用於治療炎性疾病的組合物和方法

2023-09-19 21:43:35 2

專利名稱：用於治療炎性疾病的組合物和方法
技術領域：
本發明涉及使用含單結構域抗體配體和雙特異性配體的抗體多肽構建物治療疾病(包括類風溼性關節炎)的方法、這些配體的組合物以及製備和使用這些配體的方法。具體地說，本發明提供結合炎性細胞因子(包括TNF-α和VEGF)的單結構域抗體的製備方法。本發明還公開了含結合第一個抗原或表位的第一個單免疫球蛋白可變結構域和結合第二個抗原或表位的第二個單免疫球蛋白可變結構域的雙特異性配體。更具體地說，本發明涉及雙特異性配體，其中與第一個和第二個抗原或表位中至少一個的結合起增加配體體內半壽期的作用。本發明描述了含一種以上結合特異性的開放和封閉構象配體。本發明公開了使用單結構域抗體構建物和結合第一個與第二個抗原的雙特異性配體治療類風溼性關節炎的方法，其中所述雙特異性配體可包含例如TNF-α、VEGF和HSA的任意組合。
TNF-α顧名思義，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)最初被描述為具有抗腫瘤特性的分子，但隨後發現該分子在其它過程中起關鍵作用，包括在介導炎症和自身免疫疾病中的顯著作用。TNF-α在炎性疾病中是關鍵的促炎細胞因子，這些炎性疾病包括例如類風溼性關節炎(RA)、Crohn病、潰瘍性結腸炎和其它腸病、銀屑病、中毒性休克、移植物抗宿主疾病和多發性硬化。
TNF-α的促炎作用導致組織損傷，例如誘導對血管內皮細胞的促凝血活性(Pober等，J.Immunol.1361680(1986))、增加嗜中性粒細胞和淋巴細胞的粘附(Pober等，J.Immunol.1383319(1987))和刺激巨噬細胞、嗜中性粒細胞和血管內皮細胞釋放血小板活化因子(Camussi等，J.Exp.Med.1661390(1987))。
合成為具有胞內尾的26kD跨膜前體蛋白的TNF-α，其被TNF-α-轉換金屬蛋白酶切割，然後分泌為17kD的可溶性蛋白。活性形式由17kD單體的同三聚體組成，其與兩種不同的細胞表面受體p55TNFR1和p75 TNFR2相互作用。還有證據表明，TNF-α的細胞表面結合前體形式可介導該因子的某些生物學作用。大部分細胞同時表達介導配體的不同生物學功能的p55和p75受體。p75受體參與觸發淋巴細胞增殖，p55受體參與TNF介導的細胞毒性、凋亡、抗病毒活性、成纖維細胞增殖和NF-κB活化(參見Locksley等，2001，Cell 104487-501)。
TNF受體是膜蛋白家族的成員，該家族包括NGF受體、Fas抗原、CD27、CD30、CD40、Ox40和淋巴毒素α/β異二聚體的受體。同三聚體與受體的結合誘導受體聚集為2個或3個p55或p75分子的小簇。TNF-α主要由活化的巨噬細胞和T淋巴細胞產生，但在急性炎症反應當中也由嗜中性粒細胞、內皮細胞、角質細胞和成纖維細胞產生。
TNF-α處於促炎細胞因子級聯的頂點(綜述於Feldmann和Maini，2001，Ann.Rev.Immunol.19163)。該細胞因子誘導另外的促炎細胞因子(具體地說為IL-1和IL-6)的表達或釋放(參見例如Rutgeerts等，2004，Gastroenterology 1261593-1610)。抑制TNF-α會抑制包括IL-1、IL-6、IL-8和GM-CSF的炎性細胞因子的產生(Brennan等，1989，Lancet2244)。
由於TNF-α在炎症中的作用，所以其在減輕炎性疾病症狀的工作中已成為重要的抑制標靶。已實行了各種用於疾病臨床治療的TNF-α抑制方法，具體地說包括使用可溶性TNF-α受體和TNF-α特異性抗體。被批准臨床使用的商品包括例如抗體產品RemicadeTM(英利昔單抗；Centocor，Malvern，PA；一種攜帶人IgG4恆定區和小鼠可變區的嵌合單克隆IgG抗體)、HumiraTM(阿達木單抗或D2E7；AbbottLaboratories，描述於美國專利第6,090,382號)和可溶性受體產物EnbrelTM(依那西普，一種可溶性的p75 TNFR2 Fc融合蛋白；Immunex)。
TNF-α在炎性關節炎中的作用綜述於例如Li和Schwartz，2003，Sringer Semin.Immunopathol.2519-33。在RA中，TNF-α在發炎的滑膜中(具體地說是在軟骨-血管翳接合處)高度表達(DiGiovine等，1988，Ann.Rheum.Dis.47768；Firestein等，1990，J.Immunol.1443347；和Saxne等，1988，Atrhritis Rheum.311041)。除了證實TNF-α增加炎性細胞因子IL-1、IL-6、IL-8和GM-CSF的水平以外，TNF-α還可獨自引發關節炎症和成纖維細胞樣滑膜細胞增殖(Gitter等，1989，Immunology 66196)；誘導膠原酶，由此引起軟骨破壞(Dayer等，1985，J.Exp.Med.1622163；Dayer等，1986，J.Clin.Invest.77645)；通過關節軟骨細胞抑制蛋白聚糖合成(Saklatvala，1986，Nature 322547；Saklatvala等，1985，J.Exp.Med.1621208)；並可刺激破骨細胞生成和骨吸收(Abu-Amer等，2000，J.Biol.Chem.27527307；Bertolini等，1986，Nature 319516)。TNF-α誘導骨髓的CD14+單核細胞釋放增加。該單核細胞可浸潤關節，並經RANK(受體活化物或NF-κB)-RANKL信號轉導途徑放大炎症反應，在關節炎症中導致破骨細胞形成(綜述於Anandarajah和Richlin，2004，Curr.Opin.Rheumatol.16338-343)。
TNF-α是急性期蛋白，通過其對IL-8的誘導增加血管通透性，由此將巨噬細胞和嗜中性粒細胞募集至感染部位。一旦出現這種情況，活化的巨噬細胞就繼續產生TNF-α，由此保持和放大炎症反應。
用可溶性受體構建物依那西普滴定TNF-α對RA治療有效，但對Crohn病治療無效。相反，抗體TNF-α拮抗劑英利昔單抗有效治療RA和Crohn病這二者。因此，僅中和可溶性TNF-α不是與抗TNF型治療效力相關的唯一機制。相反，封閉由TNF-α誘導的其它促炎信號或分子也起作用(Rutgeerts等，出處同上)。例如，給予英利昔單抗明顯降低粘附分子的表達，導致嗜中性粒細胞對炎症部位的浸潤下降。此外，英利昔單抗治療在Crohn病中導致先前發炎的腸黏膜上的炎性細胞消失。固有層中活化T細胞的消失由以Fas依賴性方式活化Caspase 8、9接著活化Caspase 3引起的具有膜結合TNF-α的細胞的凋亡介導(參見Lugering等，2001，Gastroenterology 1211145-1157)。因此，膜結合的或受體結合的TNF-α是抗TNF-α治療方法的重要標靶。其他人已經表明，英利昔單抗結合活化的外周血細胞和固有層細胞，並通過活化Caspase 3誘導凋亡(參見Van den Brande等，2003，Gastroenterology 1241774-1785)。
在細胞內，三聚TNF-α與其受體的結合觸發信號轉導事件級聯，包括替代抑制分子如SODD(死亡結構域沉默子)以及結合適體因子FADD、TRADD、TRAF2、c-IAP、RAIDD和TRIP，加上激酶RIP1和某些Caspase(綜述於Chen和Goeddel，2002，Science 2961634-1635；以及Muzio和Saccani，載於Methods in Molecular MedicineTumor Necrosis Factor，Methods and Protocols；Corti和Ghezzi編輯，(Humana Press，New Jersey)，81-99頁)。組裝的信號轉導複合物可通過NF-κB活化和隨後的下遊基因活化來活化細胞存活通路，或通過Caspase活化來活化凋亡通路。
在其它疾病中，TNF-α可誘導相似的胞外下遊細胞因子級聯和胞內信號轉導通路。因此，對於其中TNF-α分子促進病理狀況的其它疾病或障礙，抑制TNF-α提供了一種治療方法。
VEGF血管生成在炎性滑膜組織的活性增殖中起重要作用。高度血管化的RA滑膜組織侵襲外周關節軟骨和骨組織，導致關節損傷。
血管內皮細胞生長因子(VEGF)是已知最有效的血管生成細胞因子。VEGF是肝素結合的分泌性同二聚糖蛋白，由於其初級轉錄物的可變剪接而以幾種可變形式存在(Leung等，1989，Science 2461306)。還已知VEGF為血管通透性因子(VPF)，這歸因於其誘導炎症中的重要過程血管滲漏的能力。在RA患者滑膜組織中鑑別出VEGF突顯了VEGF在RA病理學中的潛在作用(Fava等，1994，J.Exp.Med.180341346；Nagashima等，1995，J.Rheumatol.221624-1630)。依據其中於鼠膠原蛋白誘導型關節炎(CIA)模型中給予抗VEGF抗體的研究，VEGF在RA病理學中的作用得以鞏固。在這些研究中，當誘發疾病時，關節中的VEGF表達增加，給予抗-VEGF抗血清阻斷了關節疾病的發展，並改善既有疾病(Sone等，2001，Biochem.Biophys.Res.Comm.281562-568；Lu等，2000，J.Immunol.1645922-5927)。
抗體多肽抗體對其結合靶是高度特異性的，儘管抗體源自天然的自身防禦機制，但抗體在用於治療人類患者疾病時面臨著幾個挑戰。常規抗體是多亞單位的大蛋白分子，含至少4條多肽鏈。例如，人IgG具有2條重鏈和2條輕鏈，其二硫鍵鍵合，以形成功能性抗體。常規IgG的大小為約150kD。因為其相對較大的尺寸，所以完整抗體(例如IgG、IgA、IgM等)在治療有效性方面受限，這可歸因於例如組織穿透方面的問題。相當多的研究工作集中在鑑別和生產保留抗原結合功能和溶解性的較小抗體片段。
抗體的重鏈和輕鏈多肽鏈含直接參與抗原相互作用的可變(V)區以及提供結構支持和起與免疫效應子的非抗原特異性相互作用的恆定(C)區。常規抗體的抗原結合結構域由兩個分離的結構域組成重鏈可變結構域(VH)和輕鏈可變結構域(VL其可為Vκ或者Vλ)。抗原結合位點自身由6個多肽環組成3個來自VH結構域(H1、H2和H3)，3個來自VL結構域(L1、L2和L3)。在體內，通過組合重排基因節段產生編碼VH和VL結構域的V基因的多樣性主庫。C區包括輕鏈C區(稱為CL區)和重鏈C區(稱為CH1、CH2和CH3區)。
已依據蛋白酶消化鑑別出天然抗體的眾多較小抗原結合片段。這些片段包括例如「Fab片段」(VL-CL-CH1-VH)、「Fab′片段」(具有重鏈鉸鏈區的Fab)和「F(ab′)2片段」(通過重鏈鉸鏈區接合的Fab′片段的二聚體)。已使用重組方法產生更小的抗原結合片段，稱為「單鏈Fv」(可變片段)或「scFv」，其由通過合成肽接頭接合的VL和VH組成。
單結構域抗體儘管通常已知天然抗體(例如人和大部分其它哺乳動物中)的抗原結合單位由一對V區(VL/VH)組成，但駱駝科(camelid)物種表達大比例的全功能、高特異性、無輕鏈序列的抗體。已發現駱駝科重鏈抗體為單個重鏈經其恆定區二聚化的同二聚體。這些駱駝科重鏈抗體的可變區被稱為VHH結構域，保留在分離為VH鏈片段時以高特異性結合抗原的能力((Hamers-Casterman等，1993，Nature 363446-448；Gahroudi等，1997，FEBS Lett.414521-526)。還已由例如由免疫小鼠脾臟的基因組DNA擴增並在大腸桿菌中表達的鼠VH基因文庫中鑑別出抗原結合的單VH結構域(Ward等，1989，Nature 341544-546)。Ward等將分離的單VH結構域命名為「dAb」，代表「結構域抗體」。術語「dAb」在本文指特異性結合抗原的單免疫球蛋白可變結構域(VH、VHH或VL)多肽。「dAb」獨立於其它V結構域結合抗原；但是，如同該術語在本文使用的情況一樣，「dAb」可以同其它VH或VL結構域的同或異多聚體形式存在，在該情況下dAb結合抗原不需要其它結構域，即在該情況下dAb獨立於另外的VH、VHH或VL結構域結合抗原。
單免疫球蛋白可變結構域，例如VHH，是已知最小的抗原結合抗體單位。為用於治療，優選人抗體，這主要是因為其在給予患者時不大可能激發免疫應答。如上所述，分離的非駱駝科VH結構域往往相對不溶，通常表達較差。駱駝科VHH與人抗體VH結構域的對比揭示，在對應於人VH結構域的VH/VL接合處的駱駝科VHH結構域構架區中有幾個關鍵差異。已對人VH3的這些殘基進行了更接近地類似VHH序列的突變(具體地說為Gly 44 Glu、Leu 45 Arg和Trp 47Gly)，以產生保留抗原結合活性(Davies和Riechmann，1994，FEBS Lett.339285-290)且還有改善的表達和溶解性的「駱駝化」人VH結構域。(本文使用的可變結構域胺基酸編號與Kabat編號慣例(Kabat等，1991，Sequences of Immunological Interest，第5版，美國健康與人類服務部，Washington，D.C.)一致)。WO 03/035694(Muyldermans)報導，Trp 103Arg突變改善了非駱駝科VH結構域的溶解性。Davies和Riechmann(1995，Biotechnology N.Y.13475-479)還報導了駱駝化人VH結構域噬菌體展示庫的產生和以100-400nM範圍內的親合力結合半抗原的克隆的選擇，但選定的結合蛋白抗原的克隆具有較弱的親合力。
抗體的抗原結合結構域包含2個分離的區域重鏈可變結構域(VH)和輕鏈可變結構域(VL其可為Vκ或者Vλ)。抗原結合位點自身由6個多肽環組成3個來自VH結構域(H1、H2和H3)，3個來自VL結構域(L1、L2和L3)。通過組合重排基因節段生產編碼VH和VL結構域的V基因的多樣性主庫。VH基因通過3個基因節段VH、D和JH的重組產生。在人中，根據單倍型，有約51種功能性VH節段(Cook和Tomlinson(1995)Immunol Today，16237)、25種功能性D節段(Corbett等，(1997)J.Mol.Biol.，26869)和6種功能性JH節段(Ravetch等，(1981)Cell，27583)。VH節段編碼形成VH結構域的第一個和第二個抗原結合環(H1和H2)的多肽鏈區，而VH、D和JH節段組合形成VH結構域的第三個抗原結合環(H3)。VL基因通過重組僅2個基因節段VL和JL產生。在人中，根據單倍型，有約40種功能性Vκ節段(Schable和Zachau(1993)Biol.Chem.Hoppe-Seyler，3741001)、31種功能性Vλ節段(Williams等，(1996)J.Mol.so Biol.，264220；Kawasaki等，(1997)Genome Res.，7250)、5種功能性Jκ節段(Hieter等，(1982)J.Biol.Chef.，2571516)和4種功能性Jλ節段(Vasicek和Leder(1990)J.Exp.Med.，172609)。VL節段編碼形成VL結構域的第一個和第二個抗原結合環(L1和L2)的多肽鏈區，而VL和JL節段組合形成VL結構域的第三個抗原結合環(L3)。一般認為，選自該主庫的抗體多樣化得足以以至少中等的親合力結合幾乎所有抗原。通過重排基因的「親合力突變」產生高親合力抗體，其中免疫系統以改善的結合為基準生產和選擇點突變。
抗體的結構和序列分析表明，6個抗原結合環中有5個(H1、H2、L1、L2、L3)具有少量主鏈構象或規範結構(Chothia和Lesk(1987)dMol.Biol.，196901；Chothia等，(1989)Nature，342877)。主鏈構象由(i)抗原結合環的長度和(ii)抗原結合環和抗體構架中的某些關鍵位置的特定殘基或殘基類型決定。環長和關鍵殘基的分析能使我們預測由大部分人抗體序列編碼的H1、H2、L1、L2和L3的主鏈構象(Chothia等，(1992)J.Mol.Biol.，227799；Tomlinson等，(1995)EMBOJ.，144628；Williams等，(1996)J.Mol.Biol.，264220)。儘管H3區就序列、長度和結構而言更加多樣化(由於使用D節段)，但其也形成少量短環長的主鏈構象，其取決於環和抗體構架中關鍵位置的具體殘基的長度和存在情況或殘基類型(Martin等，(1996)J.Mol.Biol，263800；Shirai等，(1996)FEBS Letters，3991)。
雙特異性抗體含VH和VL區互補對的雙特異性抗體是本領域已知的。這些雙特異性抗體必須包含2對VH和VL，各個VH/VL對結合單個抗原或表位。所描述的方法包括雜合雜交瘤(Milstein和Cuello，Nature 305537-40)、微型抗體(Hu等，(1996)Cancer Res 30563055-3061)、雙功能抗體(Holliger等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，6444 6448；WO 94/13804)、螯合重組抗體(CRAb；(Neri等，(1995)J.Mol.Biol.246，367-373)、雙scFv(例如Atwell等，(1996)Mol.Immunol.33，13011312)、「洞中結(knobs in holes)」穩定化抗體(Carter等，(1997)ProteinSci.6,781 788)。在每種情況下，各個抗體類型均包含兩個抗原結合位點，每個抗原結合位點均為VH和VL結構域互補對的形式。各個抗體由此能夠同時結合2個不同的抗原或表位，與每個抗原或表位的結合由VH及其互補VL結構域介導。這些技術中的每一種均具有其特定的缺點；例如對雜合雜交瘤來說，失活的VH/VL對可極大地降低雙特異性IgG的分數。
而且，大部分雙特異性方法依賴於不同VH/VL對的結合或VH和VL鏈的結合，以重建兩個不同的VH/VL結合位點。因此，不可能控制組裝分子中針對各個抗原或表位的結合位點的比率，因此，許多組裝分子結合一個抗原或表位，但不結合另一個。在某些情況下，已有可能在亞單位接合處工程改造重鏈和輕鏈(Carter等，1997)，以便提升對兩個抗原或表位均具有結合位點的分子數，但這永不會導致所有分子都結合兩個抗原或表位。
