生物酶法破壁用於二十二碳六烯酸油脂生產方法
2023-10-05 00:11:34 1
專利名稱:生物酶法破壁用於二十二碳六烯酸油脂生產方法
技術領域：
本發明涉及利用寇氏隱甲藻[Crypthecodiniumcohnii (Se 1 igo) Javornicky]生產二十二碳六烯酸(DHA)油脂技術領域：
，具體地說是一種生物酶法破壁用於二十二碳六烯酸油脂生產方法。
背景技術：
近年來，多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids, PUFAs)對人類健康的重要作用已愈來愈受到人們的重視。其中，二十二碳六烯酸因其在人體和動物體內的重要生理功能而倍受人們的青睞。研究表明，DHA是人體某些組織中細胞膜的基本組分；對嬰幼兒視覺系統和神經系統的發育起著重要作用；還具有降低膽固醇作用，抗凝血功效以及抑制癌功效，防止老年性痴呆症等，並且它是幼魚生長所必需的一種脂肪酸。利用寇氏隱甲藻生產二十二碳六烯酸(DHA)油脂已形成工業化生產，二十二碳六烯酸的生產工藝在不斷改進。其中現在公開報導海洋微藻生產二十二碳六烯酸(DHA)油脂中藻細胞破壁方法有兩類。一類是物理方法破壁機械破壁如採用均質機或膠體磨等機械進行磨檫和擠壓使細胞壁破裂、乾燥法等。採用機械破壁方法細胞破壁不完全，用有機溶劑萃取收得率為總油60-70%。採用乾燥法耗時耗能，且加熱及通氣方法乾燥後提取油脂過氧化值較高，毛油品質較差，冷凍乾燥成本較高，乾燥後用有機溶劑萃取精煉後得率僅為毛油30-50%。
公開日為1995年4月5日、公開號為CN1101034A的專利申請公開的利用海洋微藻生產二十二碳六烯酸(DHA)油脂的方法是採用冷凍乾燥或加熱及通氣方法乾燥後進行提取。另一類是化學方法破壁；採用化學試劑破壞細胞壁結構，然後用有機溶劑萃取得到毛油。
公開日為 2007年6月27日，公開號為CN1986822A的專利申請公開的用寇氏隱甲藻發酵生產二十二碳六烯酸油脂的方法是採用加破壁劑如十二烷基硫酸鈉等，其用量為濃縮發酵液重量的 0.1-0.6%。這種方法得到油脂中會有化學試劑殘留，影響油的品質。且毛油質量較差，精煉後得率僅為毛油30-50%。
發明內容
本發明的目的是研製一種將酶法破壁用於寇氏隱甲藻[Crypthecodinium cohnii(Seligo)Javornicky]發酵生產二十二碳六烯酸油脂的方法，它大大地提高了二十二碳六烯酸(簡稱DHA)的收得率和毛油的品質。
本發明生物酶法破壁用於二十二碳六烯酸油脂生產方法，包括以寇氏隱甲藻 [Crypthecodinium cohnii (Seligo)Javornicky]為出發菌株，在液體培養基中連續培養寇氏隱甲藻得到海藻細胞，然後通過生物酶法破壁從海藻細胞中提取二十二碳六烯酸油脂。
本發明所用的寇氏隱甲藻菌種名稱是Crypthecodinium cohnii (Seligo) Javornicky。可以從包括ATCC(美國典型培養物收集中心)的保藏培養機構獲得。
生物酶分為主體酶和輔助酶；
主體酶為鹼性蛋白酶(2709)、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶，可以使用其中的一種或幾種，若為幾種，其比例可按任意比例配合使用。其用量為發酵液重量的0. 12-0.5%，若為濃縮發酵液，其用量按濃縮前發酵液重量計算；
輔助酶為胰蛋白酶、靡蛋白酶，纖維素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶，可以使用其中的一種或多種，若為多種，其比例可按任意比例配合使用。其用量為發酵液重量的0-0. 025%，若為濃縮發酵液，主體酶和輔助酶用量按濃縮前發酵液重量計算；
在使用時，單獨用主體酶或主體酶和輔助酶並用都可達到破壁。
本發明生物酶法破壁用於二十二碳六烯酸油脂生產方法在發酵液或過濾濃縮發酵液中加入主體酶，用量為發酵液重量的0. 12-0. 5%若為濃縮發酵液，其用量按濃縮前發酵液重量計算；輔助酶，用量為發酵液重量的0-0. 025%，若為濃縮發酵液，主體酶和輔助酶用量按濃縮前發酵液重量計算，升溫50-70°C，保溫攪拌3-9小時，加入95%的乙醇，乙醇用量為發酵液濃縮發酵液的30% -150%，加入有機溶劑量為發酵液或濃縮發酵液重量的1. 5-4. 5倍，進行萃取得到二十二碳六烯酸毛油。將二十二碳六烯酸毛油經水化、鹼煉、 脫色、脫臭後得到二十二碳六烯酸精煉油。
