20.權利要求17或18的方法，其中所述治療包括防止或延遲類風溼性關節炎的發作。
21.權利要求17或18的方法或權利要求3或4的用途，其中所述組合物在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時防止關節炎記分增加。
22.權利要求21的方法，其中所述給予導致一種或多種RA指徵的統計學顯著變化。
23.權利要求22的方法，其中所述一種或多種RA指徵包括以下的一種或多種紅細胞沉降率(ESR)、Ritchie關節指數和晨僵持續時間、關節活動性、關節腫脹、一個或多個關節的x射線造影和一個或多個關節固定化切片的組織病理學分析。
24.權利要求22的方法，其中所述一種或多種RA指徵包括Tg197轉基因小鼠中的關節炎宏觀表型病徵減退，其中給予Tg197轉基因小鼠所述組合物，其中記錄所述Tg197轉基因小鼠的所述關節炎宏觀表型病徵，其中按照以下系統記錄所述關節炎宏觀表型病徵0＝無關節炎(正常外觀和屈曲狀態)，1＝輕度關節炎(關節扭曲)，2＝中度關節炎(腫脹，關節變形)，3＝重度關節炎(移動嚴重受損)。
25.權利要求22的方法，其中所述一種或多種RA指徵包括Tg197轉基因小鼠中的關節炎組織病理學症狀減退，其中給予Tg197轉基因小鼠所述組合物，其中記錄所述Tg197轉基因小鼠的所述關節炎組織病理學症狀，其中在關節上表現出所述關節炎組織病理學病徵，並使用以下系統記錄0＝無可檢測的病理狀況，1＝滑膜增生和出現多形核白細胞浸潤，2＝血管翳和纖維組織形成以及病灶性軟骨下骨侵蝕，3＝關節軟骨破壞和骨侵蝕，4＝廣泛的關節軟骨破壞和骨侵蝕。
26.權利要求21的方法，其中給予Tg197轉基因小鼠所述組合物包括以下步驟a)每周一次腹膜內注射給予雜合Tg197轉基因小鼠所述組合物，b)每周稱重一次步驟a)的小鼠，和c)按照以下系統每周記錄一次所述小鼠的關節炎宏觀表型病症0＝無關節炎(正常外觀和屈曲狀態)，1＝輕度關節炎(關節扭曲)，2＝中度關節炎(腫脹，關節變形)，3＝重度關節炎(移動嚴重受損)。
27.權利要求21的方法，其中在表現出關節炎症狀發作之前給予所述小鼠所述組合物。
28.權利要求21的方法，其中當所述小鼠為3周齡時第一次給予所述組合物。
29.權利要求21的方法，其中當所述小鼠為6周齡時第一次給予所述組合物。
30.前述權利要求中任一項的方法或用途，其中所述組合物在Tg197轉基因小鼠關節炎實驗中所具有的效力高於或等於選自依那西普、英利昔單抗和D2E7的物質的效力。
31.前述權利要求中任一項的方法或用途，其中所述組合物在Tg197轉基因小鼠關節炎實驗中有效，使得治療產生0-0.5的關節炎記分。
32.前述權利要求中任一項的方法或用途，其中所述組合物在Tg197轉基因小鼠關節炎實驗中有效，使得治療產生0-1.0的關節炎記分。
33.前述權利要求中任一項的方法或用途，其中所述組合物在Tg197轉基因小鼠關節炎實驗中有效，使得治療產生0-1.5的關節炎記分。
34.前述權利要求中任一項的方法或用途，其中所述組合物在Tg197轉基因小鼠關節炎實驗中有效，使得治療產生0-2.0的關節炎記分。
35.前述權利要求中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物含人單結構域抗體多肽。
36.前述權利要求中任一項的方法或用途，其中所述人單結構域抗體多肽結合TNFα。
37.前述權利要求中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物以小於100nM的Kd結合人TNFα。
38.前述權利要求中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物以100nM至50pM範圍的Kd結合人TNFα。
39.前述權利要求中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物以30nM至50pM的Kd結合人TNFα。
40.前述權利要求中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物以10nM至50pM的Kd結合人TNFα。
41.前述權利要求中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物以1nM至50pM範圍的Kd結合人TNFα。
42.前述權利要求中任一項的方法或用途，其中據標準L929細胞實驗的檢測，所述單結構域抗體多肽構建物拮抗人TNFα。
43.前述權利要求中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物特異性結合與細胞表面受體結合的人TNFα。
44.前述權利要求中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物具有在15分鐘至12小時範圍內的體內tα半壽期。
45.前述權利要求中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物具有在1至6小時範圍內的體內tα半壽期。
46.前述權利要求中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物具有在2至5小時範圍內的體內tα半壽期。
47.前述權利要求中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物具有在3至4小時範圍內的體內tα半壽期。
48.前述權利要求中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物具有在12至60小時範圍內的體內tβ半壽期。