有一些證據表明，可將兩種不同的抗體結合特異性加入到同一結合位點中，但這些結合位點通常提供兩種或多種對應於結構相關抗原或表位的特異性，或者對應於具有廣泛交叉反應的抗體。例如，已如此描述了交叉反應抗體，通常其中兩個抗原在序列或結構上相關，例如雞蛋溶菌酶和火雞溶菌酶(McCafferty等，WO 92/01047)，或者游離半抗原和綴合至載體的半抗原(Griffiths AD等，EMBO J 19941314 3245-60)。在另一個實例中，WO 02/02773(Abbott Laboratories)描述了具有「雙重特異性」的抗體分子。所提到的抗體分子為針對多種抗原產生或選擇的抗體，使得其特異性覆蓋一種以上的抗原。在WO 02/02773的抗體中的各個互補VH/VL對指定了對兩個或更多結構相關抗原的單一結合特異性；在這種互補對中的VH和VL結構域均不具有單獨的特異性。
因此，抗體具有廣泛的單一特異性，其包括兩種結構相關抗原。而且，已描述了為多反應性的天然自身抗體(Casali和Notkins，Ann.Rev.Immunol.7，515-531)，其與至少兩種(通常更多)結構不相關的不同抗原或表位反應。還已經表明，對單克隆抗體使用噬菌體展示技術選擇隨機肽庫將鑑別出一系列匹配抗原結合位點的肽序列。這些序列中有一些是高度相關的，具有共有序列，而其它序列非常不同，被稱為模擬表位(Lane和Stephen，Current Opinion in Immunology，1993，5，268-271)。因此，很明顯，含結合和互補的VH和VL結構域的天然4鏈抗體具有結合大範圍已知抗原中的多種不同抗原的潛力。較不清楚如何在同一抗體中建立針對兩個給定抗原(具體地說是結構上未必相關的抗原)的結合位點。
已經表明，蛋白工程方法對這方面可能有意義。例如，還已提出可通過一個可變結構域建立對金屬離子具有結合活性的催化抗體，或通過與金屬離子和互補可變結構域接觸建立對半抗原(底物)具有結合活性的催化抗體(Barbae等，5 1993 Proc.Natl.Acad.Sci USA 90，6385-6389)。但是，在此情況下，已提出底物(第一個抗原)的結合和催化需要金屬離子(第二個抗原)的結合。因此，與VH/VL對的結合涉及單組分而不是多組分抗原。
業已描述了由駱駝抗體重鏈單結構域建立雙特異性抗體的方法，其中在一個可變結構域中建立對一個抗原的結合接觸，在第二個可變結構域中建立對第二個抗原的結合接觸。但是，可變結構域是不互補的。因此，選擇抗第一個抗原的第一個重鏈可變結構域和抗第二個抗原的第二個重鏈可變結構域，然後將兩個結構域一起連接在同一條鏈上，以產生雙特異性抗體片段(Conrath等，J.Biol.Chem.270，27589-27594)。但是，駱駝重鏈單結構域的與眾不同之處在於其源自不具有輕鏈的天然駱駝抗體，實際上重鏈單結構域不能與駱駝輕鏈結合以形成互補性VH和VL對。
還已經描述了單重鏈可變結構域，其源自一般與輕鏈結合的天然抗體(源自單克隆抗體或結構域庫；參見EP-A-0368684)。已經表明，這些重鏈可變結構域特異性地與一種或多種相關抗原相互作用，但不與其它的重鏈或輕鏈可變結構域組合以建立對兩種或多種不同抗原具有特異性的配體。而且，已經表明，這些單結構域具有非常短的體內半壽期。因此，此結構域的治療價值有限。
已經提出通過將不同特異性的重鏈可變結構域連接在一起(如上所述)製備雙特異性抗體片段。該方法的缺點在於分離的抗體可變結構域可具有疏水界面，其一般與輕鏈相互作用，暴露於溶劑，可為「粘性的」，使得單結構域結合疏水表面。而且，在沒有配偶體輕鏈時，兩個或更多不同重鏈可變結構域可經其疏水界面組合和結合，這可阻止其結合其在分離時能夠結合的一種或兩種配體。此外，在此情況下，重鏈可變結構域不能與互補輕鏈可變結構域結合，因此可能不穩定和容易被打開(Worn和Pluckthun，1998 Biochemistry 37，13120-7)。
發明概述本發明的發明人在其共同待審的國際專利申請WO 03/002609中以及共同待審的未公開英國專利申請0230203.2中已描述了含免疫球蛋白單可變結構域的雙特異性免疫球蛋白配體，其中各個可變結構域可具有不同的特異性。結構域可相互起競爭作用，或獨立地結合靶分子上的抗原或表位。
本發明描述了在患TNF-α相關性炎性疾病的個體中治療該疾病的方法。該方法包括給予該個體治療有效量的單結構域抗體多肽構建物，優選人單結構域抗體構建物，其中單結構域抗體多肽構建物結合人TNF-α，由此治療TNF-α相關性疾病。
在一個方面，炎性疾病為類風溼性關節炎，該方法包括使用一種或多種單結構域抗體多肽構建物，其中一種或多種構建物拮抗人TNF-α與受體的結合。本發明描述了含一種或多種拮抗人TNF-α與受體結合的單結構域抗體多肽構建物的組合物，並描述了雙特異性配體，其中配體的一種特異性針對TNFα，第二種特異性針對VEGF或HSA。本發明進一步描述了雙特異性抗體，其中配體的一種特異性針對VEGF，第二種特異性針對HSA。
本文還包含如本文所述的多肽構建物在製備疾病治療藥物中的用途，具體地說是在製備類風溼性關節炎治療藥物中的用途。
在一個方面，本發明包括治療類風溼性關節炎的方法，該方法包括給予有需要的個體治療有效量的組合物，其包含拮抗人TNF-α與受體結合的單結構域抗體多肽構建物，由此治療類風溼性關節炎。
在一個實施方案中，組合物在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時阻止關節炎記分增加。
在另一個實施方案中，給予Tg197轉基因小鼠組合物包括以下步驟a)每周一次腹膜內注射給予雜合Tg197轉基因小鼠組合物，b)每周一次稱步驟a)小鼠的重量，和c)按照以下系統每周一次記錄小鼠的關節炎宏觀表型病徵0＝無關節炎(正常外觀和屈曲狀態)，1＝輕度關節炎(關節扭曲)，2＝中度關節炎(腫脹，關節變形)，3＝重度關節炎(移動嚴重受損)。
在另一個實施方案中，在關節炎症狀明顯發作之前給予小鼠組合物。在另一個實施方案中，在小鼠3周大時第一次給予組合物。在另一個實施方案中，在小鼠6周大時第一次給予組合物。
在另一個實施方案中，組合物在Tg197轉基因小鼠關節炎實驗中具有的效力在統計顯著性範圍內大於或等於相等劑量(以mg/kg為基準)藥物(選自依那西普、英利昔單抗和D2E7)的效力。
在另一個實施方案中，組合物在Tg197轉基因小鼠關節炎實驗中具有效力，使得治療產生0-0.5的關節炎記分。在另一個實施方案中，組合物在Tg197轉基因小鼠關節炎實驗中具有效力，使得治療產生0-1.0的關節炎記分。在另一個實施方案中，組合物在Tg197轉基因小鼠關節炎實驗中具有效力，使得治療產生0-1.5的關節炎記分。在另一個實施方案中，組合物在Tg197轉基因小鼠關節炎實驗中具有效力，使得治療產生0-2.0的關節炎記分。
在另一個實施方案中，治療包括抑制類風溼性關節炎進展。在另一個實施方案中，治療包括預防或延遲類風溼性關節炎的發作。
在另一個實施方案中，給予導致一種或多種RA指徵的統計學顯著變化。在另一個實施方案中，一種或多種RA指徵包括以下的一種或多種紅細胞沉降率(ESR)、Ritchie關節指數和晨僵持續時間、關節活動性、關節腫脹、一個或多個關節的x射線造影和一個或多個關節固定化切片的組織病理學分析。
在另一個實施方案中，一種或多種RA指徵包括Tg197轉基因小鼠中的關節炎宏觀表型病徵減退，其中給予Tg197轉基因小鼠組合物，其中記錄Tg197轉基因小鼠的關節炎宏觀表型病徵，其中按照以下系統記錄關節炎宏觀表型病徵0＝無關節炎(正常外觀和屈曲狀態)，1＝輕度關節炎(關節扭曲)，2＝中度關節炎(腫脹，關節變形)，3＝重度關節炎(移動嚴重受損)。
在另一個實施方案中，一種或多種RA指徵包括Tg197轉基因小鼠中的關節炎組織病理學病徵減退，其中給予Tg197轉基因小鼠組合物，其中記錄Tg197轉基因小鼠的關節炎組織病理學病徵，其中關節炎組織病理學病徵表現在關節上，並按照以下系統記錄0＝無可檢測的病理狀況，1＝滑膜增生和出現多形核白細胞浸潤，2＝血管翳和纖維組織形成以及病灶性軟骨下骨侵蝕，3＝關節軟骨破壞和骨侵蝕，4＝廣泛的關節軟骨破壞和骨侵蝕。
在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包括人單結構域抗體多肽。在另一個實施方案中，人單結構域抗體多肽結合TNFα。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物以小於100nM的Kd結合人TNFα。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物以100nM至50pM範圍的Kd結合人TNFα。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物以30nM至50pM的Kd結合人TNFα。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物以10nM至50pM的Kd結合人TNFα。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物以1nM至50pM範圍的Kd結合人TNFα。
在另一個實施方案中，據在標準L929細胞毒性細胞實驗中的檢測，單結構域抗體多肽構建物拮抗人TNFα。
本發明進一步包括治療類風溼性關節炎的方法，該方法包括給予有需要的個體治療有效量的組合物，其包含拮抗人TNFα與受體結合的單結構域抗體多肽構建物，其中單結構域抗體多肽構建物抑制人TNFα與TNFα受體的結合，由此治療類風溼性關節炎。
在一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物特異性結合與細胞表面受體結合的人TNFα。
在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有在15分鐘至12小時範圍內的體內tα半壽期。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有在1-6小時範圍內的體內tβ半壽期。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有在2-5小時範圍內的體內tβ半壽期。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有在3-4小時範圍內的體內tβ半壽期。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有在12-60小時範圍內的體內tβ半壽期。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有在12-48小時範圍內的體內tβ半壽期。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有在12-26小時範圍內的體內tβ半壽期。
在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有15mg.分鐘/ml至150mg.分鐘/ml的體內AUC半壽期值。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有15mg.分鐘/ml至100mg.分鐘/ml的體內AUC半壽期值。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有15mg.分鐘/ml至75mg.分鐘/ml的體內AUC半壽期值。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有15mg.分鐘/ml至50mg.分鐘/ml的體內AUC半壽期值。
在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物連接至PEG分子。在另一個實施方案中，PEG連接的單結構域抗體多肽構建物具有至少24kDa的流體動力學大小，其中總PEG大小為20-60kDa。在另一個實施方案中，PEG連接的單結構域抗體多肽構建物具有至少200kDa的流體動力學大小和20-60kDa的總PEG大小。在另一個實施方案中，本發明的PEG化蛋白平均可連接至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、17、20或更多個聚乙二醇分子。
在另一個實施方案中，抗體構建物含兩個或更多結合人TNFα的單免疫球蛋白可變結構域多肽。在另一個實施方案中，抗體構建物含結合人TNFα的單免疫球蛋白可變結構域多肽的同二聚體。在另一個實施方案中，抗體構建物含結合人TNFα的單免疫球蛋白可變結構域多肽的同三聚體。在另一個實施方案中，抗體構建物含結合人TNFα的單免疫球蛋白可變結構域多肽的同四聚體。
在另一個實施方案中，構建物還包含對非TNFα抗原有特異性的抗體多肽。在另一個實施方案中，對非TNFα抗原有特異性的抗體多肽包括單結構域抗體多肽。在另一個實施方案中，對非TNFα抗原有特異性的抗體多肽與非TNFα抗原的結合增加了抗體多肽構建物的體內半壽期。在另一個實施方案中，非TNFα抗原包括血清蛋白。在另一個實施方案中，血清蛋白選自纖維蛋白、α-2巨球蛋白、血清白蛋白、纖維蛋白原A、纖維蛋白原、血清澱粉樣蛋白A、七球蛋白(heptaglobin)、蛋白、泛素、子宮球蛋白和β-2-微球蛋白。在另一個實施方案中，非TNFα抗原包括HSA。
在另一個實施方案中，治療還包括給予至少一種另外的治療劑。
在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽CDR3的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少85％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少90％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少92％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少94％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少96％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少98％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少99％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
本發明進一步包括治療類風溼性關節炎的方法，該方法包括給予有需要的個體治療有效量的組合物，其包含拮抗人TNFα與受體結合的單結構域抗體多肽構建物，其中組合物在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時阻止關節炎記分增加，其中單結構域抗體多肽構建物以小於100nM的Kd結合人TNFα，其中據在標準L929細胞實驗中的檢測，單結構域抗體多肽構建物中和人TNFα，其中治療類風溼性關節炎。
本發明進一步包括含單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中單結構域抗體多肽構建物拮抗人TNFα與受體的結合，在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時防止關節炎記分增加，其中據在標準L929細胞實驗中的檢測，單結構域抗體多肽構建物中和人TNFα。
本發明進一步包括含單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中單結構域抗體多肽構建物拮抗人TNFα與受體的結合，在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時阻止關節炎記分增加，其中單結構域抗體多肽構建物抑制類風溼性關節炎進展。
本發明進一步包括含單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中單結構域抗體多肽構建物拮抗人TNFα與受體的結合，在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時阻止關節炎記分增加，其中單結構域抗體多肽構建物以小於100nM的Kd結合人TNFα。
本發明進一步包括含單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中單結構域抗體多肽構建物拮抗人TNFα與受體的結合，在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時阻止關節炎記分增加，其中據在標準L929細胞實驗中的檢測，單結構域抗體多肽構建物中和人TNFα，其中單結構域抗體多肽構建物抑制類風溼性關節炎進展，其中單結構域抗體多肽構建物以小於100nM的Kd結合人TNFα。
在前述3個實施方案的進一步的實施方案中，單結構域抗體多肽構建物含選自以下克隆的抗體多肽CDR3的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
在進一步的實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少85％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
在進一步的實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少90％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
在進一步的實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少92％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
在進一步的實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少94％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
在進一步的實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少96％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
在進一步的實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少98％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
