一種用於抑制簇集蛋白基因表達的成套siRNA及其應用的製作方法

2023-10-10 20:41:54 1

本發明涉及分子生物學領域，尤其涉及一種用於抑制簇集蛋白基因表達的成套siRNA及其應用。
背景技術：
：RNAi廣泛存在於自然界的物種中，自AndrewFire和CraigMello等人1998年在線蟲(Caenorhabditiselegans)中首次發現RNAi現象，Tuschl和PhilSharp等人2001年證實在哺乳動物中也存在RNAi之後，關於RNAi的機制原理、基因功能和臨床應用等研究取得了一系列的進展；RNAi不僅在防禦病毒感染，防轉座子跳躍等多種機體保護機制中發揮關鍵作用(Huntvagneretal,2001；Tuschl,2001；Waterhouseetal,2001；Zamore2001)，其相關產品也是十分有前景的候選藥物。簇集蛋白(Clusterin，CLU)是異二聚體硫酸糖蛋白(sulfatealglycoprotein，SGP-2)，最早於1983年在睪丸液中分離出來，其後發現CLU廣泛存在於人類及動物的許多組織中，如：睪丸、附睪、腎臟、心臟、肺臟、子宮、卵巢、乳腺及前列腺，也幾乎存在於包括血漿、乳汁、尿液、腦脊液和精液等所有體液中。其中，其在睪丸、附睪、肝、腎等臟器表達較高。簇集蛋白是一種多功能蛋白，參與多種生理生化過程，如介導細胞聚集、參與脂質交換和運輸、穩定細胞膜、促進生殖功能等；最近發現，其在細胞周期調節、細胞凋亡、DNA損傷，細胞黏附，組織重塑中也起到重要作用。由於選擇性剪接的結果，Clusterin有兩種主要的亞型：分泌型Clusterin(sCLU)和核型Clusterin(nCLU)。sCLU是Clusterin的主要形式，其具有細胞保護作用，是一種相對分子量為76-80ku的糖基化蛋白。研究發現簇集蛋白的分泌型蛋白質(sCLU))在EMT(上皮至間充質轉變)期間受到刺激，並且本身可以促進EMT過程(Lenferink,A.E.,C.Canti等人(2009).「TranscriptomeProfilingofaTGF-beta-inducedepithelial-to-mesenchymaltransitionrevealsextracellularclusterinasatargetfortherapeuticantibodies.」Oncogene29:831)，而EMT會導致腫瘤侵襲和化療抗性。用能與sCLU中特定區域相互作用的寡核酸阻斷EMT，可導致腫瘤生長抑制和針對細胞毒藥物的反應增加。Clusterin在腫瘤的發生和發展中可能起著重要的作用(Oncogene.，2004，23，2298-304)，對其抑制劑的開發有利於對Clusterin相關疾病(如腫瘤)的機制研究與藥物研製。技術實現要素：本發明的一個目的是提供一種抑制或降低靶基因CLU表達的siRNA。本發明提供的siRNA，由正義鏈和與其完全反向互補的反義鏈組成；所述正義鏈由19-27個核苷酸組成，且所述正義鏈從5』末端起5-9個連續核苷酸和從3』末端起5-9個連續核苷酸均進行2＇－核糖修飾；所述反義鏈與所述靶基因CLU上的區段反向互補。抑制率至少為65％，70％，75％，80％，85％，90％。siRNA通過其反義鏈與靶基因CLU上的靶序列反向互補結合；上述siRNA中，所述正義鏈由24、25或26個核苷酸組成；或，所述正義鏈從5』末端起6或7或8個連續核苷酸和從3』末端起6或7或8個連續核苷酸均進行2＇－核糖修飾。上述siRNA中，所述2＇－核糖核糖修飾為2＇-O-甲基修飾、2＇-O－氟代修飾、2＇-脫氧修飾或2＇-MOE修飾。所述siRNA為如下任一種：1)所示的siRNA由序列1所示的正義鏈和序列2所示的反義鏈組成，且序列1自5』末端起7個連續核苷酸和從3』末端起7個連續核苷酸均進行2＇-O-Me修飾；2)所示的siRNA由序列3所示的正義鏈和序列4所示的反義鏈組成，且序列3自5』末端起7個連續核苷酸和從3』末端起7個連續核苷酸均進行2＇-O-Me修飾；3)所示的siRNA由序列5所示的正義鏈和序列6所示的反義鏈組成，且序列5自5』末端起7個連續核苷酸和從3』末端起7個連續核苷酸均進行2＇-O-Me修飾；4)所示的siRNA由序列7所示的正義鏈和序列8所示的反義鏈組成，且序列7自5』末端起7