新的阿片樣肽的製作方法
2023-10-05 00:41:39 1
專利名稱：新的阿片樣肽的製作方法
技術領域：
本發明涉及阿片樣肽化合物。具體地講，它涉及具有末梢止痛活性和對μ亞型阿片樣物質受體具有選擇性的阿片樣肽化合物。
背景技術：
許多源自哺乳動物和兩棲動物的內源肽與特定阿片樣物質受體結合，並產生類似於傳統麻醉性鴉片製劑的止痛反應。許多不同類型的阿片樣物質受體都被表明存在於高等動物中。例如參見W.Martin等，J.Pharmacol.Exp.Ther.，197，517頁(1975)；和J.Lord等，Nature(London)，257，495頁(1997)。已鑑別出三種不同類型阿片樣物質受體。第一種δ顯示對腦啡呔類肽的具有區別的親和性。第二種μ對嗎啡和其它多環生物鹼具有增強的選擇性。第三種κ顯示對上述每組配體具有等同的親和性，並對強啡肽具有優先親和性。通常，μ受體似乎與止痛效應更加相關。儘管δ和κ受體可能也介導止痛作用，但是δ受體看來與行為效應有關。
每種阿片樣物質受體在與一種鴉片製劑結合時，產生特定於這類受體的特異性生物應答。當一種鴉片製劑激活多於一種的受體時，每種受體的生物應答將受影響，由此產生副作用。一種鴉片製劑特異性和選擇性越少，服用此鴉片製劑導致增加的副作用的機會越多。
現有技術中，鴉片製劑、阿片樣肽和其類似物尚未證明或已證明對與之結合的一種受體或多種受體具有有限程度的選擇性。
鴉片製劑可產生嚴重和潛在致命的副作用。副作用如呼吸衰退、耐藥性、身體依賴性和突然停藥綜合症，都是田中樞神經系統受體非特異性相互作用引起的。參見K.Budd，Internation Encyclopedia of Pharmacology andTherapeutics；N.E.Williams和H.Wilkinson，Eds.，Pergammon(Oxford)，112，51頁(1983)。因此，主要通過阿片樣物質受體在末梢神經系統中作用得到的阿片樣止痛作用，預期不會引起類似於與影響中樞神經系統的阿片樣止痛作用相關的那些不需要的副作用。
目前為止，已知產生末梢止痛效應的少數幾類藥劑之一是非類固醇抗炎劑，如阿司匹林、布洛芬、ketorolac.。這些藥劑不與阿片樣物質受體相互作用，但已知其抑制環氧酶和削弱前列腺素合成這些輕微止痛作用不會產生中樞傳導副作用，但它們可導致其它副作用，如胃腸道潰瘍。
據認為非極性肽比極性肽更易穿過血腦屏障進入中樞神經系統。已見報導的TAPP(H-Tyr-D-Ala-phePhe-NH2〕對末梢和中樞均具有抗感受傷害特性(P.Schiller等，Proceedings of the 20thEuropean Peptide Symposium，1988)。與之相反，本發明人發現這種四肽即使在100mg/kg劑量下也不產生中樞作用。
本發明的一個目的是提供阿片樣肽化合物，其作用於末梢但基本上又避免了通常在末梢施加止痛作用時伴隨的不需要的副作用。另一目的是提供選擇性結合μ-阿片樣物質受體的肽化合物。
發明概述本發明提供了新的肽化合物，其在末梢作用並對μ-阿片樣物質受體具有選擇性，該化合物由式(1)表示
和其鹽、衍生物和類似物，其中R1是Tyr或2』，6』-二甲基酪氨酸，或其類似物或衍生物；R2是D-Ala或D-Arg；R3是Phe(p-F)；R4是Phe或Phe(p-F)；X是H或C1-6烷基；和Y和Z各自獨立地為H，芳烷基或C1-6烷基。
在本發明的另一方面還還提供了藥用組合物，其含有式(1)化合物，並混合有藥物上可接受載體和/或另一種治療活性劑。
在本發明的另一方面還提供了一種治療疼痛的方法，包括對需要這種治療的哺乳動物給藥有效量的式(1)化合物。
在本發明的另一方面還進一步提供了式(1)化合物在生產用來治療疼痛的藥物的應用。
附圖簡要說明
圖1，2和4表明本發明化合物在兩種不同熱板測定中的抑制效果。
圖3表明熱板測定中H-Tyr-D-Ala-Phe-Phe-NH2的抑制效果。
圖5表明本發明化合物在尾擺動分析中的抑制效應。
發明詳述下列常用縮寫語用於整個說明書和權利要求中。