在進一步的實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少98％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
在進一步的實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少99％相同的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19。
本發明進一步包括治療類風溼性關節炎的方法，該方法包括給予有需要的個體治療有效量的組合物，其包含拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物，由此治療類風溼性關節炎。
在一個實施方案中，組合物在給予膠原蛋白誘導型關節炎(CIA)小鼠模型的小鼠時阻止關節炎記分增加。用鼠II型膠原蛋白免疫DBA/1小鼠誘發慢性復髮型多關節炎，其提供了人自身免疫性關節炎的強大模型。該模型描述於例如Courtenay等，1980，Nature 282666-668，Kato等，1996，Ann.Rheum.Dis.55535-539和Myers等，1997，Life Sci.611861-1878，其各自通過引用結合到本文中。
在一個實施方案中，給予小鼠組合物包括以下步驟a)每周一次腹膜內注射給予CIA小鼠組合物，b)每周一次稱步驟a)小鼠的重量，和c)按照以下系統每周一次記錄小鼠的關節炎宏觀表型病徵0＝無關節炎(正常外觀和屈曲狀態)，1＝輕度關節炎(關節扭曲)，2＝中度關節炎(腫脹，關節變形)，3＝重度關節炎(移動嚴重受損)。
在一個實施方案中，治療包括抑制類風溼性關節炎的進展。
在一個實施方案中，治療包括預防和延遲類風溼性關節炎發作。
在一個實施方案中，給予產生一種或多種RA指徵的統計學顯著變化。變化優選達至少10％或以上。
在一個實施方案中，一種或多種RA指徵包括以下的一種或多種紅細胞沉降率(ESR)、Ritchie關節指數(描述於Ritchie等，1968，Q.J.Med.37393-406)和晨僵持續時間、關節活動性、關節腫脹、一個或多個關節的x射線造影分析以及通過一個或多個關節固定化切片分析獲得的組織病理學指示。還可使用病情活動指數(DAS)和/或慢性關節炎系統指數(CASI)評價治療影響的病情活動和變化，參見Carotti等，2002，Ann.Rheum.Dis.61877-882，和Salaffi等，2000，Rheumatology 3990-96。
在一個實施方案中，一種或多種RA指徵包括在膠原蛋白誘導型關節炎小鼠模型的小鼠中關節炎宏觀表型病徵減退，其中給予小鼠組合物，其中記錄小鼠的關節炎宏觀表型病徵，其中按照以下系統記錄關節炎宏觀表型病徵0＝無關節炎(正常外觀和屈曲狀態)，1＝輕度關節炎(關節扭曲)，2＝中度關節炎(腫脹，關節變形)，3＝重度關節炎(移動嚴重受損)。
在一個實施方案中，一種或多種RA指徵包括在膠原蛋白誘導型關節炎小鼠模型的小鼠中的關節炎組織病理學病徵減退，其中給予小鼠組合物，其中記錄小鼠的關節炎組織病理學病徵，其中關節炎組織病理學病徵表現在關節上，並使用以下系統記錄0＝無可檢測的病理狀況，1＝滑膜增生和出現多形核白細胞浸潤，2＝血管翳和纖維組織形成以及病灶性軟骨下骨侵蝕，3＝關節軟骨破壞和骨侵蝕，4＝廣泛的關節軟骨破壞和骨侵蝕。
在一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包括人單結構域抗體多肽。
在一個實施方案中，人單結構域抗體多肽結合VEGF。
在一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物以小於100nM的Kd結合人VEGF。
在一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物以100nM至50pM範圍內的Kd結合人VEGF。
在一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物以30nM至50pM的Kd結合人VEGF。
在一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物以10nM至50pM的Kd結合人VEGF。
在一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物以1nM至50pM範圍內的Kd結合人VEGF。
在一個實施方案中，據在VEGF受體1實驗或VEGF受體2實驗中的檢測，單結構域抗體多肽構建物中和人VEGF。
本發明進一步包括治療類風溼性關節炎的方法，該方法包括給予有需要的個體治療有效量的組合物，其包含拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體構建物，其中單結構域抗體構建物抑制人VEGF與VEGF受體的結合，由此治療類風溼性關節炎。
在一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物特異性結合與細胞表面受體結合的人VEGF。
在一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物連接至PEG分子。
在一個實施方案中，PEG連接的單結構域抗體多肽構建物具有至少24kDa的流體動力學大小，其中總PEG大小為20-60kDa。
在一個實施方案中，PEG連接的單結構域抗體多肽構建物具有至少200kDa的流體動力學大小和20-60kDa的總PEG大小。
在一個實施方案中，本發明的PEG化蛋白平均可連接至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、17、20或更多個聚乙二醇分子。
在一個實施方案中，抗體構建物含兩個或更多結合人VEGF的單免疫球蛋白可變結構域多肽。
在一個實施方案中，抗體構建物含結合人VEGF的單免疫球蛋白可變結構域多肽的同二聚體。
在一個實施方案中，抗體構建物含結合人VEGF的單免疫球蛋白可變結構域多肽的同三聚體。
在一個實施方案中，抗體構建物含結合人VEGF的單免疫球蛋白可變結構域多肽的同四聚體。
在一個實施方案中，抗體構建物進一步含對非VEGF抗原具有特異性的抗體多肽。
在一個實施方案中，對非VEGF抗原具有特異性的抗體多肽包括單結構域抗體多肽。
在一個實施方案中，對非VEGF抗原具有特異性的抗體多肽與非VEGF抗原的結合增加抗體多肽構建物的體內半壽期。
在一個實施方案中，非VEGF抗原包括血清蛋白。
在一個實施方案中，血清蛋白選自纖維蛋白、α-2巨球蛋白、血清白蛋白、纖維蛋白原A、纖維蛋白原、血清澱粉樣蛋白A、七球蛋白、蛋白、泛素、子宮球蛋白和β-2-微球蛋白。
在一個實施方案中，非VEGF抗原包括HSA。
在一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有在15分鐘至12小時範圍內的體內tα半壽期。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有在1-6小時範圍內的體內tβ半壽期。
在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有在2-5小時範圍內的體內tβ半壽期。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有在3-4小時範圍內的體內tβ半壽期。
在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有在12-60小時範圍內的體內tβ半壽期。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有在12-48小時範圍內的體內tβ半壽期。
在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有在12-26小時範圍內的體內tβ半壽期。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有15mg.分鐘/ml至150mg.分鐘/ml的體內AUC半壽期值。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有15mg.分鐘/ml至100mg.分鐘/ml的體內AUC半壽期值。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有15mg.分鐘/ml至75mg.分鐘/ml的體內AUC半壽期值。在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物具有15mg.分鐘/ml至50mg.分鐘/ml的體內AUC半壽期值。
在一個實施方案中，治療進一步包括給予至少一種另外的治療劑。
在一個實施方案中，治療劑選自依那西普、英利昔單抗和D2E7。
在一個實施方案中，治療劑選自皮質類固醇、蛋白水解酶、非甾體類抗炎藥物(NSAID)、乙醯水楊酸、吡唑酮、芬那酸(fenamate)、二氟尼柳、乙酸衍生物、丙酸衍生物、昔康(oxicams)、甲芬那酸、Ponstel、甲氯芬那酸、Meclomen、保泰松、Butazolidin、二氟尼柳、Dolobid、雙氯芬酸、扶他林、吲哚美辛(indomethacin)、消炎痛(Indocin)、舒林酸、奇諾力、依託度酸、羅丁、酮咯酸、Toradol、萘丁美酮、瑞力芬、託美丁、託來汀、布洛芬、美林、非諾洛芬、Nalfon、氟比洛芬、Anthe、卡洛芬、Rimadyl、酮洛芬、Orudis、萘普生、Anaprox、Naprosyn、吡羅昔康和Feldene。
在一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的CDR3的胺基酸序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
在一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少85％相同的胺基酸序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
在一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少90％相同的胺基酸序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
在一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少92％相同的胺基酸序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
在一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少94％相同的胺基酸序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
在一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少96％相同的胺基酸序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
在一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少98％相同的胺基酸序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
在一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列或與其至少99％相同的胺基酸序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
本發明進一步包括含拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中單結構域抗體多肽構建物含選自以下的CDR3序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
本發明進一步包括含拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中單結構域抗體多肽構建物含選自以下的胺基酸序列或與其至少85％相同的序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
本發明進一步包括含拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中單結構域抗體多肽構建物含選自以下的胺基酸序列或與其至少90％相同的序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
本發明進一步包括含拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中單結構域抗體多肽構建物含選自以下的胺基酸序列或與其至少92％相同的序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
本發明進一步包括含拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中單結構域抗體多肽構建物含選自以下的胺基酸序列或與其至少94％相同的序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
本發明進一步包括含拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中單結構域抗體多肽構建物含選自以下的胺基酸序列或與其至少96％相同的序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
本發明進一步包括含拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中單結構域抗體多肽構建物含選自以下的胺基酸序列或與其至少98％相同的序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
本發明進一步包括含拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中單結構域抗體多肽構建物含選自以下的胺基酸序列或與其至少99％相同的序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30。
本發明進一步包括治療類風溼性關節炎的方法，該方法包括給予有需要的個體治療有效量的組合物，其中組合物包含拮抗人TNF-α與受體的結合併拮抗人VEGF與受體的結合的單結構域抗體構建物，由此治療類風溼性關節炎。
在一個實施方案中，組合物在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時，阻止關節炎記分增加。
在另一個實施方案中，給予Tg197轉基因小鼠組合物包括以下步驟a)每周一次腹膜內注射給予雜合Tg197轉基因小鼠組合物，b)每周一次稱步驟a)小鼠的重量，和c)按照以下系統每周一次記錄小鼠的關節炎宏觀表型病徵0＝無關節炎(正常外觀和屈曲狀態)，1＝輕度關節炎(關節扭曲)，2＝中度關節炎(腫脹，關節變形)，3＝重度關節炎(移動嚴重受損)。
在另一個實施方案中，組合物在Tg197轉基因小鼠關節炎實驗中具有的效力在統計顯著性範圍內大於或等於選自依那西普、英利昔單抗和D2E7的藥物的效力。
在另一個實施方案中，治療包括抑制類風溼性關節炎的進展。
在另一個實施方案中，治療包括預防或延遲類風溼性關節炎的發作。
在另一個實施方案中，給予產生一種或多種RA指徵的統計學顯著的變化。
在另一個實施方案中，一種或多種RA指徵包括以下的一種或多種紅細胞沉降率(ESR)、Ritchie關節指數和晨僵持續時間、關節活動性、關節腫脹、一個或多個關節的x射線造影和一個或多個關節固定化切片的組織病理學分析。
在另一個實施方案中，一種或多種RA指徵包括Tg197轉基因小鼠中的關節炎宏觀表型病徵減退，其中給予Tg197轉基因小鼠組合物，其中記錄Tg197轉基因小鼠的關節炎宏觀表型病徵，其中按照以下系統記錄關節炎宏觀表型病徵0＝無關節炎(正常外觀和屈曲狀態)，1＝輕度關節炎(關節扭曲)，2＝中度關節炎(腫脹，關節變形)，3＝重度關節炎(移動嚴重受損)。
在另一個實施方案中，一種或多種RA指徵包括Tg197轉基因小鼠中的關節炎組織病理學病徵減退，其中給予Tg197轉基因小鼠組合物，其中記錄Tg197轉基因小鼠的關節炎組織病理學病徵，其中關節炎組織病理學病徵表現在關節上，並使用以下系統記錄0＝無可檢測的病理狀況，1＝滑膜增生和出現多形核白細胞浸潤，2＝血管翳和纖維組織形成以及病灶性軟骨下骨侵蝕，3＝關節軟骨破壞和骨侵蝕，4＝廣泛的關節軟骨破壞和骨侵蝕。
在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物包括人單結構域抗體多肽。
在另一個實施方案中，人單結構域抗體多肽結合TNFα和VEGF。
在另一個實施方案中，據在標準L929細胞實驗中的檢測，單結構域抗體多肽構建物中和人TNFα。
在另一個實施方案中，單結構域抗體多肽構建物連接至PEG分子。
在另一個實施方案中，PEG連接的單結構域抗體多肽構建物具有至少24kDa的流體動力學大小，其中總PEG大小為20-60kDa。
在另一個實施方案中，PEG連接的單結構域抗體多肽構建物具有至少200kDa的流體動力學大小和20-60kDa的總PEG大小。
在另一個實施方案中，抗體多肽構建物平均連接至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、17、20或更多個聚乙二醇分子。
在另一個實施方案中，抗體構建物含兩個或更多結合人TNFα的單免疫球蛋白可變結構域多肽和/或兩個或更多結合人VEGF的單免疫球蛋白可變結構域多肽。
在另一個實施方案中，抗體構建物含結合人TNFα的單免疫球蛋白可變結構域多肽的同二聚體和/或結合人VEGF的單免疫球蛋白可變結構域多肽的同二聚體。
在另一個實施方案中，抗體構建物含結合人TNFα的單免疫球蛋白可變結構域多肽的同三聚體和/或結合人VEGF的單免疫球蛋白可變結構域多肽的同三聚體。