個連續核苷酸和從3』末端起7個連續核苷酸均進行2＇-O-Me修飾；5)所示的siRNA由序列9所示的正義鏈和序列10所示的反義鏈組成，且序列9自5』末端起7個連續核苷酸和從3』末端起7個連續核苷酸均進行2＇-O-Me修飾；6)所示的siRNA由序列11所示的正義鏈和序列12所示的反義鏈組成，且序列11自5』末端起7個連續核苷酸和從3』末端起7個連續核苷酸均進行2＇-O-Me修飾；7)所示的siRNA由序列13所示的正義鏈和序列14所示的反義鏈組成，且序列13自5』末端起7個連續核苷酸和從3』末端起7個連續核苷酸均進行2＇-O-Me修飾；8)所示的siRNA由序列15所示的正義鏈和序列16所示的反義鏈組成，且序列15自5』末端起7個連續核苷酸和從3』末端起7個連續核苷酸均進行2＇-O-Me修飾；9)所示的siRNA由序列17所示的正義鏈和序列18所示的反義鏈組成，且序列17自5』末端起7個連續核苷酸和從3』末端起7個連續核苷酸均進行2＇-O-Me修飾；10)所示的siRNA由序列19所示的正義鏈和序列20所示的反義鏈組成，且序列19自5』末端起7個連續核苷酸和從3』末端起7個連續核苷酸均進行2＇-O-Me修飾。本發明另一個目的是提供一種抑制或降低靶基因CLU表達的成套siRNA。抑制率至少為70％、75％、80％、85％、90％。本發明提供的成套siRNA，包括至少5個上述的siRNA。上述成套siRNA中，所述成套siRNA中任2個siRNA的物質的量比為1:1-1:5；或，所述成套siRNA中各siRNA為等物質的量比混合。上述成套siRNA中，所述成套siRNA由上述的siRNA中的1)所示的siRNA-7)所示的siRNA共7個siRNA組成；或，所述成套siRNA由上述的siRNA中的2)所示的siRNA-7)所示的siRNA共6個siRNA組成；或，所述成套siRNA由上述的siRNA中的1)所示的siRNA、2)所示的siRNA、4)所示的siRNA、5)所示的siRNA和7)所示的siRNA共5個siRNA組成；或，所述成套siRNA由上述的siRNA中的1)所示的siRNA-10)所示的siRNA共10個siRNA組成。本發明第三個目的是提供如下1)或2)的物質。本發明提供的如下1)或2)的物質：1)抑制或降低靶基因CLU表達的試劑，其為如下A或B：A包括上述的siRNA和轉染試劑；B包括上述的成套siRNA和轉染試劑；2)抑制或降低靶基因表達的試劑盒，其包括上述的siRNA或上述的成套siRNA或所述試劑。上述物質中，所述成套siRNA中所有siRNA分子在所述試劑中的總濃度為2-100nM。上述的siRNA或上述的成套siRNA或上述的物質在抑制或降低靶基因CLU表達中的應用也是本發明保護的範圍；或上述的siRNA或上述的成套siRNA或上述的物質在抑制或降低細胞中靶基因CLU表達中的應用也是本發明保護的範圍；或上述的siRNA或上述的成套siRNA或上述的物質在製備抑制或降低靶基因CLU表達產品中的應用也是本發明保護的範圍；或上述的siRNA或上述的成套siRNA或上述的物質在製備抑制或降低細胞中靶基因CLU表達中產品的應用也是本發明保護的範圍；或上述的siRNA或上述的成套siRNA或上述的物質在製備預防或緩解或治療由靶基因CLU表達引起的疾病中的產品中的應用也是本發明保護的範圍。本發明第四個目的是提供一種抑制或降低靶基因CLU表達的方法。本發明提供的方法，包括如下步驟：將抑制或降低靶基因CLU表達的siRNA的正義鏈從5』末端起5-9個連續核苷酸和從3』末端起5-9個連續核苷酸均進行2＇－核糖修飾；所述siRNA由正義鏈和與其反向互補的反義鏈組成；所述正義鏈由19-27個核苷酸組成；所述反義鏈與所述靶基因上的區段反向互補；或所述2＇－核糖修飾具體為2＇-O-甲基修飾、2＇-O-氟代修飾、2＇-脫氧修飾或2＇-MOE修飾。本發明第四個目的是提供一種產品。本發明提供的產品，包括上述的siRNA或上述的成套siRNA或上述的物質；和/或，所述產品具有如下1)-3)中至少一種功能：1)抑制或降低CLU基因表達；2)抑制或降低細胞中CLU基因表達；3)預防或緩解或治療由CLU基因表達引起的疾病；或，所述細胞為真核生物細胞或原核生物細胞；或，所述細胞具體為細胞為脊椎動物細胞、哺乳類動物細胞、靈長類動物細胞、人類細胞，靶基因異常表達或有基因缺陷癌細胞、腫瘤細胞、炎性細胞、血液細胞、白細胞、腦細胞、肝細胞、肺細胞、腎細胞、乳腺細胞、宮頸細胞、內皮細胞、神經細胞或神經膠質細胞；或，所述細胞具體為HeLa、293T、A549或HUVEC細胞；或，所述產品具體為藥物。