49.前述權利要求中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物具有在12至48小時範圍內的體內tβ半壽期。
50.前述權利要求中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物具有在12至26小時範圍內的體內tβ半壽期。
51.前述權利要求中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物具有15mg.分鐘/ml至150mg.分鐘/ml的體內AUC半壽期值。
52.前述權利要求中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物具有15mg.分鐘/ml至100mg.分鐘/ml的體內AUC半壽期值。
53.前述權利要求中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物具有15mg.分鐘/ml至75mg.分鐘/ml的體內AUC半壽期值。
54.前述權利要求中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物具有15mg.分鐘/ml至50mg.分鐘/ml的體內AUC半壽期值。
55.前述權利要求中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物連接至PEG分子。
56.權利要求55的方法或用途，其中PEG連接的單結構域抗體多肽構建物具有至少24kDa的流體動力學大小，其中總PEG大小為20-60kDa。
57.權利要求55的方法或用途，其中PEG連接的單結構域抗體多肽構建物具有至少200kDa的流體動力學大小，總PEG大小為20-60kDa。
58.權利要求55的方法或用途，其中PEG連接的蛋白平均連接至1-20個聚乙二醇分子。
59.前述權利要求中任一項的方法或用途，其中所述抗體構建物含兩個或更多結合人TNFα的單免疫球蛋白可變結構域多肽。
60.前述權利要求中任一項的方法或用途，其中所述抗體構建物含結合人TNFα的單免疫球蛋白可變結構域多肽的同二聚體。
61.前述權利要求中任一項的方法或用途，其中所述抗體構建物含結合人TNFα的單免疫球蛋白可變結構域多肽的同三聚體。
62.前述權利要求中任一項的方法或用途，其中所述抗體構建物含結合人TNFα的單免疫球蛋白可變結構域多肽的同四聚體。
63.前述權利要求中任一項的方法或用途，其中所述抗體構建物還包含對非TNFα抗原有特異性的抗體多肽。
64.權利要求63的方法或用途，其中所述對非TNFα抗原有特異性的抗體多肽包括單結構域抗體多肽。
65.權利要求63或64的方法或用途，其中所述對非TNFα抗原有特異性的抗體多肽與所述非TNFα抗原的結合增加了所述抗體多肽構建物的體內半壽期。
66.權利要求63-65中任一項的方法或用途，其中所述非TNFα抗原包括血清蛋白。
67.權利要求66的方法或用途，其中所述血清蛋白選自纖維蛋白、α-2巨球蛋白、血清白蛋白、纖維蛋白原A、纖維蛋白原、血清澱粉樣蛋白A、七球蛋白、蛋白、泛素、子宮球蛋白和β-2-微球蛋白。
68.權利要求63的方法或用途，其中所述非TNFα抗原包括HSA。
69.權利要求17-68中任一項的方法，其中所述治療還包括給予至少一種另外的治療劑。
70.權利要求1-69中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽CDR3的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
71.權利要求1-69中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少85％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
72.權利要求1-69中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少90％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
73.權利要求1-69中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少92％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
74.權利要求1-69中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少94％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
75.權利要求1-69中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少96％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
76.權利要求1-69中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少98％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
77.權利要求1-69中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少99％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
78.含單結構域抗體多肽構建物的組合物用於製備藥物的用途，所述構建物拮抗人TNFα結合受體，所述藥物治療、預防類風溼性關節炎、抑制其進展或延遲其發作，其中所述組合物在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時防止關節炎記分增加，其中所述單結構域抗體多肽構建物以小於100nM的Kd結合人TNFα，其中據標準L929細胞實驗檢測，所述單結構域抗體多肽構建物中和人TNFα。
79.一種治療類風溼性關節炎的方法，所述方法包括給予有需要的個體治療有效量的組合物，所述組合物含有拮抗人TNFα結合受體的單結構域抗體多肽構建物，其中所述組合物在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時防止關節炎記分增加，其中所述單結構域抗體多肽構建物以小於100nM的Kd結合人TNFα，其中據標準L929細胞實驗檢測，所述單結構域抗體多肽構建物中和人TNFα，以及其中所述類風溼性關節炎得到治療。
80.權利要求1-79中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物包含四價雙特異性抗體多肽構建物，其包含a)含結合第一個表位、融合至IgG重鏈恆定結構域的單結構域抗體多肽的第一個融合蛋白的第一個拷貝；b)所述第一個融合蛋白的第二個拷貝；c)含結合第二個表位、融合至輕鏈恆定結構域的單結構域抗體多肽的第二個融合蛋白的第一個拷貝；d)所述第二個融合蛋白的第二個拷貝；其中所述第一個融合蛋白的所述第一個和所述第二個拷貝經其各自的IgG重鏈恆定結構域彼此二硫鍵合，以及其中所述第二個融合蛋白的所述第一個拷貝的所述輕鏈恆定結構域二硫鍵合至所述第一個融合蛋白的所述第一個拷貝的IgG重鏈恆定結構域，以及其中第二個融合蛋白的所述第二個拷貝的所述輕鏈恆定結構域二硫鍵合至所述第一個融合蛋白的所述第二個拷貝的IgG重鏈恆定結構域，以及其中所述多肽構建物結合所述第一個和第二個表位。
81.權利要求80的方法或用途，其中所述第一個和/或第二個表位為TNF-α表位。
82.一種含拮抗人TNFα結合受體的單結構域抗體多肽構建物的組合物，所述組合物在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時防止關節炎記分增加，其中據標準L929細胞實驗檢測，所述單結構域抗體多肽構建物中和人TNFα。
83.一種含拮抗人TNFα結合受體的單結構域抗體多肽構建物的組合物，所述組合物在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時防止關節炎記分增加，其中所述單結構域抗體多肽構建物抑制類風溼性關節炎的進展。
84.一種含拮抗人TNFα結合受體的單結構域抗體多肽構建物的組合物，所述組合物在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時防止關節炎記分增加，其中所述單結構域抗體多肽構建物以小於100nM的Kd結合人TNFα。
85.一種含拮抗人TNFα結合受體的單結構域抗體多肽構建物的組合物，所述組合物在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時防止關節炎記分增加，其中據標準L929細胞實驗檢測，所述單結構域抗體多肽構建物中和人TNFα，其中所述單結構域抗體多肽構建物抑制類風溼性關節炎的進展，其中所述單結構域抗體多肽構建物以小於100nM的Kd結合人TNFα。
86.權利要求82-85中任一項的組合物，其中所述單結構域抗體多肽構建物包含四價雙特異性抗體多肽構建物，其包含a)含結合第一個表位、融合至IgG重鏈恆定結構域的單結構域抗體多肽的第一個融合蛋白的第一個拷貝；b)所述第一個融合蛋白的第二個拷貝；c)含結合第二個表位、融合至輕鏈恆定結構域的單結構域抗體多肽的第二個融合蛋白的第一個拷貝；d)所述第二個融合蛋白的第二個拷貝；其中所述第一個融合蛋白的所述第一個和所述第二個拷貝彼此經其各自的IgG重鏈恆定結構域二硫鍵合，以及其中所述第二個融合蛋白的所述第一個拷貝的所述輕鏈恆定結構域二硫鍵合至所述第一個融合蛋白的所述第一個拷貝的IgG重鏈恆定結構域，以及其中第二個融合蛋白的所述第二個拷貝的所述輕鏈恆定結構域二硫鍵合至所述第一個融合蛋白的所述第二個拷貝的IgG重鏈恆定結構域，以及其中所述多肽構建物結合所述第一個和第二個表位。
87.權利要求86的組合物，其中所述第一個和/或所述第二個表位為TNF-α表位。
88.權利要求82-87中任一項的組合物，其中所述單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽CDR3的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
89.權利要求82-87中任一項的組合物，其中所述單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少85％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
90.權利要求82-87中任一項的組合物，其中所述單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少90％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
91.權利要求82-87中任一項的組合物，其中所述單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少92％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
92.權利要求82-87中任一項的組合物，其中所述單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少94％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