在另一個實施方案中，抗體構建物含結合人TNFα的單免疫球蛋白可變結構域多肽的同四聚體和/或結合人VEGF的單免疫球蛋白可變結構域多肽的同四聚體。
在另一個實施方案中，抗體構建物進一步含對非TNFα或VEGF抗原具有特異性的抗體多肽。
在另一個實施方案中，對非TNFα或VEGF抗原具有特異性的抗體多肽包括單結構域抗體多肽。
在另一個實施方案中，對非TNFα或VEGF抗原具有特異性的抗體多肽與非TNFα或VEGF抗原的結合增加抗體多肽構建物的體內半壽期。
在另一個實施方案中，非TNFα或VEGF抗原包括血清蛋白。
在另一個實施方案中，血清蛋白選自纖維蛋白、α-2巨球蛋白、血清白蛋白、纖維蛋白原A、纖維蛋白原、血清澱粉樣蛋白A、七球蛋白、蛋白、泛素、子宮球蛋白和β-2-微球蛋白。
在另一個實施方案中，非TNFα抗原包括HSA。
在另一個實施方案中，治療還包括給予至少一種另外的治療劑。
本發明進一步包括含單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中單結構域抗體多肽構建物拮抗人TNFα與受體的結合以及拮抗人VEGF與受體的結合，在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時阻止關節炎記分增加，其中單結構域抗體多肽構建物抑制類風溼性關節炎進展。
本發明進一步包括含單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中單結構域抗體多肽構建物拮抗人TNFα與受體的結合以及拮抗人VEGF與受體的結合，在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時阻止關節炎記分增加，其中單結構域抗體多肽構建物以小於100nM的Kd結合人TNFα。
本發明進一步包括含單結構域抗體多肽構建物的組合物，其中單結構域抗體多肽構建物拮抗人TNFα與受體的結合以及拮抗人VEGF與受體的結合，在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時阻止關節炎記分增加，其中據在標準L929細胞實驗中的檢測，單結構域抗體多肽構建物中和人TNFα，其中單結構域抗體多肽構建物抑制類風溼性關節炎進展，其中單結構域抗體多肽構建物以小於100nM的Kd結合人TNFα。
另一個方面是選擇單結構域抗體多肽構建物的方法，其中單結構域抗體多肽構建物拮抗人TNFα與受體的結合，在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時阻止關節炎記分增加，其中據在標準L929細胞實驗中的檢測，所述單結構域抗體多肽構建物中和人TNFα，其中所述單結構域抗體多肽構建物抑制類風溼性關節炎進展，其中所述單結構域抗體多肽構建物以小於100nM的Kd結合人TNFα，該方法包括以下步驟(1)突變編碼所述單結構域抗體多肽構建物的幾個高變區位點的核酸，以便各個位點均產生所有可能的氨基置換，(2)將在步驟(1)中產生的編碼突變高變區位點的核酸導入到噬菌粒展示載體中，以形成大量展示載體，其每個均能表達所述突變高變區位點中的一種，展示在噬菌粒表面展示蛋白上；(3)在絲狀噬菌體顆粒表面上表達突變的高變區位點，以便由此產生的突變高變區位點作為與各個顆粒中包裝的M13的基因III產物的融合體，由絲狀噬菌體顆粒以單價形式展示，(4)篩選表面表達的噬菌體顆粒結合TNFα的能力，(5)分離能夠結合TNFα的表面表達的噬菌體顆粒，(6)選擇能夠結合TNFα的步驟(5)的表面表達噬菌體顆粒，其在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時也阻止關節炎記分增加，據在標準L929細胞實驗中的檢測，其中和人TNFα，抑制所述類風溼性關節炎進展，以小於100nM的Kd結合人TNFα，由此選擇一種或多種含展示蛋白的噬菌粒，其中展示蛋白含拮抗人TNFα與受體結合的單結構域抗體多肽構建物。
另一個方面是治療類風溼性關節炎的方法，該方法包括給予有需要的個體治療有效量的組合物，其含拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物，由此治療所述類風溼性關節炎，其中所述單結構域抗體多肽構建物具有在15分鐘至12小時、1-6小時、2-5小時或3-4小時範圍內的體內tα半壽期。
另一個實施方案是治療類風溼性關節炎的方法，該方法包括給予有需要的個體治療有效量的組合物，其含拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物，由此所述單結構域抗體多肽構建物具有在12-60小時、12-48小時或12-26小時範圍內的體內tβ半壽期。
另一個實施方案是治療類風溼性關節炎的方法，該方法包括給予有需要的個體治療有效量的組合物，其含拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物，由此所述單結構域抗體多肽構建物具有15mg.分鐘/ml至150mg.分鐘/ml、15mg.分鐘/ml至100mg.分鐘/ml、15mg.分鐘/ml至75mg.分鐘/ml或15mg.分鐘/ml至50mg.分鐘/ml的體內AUC半壽期值。
另一個實施方案是治療類風溼性關節炎的方法，該方法包括給予有需要的個體治療有效量的組合物，其中所述組合物含拮抗人TNFα與受體結合以及拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物，由此治療所述類風溼性關節炎，其中所述組合物在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時阻止關節炎記分增加，其中所述單結構域抗體多肽構建物各以小於100nM的Kd結合人TNFα和VEGF，其中所述單結構域抗體多肽構建物各以100nM至50pm範圍內的Kd結合人TNFα和VEGF，其中所述單結構域抗體多肽構建物各以30nM至50pm的Kd結合人TNFα和VEGF，其中所述單結構域抗體多肽構建物各以10nM至50pm的Kd結合人TNFα和VEGF，或其中所述單結構域抗體多肽構建物各以1nM至50pm範圍內的Kd結合人TNFα和VEGF。
另一個實施方案是治療類風溼性關節炎的方法，該方法包括給予有需要的個體治療有效量的組合物，其含拮抗人TNFα與受體結合以及拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物，其中所述單結構域抗體多肽構建物抑制人TNFα與TNFα受體的結合以及人VEGF與VEGF受體的結合，由此治療所述類風溼性關節炎。
另一個實施方案是治療類風溼性關節炎的方法，該方法包括給予有需要的個體治療有效量的組合物，其含拮抗人TNFα與受體結合以及拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物，其中所述單結構域抗體多肽構建物抑制人TNFα與TNFα受體的結合以及人VEGF與VEGF受體的結合，由此治療所述類風溼性關節炎，其中所述單結構域抗體多肽構建物特異性結合與細胞表面受體結合的人TNFα。
另一個實施方案是治療類風溼性關節炎的方法，該方法包括給予有需要的個體治療有效量的組合物，其中所述組合物含拮抗人TNFα與受體結合以及拮抗人VEGF與受體結合的單結構域抗體多肽構建物，由此治療所述類風溼性關節炎，其中所述單結構域抗體多肽構建物特異性結合與細胞表面受體結合的人TNFα。
本發明的另一個實施方案是治療類風溼性關節炎的方法，其包括給予TNFα特異性的抗體構建物，其中抗體構建物序列包含與本文提及的任一個抗TNFα克隆序列的同一性百分率大於或等於85、90、95、96、97、98、99或100％的序列或由其組成。
本發明的另一個實施方案是含TNFα特異性抗體構建物的組合物，其中抗體構建物序列包含與本文提及的任一個抗TNFα克隆序列的同一性百分率大於或等於85、90、95、96、97、98、99或100％的序列或由其組成。
本發明的另一個實施方案是治療類風溼性關節炎的方法，其包括給予VEGF特異性的抗體構建物，其中抗體構建物序列包含與本文提及的任一個抗VEGF克隆序列的同一性百分率大於或等於85、90、95、96、97、98、99或100％的序列或由其組成。
本發明的另一個實施方案是含對VEGF特異性的抗體構建物的組合物，其中抗體構建物序列包含與本文提及的任一個抗VEGF克隆序列的同一性百分率大於或等於85、90、95、96、97、98、99或100％的序列或由其組成。
在另一個實施方案中，提供四價雙特異性抗原結合多肽構建物，其含2個拷貝的、結合第一個抗原或表位的VH或VL單結構域抗體；和2個拷貝的、結合第二個抗原或表位的VH或VL單結構域抗體。第一個和第二個表位可存在於同一抗原上，或存在於不同抗原上。2個拷貝的、結合第一個抗原或表位的單結構域抗體各自均融合至各自的IgG重鏈恆定結構域，2個拷貝的、結合第二個抗原或表位的單結構域抗體各自均融合至各自的輕鏈恆定結構域。這些四價雙特異性多肽構建物是IgG樣的，因為其具有通過重鏈和輕鏈恆定結構域接合的兩個抗原結合臂。它們與天然IgG的不同之處在於藉助於在各個臂上存在的兩種不同抗原特異性單結構域抗體多肽，各個臂可結合兩種不同的抗原或表位，使構建物成為四價和雙特異性的。在一個實施方案中，第一個和第二個表位相同，使得有4個針對該表位的特異性結合位點存在於多肽構建物上。在另一個實施方案中，第一個和第二個表位不同，其存在於相同或不同的抗原上。
如本文所述的雙特異性四價多肽構建物可包括對任意兩個抗原或表位有特異性的單結構域抗體序列，但具體地說是對人TNF-α和VEGF有特異性的單結構域抗體序列，更具體地說是任何本文描述的單結構域抗體序列。在其它實施方案中，可使用Cκ或Cλ輕鏈恆定結構域，還可使用非IgG1的IgG重鏈恆定結構域。
本發明還包括含單結構域抗TNF-α抗體克隆和單結構域抗VEGF抗體克隆的這類構建物，單結構域抗TNF-α抗體克隆在作為單體給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時阻止關節炎記分增加，單結構域抗VEGF抗體克隆在作為單體給予膠原蛋白誘導型關節炎小鼠模型的小鼠時阻止關節炎記分增加。在進一步的實施方案中，所使用的單結構域抗TNF-α抗體克隆當用作單體時在本文描述的L929細胞毒性實驗中中和TNF-α，所使用的單結構域抗VEGF抗體克隆當用作單體時在本文描述的VEGF受體2結合實驗中拮抗VEGF受體結合。在進一步的實施方案中，所使用的單結構域抗體克隆以小於100nM的Kd結合其各自的抗原或表位。在進一步的實施方案中，雙特異性二價構建物以小於100nM的Kd結合其各自的抗原或表位，並在本文描述的Tg197和CIA關節炎模型的任一個中或二者中阻止關節炎記分增加。
就給予、劑量和效力監測而言，這種四價雙特異性構建物可以類似於本文所述其它構建物的方式用於治療類風溼性關節炎。可如上文所述，例如通過加入PEG部分，或通過與增加循環半壽期的蛋白(例如血清蛋白，如HSA)特異性結合部分(例如另外的單結構域抗體)的進一步融合，改變構建物的半壽期。
於是，在一個方面，描述了一種雙特異性抗原結合多肽，其含結合TNF-α的第一個抗體單結構域多肽和結合VEGF的第二個抗體單結構域多肽。這種多肽可用於例如治療類風溼性關節炎。
於是，在另一方面，描述了一種四價雙特異性抗原結合多肽構建物，其包含a)含結合第一個表位、融合至IgG重鏈恆定結構域的單結構域抗體多肽的第一個融合蛋白的第一個拷貝；b)所述第一個融合蛋白的第二個拷貝；c)含結合第二個表位、融合至輕鏈恆定結構域的單結構域抗體多肽的第二個融合蛋白的第一個拷貝；d)所述第二個融合蛋白的第二個拷貝；其中所述第一個融合蛋白的所述第一個和所述第二個拷貝經其各自的IgG重鏈恆定結構域彼此二硫鍵合，其中所述第二個融合蛋白的所述第一個拷貝的所述輕鏈恆定結構域二硫鍵合至所述第一個融合蛋白的所述第一個拷貝的IgG重鏈恆定結構域，其中第二個融合蛋白的所述第二個拷貝的所述輕鏈恆定結構域二硫鍵合至所述第一個融合蛋白的所述第二個拷貝的IgG重鏈恆定結構域，其中所述多肽構建物結合所述第一個和所述第二個表位。
在這種四價雙特異性抗原結合多肽構建物的一個實施方案中，結合第一個表位的單結構域抗體為選自VH和VL的V結構域。
在另一個實施方案中，結合第二個表位的單結構域抗體為選自VH和VL的V結構域。
在另一個實施方案中，IgG重鏈恆定結構域是IgG1重鏈恆定結構域。
在另一個實施方案中，輕鏈恆定結構域是Cκ或Cλ輕鏈恆定結構域。在另一個實施方案中，輕鏈恆定結構域是Cκ輕鏈恆定結構域。
在另一個實施方案中，第一個和第二個表位存在於同一抗原上。
在另一個實施方案中，第一個和第二個表位存在於不同的第一個和第二個抗原上。
在另一個實施方案中，所述結合第一個表位的單結構域抗體和所述結合第二個表位的單結構域抗體中的一個或兩個為人單結構域抗體。
在另一個實施方案中，結合所述第一個表位的單結構域抗體多肽和/或結合所述第二個表位的單結構域抗體多肽含以下的一個或多個由人種系VH基因序列編碼的FW1、由人種系VH基因序列編碼的FW2、由人種系VH基因序列編碼的FW3和由人種系VH基因序列編碼的FW4。
在另一個實施方案中，結合第一個表位的單結構域抗體多肽和結合第二個表位的單結構域抗體均為人單結構域抗體。
在另一個實施方案中，IgG重鏈恆定結構域為人IgG重鏈恆定結構域。
在另一個實施方案中，IgG重鏈恆定結構域包括CH1結構域。
在另一個實施方案中，輕鏈恆定結構域為人Cκ輕鏈恆定結構域。
在另一個實施方案中，構建物結合TNF-α和VEGF。在另一個實施方案中，結合VEGF的單結構域抗體融合至IgG1重鏈恆定結構域，結合TNF-α的單結構域抗體融合至Cκ輕鏈恆定結構域。
在另一個實施方案中，結合VEGF的單結構域抗體在給予膠原蛋白誘導型關節炎小鼠模型的小鼠時阻止關節炎記分增加。
在另一個實施方案中，拮抗人VEGF活性的單結構域抗體多肽部分以小於100nM的Kd結合人VEGF。
在另一個實施方案中，據在VEGF受體1實驗或VEGF受體2實驗中的檢測，拮抗人VEGF活性的單結構域抗體多肽部分中和人VEGF。
在另一個實施方案中，拮抗人VEGF活性的單結構域抗體多肽部分特異性結合與細胞表面受體結合的人VEGF。
在該方面的另一個實施方案中，結合TNF-α或拮抗人TNF-α活性的單結構域抗體在給予Tg197轉基因小鼠關節炎模型的小鼠時阻止關節炎記分增加。在另一個實施方案中，據在標準L929細胞毒性實驗中的檢測，單結構域抗體拮抗人TNF-α活性。在另一個實施方案中，單結構域抗體以小於100nM的Kd結合人TNF-α。
在該方面的任何實施方案中，拮抗人TNF-α活性的單結構域抗體多肽部分可包含例如選自以下克隆的抗體多肽的CDR3胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19，或包含與所述序列例如至少85％、替代性地至少90％、92％、94％、96％、98％、99％或100％相同的胺基酸序列。
在該方面的另一個實施方案中，拮抗人TNF-α活性的單結構域抗體多肽部分可包含例如選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列TAR1-2m-9、TAR1-2m-30、TAR1-2m-1、TAR1-2m-2、TAR1-5、TAR1-27、TAR1-261、TAR1-398、TAR1-701、TAR1-5-2、TAR1-5-3、TAR1-5-4、TAR1-5-7、TAR1-5-8、TAR1-5-10、TAR1-5-11、TAR1-5-12、TAR1-5-13、TAR1-5-19、TAR1-5-20、TAR1-5-21、TAR1-5-22、TAR1-5-23、TAR1-5-24、TAR1-5-25、TAR1-5-26、TAR1-5-27、TAR1-5-28、TAR1-5-29、TAR1-5-34、TAR1-5-35、TAR1-5-36、TAR1-5-464、TAR1-5-463、TAR1-5-460、TAR1-5-461、TAR1-5-479、TAR1-5-477、TAR1-5-478、TAR1-5-476、TAR1-5-490、TAR1h-1、TAR1h-2、TAR1h-3、TAR1-100-29、TAR1-100-35、TAR1-100-43、TAR1-100-47、TAR1-100-52、TAR1-109、TAR1-100、TAR1-100-34、TAR1-100-36、TAR1-100-38、TAR1-100-39、TAR1-100-40、TAR1-100-41、TAR1-100-45、TAR1-100-60、TAR1-100-62、TAR1-100-64、TAR1-100-65、TAR1-100-75、TAR1-100-76、TAR1-100-77、TAR1-100-78、TAR1-100-80、TAR1-100-82、TAR1-100-83、TAR1-100-84、TAR1-100-89、TAR1-100-90、TAR1-100-91、TAR1-100-92、TAR1-100-93、TAR1-100-94、TAR1-100-95、TAR1-100-96、TAR1-100-97、TAR1-100-98、TAR1-100-99、TAR1-100-100、TAR1-100-101、TAR1-100-102、TAR1-100-103、TAR1-100-105、TAR1-100-106、TAR1-100-107、TAR1-100-108、TAR1-100-109、TAR1-100-110、TAR1-100-111、TAR1-100-112、TAR1-100-113和TAR1-5-19，或包含與所述序列例如至少85％、替代性地至少90％、92％、94％、96％、98％、99％或100％相同的胺基酸序列。
在該方面的任一個實施方案中，拮抗人VEGF與VEGF受體結合的單結構域抗體多肽部分可包含例如選自以下克隆的抗體多肽的CDR3胺基酸序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30，或包含與所述序列例如至少85％、替代性地至少90％、92％、94％、96％、98％、99％或100％相同的胺基酸序列。