本發明的「抑制」或類似表達可指RNA或蛋白水平或相關生化指標的表達、活性或指標相對陰性對照的降低。siRNA分子混合物中單個siRNA分子的濃度可以是隨機的，優選其最低濃度和最高濃度的siRNA的濃度為1：1至1：5，更優選單個siRNA分子的濃度相等。本發明是通過向細胞引入siRNA分子或其混合物，抑制靶基因的表達；引入可以為直接引入或間接引入，除使用轉染試劑外，其他已知的各種將siRNA分子遞送如細胞的方式都可採用，如注射、載體轉染(載體可以是質粒或病毒)、電穿孔，脂質體轉染。本發明的siRNA分子是指小的單鏈或雙鏈RNA分子,其具備至少一個雙鏈區，通過siRNA作用，促進靶向mRNA的降解。「互補」是指核鹼基之間配對的能力。本發明中也可用鹼基或鹼基長度來表示核苷酸或RNA分子鏈的長度。在發明的一些實施例中,siRNA分子中至少包括一個非天然的核苷酸，如經化學修飾的核苷酸，優選在正義鏈或正義區的化學修飾；正義鏈或正義區是指與反義鏈或反義區互補形成雙鏈結構的一段連續的核苷酸鏈，反義鏈或反義區是指在RNAi作用中，與靶mRNA互補結合的一段連續的核苷酸鏈。在一些實施例中，核糖的2』-位修飾具體為2』-甲氧基修飾，2』-氟代修飾，2』-脫氧修飾，2』-MOE修飾。在一些實施例中，正義鏈的5末端的第1-10位和/或3末端的第1-10位任選1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個核苷酸經過修飾。在一些實施例中，正義鏈的5末端的第1-7位的核苷酸和3末端的第1-7位的核苷酸經過修飾。本發明的正義鏈修飾可起到：(1)增強siRNA分子穩定性；(2)減少siRNA分子脫靶性；(3)提高siRNA分子特異性；(4)減少免疫激活反應等作用。所述「特異性」指siRNA與靶mRNA間具有必要程度的互補性以誘導靶基因的抑制，而對非mRNA無抑制作用或僅有極小的抑制作用。siRNA分子混合物優選固相合成法獲得，也可通過轉錄法或其他方法合成。在一個方案中，涉及本發明的siRNA分子或其混合物在抑制細胞中靶基因表達的用途，所述靶細胞可以為真核生物細胞或原核生物細胞，真核生物細胞包括哺乳動物細胞細胞，優選嚙齒類動物細胞、靈長類動物細胞、人類細胞；細胞可以來源於多種組織或器官，如血液，淋巴，骨髓，腦，血管，肝，肺，骨，乳腺，軟骨，宮頸，結腸，角膜，胚胎，腎，肌肉，卵巢，胰腺，前列腺，皮膚，腸，脾，胃等；細胞種類可為多種，包括脂肪細胞，成纖維細胞，肌細胞，心肌細胞，內皮細胞，上皮細胞，神經細胞，神經膠質細胞，血細胞，巨核細胞，淋巴細胞，巨噬細胞，中性粒細胞，嗜酸性粒細胞，嗜鹼性粒細胞，肥大細胞，粒細胞，角化細胞，軟骨細胞，成骨細胞，破骨細胞，肝細胞；或是處於病理狀態的細胞，如癌細胞、腫瘤細胞、炎症細胞、有基因缺陷的細胞(如染色體異常或基因突變)。優選靶細胞中的靶基因表達，更優選靶細胞中的靶基因高水平表達。在一個方案中，所述細胞為為癌細胞，所述癌是前列腺癌、乳腺癌、骨肉瘤，子宮內膜癌、卵巢癌、肝細胞癌、結直腸癌、頭頸癌、膀胱癌、唾液腺癌，肺癌、胰腺癌或腎細胞癌；優選所述細胞為HeLa、293T、A549、HUVEC細胞。本發明設計合成的用於幹擾CLU基因的成套siRNA其優勢在於：(1)上述siRNA分子混合物均能有效抑制靶基因表達，所有的siRNA分子混合物均能確保70％以上的抑制效率，且所述siRNA分子混合物中的siRNA分子序列不需特殊設計，通過在線工具或其他常規技術均可獲得；而在現有技術中，不是所有設計的siRNA分子都能達到抑制基因表達的效果，一般設計的siRNA僅有50％的概率能抑制靶基因表達，僅25％的siRNA能達到75％以上的抑制效果，後續還需對siRNA進行篩選、優化，或對其效果進行實驗驗證，費時耗力；(2)解決了在不同細胞系中、不同轉染試劑處理時，siRNA作用不一致的問題，可在多個細胞系中有效沉默靶基因，並且不受轉染試劑的影響；(3)增強了siRNA分子的基因沉默效果，siRNA分子間存在協同增效效應。(4)降低了siRNA分子的脫靶效應。