其中所述的有機溶劑為正己烷或氯仿等。
本發明所述的濃縮發酵液中主體酶和輔助酶的加入量，是以過濾濃縮發酵液前的發酵液量來計算的。
本發明生物酶法破壁用於二十二碳六烯酸油脂生產方法的優點是藻細胞破壁完全，破壁率為95%以上，不需要經過乾燥，可以防止二十二碳六烯酸毛油的氧化，使萃取油脂過氧化值極低，POV值在0.5以下，收得率為總油的90%以上，精煉得率為毛油的70%以上。 具體實施方式
實施例一
一種生物酶法破壁用於二十二碳六烯酸油脂生產方法採用寇氏隱甲藻斜面菌種進行液體搖瓶培養、液體搖瓶擴大培養、一級種子培養、二級種子培養和三級發酵培養，得到發酵液。在發酵液IOOkg中加入鹼性蛋白酶O709) 0. 2kg,升溫50-70°C，保溫攪拌3_9小時，加入95%的乙醇30kg，加入正己烷150kg，進行萃取得到二十二碳六烯酸毛油3kg。將二十二碳六烯酸毛油經水化、鹼煉、脫色、脫臭後得到二十二碳六烯酸精煉油2. 34kg。
實施例二
一種生物酶法破壁用於二十二碳六烯酸油脂生產方法採用寇氏隱甲藻斜面菌種進行液體搖瓶培養、液體搖瓶擴大培養、一級種子培養、二級種子培養和三級發酵培養，得到發酵液。在發酵液IOOkg中加入中性蛋白酶0. 35kg，升溫50-70°C，保溫攪拌3_9小時，加入95%的乙醇30kg，加入正己烷150kg，進行萃取得到二十二碳六烯酸毛油3kg。將二十二碳六烯酸毛油經水化、鹼煉、脫色、脫臭後得到二十二碳六烯酸精煉油2. 34kg。
實施例三
一種生物酶法破壁用於二十二碳六烯酸油脂生產方法採用寇氏隱甲藻斜面菌種進行液體搖瓶培養、液體搖瓶擴大培養、一級種子培養、二級種子培養和三級發酵培養，得到發酵液。在發酵液IOOkg中加入木瓜蛋白酶0. 45kg，升溫50-70°C，保溫攪拌3_9小時，加入95%的乙醇30kg，加入正已烷150kg，進行萃取得到二十二碳六烯酸毛油3kg。將二十二碳六烯酸毛油經水化、鹼煉、脫色、脫臭後得到二十二碳六烯酸精煉油2. 34kg。
4[0021]實施例四
一種生物酶法破壁用於二十二碳六烯酸油脂生產方法採用寇氏隱甲藻斜面菌種進行液體搖瓶培養、液體搖瓶擴大培養、一級種子培養、二級種子培養和三級發酵培養，得到發酵液。在發酵液IOOkg中加入鹼性蛋白酶(2709)0. 12kg，加入糜蛋白酶0.001kg，升溫50-70°C，保溫攪拌3-9小時，加入95%的乙醇30kg，加入正已烷150kg，進行萃取得到二十二碳六烯酸毛油3kg。將二十二碳六烯酸毛油經水化、鹼煉、脫色、脫臭後得到二十二碳六烯酸精煉油2. 34kg。
實施例五
一種生物酶法破壁用於二十二碳六烯酸油脂生產方法採用寇氏隱甲藻斜面菌種進行液體搖瓶培養、液體搖瓶擴大培養、一級種子培養、二級種子培養和三級發酵培養，得到發酵液。在發酵液IOOkg中加入中性蛋白酶0. Wkg，加入胰蛋白酶o.(^kg、靡蛋白酶共 0. 01kg，升溫50-70°C，保溫攪拌3-9小時，加入95%的乙醇60kg，加入氯仿200kg，進行萃取得到二十二碳六烯酸毛油3. ^g。將二十二碳六烯酸毛油經水化、鹼煉、脫色、脫臭後得到二十二碳六烯酸精煉油3. 04kg。
實施例六
一種生物酶法破壁用於二十二碳六烯酸油脂生產方法採用寇氏隱甲藻斜面菌種進行液體搖瓶培養、液體搖瓶擴大培養、一級種子培養、二級種子培養和三級發酵培養，得到發酵液，在離心濃縮發酵液IOOkg(發酵液離心前為400kg)中加入鹼性蛋白酶 0709)0. mcg，按纖維素酶葡聚糖酶木聚糖酶為1 3 1的比例加入纖維素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶共0. OMkg，升溫50-70°C，保溫攪拌3-9小時，加入95%的乙醇90kg，加入正已烷250kg，進行萃取得到二十二碳六烯酸毛油16. Okgo將二十二碳六烯酸毛油經水化、 鹼煉、脫色、脫臭後得到二十二碳六烯酸精煉油12kg。
實施例七