Ala-丙氨酸Arg-精氨酸Phe-苯丙氨酸Ser-絲氨酸Tyr-酪氨酸TAPP-H-Tyr-D-Ala-Phe-Phe-NH2GPI-荷蘭豬迴腸MVD-小鼠輸精管道Phe(p-F)-對氟苯丙氨酸HOBT-N-羥基苯丙噻唑BOP-苯並三唑-N-氧-三(二甲氨)六氟磷酸磷DMF-二甲基甲醯胺TFA-三氟乙酸tBU-叔丁基Pmc-2，2，5，7，8-戊甲基苯並二氫吡喃-6-磺醯基FMOC-9-芴甲氧羰基PBQ-苯基-p-苯醌示於表1用於PBQ扭曲分析中的術語「ED50」定義為與對照組相比觀察到的扭曲量減少50％的藥劑量。示於表1用於粘合分析中的術語「Ki」是指已知μ-受體配體DAMGO和δ-受體配體DADLE的抑制常數。術語「Kiδ/Kiμ」是用來表明選擇性的數值。這一比值表明阿片樣肽與μ和δ受體結合親和性關係。
本發明化合物由式(1)表示
及其鹽、衍生物和類似物。
X是H或甲基，優選H。
R1是Tyr或2』，6』-二甲基酪氨酸，並優選Tyr。
R1的α-氨基被X取代，當X是H時，形成一個氨基，或當X是甲基時，形成烷基氨基。
R2是D-Ala或D-Arg，優選D-Ala。
R3是Phe(p-F)。
R4是Phe或Phe(p-F)，優選Phe.
Y和Z各自獨立地為H；芳烷基，如苄基；和C1-6烷基，如甲基。優選Y和Z均為H。
本發明化合物包括，但不限於化合物 # 1B H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe(p-F)-NH2；化合物 # 1C H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe-NH2；化合物 # 2B H-Tyr-D-Arg-Phe(p-F)-Phe(p-F)-NH2和化合物 # 2C H-Tyr-D-Arg-Phe(p-F)-Phe-NH2在一個優選實施方案中，本發明化合物選自化合物 # 1C H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe-NH2；和化合物 # 2C H-Tyr-D-Arg-Phe(p-F)-Phe-NH2在一個更選優實施方案中，本發明化合物是化合物 # 1C H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe-NH2。
可用胺基酸衍生物2』，6』-二甲基酪氨酸(Dmt)取代阿片樣肽化合物中的酪氨酸。實驗表明，在R1位置用Dmt取代酪氨酸，即通式1中的第一位胺基酸殘基，使阿片樣肽對μ-受體的效能增強至兩個數量級。當化合物在R1位置含有Dmt時，對μ-受體的選擇性提高。這種取代使結合抑制常數比值發生相應變動，從而反應出增加的μ-受體選擇性。
體外使用荷蘭豬迴腸(GPI)縱肌樣本來評定肽的阿片樣物質活性，而其抗感受傷害活性可在齧齒動物體內PBQ引發的扭曲模型(末梢活性)和兩個熱板試驗(中樞活性)中測定。還用尾擺動測定評估本發明化合物的止痛活性。尾擺動測定被用來評估化合物的中樞止痛活性。本發明化合物在扭曲、熱板和尾擺動測定中的活性的比較，表明止痛效應主要在末梢傳導。通過扭曲測試中的高效性和熱板測試或尾擺動測試中的低效性，證明了末梢止痛。
PBQ(苯基-p-苯醌)誘發小鼠扭曲是一種中樞止痛和末梢止痛的評估方法。實驗方案參見Sigmund等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，95，729頁(1957)，在此被本文引作參考。中樞止痛根據小鼠熱板反應抑制作用確定。其實驗方案參見G.Wolfe和A.Mac Donald，I.Phermacol.Exp.Ther.，80，300頁(1944)，在此被本文引作參考。用於測定阿片樣物質受體對μ和δ受體結合親和性的測定法及GPI測定法，根據在此被引作參考，Schiller等在Biophys，Res.Commun.，85，1322頁(1975)中提出的實驗方案進行。