在該方面的另一個實施方案中，拮抗人VEGF與VEGF受體結合的單結構域抗體多肽部分可包含選自以下克隆的抗體多肽的胺基酸序列TAR15-1、TAR15-3、TAR15-4、TAR15-9、TAR15-10、TAR15-11、TAR15-12、TAR15-13、TAR15-14、TAR15-15、TAR15-16、TAR15-17、TAR15-18、TAR15-19、TAR15-20、TAR15-22、TAR15-5、TAR15-6、TAR15-7、TAR15-8、TAR15-23、TAR15-24、TAR15-25、TAR15-26、TAR15-27、TAR15-29和TAR15-30，或包含與所述序列例如至少85％、替代性地至少90％、92％、94％、96％、98％、99％或100％相同的胺基酸序列。
定義除非另有限定，否則本文使用的所有技術和科學術語都具有和本領域(例如在細胞培養、分子遺傳、核酸化學、雜交技術和生物化學領域)一般技術人員的通常理解相同的含義。使用分子、遺傳和生物化學方法(一般參見Sambrook等，Molecular CloningA LaboratoryManual，第2版，(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.和Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology(1999)第4版，John Wiley Sons，Inc，其通過引用結合到本文中)和化學方法的標準技術。
本文使用的術語「結構域」指獨立於蛋白的剩餘部分而保留其三級結構的摺疊蛋白結構。一般來說，結構域負責蛋白的分立功能特性，在許多情況下可被加入、去除或轉移至其它蛋白，而不喪失蛋白剩餘部分和/或結構域的功能。
所述「單免疫球蛋白可變結構域」或「單結構域抗體多肽」指含免疫球蛋白可變結構域的序列特徵並特異性結合抗原(即500nM或更低的解離常數)的摺疊多肽結構域。因此，「單結構域抗體多肽」包括完整抗體可變結構域以及修飾的可變結構域，例如其中一個或多個環被無抗體可變結構域特徵的序列取代的可變結構域，或已截短或含N-末端或C-末端延伸的抗體可變結構域，以及保留500nM或更低(例如450nM或更低、400nM或更低、350nM或更低、300nM或更低、250nM或更低、200nM或更低、150nM或更低、100nM或更低)的解離常數和全長結構域的靶抗原特異性的可變結構域摺疊片段。優選抗體單可變結構域選自VH和VL，包括Vκ和Vλ。
表述「單結構域抗體多肽構建物」不僅包括分離的單結構域抗體多肽，而且包括含一個或多個單免疫球蛋白可變結構域多肽序列單體的較大多肽構建物。要強調的是，為較大構建物一部分的單結構域抗體多肽能夠獨自地特異性結合靶抗原。因此，含一個以上單結構域抗體多肽的單結構域抗體多肽構建物不包括例如其中為形成特異性結合單抗原分子所必須的結合位點而共同需要VH和VL結構域的構建物。單結構域抗體多肽構建物中的單結構域抗體多肽之間的連接可為肽或多肽接頭，或者可為其它化學連接，例如通過多肽單體與多價PEG的連接。連接的單結構域抗體多肽可相同或不同，組成多肽的靶特異性也可相同或不同。
互補性在兩種免疫球蛋白結構域屬於形成關連對或組的結構家族或源自該家族並保留該特徵的情況下，這兩種免疫球蛋白結構域是互補的。例如，抗體的VH結構域和VL結構域是互補的；兩個VH結構域不是互補的，兩個V結構域不是互補的。互補結構域可存在於免疫球蛋白超家族的其它成員中，例如T細胞受體的Vα和Vβ(或γ和δ)結構域。在本發明的第二種構型背景下，非互補結構域不協同結合靶分子，但獨立地作用於可能位於相同或不同分子上的不同靶表位。人工結構域，例如基於蛋白支架(除工程改造後結合表位以外不結合表位)的結構域，是非互補的。同樣，基於(例如)免疫球蛋白結構域和纖連蛋白結構域的兩個結構域不是互補的。
免疫球蛋白其指保留抗體分子的免疫球蛋白摺疊特徵、含兩個β摺疊並通常含保守的二硫鍵的多肽家族。免疫球蛋白超家族成員涉及體內細胞和非細胞相互作用的多個方面，包括在免疫系統中的廣泛作用(例如抗體、T細胞受體分子等)、參與細胞粘附(例如ICAM分子)和胞內信號轉導(例如受體分子，如PDGF受體)。
本發明適用於所有具有結合結構域的免疫球蛋白超家族分子。優選地，本發明涉及抗體。
組合本發明的可變結構域組合形成一組結構域；例如，互補結構域可組合，例如VL結構域組合VH結構域。非互補結構域也可組合。結構域可以多種方式組合，包括通過共價或非共價方式連接結構域。
封閉構象多特異性配體該表述描述了一種如本文定義的多特異性配體，其含至少兩個本文所認為的表位結合結構域。術語『封閉構象』(多特異性配體)指配體的表位結合結構域排列得使一個表位結合結構域的表位結合與另一個表位結合結構域的表位結合競爭。即，各個表位結合結構域可獨立地但不同時地結合關連表位。可使用本文描述的方法獲得封閉構象的配體。
抗體抗體(例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)或片段(例如Fab、F(ab′)2、Fv、二硫鍵連接的FV、scFv、封閉構象的多特異性抗體、二硫鍵連接的scFv、雙功能抗體)，無論是源自天然產生抗體的任意物種，還是通過重組DNA技術產生；不管是分離自血清、B細胞、雜交瘤、轉染瘤、酵母還是細菌。
雙特異性配體含如本文定義的第一個免疫球蛋白單可變結構域和第二個免疫球蛋白單可變結構域的配體，其中可變區能夠結合同一抗原上一般不被單特異性免疫球蛋白結合的兩種不同抗原或兩種表位。例如，兩個表位可位於同一半抗原上，但不是相同的表位，或鄰接得不足以被單特異性配體結合。本發明的雙特異性配體由具有不同特異性的可變結構域組成，不合具有相同特異性的相互互補可變結構域對。
抗原由本發明的配體結合的分子。通常，抗原被抗體配體結合，能夠在體內產生抗體應答。其可為多肽、蛋白、核酸或其它分子。一般來說，根據對特定抗原的靶特異性選擇本發明的雙特異性配體。就常規抗體及其片段而言，由可變環(L1、L2、L3和H1、H2、H3)確定的抗體結合位點能夠結合抗原。
表位通常由免疫球蛋白的VH/VL對結合的結構單元。表位限定了抗體的最小結合位點，因此代表抗體的特異性靶。就單結構域抗體而言，表位代表由獨立的可變結構域結合的結構單元。
屬配體結合庫中所有成員的配體。一般來說，不通過如上定義的抗原結合位點結合。非限制性實例包括A蛋白、L蛋白和G蛋白。
選擇通過篩選獲得或通過Darwinian選擇方法獲得，其中在結構域和抗原或表位之間或在抗體和抗原或表位之間產生結合相互作用。因此，可在存在或不存在互補可變結構域的情況下選擇結合抗原或表位的第一個可變結構域。
通用構架對應於如Kabat(「Sequences of Proteins ofImmunological Interest」，美國健康和人類服務部)所定義的序列中的保守抗體區或對應於如Chothia和Lesk，(1987)J.Mol.Biol.196910-917所定義的人種系免疫球蛋白庫或結構的單個抗體構架序列。本發明提供了單個構架和一組這種構架的用途，已發現該用途通過單獨的高變區變異允許實際上任意結合特異性的衍化。
均相免疫實驗其中檢測分析物而不需要結合和未結合試劑分離步驟的免疫實驗。
基本相同的(或「基本同源的」)第一個胺基酸或核苷酸序列含有足夠數目的與第二個胺基酸或核苷酸序列相同或等同(例如具有相似的側鏈，例如保守的胺基酸取代)的胺基酸殘基或核苷酸，使得第一個和第二個胺基酸或核苷酸序列具有相似的活性。就抗體而言，第二個抗體具有相同的結合特異性，具有第一個抗體親合性的至少50％。
「結構域抗體」或「dAb」等同於本文使用的術語「單免疫球蛋白可變結構域多肽」或「單結構域抗體多肽」。
本文使用的表述「特異性結合」指根據使用例如BIAcoreTM表面等離子體共振系統和BIAcoreTM動力學評價軟體(例如2.1版)的表面等離子體共振分析的檢測，免疫球蛋白可變結構域以1μM或以下的解離常數(Kd)結合抗原。特異性結合相互作用的親合性或Kd優選為約500nM或更低，更優選約300nM或更低。
本文使用的術語「高親合性結合」指以低於或等於100nM的Kd結合。
本文使用的表述「人單結構域抗體多肽」指具有源自人種系免疫球蛋白V區的序列的多肽。當序列分離自人個體、分離自克隆的人抗體基因序列文庫(或人抗體V區基因序列的文庫)時，或當克隆的人種系V區序列用於產生一個或多個隨後選擇其與目標靶抗原的結合的多樣性序列(通過隨機或靶向誘變)時，該序列「源自人種系V區」。人免疫球蛋白可變結構域最低與天然人免疫球蛋白可變結構域序列具有至少85％的胺基酸相似性(包括例如87％、90％、93％、95％、97％、99％或更高相似性)。
或者或另外，「人免疫球蛋白可變結構域」是含4個人免疫球蛋白可變結構域構架區(W1-FW4)的可變結構域，所述構架區如Kabat等(1991，出處同上supra)所闡述。「人免疫球蛋白可變結構域構架區」包含a)人構架區的胺基酸序列，和b)含人構架區胺基酸序列的至少8個連續胺基酸的構架區。人免疫球蛋白可變結構域可包含FW1-FW4的胺基酸序列，其與由人種系抗體基因節段編碼的對應構架區的胺基酸序列相同，或者其還可含可變結構域，其中FW1-FW4序列相對於由人種系抗體基因節段編碼的對應構架區的胺基酸序列，總共含多達10個胺基酸序列差異、多達9個胺基酸序列差異、多達8個胺基酸序列差異、多達7個胺基酸序列差異、多達6個胺基酸序列差異、多達5個胺基酸序列差異、多達4個胺基酸序列差異、多達3個胺基酸序列差異、多達2個胺基酸序列差異或多達1個胺基酸序列差異。
本文定義的「人免疫球蛋白可變結構域」自身具有特異性結合抗原的能力，無論可變結構域是以單獨的單免疫球蛋白可變結構域存在，還是以與一個或多個另外的多肽序列一起的單免疫球蛋白可變結構域存在。本文使用的術語「人免疫球蛋白可變結構域」不包含「人源化」免疫球蛋白多肽，即已在恆定區中修飾而使其在人中免疫原性較小的非人(例如小鼠、駱駝等)免疫球蛋白。
本文使用的表述「免疫球蛋白可變結構域的序列特徵」指與免疫球蛋白可變結構域組成的序列在20個或更多個、25個或更多個、30個或更多個、35個或更多個、40個或更多個、45個或更多個乃至50個或更多個連續胺基酸內同源的胺基酸序列。
本文使用的術語「二價」指抗原結合抗體多肽具有兩個抗原特異性結合位點。抗原結合位點所識別的表位可相同或不同。當抗體多肽經各自的兩個抗原特異性結合位點結合兩種不同的表位(存在於不同的抗原上，或存在於同一抗原上)時，將抗體多肽稱為「雙特異性的」。
本文使用的術語「四價」指抗原結合多肽具有4個抗原特異性結合位點。抗原結合位點所識別的表位可相同或不同。「雙特異性」四價抗體多肽對一個表位或抗原具有兩個結合位點，對另一個不同表位或抗原具有兩個結合位點。
本文使用的「四價雙特異性抗原結合多肽構建物」具有類似於天然IgG的結構，即其具有兩個通過重鏈和輕鏈恆定結構域連接的抗原結合臂。但是，與天然IgG不同，各個臂均具有兩個抗原結合結構域，一個是第一個抗原特異性的，一個是第二個抗原特異性的。在本文描述的四價雙特異性抗原結合多肽構建物中，各個抗原結合結構域均為單結構域抗體，即抗原結合結構域不配對在一起形成單個結合位點，如在scFv中的單個結合位點。
本文使用的術語「IgG型」指人工抗原結合多肽，其具有的結構類似於天然IgG，即構建物具有兩個通過彼此結合的重鏈和輕鏈恆定結構域連接的抗原結合臂。如本文所述，IgG型的抗原結合多肽由4條多肽鏈組成含結合第一個抗原或表位、融合至IgG重鏈恆定結構域(例如含CH1-CH2-CH3的結構域)的單結構域抗體多肽的第一個融合蛋白的兩個拷貝；含結合第二個抗原或表位、融合至輕鏈恆定結構域(例如Cλ或Cκ)的單結構域抗體多肽的第二個融合蛋白的兩個拷貝。在該型中，當在細胞中共表達時，重鏈恆定結構域彼此二硫鍵合，這些重鏈恆定結構域各自還均二硫鍵合至輕鏈恆定結構域。當該術語在本文中使用時，IgG型的抗原結合多肽是四價的；可選擇融合至恆定結構域的單結構域抗體，以結合不同抗原(例如融合至重鏈恆定結構域、結合一種抗原的dAb1，融合至輕鏈恆定結構域、結合另一種抗原的dAb2)、相同抗原上的不同表位(例如融合至重鏈恆定結構域、結合抗原上的一種表位的dAb1，融合至輕鏈恆定結構域、結合相同抗原上的另一種表位的dAb2)，或者全部4個拷貝均可結合相同抗原上的相同表位(dAb1和dAb2結合相同抗原上的相同表位)。
本文使用的術語「Fab型」指二價抗體多肽構建物，其中一個單結構域抗體融合至輕鏈恆定結構域CL(例如Cλ或Cκ)，另一個單結構域抗體融合至重鏈CH1恆定結構域，各自的CH1和CL恆定結構域彼此二硫鍵合。可選擇單結構域抗體，以結合不同的抗原(產生雙特異性Fab型)、相同抗原上的不同表位(也是雙特異性的)或相同抗原上的相同表位。Fab型雙特異性抗體多肽的實例包括例如本文描述的融合至例如Cλ輕鏈的抗TNF-α單結構域抗體，以及如本文描述的融合至人重鏈CH1恆定結構域的抗VEGF單結構域抗體，其中兩種融合蛋白經其各自的恆定結構域彼此二硫鍵合。在該型的抗體多肽構建物中，抗原結合結構域不配對在一起形成單個結合位點，例如在scFv中的單個結合位點；相反，各個單結構域抗體自身均可結合抗原，使構建物成為二價的。
所述「類風溼性關節炎」(RA)指涉及關節和/或其它內部器官的襯層中炎症的疾病。RA通常影響許多不同的關節。其通常為慢性的，並可為驟發性疾病。RA是侵襲整個機體的系統性疾病，是最常見的關節炎形式之一。其特徵在於關節襯膜的炎症，引起疼痛、僵硬、暖感、充血和腫脹。發炎的關節襯層滑膜可侵襲和損傷骨和軟骨。炎性細胞釋放可消化骨和軟骨的酶。受影響的關節可失去其形狀和定位，導致疼痛和無法移動。症狀包括關節炎症、腫脹、難以移動和疼痛。其它症狀包括喪失食慾、發熱、精力損耗、貧血。其它特徵包括受壓區域(例如肘後)中皮膚下的腫塊(類風溼性結節)。類風溼性關節炎在臨床上基於幾種臨床認可的等級記分，例如描述於美國專利5,698,195的等級，該專利通過引用結合到本文中。簡而言之，臨床反應研究可評價以下參數1.觸痛關節的數目和疼痛/觸痛的評價使用以下的評分0＝無疼痛/觸痛1＝輕度疼痛。在詢問時患者訴其觸痛。
2＝中度疼痛。患者訴其觸痛和退縮。
3＝嚴重疼痛。患者訴其觸痛和退縮以及縮回。
2.腫脹關節的數目獨立地評價各個關節的觸痛和腫脹。
3.晨僵的持續時間(以分鐘計)4.握力5.視覺模擬疼痛評分(0-10cm)6.詢問患者和盲評價者，以評價對藥物的臨床反應。使用如下的主觀評分系統評價臨床反應5＝極佳的反應(最佳可能的預期反應)4＝良好反應(低於最佳可能的預期反應)3＝普通反應(明確改善但可較好)2＝無反應(無作用)1＝惡化(疾病惡化)迄今未知類風溼性關節炎的病因。但是，已知RA是自身免疫病，導致免疫系統攻擊健康關節組織，引起炎症和隨後的關節損傷。許多RA患者具有稱為HLA-DR4的某種遺傳標記。
本文使用的表述「TNF-α相關性疾病」指其中單獨或聯合一種或多種另外的藥物或治療，給予中和或拮抗TNF-α功能的藥物對治療該疾病有效的疾病或障礙，術語「治療」如本文所定義。
本文使用的術語「治療」指預防疾病或疾病症狀的發作、抑制疾病疾或病症狀的進展或逆轉疾病或疾病症狀。
本文使用的表述「預防疾病發作」指在傾向於患特定疾病(例如類風溼性關節炎)的個體中不出現該疾病的一種或多種症狀或可檢測參數。
本文使用的表述「抑制疾病的進展」指相對於沒有這種治療時的進展，採用藥物的治療停止或延緩了治療個體自身已表現出來的疾病症狀的嚴重性增加。
本文使用的表述「逆轉疾病」指相對於這種給予之前的症狀或參數，在給予藥物後，疾病的一種或多種症狀或可檢測參數改善。症狀或可檢測參數「改善」的證據為該可檢測參數的統計學顯著(但優選至少10％)的有利差異。
可檢測參數可包括例如可直接檢測的參數以及可間接檢測的參數。可直接檢測參數的非限制性實例包括關節大小、關節活動性、關節炎和組織病理學記分或指徵以及指示物(例如細胞因子)的血清水平。可間接檢測參數的實例包括例如患者的不舒服感覺或活動性欠缺或臨床認可的評定疾病嚴重性的等級。
本文使用的參數(例如關節炎記分或其它可檢測參數)「增加」指該參數的統計學顯著性增加。或者，「增加」指至少10％的增加。同樣，參數的「下降」指參數的統計學顯著性下降，或至少10％的下降。
本文使用的術語「拮抗」指藥物幹擾活性。當活性為例如TNF-α、VEGF或另一種生物活性分子或細胞因子的活性時，該術語包括抑制該分子或細胞因子的活性(達至少10％)，包括作為非限制性實例的與受體結合或相互作用(體外或在培養的細胞表面上或體內)、胞內信號轉導、細胞毒性、有絲分裂發生或其它由該分子或細胞因子介導的下遊作用或過程(例如基因活化)。拮抗作用包括幹擾因子(例如TNF、VEGF等)的受體結合以及當因子結合至細胞表面受體時幹擾因子的活性。
本文使用的術語「大於或等於」指一個值等於另一個值，或以統計學顯著方式(P＜0.1，優選p＜0.05，更優選p＜0.01)大於該值。當在例如疾病治療或受體結合拮抗中對比組合物的效力與另一種組合物的效力時，對比應在等摩爾的基礎上進行。
本文使用的「連接的」指聚合物部分(例如PEG)連接至抗體多肽(例如本文所述的單結構域抗體)的胺基酸殘基。PEG聚合物與抗體多肽(例如單結構域抗體)的胺基酸殘基的連接被稱為「PEG化」，可使用幾個PEG連接部分實現，這些PEG連接部分包括但不限於N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)活化酯、琥珀醯亞胺丙酸酯(SPA)、馬來醯亞胺(MAL)、乙烯碸(VS)或硫醇。PEG聚合物或其它聚合物可在預定位置連接至抗體多肽，或者可以隨機連接至抗體分子。但是，優選PEG聚合物在預定位置連接至抗體多肽。PEG聚合物可連接至抗體多肽中的任意殘基，但是，優選聚合物連接至賴氨酸或半胱氨酸，其或者是抗體多肽中天然的，或者通過例如將抗體多肽中的天然殘基誘變為半胱氨酸或賴氨酸而工程改造入抗體多肽中。本文使用的「連接的」還可指兩個或更多抗體單可變結構域單體的結合，以形成二聚體、三聚體、四聚體或其它多聚體。dAb單體可通過本領域已知的幾種方法連接形成多聚體，所述方法包括但不限於dAb單體作為融合蛋白表達、兩個或更多單體經單體之間肽接頭的連接，或通過翻譯後單體的彼此直接化學連接或利用二硫鍵的接頭的化學連接，或通過連接至二、三或多價連接部分(例如多臂PEG)。
就聚合物「直接連接」至抗體多肽(例如單可變結構域多肽)而言，本文使用的表述「直接連接」指聚合物連接至殘基的情況，其中所述殘基是可變結構域的天然組成部分，例如不包含在恆定區、鉸鏈區或接頭肽內。相反，本文使用的表述「間接連接」至抗體多肽指聚合物分子與抗體單可變結構域的連接，其中聚合物不連接至為天然可變區的組成部分的胺基酸殘基(例如可連接至鉸鏈區)。如果聚合物經連接肽連接至抗體多肽，則聚合物是「間接連接」的，即聚合物不連接至為抗體自身組成部分的胺基酸殘基。或者，如果聚合物連接至多肽的C-末端鉸鏈區，或連接至可作為抗體多肽的組成部分存在的恆定區任意殘基，則聚合物「間接連接」至抗體多肽。