93.權利要求82-87中任一項的組合物，其中所述單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少96％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
94.權利要求82-87中任一項的組合物，其中所述單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少98％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
95.權利要求82-87中任一項的組合物，其中所述單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少99％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
96.含單結構域抗體多肽構建物的組合物用於製備藥物的用途，所述構建物拮抗人VEGF結合VEGF受體，所述藥物治療、預防類風溼性關節炎、抑制其進展或延遲其發作。
97.一種治療類風溼性關節炎方法，所述方法包括給予有需要的個體治療有效量的組合物，所述組合物含有拮抗人VEGF結合VEGF受體的單結構域抗體多肽構建物，由此治療所述類風溼性關節炎。
98.權利要求96的用途或權利要求97的方法，其中所述組合物在給予膠原蛋白誘發的關節炎(CIA)小鼠模型的小鼠時防止關節炎記分增加。
99.權利要求98的方法或用途，其中將所述組合物給予所述小鼠包括以下步驟a)每周一次腹膜內注射給予CIA模型小鼠所述組合物，b)每周稱重一次步驟a)的小鼠，和c)按照以下系統每周記錄一次所述小鼠的關節炎宏觀表型病徵0＝無關節炎(正常外觀和屈曲狀態)，1＝輕度關節炎(關節扭曲)，2＝中度關節炎(腫脹，關節變形)，3＝重度關節炎(移動嚴重受損)。
100.權利要求97-99中任一項的方法，其中所述治療包括抑制所述類風溼性關節炎的進展。
101.權利要求97-99中任一項的方法，其中所述治療包括預防或延遲類風溼性關節炎的發作。
102.權利要求97-99中任一項的方法或用途，其中所述給予導致一種或多種RA指徵的統計學顯著變化。
103.權利要求102的方法或用途，其中所述一種或多種RA指徵包括以下的一種或多種紅細胞沉降率(ESR)、Ritchie關節指數和晨僵持續時間、關節活動性、關節腫脹、一個或多個關節的x射線造影和一個或多個關節固定化切片的組織病理學分析。
104.權利要求102的方法或用途，其中所述一種或多種RA指徵包括膠原蛋白誘發的關節炎小鼠模型的小鼠中關節炎宏觀表型病徵減退，其中給予所述小鼠所述組合物，其中記錄所述小鼠的所述關節炎宏觀表型病徵，其中按照以下系統記錄所述關節炎宏觀表型病徵0＝無關節炎(正常外觀和屈曲狀態)，1＝輕度關節炎(關節扭曲)，2＝中度關節炎(腫脹，關節變形)，3＝重度關節炎(移動嚴重受損)。
105.權利要求102的方法或用途，其中所述一種或多種RA指徵包括膠原蛋白誘發的關節炎小鼠模型的小鼠中關節炎組織病理學病徵減退，其中給予所述小鼠所述組合物，其中記錄所述小鼠的所述關節炎組織病理學病徵，其中在關節上表現出所述關節炎組織病理學病徵，並使用以下系統記錄0＝無可檢測的病理狀況，1＝滑膜增生和出現多形核白細胞浸潤，2＝血管翳和纖維組織形成以及病灶性軟骨下骨侵蝕，3＝關節軟骨破壞和骨侵蝕，4＝廣泛的關節軟骨破壞和骨侵蝕。
106.權利要求134的用途或方法，其中所述雙特異性抗體構建物包含四價雙特異性抗體多肽構建物，其包含a)含結合第一個表位、融合至IgG重鏈恆定結構域的單結構域抗體多肽的第一個融合蛋白的第一個拷貝；b)所述第一個融合蛋白的第二個拷貝；c)含結合第二個表位、融合至輕鏈恆定結構域的單結構域抗體多肽的第二個融合蛋白的第一個拷貝；d)所述第二個融合蛋白的第二個拷貝；其中所述第一個融合蛋白的所述第一個和所述第二個拷貝彼此經其各自的IgG重鏈恆定結構域二硫鍵合，以及其中所述第二個融合蛋白的所述第一個拷貝的所述輕鏈恆定結構域二硫鍵合至所述第一個融合蛋白的所述第一個拷貝的IgG重鏈恆定結構域，以及其中第二個融合蛋白的所述第二個拷貝的所述輕鏈恆定結構域二硫鍵合至所述第一個融合蛋白的所述第二個拷貝的IgG重鏈恆定結構域，以及其中所述多肽構建物結合所述第一個和所述第二個表位。
107.權利要求106的方法或用途，其中所述第一個和/或第二個表位為VEGF表位。
108.權利要求96-107中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物包括人單結構域抗體多肽。
109.權利要求108的方法或用途，其中所述人單結構域抗體多肽結合VEGF。
110.權利要求96-109中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物以小於100nM的Kd結合人VEGF。
111.權利要求96-109中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物以100nM至50pM範圍內的Kd結合人VEGF。
112.權利要求96-109中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物以30nM至50pM的Kd結合人VEGF。
113.權利要求96-109中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物以10nM至50pM的Kd結合人VEGF。
