紅緣擬層孔菌發酵產物的抗腫瘤和增強免疫活性的製作方法

2023-10-26 06:01:57

專利名稱：紅緣擬層孔菌發酵產物的抗腫瘤和增強免疫活性的製作方法
技術領域：
本發明公開了紅緣擬層孔菌發酵菌絲體的抗腫瘤和免疫增強活性，並提供其發酵製備方法及條件，研究表明紅緣擬層孔菌發酵菌絲體對肝癌H22荷瘤具有較好的抑制作用，且能明顯的增強小鼠的免疫活性。該研究屬於菌物生藥發酵產物的製備及其在醫藥與保健品領域的應用方法，並為預防及治療腫瘤藥開發提供依據。
背景技術：
癌症，醫學術語又稱惡性腫瘤，是控制細胞生長增殖機制的失常而引起的疾病，是目前危害人類健康和生命的重要疾病之一。近些年來腫瘤的發病率在不斷上升，已經成為人類的頭號殺手。隨著天然產物化學的發展，真菌作為自然界中的一大生物類群，以其藥理活性好，副作用較小，並且並可通過發酵手段大量獲得，越來越被人們所重視。多孔菌科真菌是擔子菌中的一大類群，例如中藥靈芝、豬苓、茯苓等都屬於這一類群，多孔菌類的抗腫瘤活性也多有研究報導，被稱為桑黃的菌類以及靈芝和樺褐孔菌的抗腫瘤活性都很好，因此研究真菌中抗腫瘤成分並將其開發成藥品或保健品的需求是十分迫切的。紅緣擬層孔菌Fomitopsis pinicola (Sw. :Fr. )P. Karst ,又名「紅緣層孔菌」等。隸屬於擔子菌綱(Basidiomycetes)非裙菌目(Aphyllophorales)多孔菌科(Polyporaceae),擬層孔菌屬(Fomes)。紅緣擬層孔菌是世界性分布的木腐性真菌,它大多生長在闊葉樹活立木、針葉樹、腐朽木以及倒木上，對很多種類的闊葉樹木具有很強的危害性。紅緣擬層孔菌具祛風除溼，強心，解熱，滋補強壯，扶正培本、補肺益腎，安神定志、和胃健脾等作用，對癌症、心臟病、腦溢血、貧血、糖尿病、腎炎和支氣管炎等疾病有很好的治療效果。民間用其治療礦工的「寒腿」病。在中國東北長白山地區為常見種類，在春季、夏季和秋季均會出現。味微苦、性平。有研究表明，紅緣擬層孔菌提取物具有抗腫瘤、抑菌、抗炎、抗氧化、抑制肥胖、保護肝臟、抑制水腫並能清除游離基、調節中樞神經系統、治療糖尿病、增強人體免疫力。