本文使用的術語「同源性」或「相似性」指兩個核苷酸或胺基酸序列在結構上彼此相似的程度。本文使用的術語「相似性」是在序列比對時胺基酸序列在對應位置具有相似胺基酸殘基的程度的尺度。當其側鏈相似時胺基酸彼此相似。具體地說，「相似性」包括彼此為保守置換的胺基酸。「保守」置換是在blosum62置換矩陣(Hentikoff和Hentikoff，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915-10919)中具有正分的任意置換。所述「序列A與序列B n％相似」指序列A和B之間最優全局比對位置的n％由相同胺基酸或保守置換組成。可在Needleman-Wunsch比對算法中使用以下參數進行最優全局比對對於多肽置換矩陣blosum62。
空位記分函數-A-B*LG，其中A＝11(空位罰分)，B＝1(空位長度罰分)，LG是空位長度。
對於核苷酸序列置換矩陣匹配為10，不匹配為0。
空位記分函數-A-B*LG，其中A＝50(空位罰分)，B＝3(空位長度罰分)，LG是空位長度。
典型的保守置換為Met、Val、Leu和Ile之一；Ser和Thr之一；殘基Asp、Glu和Ash之一；殘基Gln、Lys和Arg之一；或芳香族殘基Phe和Tyr。
正如本文所使用的，當使用Needleman-Wunsch算法或Tatusova和Madden，1999，FEMS Microbiol Lett.174247-250描述的「BLAST 2序列」算法比對時，兩個序列彼此具有至少85％的序列相似性，這兩個序列是「同源的」或「相似的」。當使用「BLAST 2序列算法」比對胺基酸序列時，Blosum62矩陣是默認矩陣。
如本領域所知，「同一性」是兩個或更多多肽序列或兩個或更多核苷酸序列之間的關係，其通過對比序列測定。在本領域，「同一性」還指多肽或多核苷酸序列之間的序列相關性程度，其視情況通過這些序列鏈之間的匹配來測定。通過已知方法可容易地計算同一性百分率，這些方法包括但不限於描述於Computational MolecularBiology，Lesk，A.M.編輯，Oxford University Press，New York，1988；BiocomputingInformatics and Genome Projects，Smith，D.W.編輯，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.編輯，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，AcademicPress，1987；和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.編輯，M Stockton Press，New York，1991；和Carillo，H.和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，481073(1988)的方法。測定同一性的優選方法設計用於獲得所測試序列之間的最大匹配。測定同一性的方法在可公開獲得的電腦程式中編程。測定兩個序列之間的序列同一性的優選計算機編程方法包括但不限於GCG程序包(Devereux，J.等，Nucleic Acids Research 12(1)387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Atschul，S.F.等，J.Molec.Biol.215403-410(1990))。BLAST X程序可由NCBI和其它來源公開獲得(BLAST Manual，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，J.Mol.Biol.215403-410(1990))。作為說明，核苷酸序列與「SEQ ID NOA」的參比核苷酸序列具有至少例如95％「同一性」的多核苷酸，含義是除了該多核苷酸序列在「SEQ ID NOA」參比核苷酸序列的每100個核苷酸中可包含多達5個點突變以外，該多核苷酸的核苷酸序列與參比序列相同。換句話說，為獲得所具有的核苷酸序列與參比核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸，參比序列中最多5％的核苷酸可缺失或由另一種核苷酸置換，或可將參比序列總核苷酸中最多5％的若干核苷酸插入到參比序列中。參比序列的這些突變可出現在參比核苷酸序列的5或3末端位置或這些末端位置之間的任何位置，其獨立地散布在參比序列中的核苷酸中，或散布在參比序列中的一個或多個連續簇(contiguous group)中。類似地，就胺基酸序列與「SEQ IDNOB」的參比胺基酸序列具有至少例如95％同一性的多肽而言，含義是除了該多肽序列在「SEQ ID NOB」參比胺基酸的每100個胺基酸中可包含最多5個胺基酸變化以外，該多肽的胺基酸序列與參比序列相同。換句話說，為獲得所具有的胺基酸序列與參比胺基酸序列至少95％相同的多肽，參比序列中最多5％的胺基酸殘基可缺失或由另一種胺基酸置換，或可將最多參比序列中總胺基酸殘基5％的若干胺基酸插入到參比序列中。參比序列的這些變化可出現在參比胺基酸序列的氨基或羧基末端位置或這些末端位置之間的任何位置，其獨立地散布在參比序列中的殘基中，或散布在參比序列中的一個或多個連續簇中。
本文使用的術語「低嚴格性」、「中等嚴格性」、「高嚴格性」或「非常高的嚴格條件」描述了核酸雜交和漂洗的條件。關於實施雜交反應的指導可見於Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley和Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6，其通過引用整體結合到本文中。在該參考文獻中描述了含水和不含水的方法，可使用任一種。本文所指的特異性雜交條件為如下的條件(1)低嚴格雜交條件6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)、約45℃，接著以0.2X SSC、0.1％SDS於至少50℃(對於低嚴格雜交條件，漂洗溫度可增加至55℃)漂洗2次；(2)中等嚴格雜交條件6X SSC、約45℃，接著以0.2X SSC、0.1％SDS於60℃漂洗1次或多次；(3)高嚴格雜交條件6X SSC、約45℃，接著以0.2X SSC、0.1％SDS於65℃漂洗1次或多次；以及優選(4)非常高的嚴格雜交條件0.5M磷酸鈉、7％SDS，65℃，接著以0.2XSSC、1％SDS於65℃漂洗1次或多次。
本文使用的表述「於......濃度」指給定多肽以所提及的每單位體積質量或摩爾量溶解在溶液(優選水性溶液)中。因此，「於X濃度」或「於至少X的濃度」存在的多肽排除了多肽的乾燥和結晶製品。
本文使用的術語「庫」指不同變體的集合，例如其一級序列不同的多肽變體。用於本發明的文庫包括含至少1000個成員的多肽庫。
本文使用的術語「文庫」指異源多肽或核酸的混合物。文庫由各個均具有單一多肽或核酸序列的成員組成。就此而言，文庫與庫同義。文庫成員之間的序列差異是產生文庫中存在的多樣性的原因。文庫可採取多肽或核酸的簡單混合物的形式，或可為生物體或細胞的形式，例如用核酸文庫轉化的細菌、病毒、動物或植物細胞等。優選地，各個單獨的生物體或細胞都僅含有一個或少量的文庫成員。有利地，將核酸摻入到表達載體中，以便允許表達由核酸編碼的多肽。因此，在一個優選方面，文庫可採取宿主生物群的形式，各個生物均含有表達載體的一個或多個拷貝，該載體含核酸形式的文庫單個成員，可表達其以產生其對應的多肽成員。因此，宿主生物群具有編碼遺傳多樣性多肽變體大庫的潛力。
本文使用的「聚合物」指由重複單體單位組成的大分子，並可指非合成的或天然存在的聚合物，例如任選取代的直鏈或支鏈聚亞烷基、聚亞烯基或聚氧亞烷基，或分支或未分支的多糖。具體地說，本文使用的「聚合物」指任選取代的或分支的鏈聚(乙二醇)、聚(丙二醇)或聚(乙烯醇)及其衍生物。
本文使用的「PEG」或「PEG聚合物」指聚乙二醇，更具體地說可指衍生化形式的PEG，包括但不限於PEG的N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)活性酯例如琥珀醯亞胺丙酸酯、苯並三唑活性酯、用馬來醯亞胺、乙烯碸或巰基基團衍化的PEG。具體的PEG製品可包括PEG-O-CH2CH2CH2-CO2-NHS、PEG-O-CH2-NHS、PEG-O-CH2CH2-CO2-NHS、PEG-S-CH2CH2-CO-NHS、PEG-O2CNH-CH(R)-CO2-NHS、PEG-NHCO-CH2CH2-CO-NHS和PEG-O-CH2-CO2-NHS，其中R是(CH2)4)NHCO2(mPEG)。在本發明中有用的PEG聚合物可為線性分子，或者可為分支的，其中多個PEG部分存在於單個聚合物中。在本發明中有用的一些特別優選的PEG構象包括但不限於以下形式
本文使用的「巰基選擇性試劑」是用於將PEG聚合物連接至含巰基胺基酸的試劑。胺基酸殘基半胱氨酸上的巰基基團對與巰基選擇性試劑的相互作用特別有用。用於本發明的巰基選擇性試劑包括但不限於馬來醯亞胺、乙烯碸或硫醇。巰基選擇性試劑偶聯半胱氨酸殘基的用途是本領域已知的，可根據本發明的需要而採用(參見Eg.，Zalipsky，1995，Biocojug.Chem.6150；Greenwald等，2000，Crit. Rev.Ther.Drug Carrier Syst.17101；Herman等，1994，Macromol Chem.Phys.195203)。
本文使用的術語「抗原」指被抗體或抗體的結合區(例如可變結構域)結合的分子。通常，抗原能夠在體內產生抗體應答。抗原可為肽、多肽、蛋白、核酸、脂質、糖或其它分子。一般來說，根據對特定抗原的靶特異性選擇免疫球蛋白可變結構域。
本文使用的術語「表位」指通常由免疫球蛋白VH/VL對結合的結構單元。表位限定了抗體的最小結合位點，因此代表了抗體的特異性靶。就單結構域抗體而言，表位代表由分離的可變結構域結合的結構單元。
本文使用的術語「中和」當用於指代本文所述的單免疫球蛋白可變結構域多肽時，意指該多肽幹擾靶抗原的可檢測活性或功能。如果多肽將靶抗原的可檢測活性或功能降低至少50％，優選至少60％、70％、80％、90％、95％或更高，最高到並包括100％抑制(即無可檢測的靶抗原作用或功能)，則該多肽是「中和」多肽。靶抗原的可檢測活性或功能的這種降低可由本領域技術人員使用檢測該活性或功能的一種或多種指標的標準方法來評價。作為實例，當靶為TNF-α時，可使用標準L929細胞殺傷實驗或通過檢測單免疫球蛋白可變結構域抑制HUVEC上TNF-α誘導性ELAM-1表達(其檢測TNF-α誘導的細胞活化)的能力，評價中和活性。和本文使用的「中和」類似，本文使用的「抑制細胞的細胞毒性」指根據例如使用標準L929細胞殺傷實驗的檢測，細胞死亡下降，其中被抑制的細胞毒性為細胞死亡下降至少10％或以上。
本文使用的「靶抗原的可檢測活性或功能」包括但不限於例如細胞信號轉導、酶活性、結合活性、配體依賴性內化、細胞殺傷、細胞活化、提升細胞存活率和基因表達。本領域技術人員可實施檢測給定靶抗原的這些活性的實驗。優選地，如下確定本文使用的「活性」(1)細胞型實驗中的ND50；(2)對靶配體的親合性；(3)ELISA結合；或(4)受體結合實驗。實施這些測試的方法是本領域技術人員已知的，在下文進一步詳述。
本文使用的「保留活性」指PEG連接的抗體多肽(例如單可變結構域)的活性水平，其為非PEG連接的抗體多肽活性水平的至少10％，優選為相同序列的非PEG連接的抗體多肽活性的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％直到90％，優選達95％、98％直到100％，其中活性如本文所述測定。更具體地說，應當以抗體摩爾數為基準測定PEG連接的抗體多肽相比於非PEG連接的抗體多肽的活性；即在各個實驗中應使用摩爾數相等的各PEG連接抗體多肽和非PEG連接抗體多肽。在測定特定的PEG連接抗體多肽是否「保留活性」時，優選將PEG連接的抗體多肽的活性與無PEG時的相同抗體多肽的活性對比。
本文使用的術語「同二聚體」、「同三聚體」、「同四聚體」和「同多聚體」分別指含2、3或更多個(例如4、5等)給定單免疫球蛋白可變結構域多肽序列單體的分子。例如，同二聚體應包括兩個拷貝的相同VH序列。單免疫球蛋白可變結構域多肽的「單體」是特異性結合抗原的單個VH或VL序列。同二聚體、同三聚體、同四聚體或同多聚體中的單體可通過以下方式連接作為融合多肽表達(例如用單體之間的肽接頭)，或通過將翻譯後的單體彼此直接化學連接或通過利用二硫鍵的接頭化學連接，或通過連接至二、三或多價連接部分。在一個實施方案中，同二聚體、同三聚體、同四聚體或同多聚體中的單體可通過多臂PEG聚合物連接，其中二聚體、三聚體、四聚體或多聚體中的各個單體都如上所述連接至多臂PEG的PEG部分。
本文使用的術語「異二聚體」、「異三聚體」、「異四聚體」和「異多聚體」分別指含兩種或更多種不同單免疫球蛋白可變結構域多肽序列的2、3或更多個(例如4、5、6、7直到8個或更多個)單體的分子。例如，異二聚體應包括兩個VH序列，例如VH1和VH2，或者可替代地包括VH和VL的組合。和同二聚體、同三聚體或同四聚體相類似，異二聚體、異三聚體、異四聚體或異多聚體中的單體可通過以下方式連接作為融合多肽表達(例如用單體之間的肽接頭)，或通過將翻譯後的單體彼此直接化學連接或通過利用二硫鍵的接頭化學連接，或通過連接至二、三或多價連接部分。在一個實施方案中，異二聚體、異三聚體、異四聚體或異多聚體中的單體可通過多臂PEG聚合物連接，其中二聚體、三聚體、四聚體或多聚體中的各個單體都如上所述連接至多臂PEG的PEG部分。
本文使用的術語「半壽期」指配體(例如抗體多肽，如單免疫球蛋白可變結構域)的血清濃度例如由於配體降解和/或天然機制對配體的清除和螯合而在體內降低50％所耗費的時間。在體內穩定化抗體多肽，其半壽期通過結合至抵抗降解和/或清除或螯合的分子(例如PEG)而增加。如果抗體多肽(例如dAb)在體內的功能活性持續的周期長於未連接至PEG聚合物的相似dAb，則其半壽期增加。通常，PEG化dAb的半壽期相對於非PEG化dAb增加10％、20％、30％、40％、50％或更高。半壽期在2x、3x、4x、5x、10x、20x、30x、40x、50x或更高範圍內的增加是有可能的。或者或另外，半壽期在達30x、40x、50x、60x、70x、80x、90x、100x、150x範圍內的增加是有可能的。按照本發明，PEG連接的抗體單可變結構域具有0.25-170小時的半壽期，優選1-100小時，更優選30-100小時，再更優選50-100小時，高達170、180、190和200小時或更高。
本文使用的「對降解的抗性」或「抗降解」當針對PEG或其它聚合物連接的dAb單體或多聚體使用時，意指PEG或其它聚合物連接的dAb單體或多聚體在接觸pH 2.0的胃蛋白酶30分鐘時降解不超過10％，優選根本不降解。在具體提到連接PEG或其它聚合物連接的dAb多聚體(例如異或同二聚體、三聚體、四聚體等)時，抗降解的分子在pH 2.0的胃蛋白酶存在下於30分鐘內的降解低於5％，優選根本不降解。
本文使用的「流體動力學大小」指基於分子(例如蛋白分子)在水性溶液中的擴散的分子表觀大小。可處理蛋白在溶液中的擴散或運動，以得到蛋白的表觀大小，其中尺寸通過蛋白顆粒的「Stokes半徑」或「流體動力學半徑」獲得。蛋白的「流體動力學大小」取決於質量和形狀(構象)這二者，使得具有相同分子量的兩種蛋白可基於蛋白整體構象具有不同的流體動力學大小。PEG連接的抗體多肽(例如單可變結構域，包括本文描述的抗體可變結構域多聚體)的流體動力學大小可在24kDa至500kDa、30-500kDa、40-500kDa、50-500kDa、100-500kDa、150-500kDa、200-500kDa、250-500kDa、300-500kDa、350-500kDa、400-500kDa和450-500kDa的範圍內。優選本發明的PEG化dAb的流體動力學大小為30-40kDa、70-80kDa或200-300kDa。當需要將抗體可變結構域多聚體用於造影應用時，多聚體應具有50-100kDa的流體動力學大小。或者，當需要將抗體單結構域多聚體用於治療應用時，多聚體應具有200kDa以上的流體動力學大小。
附圖簡述

圖1顯示了VH/HSA在位置H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H96、H97、H98(分別由DVT或NNK編碼)處的多樣性，這些位置位於VH HSA的抗原結合位點。VK序列在位置L50、L53是多樣化的。胺基酸序列，SEQ ID NO219；核苷酸序列，上鏈，SEQID NO220。
圖2顯示了文庫1種系VK/DVT VH；文庫2種系VK/NNK VH；文庫3種系VH/DVT VK；文庫4種系VH/NNK VK。為噬菌體展示/ScFv形式。預先選擇結合屬配體A蛋白和L蛋白的這些文庫，以便大部分克隆和選擇的文庫有功能。針對HSA(第一輪)和β-gal(第二輪)或HSA β-gal選擇來選擇文庫，或針對β-gal(第一輪)和HSA(第二輪)β-gal HSA選擇來選擇文庫。按順序PCR擴增這些克隆的可溶性scFv。選擇一個編碼雙特異性抗體的克隆K8進行進一步研究。核苷酸序列SEQ ID NO221；胺基酸序列SEQ ID NO222。
圖3顯示了VH鏈和VK鏈的比對。VH模擬，SEQ ID NO1；K8，SEQ ID No 223(VH)和232(VK)；VH2，SEQ ID NO224；VH4，SEQ ID NO225；VHC11，SEQ ID NO226；VHA10sd，SEQ ID NO227；VHA1sd，SEQ ID NO228；VHA5sd，SEQ ID NO229；VHC5sd，SEQ ID NO230；VHC11sd，SEQ ID NO231；Vκ模擬，SEQ ID NO3；E5sd，SEQ ID NO233；C3，SEQ ID NO234。
圖4顯示了K8抗體結合特性的特徵，K8抗體結合特性的特徵在於單克隆噬菌體ELISA，發現雙特異性K8抗體結合HSA和β-gal，並展示在噬菌體表面上，吸收信號大於1.0。未檢測到與其它蛋白的交叉反應性。
圖5顯示了使用已知濃度的K8抗體片段實施的scFv ELISA。用100μg HSA、10μg/ml的BSA和β-gal和100μg/ml A蛋白以1μg/ml濃度包被96-孔板。施加50μg的K8 scFv的連續稀釋液，用L蛋白-HR檢測結合的抗體片段。ELISA結果證實了K8抗體的雙特異性性質。