綜上，上述siRNA分子混合物提高了寡核酸抑制基因表達的概率；整體上提升了抑制效率；同時降低了脫靶效應；且其在應用過程中，省去了前期對單一RNAi分子的複雜設計、篩選、驗證與優化的過程，操作簡單、節省成本。是一種通用、有效、快速的RNAi工具。附圖說明圖1為siRNA體外穩定性測定結果。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、成套siRNA的製備1、設計原則設計的所有單個siRNA均靶向靶基因CLU(如表1),設計方法參照Elbashiretal.2002；Paddisonetal.2002；Reynoldsetal.2004；Ui-Teietal.2004等人的方法(Elbashir,S.M.,Harborth,J.,Weber,K.,andTuschl,T.2002.AnalysisofgenefunctioninsomaticmammaliancellsusingsmallinterferingRNAs.Methods26:199–213；Paddison,P.J.,Caudy,A.A.,Bernstein,E.,Hannon,G.J.,andConklin,D.S.2002.ShorthairpinRNAs(shRNAs)inducesequence-specificsilencinginmammaliancells.Genes&Dev.16:948–958；Reynolds,A.,Leake,D.,Boese,Q.,Scaringe,S.,Marshall,W.S.,andKhvorova,A.2004.RationalsiRNAdesignforRNAinterference.Nat.Biotechnol.22:326–330；Ui-Tei,K.,Naito,Y.,Takahashi,F.,Haraguchi,T.,Ohki-Hamazaki,H.,Juni,A.,Ueda,R.,andSaigo,K.2004.GuidelinesfortheselectionofhighlyeffectivesiRNAsequencesformammalianandchickRNAinterference.NucleicAcidsRes.32:936–948)。為保證siRNA的特異性，使用BLAST(BasicLocalAlignmentSearchToo，http://www.ncbi.nlm.gov))分析序列同一性(identity)，選擇與其他序列同一性最小的序列。成套siRNA由5-10個siRNA分子組成；每個siRNA由25個核苷酸組成的SS正義鏈和與其反向互補的反義鏈AS組成，且為平末端；每個siRNA通過其反義鏈與靶基因上的靶序列互補結合；AS鏈和SS鏈完全反向互補，AS鏈與靶基因完全互補，SS的從5』末端起7個連續核苷酸和從3』末端起7個連續核苷酸均經過2＇-O-Me修飾。靶基因如表1所示。表1為靶基因靶基因名稱登錄號CLU簇集蛋白NM_0018312、設計合成靶基因對應的成套siRNA表1所示的靶基因對應的siRNA的名稱如表2所示，具體序列如表3所示。表2siRNA分子混合物組成表3siRNA分子混合物序列表上述表中，mA、mU、mC和mG分別為2＇-O-Me修飾後A、2＇-O-Me修飾後U、2＇-O-Me修飾後C和2＇-O-Me修飾後G。分別將上述成套siRNA組RM-2(7個siRNA混合)、RM-3(6個siRNA混合)、RM-1(5個siRNA混合)、RM-6(10個siRNA混合)中的每個siRNA按照分組要求混合，其中，RM-2混合物中所有siRNA分子的總濃度為100nM，且每個siRNA分子為等物質的量比混合。實施例2、成套siRNA抑制靶基因表達的研究一、不同細胞系中成套siRNARM-2的抑制效果比較分別將4種不同的細胞系(293T,HeLa,A549與HUVEC(ATCC)接種在細胞培養板中培養24h後觀察細胞，狀態良好開始轉染。表4細胞系來源細胞系名稱來源293T人胚腎細胞ATCCHeLa宮頸癌細胞ATCCA549非小細胞肺癌細胞ATCCHUVEC人臍靜脈內皮細胞ATCC50μLriboFECT轉染體系：5μLriboFECTTMCPReagent(廣州市銳博生物科技有限公司，C10511-05)、5μL實施例1製備的成套siRNA組RM-2(所有siRNA的總濃度為100nM)和40μLriboFECTTMCPBuffer(廣州市銳博生物科技有限公司，C10511-05)。