114.權利要求96-109中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物以1nM至50pM範圍內的Kd結合人VEGF。
115.權利要求96-114中任一項的方法或用途，其中據VEGF受體1實驗或VEGF受體2實驗檢測，所述單結構域抗體多肽構建物中和人VEGF。
116.權利要求96-115中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物特異性結合與細胞表面受體結合的人VEGF。
117.權利要求96-116中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物連接至PEG分子。
118.權利要求117的方法或用途，其中PEG連接的單結構域抗體多肽構建物具有至少24kDa的流體動力學大小，其中總PEG大小為20-60kDa。
119.權利要求117的方法或用途，其中PEG連接的單結構域抗體多肽構建物具有至少200kDa的流體動力學大小和20-60kDa的總PEG大小。
120.權利要求117-119中任一項的方法或用途，其中PEG連接的單結構域抗體多肽構建物平均連接至兩個或更多聚乙二醇分子。
121.權利要求117-119中任一項的方法或用途，其中PEG連接的單結構域抗體多肽構建物平均連接至2-20個PEG分子。
122.權利要求96-121中任一項的方法或用途，其中所述抗體構建物含兩個或更多結合人VEGF的單免疫球蛋白可變結構域多肽。
123.權利要求96-121中任一項的方法或用途，其中所述抗體構建物含結合人VEGF的單免疫球蛋白可變結構域多肽的同二聚體。
124.權利要求96-121中任一項的方法或用途，其中所述抗體構建物含結合人VEGF的單免疫球蛋白可變結構域多肽的同三聚體。
125.權利要求96-121中任一項的方法或用途，其中所述抗體構建物含結合人VEGF的單免疫球蛋白可變結構域多肽的同四聚體。
126.權利要求96-125中任一項的方法或用途，其中所述構建物還含有對非VEGF抗原具有特異性的抗體多肽。
127.權利要求126的方法或用途，其中所述對非VEGF抗原具有特異性的抗體多肽包括單結構域抗體多肽。
128.權利要求126或127的方法或用途，其中所述對非VEGF抗原具有特異性的所述抗體多肽與所述非VEGF抗原的結合增加了所述抗體多肽構建物的體內半壽期。
129.權利要求126-128中任一項的方法或用途，其中所述非VEGF抗原包括血清蛋白。
130.權利要求129的方法或用途，其中所述血清蛋白選自纖維蛋白、α-2巨球蛋白、血清白蛋白、纖維蛋白原A、纖維蛋白原、血清澱粉樣蛋白A、七球蛋白、蛋白、泛素、子宮球蛋白和β-2-微球蛋白。
131.權利要求126-129中任一項的方法或用途，其中所述非VEGF抗原包括HSA。
132.權利要求97-131中任一項的方法，其中所述治療還包含給予至少一種另外的治療劑。
133.權利要求132的方法，其中所述治療劑選自依那西普、英利昔單抗和D2E7。
134.權利要求132的方法，其中所述治療劑選自皮質類固醇、非甾體類抗炎藥物(NSAID)、乙醯水楊酸、吡唑酮、芬那酸、二氟尼柳、乙酸衍生物、丙酸衍生物、昔康、甲芬那酸、Ponstel、甲氯芬那酸、Meclomen、保泰松、Butazolidin、二氟尼柳、Dolobid、雙氯芬酸、扶他林、吲哚美辛、消炎痛、舒林酸、奇諾力、依託度酸、羅丁、酮咯酸、Toradol、萘丁美酮、瑞力芬、託美丁、託來汀、布洛芬、美林、非諾洛芬、Nalfon、氟比洛芬、Anthe、卡洛芬、Rimadyl、酮洛芬、Orudis、萘普生、Anaprox、Naprosyn、吡羅昔康和Feldene。
135.權利要求134中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽CDR3的胺基酸序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
136.權利要求96-134中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少85％相同的胺基酸序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
137.權利要求96-134中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少90％相同的胺基酸序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
138.權利要求96-134中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少92％相同的胺基酸序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
139.權利要求96-134中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少94％相同的胺基酸序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
140.權利要求96-134中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少96％相同的胺基酸序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
141.權利要求96-134中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少98％相同的胺基酸序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