本發明化合物能用肽化學領域熟知的方法製備。例如，參見Principle ofPeptide Synthesis，Bodansky M.，Spinger-Verlag，Berlin，Heidelberg，NewYork，Tokyo 1984，或The Peptides，Analysis，Synthesis Biology，由ErhardGross和Johannes Meienhofer編著，Academic Press，1979。
本發明化合物根據肽合成領域建立的步驟，利用下面概述的固相合成方法製備。在合成的適當步驟採用可購買的對-氟苯丙酸。2』，6』-二甲基酪氨酸也在合成中結合使用，並通過已有的化學合成方法製備。
本發明肽的藥物可接受鹽可以按照常規通過與適當的酸反應生成。通過加酸可形成合適的酸加成鹽，這些酸如鹽酸、氫溴酸、磷酸、乙酸、反丁烯二酸、水楊酸、檸檬酸、乳酸、苯乙醇酸、酒石酸、草酸、甲磺酸、和其它本領域技術人員已知的酸。
本發明還提供了藥物組合物。合適的組合物包括藥物有效量的本發明化合物，或其藥物可接受鹽，並混合有一種藥物可接受載體或助劑。可將治療有效量的本發明肽和藥物可接受載體物質(如碳酸鎂或乳糖〕配製形成一種治療組合物，如(i)對病人口服給藥所用的藥丸、片劑、膠囊或口服液形式；(ii)能通過吸入、經皮、鼻、直腸或舌下給藥的一種液體或軟膏；(iii)能由靜脈、腸胃外、皮下或腹膜內給藥的液體；或(iv)一種口服或腸胃外的持續釋放製劑。
本發明還提供了一種治療包括人在內的哺乳動物疼痛的方法。此方法包括以一種常規方式，如口服、腸胃外、經皮或經黏膜，利用可生物降解生物相容聚合物或膠粒、凝膠和脂質體定點傳遞生成持續釋放製劑，給藥有效量式1肽或藥物可接受鹽或其組合物。對患者的給藥肽劑量約為0.01至100mg/kg，優選約0.05至20mg/kg，並最優選約0.1至1mg/kg。
以下實施例被用來更好地描述本發明。這些實施例僅為說明本發明，不以任何方式限制本發明。實施例11C H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe-NH2的製備使用克諾爾樹脂製備合成肽。所用胺基酸α氨基被Fmoc保護，酪氨酸側鏈被tBu保護。偶聯步驟使用的二甲基甲醯胺中不含二甲胺。用於洗滌步驟的DMF和TFA是生物級純。純化步驟中使用USP純化水和HPLC級乙晴。其餘所有溶劑均為ACS純，使用時無需純化。
在裝載0.84毫摩爾/g的樹脂上人工進行固相合成。室溫下用Fmoc-胺基酸、HOBT和BOP各1.5至2當量在DMF中進行肽縮合3-24小時。用20％(v/v)哌啶的DMF溶液進行α氨基Fmoc的脫保護步驟。通過用TFA/CH2Cl2/苯甲醚處理完成肽切除及側鏈的脫保護。在室溫下氮氣中用TFA處理肽樹脂兩個90分鐘。CH2Cl2洗滌並蒸發後，殘餘物用乙醚處理，過濾沉澱物並真空乾燥。
在C1810μ-15μ300A反相柱上通過HPLC純化所得的粗肽，用0.06％TFA/H2O和0.06％TFA/乙腈梯度洗脫。在220nm下進行監測。收集純化部分並冷凍乾燥。將該純化物轉化成它的鹽酸鹽形式，得到純化的標題化合物。
用相似方式還合成了下面的肽1A H-Tyr-D-Ala-Phe-Phe-NH21B H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe(p-F)-NH2實施例22C H-Tyr-D-Arg-Phe(p-F)-Phe-NH2的製備使用克諾爾樹脂製備合成肽。所用胺基酸的α氨基被Fmoc保護，且側鏈保護如下D-Arg側鏈由(Pmc)保護，酪氨酸側鏈由tBu保護。偶聯步驟使用的二甲基甲醯胺不含二甲胺。用於洗滌步驟的DMF和TFA是生物級純。純化步驟中使用USP純化水和HPLC級乙腈。其餘所有溶劑均為ACS純，使用時不經任何純化。
在裝載0.84毫摩爾/g的樹脂上人工進行固相合成。室溫下用Fmoc-胺基酸、HOBT和BOP各1.5至2當量在DMF中進行肽縮合2-5小時。用20％(v/v)哌啶的DMF溶液進行α氨基Fmoc的脫保護。通過用TFA/CH2Cl2/苯甲醚處理完成肽切除及側鏈的脫保護。在室溫下氮氣中用TFA處理肽樹脂兩個90分鐘。經CH2Cl2洗滌並蒸發後，殘餘物用乙醚處理，過濾沉澱物並真空乾燥。
在C1810μ-15μ300A反相柱上通過HPLC純化所得的粗肽，用0.06％TFA/H2O和0.06％TFA/乙腈梯度洗脫。在220nm下進行監測。收集純化部分並冷凍乾燥。
用相似方式還合成了下面的肽2A H-Tyr-D-Arg-Phe-Phe-NH22B H-Tyr-D-Arg-Phe(p-F)-Phe(p-F)-NH2實施例3放射配體結合分析膜製備通過吸入CO2使體重350-450g的雄性Sprague-Dauley小鼠致死。小鼠被斷頭，移出除去小腦的腦，置入冰冷鹽水溶液中，然後在PH7.4(10ml/腦)50mM冰冷Tris緩衝液中勻漿。將膜在14000rpm、4℃下離心30分鐘。沉澱物重新懸浮於約6ml/腦的PH7.4 50mM冰冷Tris緩衝液中，並在-78℃下存放備用。根據購買的蛋白分析盒(Bio-Rad)進行腦勻漿的蛋白定量。
放射配體的抑制(3H)-DAMGO和(3H)-DAGLE分別用作μ和δ受體的放射配體。放射配體50μl、膜100μl和系列稀釋的測試化合物在22℃下溫育1小時。在示蹤物和膜存在時使用500倍過量的未標記配體確定非特異性結合。游離配體通過用WhatmanGF/B濾紙(用1％聚乙烯亞胺水溶液預浸溼)過濾從結合物上分離並用Brandle細胞收集器以PH7.4 50mM的冰冷Tris緩衝液漂洗。乾燥濾物，在每孔500ml閃爍體的24孔微板上計數放射性。用Wallac 1450 Microbeta計數器測定放射性。
根據Cheng和Prusoff方程從IC50確定各種化合物的Ki’s。結合分析結果示於表1。
根據Schiller等在Biophys.Res.Commun.，85，1322頁(1975)中所述的方法，使用豚鼠迴腸(GPI)分析法(縱向肌肉樣品)確定μ受體上肽化合物的活性。活性結果示於表1。實施例4在55℃進行熱板分析(止痛活性測定)。該項分析中，使用體重20-25克的CD#1雄性小鼠。將小鼠稱重、標記並分成10組。
通過皮下注射化合物(或標準物或介質)處理小鼠，注射量相當於0.1ml/10gp.c.(10ml/kg)。
分別評估小鼠在熱板時的反應時間。熱板(Sorel，DS37型)溫度設定在55℃。觀察小鼠出現不適跡象，如舔腳爪或抖動腳爪，試圖逃跑(跳出熱板)或顫抖。當出現這些跡象之一時，開始記錄反應時間，以秒計。觀察每隻小鼠最長時間為30秒，以防止爪組織損傷。
每次讀數時，將對照組平均反應時間乘1.5。每隻處理小鼠的反應時間與「對照組平均值×1.5」相比。如果反應時間小於「對照組平均值×1.5」，則認為小鼠不具有止痛效果。如果反應時間大於「對照組平均值×1.5」，則認為小鼠具有止痛效果。每組中止痛小鼠的數量決定了此種讀數化合物的止痛百分率。如果止痛百分率小於30％，則認為化合物沒有活性。結果示於圖1至3。實施例5扭動分析在體重18和22g的CD#1雄性小鼠上進行此項試驗。小鼠被稱重並標記。以0.3ml/20g的量用0.02％的苯醌溶液腹膜內注射小鼠。記錄注射後15分鐘內出現的扭曲現象。皮下給藥化合物(或介質，或標準物)後，間隔5、20或60分鐘時，注射苯醌。
按照下面的方法製備0.02％的苯醌溶液。將20mg苯醌溶解於5ml 90％乙醇中(Sigma，試劑，乙醇)。將溶解的苯醌緩慢加入95ml持續振蕩並預熱(沒有沸騰)的蒸餾水中。苯醌溶液使用前放置2小時，且任何時候均避光保存。每天製備測試使用的新溶液。
該項分析結果示於下表1。可以看出，當本發明肽化合物中R3和R4之一或兩者均為Phe(p-F)時，該化合物與相應的沒有Phe(p-F)的化合物相比顯示出對μ阿片樣受體的更高的選擇性以及正如GPI分析中所測定的更大的受體傳導性。並且，本發明化合物呈現出如扭動分析中所測定的更高的末梢止痛活性。
表1
實施例6在58℃進行熱板分析(止痛活性測定)。該項分析中，使用體重20-25克的NMR1雄性小鼠。將小鼠稱重、標記並分成6組。