一種生物酶法破壁用於二十二碳六烯酸油脂生產方法採用寇氏隱甲藻斜面菌種進行液體搖瓶培養、液體搖瓶擴大培養、一級種子培養、二級種子培養和三級發酵培養， 得到發酵液，在離心濃縮發酵液IOOkg(發酵液離心前為400kg)中均等地加入中性蛋白酶和木瓜蛋白酶共OJkg，按胰蛋白酶靡蛋白酶纖維素酶為2 3 5的比例加入胰蛋白酶、靡蛋白酶、纖維素酶共0. OWkg，升溫50-70°C，保溫攪拌3-9小時，加入95%的乙醇 120kg，加入氯仿300kg，進行萃取得到二十二碳六烯酸毛油12.8kg。將二十二碳六烯酸毛油經水化、鹼煉、脫色、脫臭後得到二十二碳六烯酸精煉油9. 2kgo
實施例八
一種生物酶法破壁用於二十二碳六烯酸油脂生產方法採用寇氏隱甲藻斜面菌種進行液體搖瓶培養、液體搖瓶擴大培養、一級種子培養、二級種子培養和三級發酵培養， 得到發酵液，在離心濃縮發酵液IOOkg (發酵液離心前為450kg)中均等地加入鹼性蛋白酶 O709)和木瓜蛋白酶共OJkg，按胰蛋白酶靡蛋白酶纖維素酶葡聚糖酶為1 :4:1 的比例加入胰蛋白酶、靡蛋白酶、纖維素酶、葡聚糖酶共0. 02kg，升溫50-70°C，保溫攪拌 3-9小時，加入95 %的乙醇13^g，加入正已烷350kg，進行萃取得到二十二碳六烯酸毛油 14kg。將二十二碳六烯酸毛油經水化、鹼煉、脫色、脫臭後得到二十二碳六烯酸精煉油10kg。
實施例九[0032] 一種生物酶法破壁用於二十二碳六烯酸油脂生產方法採用寇氏隱甲藻斜面菌種進行液體搖瓶培養、液體搖瓶擴大培養、一級種子培養、二級種子培養和三級發酵培養，得到發酵液。在發酵液IOOkg中加入中性蛋白酶0. ^g，按胰蛋白酶靡蛋白酶纖維素酶 葡聚糖酶木聚糖酶為1 :2:1:1: 1的比例加入胰蛋白酶、靡蛋白酶，纖維素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶共0. 025kg,升溫50-70°C，保溫攪拌3-9小時，加入95%的乙醇150kg，加入氯仿450kg，進行萃取得到二十二碳六烯酸毛油3. 5kgo將二十二碳六烯酸毛油經水化、 鹼煉、脫色、脫臭後得到二十二碳六烯酸精煉油2. 6kgo
權利要求
1. 一種生物酶法破壁用於二十二碳六烯酸油脂生產方法，其特徵在於包括以寇氏隱甲藻[Crypthecodinium cohnii (Seligo) Javornicky]為出發菌株，在液體培養基中連續培養寇氏隱甲藻得到海藻細胞，然後通過生物酶法破壁從海藻細胞中提取二十二碳六烯酸油脂；所述生物酶法是在發酵液或過濾濃縮發酵液中加入主體酶和輔助酶，升溫50-70°C， 保溫攪拌3-9小時，加入95%的乙醇，乙醇用量為發酵液的30% -150%，加入有機溶劑進行萃取得到二十二碳六烯酸毛油；將二十二碳六烯酸毛油經水化、鹼煉、脫色、脫臭後得到二十二碳六烯酸精煉油；所述主體酶為鹼性蛋白酶2709、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一種或幾種，若為幾種，其比例可按任意比例配合使用；輔助酶為胰蛋白酶、靡蛋白酶，纖維素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶中的一種或多種，若為多種，其比例按任意比例配合使用；所述主體酶用量為發酵液重量的0. 12-0. 5%;輔助酶用量為發酵液重量的0-0. 025%，若為濃縮發酵液，所述主體酶和輔助酶用量均按濃縮前發酵液重量計算。
專利摘要
一種生物酶法破壁用於二十二碳六烯酸油脂生產方法，包括以寇氏隱甲藻[Crypthecodinium cohnii(Seligo)Javornicky]為出發菌株，在液體培養基中連續培養寇氏隱甲藻得到海藻細胞，然後通過生物酶法破壁從海藻細胞中提取二十二碳六烯酸油脂。其優點是藻細胞破壁完全，破壁率為95％以上，不需要經過乾燥，可以防止二十二碳六烯酸毛油的氧化，使萃取油脂過氧化值極低，POV值在0.5以下，收得率為總油的90％以上，精煉得率為毛油的70％以上。
文檔編號C12R1/89GKCN101307341 B發布類型授權 專利申請號CN 200810047859
公開日2012年1月4日 申請日期2008年5月29日
發明者過群 申請人:羅蓋特生物營養品(武漢)有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (3), 非專利引用 (2),