發明內容
本發明公開了紅緣擬層孔菌發酵菌絲體的製備方法，具體如下(I)最適基礎培養基為馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氫鉀lg/L，硫酸鎂I. 5g/L,維生素 BI 0. 4g/L。(2)各級種子的製備用接種環將紅緣擬層孔菌母種斜面培養基上的菌絲接在兩個500ml搖瓶內，每個搖瓶裝有篩選出的最佳培養基IOOml,置於28°C的恆溫振蕩器中，轉速130r/min，PH自然，發酵周期為80小時，作為一級液種。將這200ml —級液種分成四等份後轉接入四瓶2000ml搖瓶中，每瓶裝有200ml培養液，同一級液種的培養條件培養64小 時作為二級液種。(3)升罐培養實驗將35L篩選出的最佳培養基裝入50L的發酵罐中，在121°C條件下對發酵罐內的培養基進行滅菌25min後將培養好的紅緣擬層孔菌的二級液種在火焰下轉接入50L發酵罐中，在28°C的條件下培養96小時，初始攪拌數為150rpm，罐壓
0.05Mpa，起始溶氧為100%，通氣量I :0. 5，PH自然。最佳發酵周期為56 64h，在此條件下菌絲體溼重達到6. 8901g/L，胞外粗多糖含量達到0. 2965g/L。本發明公開了紅緣擬層孔菌發酵菌絲體的小鼠抗腫瘤活性的研究，方法與結果如下無菌條件下，取接種7d的種鼠腹水肝癌H22細胞，用生理鹽水製成細胞個數為lX 106-5X 106/mL的細胞懸液，以每鼠0. ImL接種於小鼠左後肢腋窩皮下，隨機分組，每組10隻。次日開始給藥，陽性藥組隔天腹腔注射環磷醯胺(25mg/kg),體積為0. 2mL/10g,受試藥組(100mg/kg，200mg/kg)和對照組(生理鹽水)灌胃給藥，體積為0. 2mL/10g，連續10d，第11天處死小鼠，摘取瘤塊、胸腺和脾臟，分別稱重。腫瘤抑制率=(對照組平均瘤重一給藥組平均瘤重)/對照組平均瘤重X 100%。胸腺指數為每g體重中胸腺的mg數，脾指數為每g體重中脾臟的mg數，各數值均以平均值土標準差(1±、)來表示。通過軟體spss 18.0統計分析數據的代表性，P〈0. 05說明在統計學上差異顯著，p〈0. 01說明在統計學上差異極顯著。發酵產物組的體內抗腫瘤作用如表I所示。除了 CTX組對小鼠移植瘤的抑制率達到80. 59%之外，發酵產物組對小鼠的移植瘤具有極明顯的抑制作用，但不存在量效關係，在劑量為100mg/kg/d時的抑制率達到62. 54%，同對照組相比存在顯著性差異(P < 0. 01)。表I紅緣擬層孔菌的發酵產物對荷瘤小鼠腫瘤的影響
權利要求
1.紅緣擬層孔菌的發酵菌絲體在製備、抑制腫瘤和增強免疫力藥物中的用途及其相關應用。所述的藥物劑型是指藥劑學上所說的任何劑型，如片劑、注射劑、膠囊劑、膠漿劑、塗膜劑、乳劑、混懸劑、合劑、散劑、顆粒劑等。
2.根據權利要求I所述，紅緣擬層孔菌的發酵菌絲體的製備方法，其特徵包括如下步驟 (1)最適基礎培養基為馬鈴薯200g/L，葡萄糖20 g/L，磷酸ニ氫鉀I 8/し硫酸鎂1.5g/L,維生素 BI O. 4 g/L。
(2)各級種子的製備用接種環將紅緣擬層孔菌母種斜面培養基上的菌絲接在兩個500ml搖瓶內，姆個搖瓶裝有篩選出的最佳培養基100ml,置於28°C的恆溫振蕩器中，轉速130r/min, PH自然，發酵周期為80小時，作為ー級液種。將這200ml —級液種分成四等份後轉接入四瓶2000ml搖瓶中，每瓶裝有200ml培養液，同一級液種的培養條件培養64小時作為ニ級液種。
(3)升罐培養實驗將35L篩選出的最佳培養基裝入50L的發酵罐中，在121°C條件下對發酵罐內的培養基進行滅菌25min後將培養好的紅緣擬層孔菌的ニ級液種在火焰下轉接入50L發酵罐中，在28°C的條件下培養96小時，初始攪拌數為150rpm，罐壓O. 05Mpa，起始溶氧為100%，通氣量I :0. 5，PH自然。最佳發酵周期為56飛4h，在此條件下菌絲體溼重達到6. 8901g/L，胞外粗多糖含量達到O. 2965g/L。
3.由權利要求2的製備得到紅緣擬層孔菌的發酵菌絲體具有一定的抗腫瘤活性，對H22荷瘤小鼠的抑制率達到極顯著水平(P〈0. 01)。並具有明顯的增強小鼠免疫水平的作用。
全文摘要
本發明公開了紅緣擬層孔菌發酵菌絲體的抗腫瘤和免疫增強活性，並提供其發酵製備方法及條件，研究表明紅緣擬層孔菌發酵菌絲體對肝癌H22荷瘤具有較好的抑制作用，且能明顯的增強小鼠的免疫活性。該研究屬於菌物生藥發酵產物的製備及其在醫藥與保健品領域的應用方法，並為預防及治療腫瘤藥開發提供依據。
文檔編號A61K36/07GK102648924SQ20121013706
公開日2012年8月29日 申請日期2012年5月4日 優先權日2012年5月4日
發明者包海鷹, 孫雪 申請人:包海鷹