142.權利要求96-134中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少99％相同的胺基酸序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
143.一種含拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中所述單結構域抗體多肽構建物含選自以下的CDR3序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
144.一種含拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中所述單結構域抗體多肽構建物含選自以下的胺基酸序列或與其至少85％相同的序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
145.一種含拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中所述單結構域抗體多肽構建物含選自以下的胺基酸序列或與其至少90％相同的序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
146.一種含拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中所述單結構域抗體多肽構建物含選自以下的胺基酸序列或與其至少92％相同的序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
147.一種含拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中所述單結構域抗體多肽構建物含選自以下的胺基酸序列或與其至少94％相同的序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
148.一種含拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中所述單結構域抗體多肽構建物含選自以下的胺基酸序列或與其至少96％相同的序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
149.一種含拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中所述單結構域抗體多肽構建物含選自以下的胺基酸序列或與其至少98％相同的序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
150.一種含拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中所述單結構域抗體多肽構建物含選自以下的胺基酸序列或與其至少99％相同的序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
151.權利要求143-150中任一項的組合物，其中所述單結構域抗體多肽構建物包含四價雙特異性抗體多肽構建物，其包含a)含結合第一個表位、融合至IgG重鏈恆定結構域的單結構域抗體多肽的第一個融合蛋白的第一個拷貝；b)所述第一個融合蛋白的第二個拷貝；c)含結合第二個表位、融合至輕鏈恆定結構域的單結構域抗體多肽的第二個融合蛋白的第一個拷貝；d)所述第二個融合蛋白的第二個拷貝；其中所述第一個融合蛋白的所述第一個和所述第二個拷貝經其各自的IgG重鏈恆定結構域彼此二硫鍵合，以及其中所述第二個融合蛋白的所述第一個拷貝的所述輕鏈恆定結構域二硫鍵合至所述第一個融合蛋白的所述第一個拷貝的IgG重鏈恆定結構域，以及其中第二個融合蛋白的所述第二個拷貝的所述輕鏈恆定結構域二硫鍵合至所述第一個融合蛋白的所述第二個拷貝的IgG重鏈恆定結構域，以及其中所述多肽構建物結合所述第一個和所述第二個表位。
152.權利要求151的組合物，其中所述第一個和/或所述第二個表位為VEGF表位。
153.含拮抗人TNFα活性和拮抗人VEGF結合受體的單結構域抗體多肽構建物的組合物的用途，該用途用於製備治療、預防類風溼性關節炎、抑制類風溼性關節炎進展或延遲類風溼性關節炎發作的藥物。
154.含拮抗人TNFα結合受體和拮抗人VEGF結合受體的單結構域抗體多肽構建物的組合物的用途，該用途用於製備治療、預防類風溼性關節炎、抑制類風溼性關節炎進展或延遲類風溼性關節炎發作的藥物。
155.一種治療類風溼性關節炎的方法，所述方法包括給予有需要的個體治療有效量的組合物，其中所述組合物含拮抗人TNFα結合受體和拮抗人VEGF結合受體的單結構域抗體多肽構建物，由此治療所述類風溼性關節炎。
156.權利要求153或154的用途或權利要求155的方法，其中所述多肽構建物含雙特異性抗體構建物。
157.權利要求134的用途或方法，其中所述雙特異性抗體構建物含四價雙特異性抗體多肽構建物，其包含a)含結合第一個表位、融合至IgG重鏈恆定結構域的單結構域抗體多肽的第一個融合蛋白的第一個拷貝；b)所述第一個融合蛋白的第二個拷貝；c)含結合第二個表位、融合至輕鏈恆定結構域的單結構域抗體多肽的第二個融合蛋白的第一個拷貝；d)所述第二個融合蛋白的第二個拷貝；其中所述第一個融合蛋白的所述第一個和所述第二個拷貝經其各自的IgG重鏈恆定結構域彼此二硫鍵合，以及其中所述第二個融合蛋白的所述第一個拷貝的所述輕鏈恆定結構域二硫鍵合至所述第一個融合蛋白的所述第一個拷貝的IgG重鏈恆定結構域，以及其中第二個融合蛋白的所述第二個拷貝的所述輕鏈恆定結構域二硫鍵合至所述第一個融合蛋白的所述第二個拷貝的IgG重鏈恆定結構域，以及其中所述多肽構建物結合所述第一個和所述第二個表位。
158.權利要求153-157中任一項的方法或用途，其中所述組合物在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時防止關節炎記分增加。
159.權利要求158的方法或用途，其中給予Tg197轉基因小鼠所述組合物，其包括以下步驟a)每周一次腹膜內注射給予雜合Tg197轉基因小鼠所述組合物，b)每周稱重一次步驟a)的小鼠，和c)按照以下系統每周記錄一次所述小鼠的關節炎宏觀表型病徵0＝無關節炎(正常外觀和屈曲狀態)，1＝輕度關節炎(關節扭曲)，2＝中度關節炎(腫脹，關節變形)，3＝重度關節炎(移動嚴重受損)。
160.權利要求158的方法或用途，其中所述組合物在Tg197轉基因小鼠關節炎實驗中所具有的效力高於或等於選自以下物質的效力依那西普、英利昔單抗和D2E7。
161.權利要求153-157中任一項的方法或用途，其中所述組合物在給予膠原蛋白誘發的關節炎(CIA)小鼠模型的小鼠時防止關節炎記分增加。
162.權利要求161的方法或用途，其中給予所述小鼠所述組合物，其包括以下步驟a)每周一次腹膜內注射給予CIA模型小鼠所述組合物，b)每周稱重一次步驟a)的小鼠，和c)按照以下系統每周記錄一次所述小鼠的關節炎宏觀表型病徵0＝無關節炎(正常外觀和屈曲狀態)，1＝輕度關節炎(關節扭曲)，2＝中度關節炎(腫脹，關節變形)，3＝重度關節炎(移動嚴重受損)。
163.權利要求158的方法或用途，其中所述給予導致一種或多種RA指徵的統計學顯著變化。
164.權利要求131或134-137中任一項的方法，其中所述治療包括抑制所述類風溼性關節炎的進展。
165.權利要求155-163中任一項的方法，其中所述治療包括預防或延遲類風溼性關節炎的發作。
166.權利要求163的方法，其中所述一種或多種RA指徵包括以下的一種或多種紅細胞沉降率(ESR)、Ritchie關節指數和晨僵持續時間、關節活動性、關節腫脹、一個或多個關節的x射線造影和一個或多個關節固定化切片的組織病理學分析。
167.權利要求163的方法，其中所述一種或多種RA指徵包括Tg197轉基因小鼠中的關節炎宏觀表型病徵減退，其中給予Tg197轉基因小鼠所述組合物，其中記錄所述Tg197轉基因小鼠的所述關節炎宏觀表型病徵，其中按照以下系統記錄所述關節炎宏觀表型病徵0＝無關節炎(正常外觀和屈曲狀態)，1＝輕度關節炎(關節扭曲)，2＝中度關節炎(腫脹，關節變形)，3＝重度關節炎(移動嚴重受損)。
168.權利要求140的方法，其中所述一種或多種RA指徵包括Tg197轉基因小鼠中的關節炎組織病理學病徵減退，其中給予Tg197轉基因小鼠所述組合物，其中記錄所述Tg197轉基因小鼠的所述關節炎組織病理學病徵，其中在關節上表現出所述關節炎組織病理學病徵，並使用以下系統記錄0＝無可檢測的病理狀況，1＝滑膜增生和出現多形核白細胞浸潤，2＝血管翳和纖維組織形成以及病灶性軟骨下骨侵蝕，3＝關節軟骨破壞和骨侵蝕，4＝廣泛的關節軟骨破壞和骨侵蝕。
169.權利要求161的方法或用途，其中所述給予導致一種或多種RA指徵的統計學顯著變化。
170.權利要求169的方法或用途，其中所述一種或多種RA指徵包括膠原蛋白誘發的關節炎小鼠模型的小鼠中關節炎宏觀表型病徵減退，其中給予所述小鼠所述組合物，其中記錄所述小鼠的所述關節炎宏觀表型病徵，其中按照以下系統記錄所述關節炎宏觀表型病徵0＝無關節炎(正常外觀和屈曲狀態)，1＝輕度關節炎(關節扭曲)，2＝中度關節炎(腫脹，關節變形)，3＝重度關節炎(移動嚴重受損)。
171.權利要求169的方法，其中所述一種或多種RA指徵包括膠原蛋白誘發的關節炎小鼠模型的小鼠中關節炎組織病理學病徵減退，其中給予所述小鼠所述組合物，其中記錄所述小鼠的所述關節炎組織病理學病徵，其中在關節上表現出所述關節炎組織病理學症狀，並使用以下系統記錄0＝無可檢測的病理狀況，1＝滑膜增生和出現多形核白細胞浸潤，2＝血管翳和纖維組織形成以及病灶性軟骨下骨侵蝕，3＝關節軟骨破壞和骨侵蝕，4＝廣泛的關節軟骨破壞和骨侵蝕。
172.權利要求153-171中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物包括人單結構域抗體多肽。
173.權利要求172的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物結合TNFα和VEGF。
174.權利要求172的方法或用途，其中據VEGF受體1實驗或VEGF受體2實驗檢測，所述拮抗人VEGF活性的單結構域抗體多肽部分中和人VEGF。
175.權利要求153-174中任一項的方法或用途，其中據標準L929細胞實驗檢測，所述單結構域抗體多肽構建物中和人TNFα。
176.權利要求153-175中任一項的方法或用途，其中所述單結構域抗體多肽構建物連接至PEG分子。
177.權利要求176的方法或用途，其中PEG連接的單結構域抗體多肽構建物具有至少24kDa的流體動力學大小，其中總PEG大小為20-60kDa。
178.權利要求176的方法或用途，其中PEG連接的單結構域抗體多肽構建物具有至少200kDa的流體動力學大小和20-60kDa的總PEG大小。
179.權利要求176-178中任一項的方法或用途，其中所述抗體多肽構建物平均連接至2個或多個聚乙二醇分子。
180.權利要求176-178中任一項的方法或用途，其中所述抗體多肽構建物平均連接至2-20個PEG分子。
181.權利要求153-180中任一項的方法或用途，其中所述抗體構建物含兩個或更多結合人TNF-α的單免疫球蛋白可變結構域多肽和/或兩個或更多結合人VEGF的單免疫球蛋白可變結構域多肽。
182.權利要求153-180中任一項的方法或用途，其中所述抗體構建物含結合人TNF-α的單免疫球蛋白可變結構域多肽的同二聚體和/或結合人VEGF的單免疫球蛋白可變結構域多肽的同二聚體。