圖6顯示了使用可溶性scFv ELISA分析的克隆K8VK/模擬VH的結合特徵。如Harrison等，Methods Enzymol.1996；26783-109所述用IPTG誘導可溶性scFv片段的產生，直接檢測含scFv的上清液。如實施例1所述進行可溶性scFv ELISA，用L蛋白-HRP檢測結合的scFv。ELISA結果揭示，該克隆仍能結合β-gal，而結合BSA被消除。
圖7顯示了可變結構域載體1和2的序列。核苷酸序列SEQ IDNO221；胺基酸序列SEQ ID NO222。
圖8是用於構建VH1/VH2多特異性配體的CH載體圖。
圖9是用於構建VK1/VK2多特異性配體的VK載體圖。
圖10對比了TAR1-5二聚體4、TAR1-5-19二聚體4和TAR1-5-19單體的TNF受體實驗。
圖11對比了TAR1-5二聚體1-6的TNF受體實驗。所有二聚體都已FPLC純化，顯示了優化的二聚化類型的結果。
圖12不同型的TAR1-519同二聚體的TNF受體實驗具有3U、5U或7U接頭的dAb接頭-dAb型、Fab型和半胱氨酸鉸連結頭型。
圖13文庫1的模擬VH序列。基於種系序列DP47-JH4b的VH構架序列。其中NNK隨機化(N＝A或T或C或G核苷酸；K＝G或T核苷酸)已摻入到文庫1中的位置用粗體下劃線文本表示。胺基酸序列SEQ ID NO1；核苷酸序列，上鏈，SEQ ID NO2。
圖14文庫2的模擬VH序列。基於種系序列DP47-JH4b的VH構架序列。其中NNK隨機化(N＝A或T或C或G核苷酸；K＝G或T核苷酸)已摻入到文庫2中的位置用粗體下劃線文本表示。胺基酸序列SEQ ID NO235；核苷酸序列，上鏈，SEQ ID NO236。
圖15文庫3的模擬VK序列。基於種系序列DPK9-J K1的VK構架5序列。其中NNK隨機化(N＝A或T或C或G核苷酸；K＝G或T核苷酸)已摻入到文庫3中的位置用粗體下劃線文本表示。胺基酸序列SEQ ID NO3；核苷酸序列，上鏈，SEQ ID NO4。
圖16抗MSA dAb MSA 16和MSA 26的核苷酸和胺基酸序列。MSA 16胺基酸序列，SEQ ID NO237；核苷酸序列，SEQ ID NO238。MSA 26胺基酸序列，SEQ ID NO239；核苷酸序列，SEQ IDNO240。
圖17MSA 16和26的抑制Biacore。通過測定Kd的抑制Biacore分析純化的dAb MSA16和MSA26。簡言之，測試dAb，以確定在高密度MSA包被的Biacore CM5晶片上獲得200RU應答所需的dAb濃度。一旦確定了所需的dAb濃度，就將在預期Kd附近的濃度範圍的MSA抗原與dAb預混合，並過夜溫育。然後以30μl/分鐘的高流速檢測各個預混合物中dAb與MSA包被Biacore晶片的結合。
圖18注射後的MSA16血清水平。在小鼠中測定dAb MSA16的血清半壽期。MSA16以約1.5mg/kg單劑靜脈注射入CD1小鼠中給藥。採用2區室模型的建模顯示MSA16具有0.98小時的t1/2β、36.5小時的t1/2β和913小時.mg/ml的AUC。和具有0.06小時的t1/2β和0.34小時的t1/2β的HEL4(抗雞蛋溶菌酶dAb)相比，MSA16具有被延長得相當長的半壽期。
圖19顯示抑制TNF與含MSA26Ck和TAR1-5-19CH的Fab樣片段結合的ELISA(a)和TNF受體實驗(c)。加入MSA和Fab樣片段降低了抑制水平。用雙特異性VK CH和VK CK Fab樣片段探測用1μg/ml TNF-α包被的ELISA板，另用經計算在ELISA上產生相似信號的濃度的對照TNF-α結合dAb探測該ELISA板。在有和沒有2mg/ml MSA的情況下，雙特異性和對照dAb均用於探測ELISA板。雙特異性孔中的信號降低超過50％，但dAb孔中的信號根本沒降低(參見圖19a)。另在有和無MSA的情況下，將相同的雙特異性蛋白置於受體實驗中，也表明MSA競爭(參見圖19c)。這表明，MSA與雙特異性的結合與其和TNF-α的結合競爭。
圖20TNF受體實驗顯示了TNF與TAR1-5-19 dAb和MSA16 dAb的二硫鍵合異二聚體結合的抑制劑。MSA和二聚體的加入以劑量依賴性方式降低抑制劑水平。在恆定濃度(18nM)的異二聚體和連續稀釋的MSA與HSA存在下進行TNF受體實驗。以一定濃度範圍(一直到2mg/ml)存在的HSA不引起二聚體抑制TNF-α能力的降低。但是，加入MSA使二聚體抑制TNF-α的能力劑量依賴性降低。這表明，MSA和TNF-α競爭結合MSA16二聚體-cys鍵合的TAR1-5-19。單獨的MSA和HSA不影響實驗中的TNF結合水平。
圖21顯示了人種系構架節段DP47的多核苷酸和胺基酸序列(另參見圖1)。胺基酸序列是SEQ ID NO1；上鏈的多核苷酸序列是SEQID NO2。
圖22顯示了人種系構架節段DPK9的多核苷酸和胺基酸序列。胺基酸序列是SEQ ID NO3；上鏈的多核苷酸序列是SEQ ID NO4。
圖23顯示了本文描述的TAR1克隆的胺基酸序列(參見例如實施例13)。TAR1-5，SEQ ID NO241；TAR1-27，SEQ ID NO242；TAR1-261，SEQ ID NO243；TAR1-398，SEQ ID NO244；TAR1-701，SEQID NO245；TAR1-5-2，SEQ ID NO246；TAR1-5-3，SEQ ID NO247；TAR1-5-4，SEQ ID NO248；TAR1-5-7，SEQ ID NO249；TAR1-5-8，SEQ ID NO250；TAR1-5-10，SEQ ID NO251；TAR1-5-11，SEQ IDNO252；TAR1-5-12，SEQ ID NO253；TAR1-5-13，SEQ ID NO254；TAR1-5-19，SEQ ID NO191；TAR1-5-20，SEQ ID NO255；TAR1-5-21，SEQ ID NO256；TAR1-5-22，SEQ ID NO257；TAR1-5-23，SEQ IDNO258；TAR1-5-24，SEQ ID NO259；TAR1-5-25，SEQ ID NO260；TAR1-5-26，SEQ ID NO261；TAR1-5-27，SEQ ID NO262；TAR1-5-28，SEQ ID NO263；TAR1-5-29，SEQ ID NO264；TAR1-5-34，SEQID NO265；TAR1-5-35，SEQ ID NO266；TAR1-5-36，SEQ ID NO267；TAR1-5-464，SEQ ID NO268；TAR1-5-463，SEQ ID NO269；TAR1-5-460，SEQ ID NO270；TAR1-5-461，SEQ ID NO271；TAR1-5-479，SEQ ID NO272；TAR1-5-477，SEQ ID NO273；TAR1-5-478，SEQ ID NO274；TAR1-5-476，SEQ ID NO275；TAR1-5-490，SEQ ID NO276；TAR1h-1，SEQ ID NO277；TAR1h-2，SEQ ID NO278；TAR1h-3，SEQ ID NO279。
圖24顯示了單劑靜脈注射後dAb單體型或Fc融合型的TAR1-5-19的血清半壽期的對比。
圖25概述了在使用TAR1-5-19的一系列Tg197模型實驗中給予的dAb構建物的劑量和給予時間。
圖26概述了在Tg197小鼠RA模型研究中使用的不同型的TAR1-5-19 dAb(Fc融合、PEG化、抗-TNF/抗-SA雙特異性)的每周一次的劑量。
圖27概述了在Tg197小鼠RA模型研究中給予的抗TNF dAb的型(Fc融合、PEG二聚體、PEG四聚體、抗-TNF/抗-SA雙特異性)、傳遞方式和劑量，該研究對比了抗TNF dAb構建物的效力和現有抗TNF產品的效力。
圖28顯示了研究的給藥方案和評分方案，該研究在Tg197小鼠RA模型中檢驗抗TNF dAb抵抗既有疾病症狀的效力。
圖29顯示了IgG樣雙特異性抗體的SDS PAGE凝膠分析，所述IgG樣雙特異性抗體含融合至人IgG1恆定結構域的人VEGF特異性Vκ可變結構域和融合至人Cκ恆定結構域的人TNF-α特異性Vκ可變結構域。泳道1InVitrogen Multimark分子量標記。泳道2在1X非還原性載樣緩衝液中的抗TNF x抗VEGF雙特異性抗體。泳道3在1X載樣緩衝液+10mM β-巰基乙醇中的抗TNF x抗VEGF雙特異性抗體。
圖30A和B顯示了在TNF-α活性和VEGF受體結合實驗中檢驗抗-TNF x抗VEGF雙特異性抗體的抑制作用的實驗結果。A.L929TNF-α細胞毒性中和實驗的結果。以方塊顯示數據點的曲線，對照抗TNF-α抗體。以尖朝上的三角形表示數據點的曲線，抗TNF x抗VEGF雙特異性抗體。以尖朝下的三角形表示數據點的曲線，抗TNF-α單體。B.人VEGF受體2結合實驗的結果。以方塊顯示數據點的曲線，抗TNF x抗VEGF雙特異性抗體。以尖朝上的三角形表示數據點的曲線，抗VEGF對照。以尖朝下的三角形表示數據點的曲線，陰性對照。
發明詳述雙特異性抗體多肽本發明的發明人在其國際專利申請WO 2004/003019中已描述了雙特異性配體的進一步改良，其中配體的一種特異性針對生物體體內存在的蛋白或多肽，可通過與其結合起增加配體半壽期的作用。WO2004/003019描述了含對第一種抗原或表位具有結合特異性的第一個免疫球蛋白單可變結構域和對第二種抗原或表位具有結合活性的第二個互補免疫球蛋白單可變結構域的雙特異性配體，其中所述抗原或表位中的一種或兩種起增加配體體內半壽期的作用，其中所述第一個和第二個結構域沒有共有相同特異性的相互互補結構域，前提是所述雙特異性配體不由抗HSA VH結構域和抗p半乳糖苷酶VK結構域組成。
有利地，如本文所述增加配體半壽期的抗原或表位存在於生物體體內可見的蛋白或多肽上。
實例包括胞外基質蛋白、血液蛋白和存在於生物體各種組織中的蛋白。蛋白例如通過充當填充劑或通過將配體錨定至需要的作用位點，起降低血液中配體清除速率的作用。下文的附件1給出了增加體內半壽期的抗原/表位的實例。
增加的半壽期對免疫球蛋白的體內應用有用，尤其是對抗體有用，最尤其是對小尺寸的抗體片段有用。這種片段(Fv，二硫鍵合的Fv、Fab、scFv、dAb)受到機體的快速清除；因此，儘管其能夠快速地到達機體的大多數組成部分，且快速生產和易於操作，但其體內應用受限於其僅短暫的體內保留時間。本發明通過提供體內半壽期增加的配體並因此提供在機體中保留較長時間的配體功能活性而解決了此問題。
配體半壽期的藥代動力學分析和測定方法是本領域技術人員熟知的。詳述可見於Kenneth，A等Chemical Stability of PharmaceuticalsA Handbook for Pharmacists和Peters等，Pharmacokinetc analysisAPractical Approach(1996)。還可參考「Pharmacokinetics」，M Gibaldi和D Perron，Marcel Dekker出版，第2修訂版(1982)，其描述了諸如tα和tβ半壽期以及曲線下面積(AUC)之類的藥代動力學參數。
可由配體血清濃度對時間的曲線測定半壽期(T1/2α和T1/2β)和AUC。例如，可使用WinNonlin分析軟體包(可由Pharsight Corp.，Mountain View，CA，USA獲得)建立曲線模型。在第一階段(α期)，配體在患者中主要經歷分布，某些被去除。第二階段(β期)是末期，此時配體已分布完，血清濃度隨著配體由患者中被清除而降低。tα半壽期是第一階段的半壽期，tβ半壽期是第二階段的半壽期。因此，有利地，本發明提供具有15分鐘或更高的範圍內的tα半壽期的本發明配體或含配體的組合物。在一個實施方案中，範圍的下限是30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、10小時、11小時或12小時。另外或或者，本發明的配體或組合物具有在高達並包括12小時範圍內的tα半壽期。在一個實施方案中，範圍的上限是11、10、9、8、7、6或5小時。合適範圍的實例是1-6小時、2-5小時或3-4小時。有利地，本發明提供具有在2.5小時或更高的範圍內的tβ半壽期的本發明配體或含配體的組合物。
在一個實施方案中，範圍的下限是3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、10小時、11小時或12小時。另外或或者，本發明的配體或組合物具有在高達並包括21天範圍內的tβ半壽期。在一個實施方案中，範圍的上限是12小時、24小時、2天、3天、5天、10天、15天或20天。有利地，本發明的配體或組合物具有在12-60小時範圍內的tβ半壽期。
在進一步的實施方案中，其在12-48小時的範圍內。在再進一步的實施方案中，其在12-26小時的範圍內。
在以上標準以外或作為替代，本發明提供具有在1mg.分鐘/ml或以上範圍內的AUC值(曲線下面積)的本發明配體或含配體的組合物。在一個實施方案中，範圍的下限是5、10、15、20、30、100、200或300mg.分鐘/ml。另外或或者，本發明的配體或組合物具有在高達600mg.分鐘/ml範圍內的AUC。
在一個實施方案中，範圍的上限是500、400、300、200、150、100、75或50mg.分鐘/ml。有利地，本發明的配體具有選自以下範圍內的AUC15-150mg.分鐘/ml、15-100mg.分鐘/ml、15-75mg.分鐘/ml和15-50mg.分鐘/ml。
在第一個實施方案中，雙特異性配體含2個互補可變結構域，即，即便兩個可變結構域在本發明背景下單獨地結合其關連表位，但在其天然環境中也能夠作為關連對或組有效在一起運作。例如，互補可變結構域可為免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變結構域(VH和VL)。VH和VL結構域有利地由scFv或Fab抗體片段提供。可通過例如以下方式將可變結構域連接在一起形成多價配體提供各個V結構域C末端的鉸鏈區和鉸鏈區中半胱氨酸之間的二硫鍵合；或提供每個均在結構域的C末端具有半胱氨酸的dAb，半胱氨酸二硫鍵合在一起；或產生V-CH和V-CL，以產生Fab型；或使用肽接頭(例如下文論述的Gly4Ser接頭)，以產生二聚體、三聚體和另外的多聚體。本發明的發明人已發現，使用互補可變結構域允許兩個結構域表面包裝在一起，與溶劑隔離。而且，互補結構域能夠彼此穩定化。另外，其允許建立雙特異性IgG抗體，而沒有現有技術中使用的雜合雜交瘤的缺點或在亞單位接合處工程改造重鏈或輕鏈的需要。
本發明第一方面的雙特異性配體具有至少1個VH/VL對。因此，本發明的雙特異性IgG包含兩個這種對，Y型分子的每個臂上有1對。因此，和所使用的鏈比率決定了其製備成功與否並導致操作困難的常規雙特異性抗體或雙功能抗體不同，本發明的雙特異性配體沒有鏈平衡的問題。常規雙特異性抗體中的鏈不平衡起因於兩條不同的VL鏈和兩條不同的VH鏈的結合，其中VL鏈1和VH鏈1一起能夠結合抗原或表位1，VL鏈2和VH鏈2一起能夠結合抗原或表位2，兩個正確的配對以某種方式相互連接。因此，只有在單個分子中VL鏈1與VH鏈1配對以及VL鏈2與VH鏈2配對時才產生雙特異性。這種雙特異性分子可以兩種不同方式建立。首先，其可通過結合兩個現有的各自結合不同抗原或表位的VH/VL配對(例如在雙特異性IgG中)來建立。在此情況下VH/VL配對必須全部以1∶1比率聚集在一起，以便建立全部為雙特異性的分子群。這永不會出現(即便在通過「洞中結(knobs into holes)」工程法增強互補CH結構域時)，結果產生雙特異性分子和僅能結合一種抗原或表位而不能結合另一種的分子的混合物。第二種建立雙特異性抗體的方式是藉助於兩種不同VH鏈與兩種不同VL鏈的同時結合(例如在雙特異性雙功能抗體中)。在此情況下，儘管VL鏈1與VL鏈1配對以及VL鏈2與VH鏈2配對(其可通過「洞中結(knobs into holes)」工程改造VL和VH結構域而增強)有優先傾向，但這種配對永不會在所有分子中都實現，結果產生混合製品，由此出現不能結合任一種抗原或表位的不正確配對。
按照本發明第一方面的雙特異性配體方法構建的雙特異性抗體克服了所有這些問題，因為與抗原或表位1的結合分別位於VH或VL結構域中，與抗原或表位2的結合分別位於互補VL或VH結構域中。因為VH和VL結構域以1∶1為基礎配對，所以全部VH/VL配對都是雙特異性的，因此使用這些VH/VL配對(Fv、scFv、Fab、微型抗體、IgG等)構建的所有型都具有100％雙特異性活性。
在本發明背景下，第一種和第二種表位被理解為不相同且不由單個單特異性配體結合的表位。在本發明的第一種構型中，其有利地處於不同抗原上，其中一個起增加配體體內半壽期地作用。同樣，第一個和第二個抗原有利地不相同。
本發明的雙特異性配體不包括如WO 02/02773所述的配體。因此，本發明的配體不包括協同結合任一種或多種抗原或表位的互補VH/VL對。相反，本發明第一方面的配體含VH/VL互補對，其中V結構域具有不同的特異性。
而且，本發明第一方面的配體含對非結構相關的表位或抗原具有不同特異性的VH/VL互補對。結構相關的表位或抗原是具有足夠的結構相似性、被以協同方式起結合抗原或表位作用的常規VH/VL互補對結合的表位或抗原，就結構相關的表位而言，表位在結構上相似得足以使其「符合」在VH/VL二聚體的抗原結合位點處形成的相同結合袋。
在第二方面，本發明提供含第一個免疫球蛋白可變結構域(具有第一種抗原或表位結合特異性)和第二個免疫球蛋白可變結構域(具有第二種抗原或表位結合特異性)的配體，其中所述第一個和第二個可變結構域中的一個或兩個結合增加配體體內半壽期的抗原，而可變結構域彼此不互補。
在一個實施方案中，與一個可變結構域的結合調節配體與第二個可變結構域的結合。
在該實施方案中，可變結構域可為例如VH結構域對或VL結構域對。抗原在第一個位點的結合可調節(例如增強或抑制)抗原在第二個位點的結合。例如，在第一個位點的結合至少部分地抑制抗原在第二個位點的結合。在該實施方案中，配體例如可通過結合增加配體半壽期的蛋白而保持在目標生物體體內，直至例如其結合第二種靶蛋白並與增加半壽期的蛋白解離的時刻。
在上文中的結合調節由於抗原結合位點彼此相對的結構鄰近性而得以實現。這種結構鄰近性可利用連接兩個或更多抗原結合位點的結構組分的性質而獲得，例如通過提供具有相對剛性結構(其將抗原結合位點緊鄰保持)的配體。有利地，兩個或更多抗原結合位點彼此物理緊鄰，使得一個位點通過涉及免疫球蛋白分子中的位阻和/或構象變化的過程調節另一個位點的抗原結合。
