一株產過氧化氫酶菌株及利用該菌株以檸檬酸為碳源發酵產酶的方法
2023-10-10 07:51:54 1
專利名稱：：一株產過氧化氫酶菌株及利用該菌株以檸檬酸為碳源發酵產酶的方法
技術領域：
：本發明利用一株高產過氧化氫酶的粘質沙雷菌株(Serratiamarcescens)SYBC08及利用該菌株以檸檬酸為碳源發酵生產過氧化氫酶的方法，所製備的酶能被應用於食品和工業廢水處理等方面，屬於生物
技術領域：
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背景技術：
：過氧化氫是一種很強的氧化劑，一直以來應用於食品工業作為殺菌劑和半導體工業作為矽片的洗滌劑。近年來過氧化氫被用於工業廢水處理中，其中最常用於含硫、含酚和含氰化物廢水的處理，以及氣體的洗滌、脫氯等。2006年，過氧化氫全世界的消費量大約220萬噸，這是20年前的2倍。但過氧化氫在工業產品和排放物中的殘留可能會引起人的身體健康惡化和環境汙染。過氧化氫酶(CAT)能有效地催化過氧化氫分解為無毒的水和氧氣，並且酶本身沒有害。另外在處理工業廢水中，H2O2中添加CAT可以促進降解芳環化合物和脂族化合物，H2O2中添加CAT處理生物過濾器，還可提高其對廢水脫臭效果。因此極大的刺激了微生物發酵產過氧化氫酶的研究熱情。過氧化氫酶廣泛存在於需氧微生物中，目前國外已經用不同種屬的菌株發酵生產過氧化氫酶(見表1)。國內發酵法生產過氧化氫酶所涉及菌株和方法產酶活力低且成本較高。表1不同過氧化氫酶菌株發酵產過氧化氫酶的情況時間國家和科研單位丨菌株生產規模酶活力來源—2005阿爾及禾Ij17Aspergillus搖瓶102U/mlBiotechnol.MentouridephoenicisAgron.Soc.Constantine大學Environ.1991S~±~PenicilliumSSif735.OU/mlEnzymeMicrob.Basilicata大學variabile(P16)Technol.,1999E|]度，中央食品Saccharomyces搖瓶5616U/LProcess技術研究所cereisiaeBiochemistry1991希臘，國家~~技術ALTERNARIA搖瓶546.42U/mlBiotechnology__ALTERWATA___Letters_1999Ep度，中央食品Saccharomyces搖瓶165-2277U/mlBiotechnology技術研究所cereisiaeTechniquestableseeoriginaldocumentpage4
發明內容本發明的目的是利用一株高產過氧化氫酶的粘質沙雷菌株(Serratiamarcesces)SYBC08及利用該菌株以檸檬酸為碳源發酵生產過氧化氫酶的方法，所製備的過氧化氫酶可廣泛應用於食品工業和工業廢水處理等方面，來替代價格昂貴的進口的過氧化氫酶。本發明的技術方案一株高產過氧化氫酶的沙雷氏菌屬菌株，其分類命名為粘質沙雷菌(Serratiamarcesces)SYBC08，已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC3449。用CGMCC3449菌株為出發菌種，經種子培養和利用檸檬酸為碳源發酵產過氧化氫酶；工藝為⑴種子培養種子培養基以質量體積濃度計2%葡萄糖，蛋白腖，0.5%氯化鈉，0.5%牛肉膏；培養條件從平板上括取兩環菌種於包含50mL培養基的250mL三角瓶中進行培養，PH7.0，溫度30°C，轉速200r/min，培養時間12h；⑵產酶培養產酶培養基以質量體積濃度計6%玉米漿粉，6%檸檬酸；發酵條件再以2%-4%的接種量，進行5L發酵罐發酵，pH6.08.0，溫度2836°C，發酵時間2436h，轉速200600r/min，通氣量1.52.0L/min/L。根據上述條件，在5L發酵罐中進行發酵，發酵液的過氧化氫酶活力最高達20000U/mL以上。本發明從不同環境條件下的土壤中篩選出一株高產過氧化氫酶沙雷氏菌屬菌株，分類命名為粘質沙雷菌(Serratiamarcesces)SYBC08。1、本菌株的篩選和菌種鑑定1.1採集大量不同環境條件下的土壤樣品，製備成土壤懸浮液，適量加到已經滅菌的LB液體培養基中，靜置放於30°C的溫箱中24h，加入過氧化氫達到最終濃度分別為IOOmM和500mM，均處理1小時。再靜置培養24h，對培養液進行無菌稀釋適當倍數，塗布於平板。挑選單菌落進行斜面保持。1.2直接將採集到大量不同環境條件下的土壤樣品，用無菌水稀釋適當倍數，塗布於LB基平板中。用鉬絲挑取單菌落浸入滴有3%過氧化氫的載玻片上，選取起泡明顯的菌株進行斜面保存。1.3將兩種方法篩選到的菌株，用LB培養基，進行液體搖瓶發酵。最終篩選到一株過氧化氫活力相對較高的菌株(圖1)，經生理生化(見表2)和電鏡(圖2.)，16SrDNA序列鑑定(見序列SEQIDNO1)並編號確定為粘質沙雷菌SYBC08(SerratiamarcescesSYBC08)。