183.權利要求153-180中任一項的方法或用途，其中所述抗體構建物含結合人TNF-α的單免疫球蛋白可變結構域多肽的同三聚體和/或結合人VEGF的單免疫球蛋白可變結構域多肽的同三聚體。
184.權利要求153-180中任一項的方法或用途，其中所述抗體構建物含結合人TNF-α的單免疫球蛋白可變結構域多肽的同四聚體和/或結合人VEGF的單免疫球蛋白可變結構域多肽的同四聚體。
185.權利要求153-180中任一項的方法或用途，其中所述構建物還含有對非TNFα或VEGF抗原具有特異性的抗體多肽。
186.權利要求185的方法或用途，其中所述對非TNFα或VEGF抗原具有特異性的抗體多肽包括單結構域抗體多肽。
187.權利要求185或186的方法或用途，其中所述對非TNFα或VEGF抗原具有特異性的抗體多肽與所述非TNFα或VEGF抗原的結合增加所述抗體多肽構建物的體內半壽期。
188.權利要求185-187中任一項的方法或用途，其中所述非TNFα或VEGF抗原包括血清蛋白。
189.權利要求188的方法或用途，其中所述血清蛋白選自纖維蛋白、α-2巨球蛋白、血清白蛋白、纖維蛋白原A、纖維蛋白原、血清澱粉樣蛋白A、七球蛋白、蛋白、泛素、子宮球蛋白和β-2-微球蛋白。
190.權利要求185-189中任一項的方法或用途，其中所述非TNFα抗原包括HSA。
191.權利要求155-190中任一項的方法，其中所述治療還包含給予至少一種另外的治療劑。
192.權利要求191的方法，其中所述另外的治療劑選自皮質類固醇、非甾體類抗炎藥物(NSAID)、乙醯水楊酸、吡唑酮、芬那酸、二氟尼柳、乙酸衍生物、丙酸衍生物、昔康、甲芬那酸、Ponstel、甲氯芬那酸、Meclomen、保泰松、Butazolidin、二氟尼柳、Dolobid、雙氯芬酸、扶他林、吲哚美辛、消炎痛、舒林酸、奇諾力、依託度酸、羅丁、酮咯酸、Toradol、萘丁美酮、瑞力芬、託美丁、託來汀、布洛芬、美林、非諾洛芬、Nalfon、氟比洛芬、Anthe、卡洛芬、Rimadyl、酮洛芬、Orudis、萘普生、Anaprox、Naprosyn、吡羅昔康和Feldene。
193.一種雙特異性抗原結合多肽，其含有結合TNF-α的第一個抗體單結構域多肽和結合VEGF的第二個抗體單結構域多肽。
194.權利要求193的雙特異性抗原結合多肽，其中所述構建物含四價雙特異性抗體多肽構建物，其包含a)含結合第一個表位、融合至IgG3重鏈恆定結構域的單結構域抗體多肽的第一個融合蛋白的第一個拷貝；b)所述第一個融合蛋白的第二個拷貝；c)含結合第二個表位、融合至輕鏈恆定結構域的單結構域抗體多肽的第二個融合蛋白的第一個拷貝；d)所述第二個融合蛋白的第二個拷貝；其中所述第一個融合蛋白的所述第一個和所述第二個拷貝經其各自的IgG重鏈恆定結構域彼此二硫鍵合，以及其中所述第二個融合蛋白的所述第一個拷貝的所述輕鏈恆定結構域二硫鍵合至所述第一個融合蛋白的所述第一個拷貝的IgG重鏈恆定結構域，以及其中第二個融合蛋白的所述第二個拷貝的所述輕鏈恆定結構域二硫鍵合至所述第一個融合蛋白的所述第二個拷貝的IgG重鏈恆定結構域，以及其中所述多肽構建物結合所述第一個和所述第二個表位。
195.權利要求165的雙特異性抗原結合多肽，其中所述第一個表位為TNF-α表位，所述第二個表位為VEGF表位。
196.權利要求165的雙特異性抗原結合多肽，其中所述第一個表位為VEGF表位，所述第二個表位為TNF-α表位。
197.一種含拮抗人TNFα結合受體和拮抗人VEGF結合受體的單結構域抗體多肽構建物的組合物，其在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時防止關節炎記分增加，其中所述單結構域抗體多肽構建物抑制類風溼性關節炎進展。
198.一種含拮抗人TNFα結合受體和拮抗人VEGF結合受體的單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中所述組合物在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時防止關節炎記分增加，其中所述單結構域抗體多肽構建物以小於100nM的Kd結合人TNFα，其中所述單結構域抗體多肽構建物抑制類風溼性關節炎進展。
199.一種含拮抗人TNFα結合受體和拮抗人VEGF結合受體的單結構域抗體多肽構建物的組合物，其在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時防止關節炎記分增加，其中據標準L929細胞實驗檢測，所述單結構域抗體多肽構建物中和人TNFα，其中所述單結構域抗體多肽構建物以小於100nM的Kd結合人TNFα，其中所述單結構域抗體多肽構建物抑制類風溼性關節炎進展。
200.一種含拮抗人TNFα結合受體和拮抗人VEGF結合受體的單結構域抗體多肽構建物的組合物，其在給予膠原蛋白誘發的關節炎模型小鼠時防止關節炎記分增加，其中所述單結構域抗體多肽構建物抑制類風溼性關節炎的進展。
201.權利要求193-200中任一項的組合物，其中所述組合物與至少一種另外的治療劑一起給予。
全文摘要
本發明涉及用於治療炎性疾病的組合物和方法。更具體地說，本發明涉及抗體組合物及其在炎性疾病治療中的用途。
文檔編號A61P19/02GK101039959SQ200580028518
公開日2007年9月19日 申請日期2005年6月29日 優先權日2004年6月30日
發明者O·伊納託維奇, R·德維爾德特, B·伍爾文, S·格蘭特, P·瓊斯, A·巴斯蘭, N·布魯伊斯 申請人:杜門蒂斯有限公司

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