第一個和第二個抗原結合結構域可共價或非共價結合。在結構域共價結合的情況下，結合例如可由二硫鍵或多肽接頭(例如(Gly4Ser)n，其中n＝1-8，例如2、3、4、5或7)介導。
按照本發明該方面的配體可組合成非免疫球蛋白多配體結構，以形成多價複合物，其結合具有相同抗原的靶分子，由此提供優良的親合力，而至少一個可變結構域結合增加多聚體半壽期的抗原。例如，天然細菌報告分子如SpA已用作CDR移植支架，以產生特異性結合一個或多個表位的配體。該方法詳述於美國專利5,S31,012。其它合適的支架包括基於纖連蛋白和親合體(affibodies)的支架。適宜方法的細節描述於WO 98/58965。其它合適的支架包括如van denBeuken等，J.Mol.Biol.(2001)310，591-601所述的脂質運載蛋白(lipocallin)和CTLA4，以及如WO0069907(Medical Research Council)所述的支架，其基於例如細菌GroEL或其它伴侶多肽的環狀結構。
蛋白支架可組合，例如CDR可移植至CTLA4支架上，並和免疫球蛋白VH或VL結構域一起用於形成配體。
同樣，可組合纖連蛋白、脂質運載蛋白和其它支架。
在可變結構域選自例如使用本文所述的噬菌體展示技術選定的V基因庫的情況下，這些可變結構域可包含通用構架區，使得其可由本文定義的特異性屬配體識別。通用構架、屬配體等的使用描述於WO 99/20749。在本發明中，所提到的噬菌體展示包括噬菌體和/或噬菌粒的使用。
當使用V基因庫時，多肽序列的變化優選位於可變結構域的結構環中。任一個可變結構域的多肽序列都可通過DNA重排或突變改變，以便增強各個可變結構域與其互補對的相互作用。
在本發明的優選實施方案中，「雙特異性配體」是單鏈Fv片段。在本發明的替代實施方案中，『雙特異性配體』由抗體的Fab區組成。術語「Fab區」包括其中使用兩個VH或兩個VL結構域的Fab-樣區。
可變區可來源於抗靶抗原或表位的抗體。或者，其可來源於例如在絲狀噬菌體表面上表達的單抗體結構域的庫。可如下文和實施例所述進行選擇。
dAb的製備本發明的一個方面不僅涉及一般的雙特異性配體，而且涉及結合單獨TNF-α、TNF-α和HSA或其它延長半壽期的多肽的雙特異性形式配體的各種構建物，以及結合TNF-α和VEGF的雙特異性形式配體的各種構建物。還可製備結合VEGF和HSA或其它延長半壽期的多肽的配體。雙特異性TNF-α/VEGF構建物可另外包含HSA或另一種延長半壽期的分子的結合體。在這些實施方案的每一個中，單個配體，即結合TNF-α、HSA或VEGF的配體，可為並優選為dAb。這種dAb的生產論述於下文和實施例。
在各個方面中，本文公開的dAb可以單聚體形式、二聚體形式、三聚體形式、四聚體形式乃至更高多聚體形式存在。除了異二聚體形式如雙特異性構建物以外，多聚構建物可為同多聚物，即同二聚體、同三聚體、同四聚體等。還具體設想了異三聚體、異四聚體和更高級的異多聚體。各種dAb構象中的每一個均可另外與其餘的部分複合，例如聚乙二醇(PEG)，以便進一步延長多肽構建物的血清半壽期。PEG化是本領域已知的，並在本文有論述。
以多種方式製備單免疫球蛋白可變結構域或dAb。在一個優選方面，dAb是人單免疫球蛋白可變結構域。對於這些方法中的每一個，可使用眾所周知的核酸序列製備(例如擴增、突變等)和操作方法。
一種製備dAb的方法是擴增和表達已知結合目標抗原的克隆抗體的重鏈或輕鏈基因的VH或VL區。VH和VL結構域的邊界陳述於Kabat等，(1991，出處同上)。使用有關重鏈和輕鏈基因的VH和VL結構域邊界的信息設計PCR引物，由編碼已知結合給定抗原的抗體的克隆重鏈或輕鏈編碼序列擴增V結構域。將擴增的V結構域插入到合適的表達載體中，例如pHEN-1(Hoogenboom等，1991，Nucleic AcidsRes.194133-4137)，並單獨地或作為與另一個多肽序列的融合體表達。然後篩選在與重鏈或輕鏈多肽的剩餘部分分離時高親合性結合目標抗原的表達的VH或VL結構域。對於本發明的所有方面，如本領域所知曉的或如下文所述進行結合篩選。
通過例如噬菌體展示、相對於目標抗原的淘選，篩選VH或VL結構域庫。構建噬菌體展示文庫和λ噬菌體表達文庫的方法在本領域眾所周知，講述於例如McCafferty等，1990，Nature 348552；Kang等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，884363；Clackson等，1991，Nature 352624；Lowman等，1991，Biochemistry 3010832；Burton等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.8810134；Hoogenboom等，1991，Nucleic Acids Res.194133；Chang等，1991，J.Immunol.1473610；Breitling等，1991，Gene 104147；Marks等，1991，J.Mol.Biol.222；581；Barbas等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.894457；Hawkins和Winter(1992)J.Immunol.，22867；Marks等，(1992)J.Biol.Chem，26716007；和Lerner等，(1992)Science，2581313。scFv噬菌體文庫講述於例如Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.855879-5883；Chaudhary等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.871066-1070；McCafferty等，1990，出處同上；Clackson等，1991，出處同上；Marks等，1991，出處同上；Chiswell等，1992，Trends Biotech.1080；和Marks等，1992，出處同上。業已描述了展示在噬菌體外殼蛋白上的scFv文庫的各種實施方案。噬菌體展示方法的精要也是已知的，例如描述於WO 96/06213和WO 92/01047(Medical Research Council等)以及WO 97/08320(Morphosys，出處同上)。
VH或VL結構域庫可為免疫球蛋白序列的天然庫或合成庫。天然庫是例如由從一個或多個個體收集的免疫球蛋白表達細胞製備的庫。這種庫可為「原初」庫，即例如由人胎兒或新生兒免疫球蛋白表達細胞製備，或重排庫，即由例如成人B細胞製備。天然庫描述於例如Marks等，1991，J.Mol.Biol.222581和Vaughan等，1996，Nature Biotech.14309。如果有需要，就此而言，則可對由天然庫或結合靶抗原的任意庫鑑別的克隆進行誘變和進一步的篩選，以便生產和選擇具有改良結合特徵的變體。
通過人工將多樣性導入到克隆的V結構域中，製備單免疫球蛋白可變結構域的合成庫。合成庫描述於例如Hoogenboom和Winter，1992，J.Mol.Biol.227381；Barbas等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.894457；Nissim等，1994，EMBO J.13692；Griffiths等，1994，EMBO J.133245；DeKriuf等，1995，J.Mol.Biol.24897；和WO99/20749。
常規抗體的抗原結合結構域含兩個單獨的區重鏈可變結構域(VH)和輕鏈可變結構域(VL其可為Vκ或Vλ)。這種抗體的抗原結合位點由6個多肽環構成3個來自VH結構域(H1、H2和H3)，3個來自VL結構域(L1、L2和L3)。這些環的邊界描述於例如Kabat等(1991，出處同上)。通過組合重排基因節段體內生產編碼VH和VL結構域的V基因的多樣性主庫。VH基因通過3個基因節段VH、D和JH的重組產生。在人中，根據單倍型，有約51種功能性VH節段(Cook和Tomlinson(1995)Immunol Today，16237)、25種功能性D節段(Corbett等，(1997)J.Mol.Biol.，26869)和6種功能性JH節段(Ravetch等，(1981)Cell，27583)。VH節段編碼形成VH結構域的第一個和第二個抗原結合環(H1和H2)的多肽鏈區，而VH、D和JH節段組合形成VH結構域的第三個抗原結合環(H3)。
VL基因通過重組僅2種基因節段VL和JL產生。在人中，根據單倍型，有約40種功能性Vκ節段(Schable和Zachau(1993)Biol.Chem.Hoppe-Seyler，3741001)、31種功能性Vλ節段(Williams等，(1996)J.Mol.so Biol.，264220；Kawasaki等，(1997)Genome Res.，7250)、5種功能性Jκ節段(Hieter等，(1982)J.Biol.Chef，2571516)和4種功能性Jλ節段節段(Vasicek和Leder(1990)J.Exp.Med.，172609)。VL節段編碼形成VL結構域的第一個和第二個抗原結合環(L1和L2)的多肽鏈區，而VL和JL節段組合形成VL結構域的第三個抗原結合環(L3)。一般認為，選自該原始庫的抗體多樣化得足以以至少中等的親合力結合幾乎所有抗原。通過重排基因的「親合力突變」體內產生高親合性抗體，其中免疫系統以改善的結合為基準生產和選擇點突變。
抗體的結構和序列分析表明，6個抗原結合環中有5個(H1、H2、L1、L2、L3)具有有限量的主鏈構象或規範結構(Chothia和Lesk(1987)dMol.Biol.，196901；Chothia等，(1989)Nature，342877)。主鏈構象由(i)抗原結合環的長度和(ii)抗原結合環和抗體構架中的某些關鍵位置的特定殘基或殘基類型決定。環長和關鍵殘基的分析能使我們預測由大部分人抗體序列編碼的H1、H2、L1、L2和L3的主鏈構象(Chothia等，(1992)J.Mol.Biol.，227799；Tomlinson等，(1995)EMBOJ.，144628；Williams等，(1996)J.Mol.Biol.，264220)。儘管H3區就序列、長度和結構而言更加多樣化(原因在於使用D節段)，但其也形成有限量的短環長主鏈構象，其取決於環和抗體構架中關鍵位置的具體殘基的長度和存在情況或殘基類型(Martin等，(1996)J.Mol.Biol，263800；Shirai等，(1996)FEBS Letters，3991)。
然而，按照本發明的一個實施方案，可將多樣性加入到合成庫中各種抗原結合環CDR的任意位點，該方法產生更大比例的未正確摺疊的V結構域並因此使潛在結合抗原的分子的比例更小。了解了有助於抗原結合環主鏈構象的殘基使得可以鑑別VH或VL結構域合成庫中的多樣性的特異性殘基。即，最好在非保持主鏈構象所必須的殘基中引入多樣性。作為實例，對於環L2的多樣性，常規方法應是使如Kabat等(1991，出處同上)定義的對應CDR(CDR2)中的所有殘基(約7個殘基)都多樣化。但是，對於L2，已知50和53位在天然抗體中是多樣化的，並觀察到其與抗原接觸。優選方法應是僅使該環中的這兩個殘基多樣化。這表明，功能多樣性的顯著提升需要確立抗原結合特異性的範圍。
在一個方面，在VH或Vκ背景中，基於人工多樣化的種系VH或Vκ序列，製備合成的可變結構域庫。例如，VH結構域庫基於克隆的種系VH基因節段V3-23/DP47(Tomlinson等，1992，J.Mol.Biol.2277768)和JH4b(參見圖1和2)。Vκ結構域庫基於例如種系Vκ基因節段O2/O12/DPK9(Cox等，1994，Eur.J.Immunol.24827)和Jκ1(參見圖3)。通過例如PCR誘變將多樣性導入到這些或其它基因節段中。多樣性可通過例如錯配PCR(Hawkins等，1992，J.Mol.Biol.226889)或化學誘變隨機導入。但是，如上所述，優選多樣性導入的目標在於特定殘基。進一步優選通過使用誘變引物導入密碼子NNK(使用IUPAC命名法，其中N＝G、A、T或C，K＝G或T)靶向目標殘基，NNK編碼全部胺基酸和TAG終止密碼子。獲得相似末端的其它密碼子也是有用的，包括NNN密碼子(其導致產生另外的終止密碼子TGA和TAA)、DVT密碼子((A/G/T)(A/G/C)T)、DVC密碼子((A/G/T)(A/G/C)C)和DVY密碼子((A/G/T)(A/G/C)(C/T)。DVT密碼子編碼22％絲氨酸和11％酪氨酸、天冬醯胺、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸和半胱氨酸，這最緊密地模擬了天然人抗體的抗原結合位點的胺基酸殘基分布。使用在待多樣化的各個位置均具有一個或多個選定簡併密碼子的PCR引物製備庫。PCR誘變在本領域眾所周知；但是，在下文題為「PCR誘變」的章節中論述了用於本發明方法的引物設計和PCR誘變的考慮因素。
在一個方面，如圖1所示，在對應於CDR1、2和3中多樣性的位點H30、H31、H33、H35、H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H97和H98，使用NNK密碼子將多樣性導入到人種系VH基因節段V3-23/DP47(Tomlinson等，1992，J.Mol.Biol.2277768)和JH4b的序列中。
在另一方面，如圖2所示，在對應於CDR1、2和3中多樣性的位點H30、H31、H33、H35、H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H97、H98、H99、H100、H100a和H100b，例如使用NNK密碼子將多樣性導入到人種系VH基因節段V3-23/DP47和JH4b的序列中。
在另一方面，如圖3所示，在對應於CDR1、2和3中多樣性的位點L30、L31、L32、L34、L50、L53、L91、L92、L93、L94和L96，例如使用NNK密碼子將多樣性導入到人種系Vκ基因節段O2/O12/DPK9和Jκ1的序列中。
如本領域所知並如例如WO 99/20749所述將多樣化庫克隆入噬菌體展示載體中。一般來說，實施本發明所需的核酸分子和載體構建物可由本領域獲得，並如Sambrook等，(1989).Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbor，USA的標準實驗室方法所述構建和操作。
通常在重組載體中進行本發明核酸的操作。本文使用的「載體」指用於將異源DNA導入到用於其表達和/或複製的細胞中的分離元件。選擇或構建並隨後使用該載體的方法是本領域技術人員眾所周知的。許多載體可公開獲得，包括細菌質粒、噬菌體、人工染色體和游離型載體。這種載體可用於簡單克隆和誘變；或者，作為攜帶本發明庫(或前庫)成員的載體的代表，使用基因表達載體。選定按照本發明使用的載體，以容納長度通常為0.25千鹼基對(kb)至40kb的目標大小的多肽編碼序列。在體外克隆操作後用載體轉化合適的宿主細胞。各個載體均含有各種功能元件，其一般包括克隆(或「多接頭」)位點、複製起點和至少一個選擇標記基因。如果給定載體是表達載體，則其另外具有以下的一個或多個增強子元件、啟動子、轉錄終止子和信號序列，其每個均定位在克隆位點的附近，使得其有效連接至編碼本發明多肽庫成員的基因。
一般來說，克隆和表達載體這二者均含有能使載體在一個或多個選定的宿主細胞中複製的核酸序列。通常，在克隆載體中，該序列是能使載體獨立於宿主染色體DNA複製的序列，包括複製起點或自主複製序列。各種細菌、酵母和病毒的此類序列是眾所周知的。質粒pBR322的複製起點適於大部分革蘭氏陰性菌，2μ質粒起點適於酵母，而各種病毒起點(例如SV 40、腺病毒)用於哺乳動物細胞中的克隆載體。一般來說，哺乳動物表達載體不需要複製起點，除非這些起點用在能夠複製高水平DNA的哺乳動物細胞中，例如COS細胞。
有利地，克隆或表達載體還含有又被稱為選擇標記的選擇基因。該基因編碼的蛋白是在選擇性培養基中培養的轉化宿主細胞存活或生長所必需的。因此，未用含選擇基因的載體轉化的宿主細胞在該培養基中不能存活。典型的選擇基因編碼蛋白賦予對抗生素和其它毒素(例如氨苄青黴素、新黴素、氨甲蝶呤或四環素)的抗性、補充營養缺陷或提供生長培養基中不可獲得的關鍵營養物。
因為本發明載體的複製最通常在大腸桿菌中進行，所以使用大腸桿菌選擇標記，例如賦予對抗生素氨苄青黴素抗性的β-內醯胺酶基因。這些載體可得自大腸桿菌質粒(例如pBR322)或pUC質粒(例如pUC18或pUC19)。
表達載體通常含被宿主生物識別並有效連接至目的編碼序列的啟動子。這種啟動子可為誘導型或組成型啟動子。術語「有效連接的」指這種並列其中所述組分所處的關係允許其以預計方式起作用。「有效連接」至編碼序列的控制序列以在和控制序列相適的條件下實現編碼序列表達的方式連接。
適用於原核生物宿主的啟動子包括例如β-內醯胺酶和乳糖酶啟動子系統、鹼性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動子系統和雜合啟動子，例如tac啟動子。用於細菌系統的啟動子一般還包含有效連接至編碼序列的Shine-Dalgarno序列。
在本文所述的文庫或庫中，優選載體是能夠表達對應於多肽文庫成員的核苷酸序列的表達載體。因此，通過對表達多肽文庫成員的單個克隆進行單獨增殖和表達，或通過使用任一種選擇展示系統，進行選擇。如上所述，優選的選擇展示系統使用噬菌體展示。因此，可使用噬菌體或噬菌粒載體。優選的載體是噬菌粒載體，其具有大腸桿菌複製起點(用於雙鏈複製)，還具有噬菌體複製起點(用於生產單鏈DNA)。這種載體的操作和表達在本領域眾所周知(Hoogenboom和Winter(1992)，出處同上；Nissim等，(1994)，出處同上)。簡單地說，載體含賦予噬菌粒選擇性的β內醯胺酶或其它選擇標記基因和表達盒上遊的lac啟動子，該表達盒由pelB前導序列(其將表達的多肽引導入壁膜間隙)(N至C末端)、多克隆位點(用於克隆核苷酸形式的文庫成員)、任選的一個或多個肽標記(用於檢測)、任選的一個或多個TAG終止密碼子和噬菌體蛋白pIII組成。在使用大腸桿菌的各種抑制基因和非抑制基因菌株並加入葡萄糖、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)或輔助噬菌體如VCS M13的情況下，載體能夠作為不表達的質粒複製，產生大量的唯一的多肽