通過皮下注射化合物(或標準物或介質)處理小鼠，注射量相當於0.1ml/10gp.c.(10ml/kg)。
分別評估小鼠在熱板上的反應時間。熱板(Sorel，DS37型)溫度設定在58℃。觀察小鼠出現不適跡象，如舔腳爪或抖動腳爪，試圖逃跑(跳出熱板)或顫抖。當出現這些跡象之一時，開始記錄反應時間，以「秒」計。觀察每隻小鼠最長時間為20秒，以防止爪組織損傷。
如果反應時間與對照組有顯著差異(p＜0.05；兩種方式的ANOVA，sigmaslot)，則認為化合物有止痛性。
結果示於圖4。實施例7尾擺動分析此項分析測定中，使用體重20和25g的NMRI雄性小鼠。小鼠被稱重、標記，分成6組。
通過皮下注射化合物(或標準物或介質)處理小鼠，注射量相當於0.1ml/10gp.c.(10ml/kg)。
分別評估小鼠在尾擺動試驗中的反應時間。當變阻器控制光束直接照射到鼠尾尖(IITC Inc.33型)時，測定尾擺動的潛伏期。觀察每隻小鼠最長時間為10秒，以防止組織損傷。
如果反應時間與對照組有顯著差異(p＜0.05；兩種方式的ANOVA，SigmaStat)，則認為化合物有止痛性。
結果示於圖5。
權利要求
1.一種式(1)化合物及其鹽、衍生物和類似物
其中R1是Tyr或2』，6』-二甲基酪氨酸，或其類似物或衍生物；R2是D-Ala或D-Arg；R3是Phe(p-F)；R4是Phe或Phe(p-F)；X是H或C1-6烷基；及Y和Z分別單獨為H、芳烷基或C1-6烷基。
2.根據權利要求1中的化合物，其中R2是D-Ala。
3.根據權利要求1中的化合物，其中R2是D-Arg。
4.根據權利要求1中的化合物，R4是Phe。
5.根據權利要求4中的化合物，其中R2是D-Ala。
6.根據權利要求4中的化合物，其中R2是D-Arg。
7.根據權利要求1至6中所述的任一化合物，其中X是H，Y和Z均為H。
8.根據權利要求1中的化合物，選自H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe(p-F)-NH2；和H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe-NH2。
9.化合物H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe-NH2。
10.根據權利要求1中的化合物，選自H-Tyr-D-Arg-Phe(p-F)-Phe(p-F)-NH2；和H-Tyr-D-Arg-Phe(p-F)-Phe-NH2。
11.化合物H-Tyr-D-Arg-Phe(p-F)-Phe-NH2。
12.一種藥物組合物，含有與藥物可接受載體混和的權利要求1，2，3，4，5，6，8，9，10和11之一的一種化合物。
13.一種藥物組合物，含有與藥物可接受載體混和的權利要求7的化合物。
14.一種治療疼痛的方法，包括給需要這種治療的哺乳動物以有效量的權利要求1，2，3，4，5，6，8，9，10和11之一的化合物。
15.一種治療疼痛的方法，包括給需要這種治療的哺乳動物以有效量的權利要求7的化合物。
16.權利要求1，2，3，4，5，6，8，9，10和11之一的化合物在製備有效治療疼痛的製劑中的應用。
17.權利要求7的化合物在製備有效治療疼痛的製劑中的應用。
18.權利要求1中化合物的製備方法，採用固相合成法製備。
全文摘要
本發明涉及用於治療疼痛的新的阿片樣肽及其製備方法和含這些肽的藥物可接受組合物。本發明還涉及利用本發明組合物控制病人疼痛的方法和所述化合物在製備有效治療疼痛的製劑中應用。本發明的肽對μ－阿片樣物質受體具有高度選擇性。本發明肽尤其特別適合用作主要作用在末梢μ－阿片樣物質受體的止痛劑。因為這些肽在末梢起作用,它們基本避免了產生通常與中樞止痛作用相關的副作用。
文檔編號A61P25/00GK1200127SQ9619762
公開日1998年11月25日 申請日期1996年8月14日 優先權日1995年8月18日
發明者王五一 申請人:阿斯特拉公司