表2.SerratiamarcescesSYBC08生理生化鑑定結果tableseeoriginaldocumentpage5注「+」表示陽性，「_」表示陰性，d表示11%-89%菌株陽性。2、酶活的測定方法3mL反應體系中包括粗酶液0.ImL,0.lmol/LNa2HPO4-NaH2PO4緩衝液(pH7.0)2.4mL,0.12mol/LH2O2溶液0.5mL(新鮮配製)。以去離子水替代H2O2溶液作為空白對照，以波長240nm體系下吸光度的下降來衡量過氧化氫的酶促降解速度。每隔IOs讀取一次吸光度值，一般持續進行Imin後停止測定，以反應的線性範圍計算酶活，一個標準酶活力(IU)定義為在最適溫度下，每分鐘分解IyHiolH2O2所需的酶量。本發明的有益效果首先提供了一株高產過氧化氫酶的菌株及用該菌為出發菌株採用液體發酵製備過氧化氫酶的方法。本發明的菌種和發酵產酶方法與其它菌種和製備過氧化氫酶方法相比較，具有酶活力高，發酵時間短和成本低的特點，且所生產出來的過氧化氫酶可廣泛使用於食品工業和工業廢水處理等方面，並可替代價格昂貴的進口過氧化氫酶，因此本發明的菌種和發酵產酶技術有廣泛的工業使用價值和顯著的經濟效益前景。圖1粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)SYBC08平板菌落。圖2粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)SYBC08透射電鏡形態。生物材料樣品保藏粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)SYBC08，已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2009年11月16日，保藏編號為CGMCC3449。具體實施例方式實施例1從斜面上挑取單菌落，劃線於LB培養基中，將平板置於30°C培養箱培養24h。從平板上括取兩環菌種於包含50mL培養基的250mL三角瓶進行培養。培養條件pH7.0，培養時間12h，溫度30°C，搖瓶轉速200r/min，再以2%接種量接種進行發酵罐試驗。5L發酵罐進行發酵試驗發酵條件為控制pH為8.0，培養時間24h，溫度28°C，轉速200rpm，通氣量2.0L/min/L，發酵液酶活力達19001.13U/mL。種子培養基如上所述。產酶培養基為玉米漿粉，檸檬酸。實施例2從斜面上挑取單菌落，劃線於LB培養基中，將平板置於30°C培養箱培養24h。從平板上括取兩環菌種於包含50mL培養基的250mL三角瓶進行培養。培養條件pH7.0，培養時間12h，溫度30°C，搖瓶轉速200r/min，再以3%接種量接種進行發酵罐試驗。5L發酵罐進行發酵試驗發酵條件為控制PH6.0，培養時間3011，溫度361，轉速60011)111，通氣量2.OL/min/L，發酵液酶活力達16001.25U/mL。種子培養基如上所述。產酶培養基為3%玉米漿粉，3%檸檬酸。實施例3從斜面上挑取單菌落，劃線於LB培養基中，將平板置於30°C培養箱培養24h。從平板上括取兩環菌種於包含50mL培養基的250mL三角瓶進行培養。培養條件pH7，培養時間12h，溫度30°C，搖瓶轉速200r/min，再以4%接種量接種進行發酵罐試驗。5L發酵罐進行發酵試驗發酵條件為控制pH為7.0，培養時間36h，溫度32.8°C，轉速400rpm，通氣量1.5L/min/L，發酵液酶活力達20029.31U/mL。種子培養基如上所述。產酶培養基為6%玉米漿粉，6%檸檬酸。序列表SEQIDNO11533DNA粘質沙雷菌(Serratiamarcesces)SYBC081agagttgatcatggctcagattgaacgctggcggcaggcttaacacatgcaagtcgagcg60gtagcacaggggagcttgctccctgggtgacgagcggcggacgggtgagtaatgtctggg120aaactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataacgtcgc180aagaccaaagagggggaccttcgggcctcttgccatcagatgtgcccagatgggattagc240tagtaggtggggtaatggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgacc300agccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatatt360gcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttcgggttg420taaagcactttcagcgaggaggaaggtggtgaacttaatacgttcatcaattgacgttac480tcgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaag540cgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtttgttaagtcagatgtgaa600atccccgggctcaacctgggaactgcatttgaaactggcaagctagagtctcgtagaggg660gggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcga720aggcggccccctggacgaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggat780tagataccctggtagtccacgctgtaaacgatgtcgatttggaggttgtgcccttgaggc840gtggcttccggagctaacgcgttaaatcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaa900actcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgca960acgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaactttccagagatggattggtgcc1020ttcgggaactctgggacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgg1080gttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcggttcggccgggaact1140caaaggagactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggc1200ccttacgagtagggctacacacgtgctacaatggcatatacaaagagaagcgacctcgcg1260agagcaagcggacctcataaagtatgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactcc1320atgaagtcggaatcgctagtaatcgtagatcagaatgctacggtgaatacgttcccgggc1380cttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaac1440cttcgggagggcgcttaccactttgtgattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtaa1500ccgtaggggaacctgcggctggatcacctcctt153權利要求一株產過氧化氫酶的沙雷氏菌屬菌株，其分類命名為粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)SYBC08，已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC3449。2.用權利要求1所述的菌株發酵生產過氧化氫酶的方法，其特徵在於用CGMCC3449菌株為出發菌種，經種子培養和利用檸檬酸為碳源發酵產過氧化氫酶；工藝為(1)種子培養種子培養基以質量體積濃度計2%葡萄糖，蛋白腖，0.5%氯化鈉，0.5%牛肉膏；培養條件從平板上括取兩環菌種於包含50mL培養基的250mL三角瓶中進行培養，pH7.0，溫度300C，轉速200r/min,培養時間12h；(2)產酶培養產酶培養基以質量體積濃度計6%玉米漿粉，6%檸檬酸；發酵條件再以2%-4%的接種量，進行5L發酵罐發酵，pH6.08.0，溫度2836°C，發酵時間2436h，轉速200600r/min，通氣量1.52.OL/min/L。全文摘要一株產過氧化氫酶菌株及利用該菌株以檸檬酸為碳源發酵產酶的方法，屬於生物
技術領域：
。本發明提供了一株高產過氧化氫酶的菌株粘質沙雷氏菌(SerratiamarcescensSYBC08)，已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC3449。同時還發明了以該菌為出發菌種，經種子培養和以檸檬酸為碳源產酶發酵生產過氧化氫酶的技術，發酵液最高酶活可達20000U/mL以上。所產過氧化氫酶可廣泛應用於食品、工業廢水處理等領域。文檔編號C12N1/20GK101805709SQ20091023430公開日2010年8月18日申請日期2009年11月24日優先權日2009年11月24日發明者廖祥儒,張峰,曾化偉,蔡宇傑申請人:江南大學