100μLLF2K轉染體系：1μLLF2K(Invitrogen，11668019)，5μL實施例1製備的成套siRNA組RM-2(所有siRNA的總終濃度為100nM)和94μLOpti-MEM細胞培養基(ThermoFisherScientific，31985070)。細胞培養板的每個孔中加入上述50μLriboFECT轉染體系或100μLLF2K轉染體系，得到轉染後的不同細胞系。轉染48h後，收集轉染後不同細胞系，Trizol法提取RNA，ReverseTranscriptionmix反轉錄試劑盒用於反轉錄(廣州市銳博生物科技有限公司，C10170)得到轉染後不同細胞系的cDNA。以轉染後不同細胞系的cDNA為模板，用H-CLU-F和H-CLU-R引物進行RT-PCR擴增，以人的看家基因actin作為內參基因(Forward:5-TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG-3；Reverse:5-ACATCTGCTGGAAGGTGGACA-3)，利用Real-timePCR試劑盒SYBRPremix(2×)(BIO-RAD750000131)進行實時螢光定量PCR反應。一個樣品的9個重複(每個單獨的樣品在轉染時有3個重複，在qPCR時每個重複做3個復孔)的Ct誤差在±0.5，然後用CFX2.1進行相對定量分析。SPSS19.0數據統計軟體數據分析，表中數據為其平均值，P值均<0.05。NC陰性對照組：轉染的siRNA為無關非特異siRNA，5'UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT3'5'ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT3'；N空白對照組：正常細胞，無siRNA轉染。H-CLU-F：CAAGGCGAAGACCAGTACTATC；H-CLU-R：CAGTGACACCGGAAGGAACReal-TimePCR抑制率計算方式：結果如表5所示：表5為不同細胞系中RM-2的抑制率(％)比較結果表明，相對NC陰性對照組對照(表達水平為1)，針對不同的靶基因，在不同的細胞系中，使用不同的轉染試劑，RM-2混合物均能達到70％以上的抑制效果。二、HeLa細胞中RM-2混合物與單個siRNA分子的靶基因抑制效率比較方法與上述一相同，不同的是將實施例1製備的成套siRNA組RM-2轉染HeLa細胞。以轉染RM-2中單個siRNA為對照。抑制率(％)結果如表6所示。表6HeLa細胞中RM-2與單個siRNA的抑制率(％)比較簡稱RM-2D1D2D3D4D5D6D7CLU9082888586919273上述表中的D1-D7分別為每個靶基因對應的7個siRNA,RM-2為靶基因CLU對應的7個siRNA的混合樣品。結果表明，針對靶基因CLU，RM-2混合物抑制效果(抑制率)大於90％；且與其相同濃度的7個單個siRNA分子相比，起到了協同增效的作用。三、不同組的成套siRNA轉染HeLa細胞的抑制效果比較比較不同成套siRNA組在HeLa細胞中抑制效果。方法與上述一相同，不同的是將實施例1製備的CLU對應的成套siRNA組RM-1、RM-2、RM-3、RM-6分別轉染HeLa細胞。結果如表7所示，表7不同siRNA條數混合而成的siRNA混合物siRNA混合物RM-1RM-2RM-3RM-6抑制率(％)79838991結果表明，混合物RM-1、RM-2、RM-3、RM-6均能起到高效抑制多種基因表達的作用。實施例3、體外穩定性測定將siRNARB-CLU-D6經無RNA酶水稀釋至5μM後加入等體積的新鮮大鼠血清(為上海遠慕生物科技有限公司產品),然後在37℃孵育6小時，取樣進行電泳觀察siRNA的完整性。結果如圖1所示，本發明的siRNA在血清中穩定，預計其在體內具有更好的效力。其它RB-CLU-Dx(x為D1-D10)，其實驗結果相同，具體圖省略。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp