一種提高桑黃活性成分含量的方法與流程
2023-10-10 13:19:44
本發明涉及中藥材，尤其涉及一種提高桑黃活性成分含量的方法。
背景技術：
桑黃是我國珍稀的藥用真菌。桑黃別名猢猻眼、桑耳、桑臣等，是一種珍貴的大型藥用真菌，其子實體可入藥。因寄生於桑樹而得名，桑黃在我國分布較廣，主要生長在我國華北、東北、西北及四川、雲南等地，在韓國和日本等一些東亞國家也均有生長，被譽為「森林黃金」，具有野生子實體數量少，人工栽培難度高的特點。傳統中醫藥學將桑黃運用在血崩、血淋、閉經等疾病。現代藥理學研究表明，桑黃在抗癌方面效果顯著，除此之外，還有抗肺炎、降血脂、抗氧化以及保護肝臟等作用。是當今醫藥和食品工業共同研究和關注點。
隨著桑黃藥用價值的深入研究，市場對於桑黃的需求量逐年增加，造成了對桑黃子實體的破壞性開採，對於產地的保護意識淡薄，造成了子實體難以成型，資源日益枯竭，在我國的部分地區已難以尋找到桑黃的蹤跡，大部分產區已岌岌可危。人工栽培難度較大，桑黃的開發和利用也因此受到限制。
液體發酵技術、固體培養技術和人工栽培技術是目前獲得桑黃菌絲體和子實體主要的途徑。目前，由於子實體規模化人工栽培技術尚不十分成熟，市場上大多採用液體發酵技術來獲取桑黃子實體或非子實體產物，對活性成分的研究甚少。
技術實現要素：
發明目的：針對現有技術中存在的問題，本發明提供了一種提高桑黃活性成分含量的方法，採用液體發酵的方式，通過對發酵條件進行優化，提高多糖和黃酮的含量。
技術方案：本發明所述的提高桑黃活性成分含量的方法，包括：將桑黃種子液接種於液體培養基中進行發酵，所述的液體培養基中含有碳源和氮源，所述的碳源為麥芽糖，所述的氮源為酵母提取物。
所述麥芽糖在液體培養基中的濃度為2-6％，優選為2-4％，更優選為2％。
所述酵母提取物在液體培養基中的濃度為0.1-0.4％，優選為0.2-0.4％，更優選為0.4％。
發酵時液體培養基中還含有MgSO4·7H2O 0.4-0.6‰，KH2PO4 4.5-5‰。優選的，發酵時液體培養基中還含有MgSO4·7H2O 0.5‰，KH2PO4 4.6‰。
上述濃度是指質量分數。
所述桑黃種子液的製備方法為：將桑黃菌種活化後接種於PDA液體培養基，27-29℃搖床中以150-170r/min培養6-7d。
發酵時，接種量為9-10％。
所述發酵的溫度為27-29℃，搖床轉速為150-170r/min，時間為6-9d。優選的，所述發酵的溫度為28℃，搖床轉速為160r/min，時間為7d。
與現有技術相比，本發明的有益效果為：本發明採用液體發酵的方式，通過對發酵條件進行優化，提高多糖和黃酮的含量。桑黃的生長條件在0.2％麥芽糖為碳源，0.4％酵母提取物為氮源時，多糖和黃酮含量可以獲得較高值。
附圖說明
圖1為實施例2不同碳源百分含量下桑黃多糖、黃酮含量；
圖2為實施例2不同碳源百分含量下桑黃多糖、黃酮的總產量；
圖3為實施例3不同氮源百分含量下桑黃多糖、黃酮含量；
圖4為實施例3不同氮源百分含量下桑黃多糖、黃酮總產量。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡明本發明，應理解這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍，在閱讀了本發明之後，本領域技術人員對本發明的各種等價形式的修改均落於本申請所附權利要求所限定的範圍。
實施例1
桑黃的液體發酵方法，包括：
(1)菌種活化
將桑黃菌種接種在PDA固體培養基上，放置在28℃恆溫培養箱中培養14d，用於液體培養的接種。
(2)桑黃一級種製備
將配置好的PDA液體培養基分裝到三角瓶中，每瓶裝100mL，高壓蒸汽滅菌鍋121℃滅菌30min後使用。在無菌條件下，用直徑為6mm的無菌打孔器在已活化的固體培養基上打孔，挑選8片菌種片放入PDA液體培養基中，接種後將三角瓶放入28℃搖床中以160r/min培養7d，獲得桑黃一級種。
(3)發酵
在超淨工作檯中無菌條件下，使用種子打碎機將發酵生長成的一級菌種打碎，按10％(v/v)的接種量接入用於發酵的液體培養基的三角瓶中，pH自然，放置在搖床中以28℃，轉速160r/min的發酵條件培養7d。
多糖含量的測定方法如下：
多糖的製備：桑黃菌種接種至液體培養基，發酵培養至菌絲球充滿培養基後過濾，用60目篩子濾去培養基，用蒸餾水洗滌，放置在無紡布上60℃乾燥，得幹菌絲體，研磨成粉，稱重。精確稱取0.05g的菌絲體，浸泡於5mL 1mol/L的NaOH溶液中，於100℃水浴提取1小時，所得的提取液即為多糖粗品。
標準曲線的製作：稱取乾燥(恆溫乾燥箱60攝氏度，6小時)至恆重的葡萄糖10mg，放置於100ml的容量瓶，加去離子水定容，即為0.1mg/ml的葡萄糖標準液。精密吸取葡萄糖標準液0mL，0.2mL，0.4mL，0.6mL，0.8mL，1mL，1.2mL，1.4mL，1.6mL分別加入到各具塞試管中，用去離子水補足每管2ml，各管加入1ml的6％苯酚，迅速搖勻。再加入5ml的濃硫酸，放入時不要沿管壁加入，直接添加有利於濃硫酸快速與樣品混合，靜置10分鐘，100℃水浴15分鐘。取出後放置到室溫，在490nm波長處測量各管吸光度。以試管溶液中的糖濃度為橫坐標，各試管分別測得的吸光度為縱坐標，作標準曲線。試劑空白為參比。
桑黃多糖的含量測定：採用苯酚硫酸法測定桑黃多糖的含量。精密稱取桑黃多糖0.02mL，用去離子水補足至2mL即為供試品溶液，加入試劑量和操作方法和標準曲線的製作相同，在分光光度計上測量其吸光度，根據標準曲線，計算多糖含量。
黃酮含量的檢測方法如下：
黃酮的萃取：稱取研磨成粉的桑黃菌絲0.05g，加入5mL70％乙醇，放置在超聲波清洗儀中提取1h，獲得萃取液。
桑黃黃酮的含量測定：定量移取樣品液1mL於25mL容量瓶中，加入30％乙醇補充至10mL，加入5％NaN02 0.2mL搖勻，靜置5分鐘，加入0.2mL 10％A1(N03)3靜置6分鐘後，加2mL 4％NaOH，加入70％乙醇補充至50mL，510nm波長處進行比色測定，試劑空白為參比。
蘆丁/乙醇標準曲線的測定：精密稱取30mg蘆丁，用70％乙醇配製50ml蘆丁標準液。精密吸取蘆丁標準液0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml分別加入到各具塞試管中，各加5％NaNO2溶液0.2mL，搖勻，放置6min；而後各加10％Al(NO3)3溶液0.2mL，搖勻放置6min；然後加4％NaOH溶液2mL，加70％乙醇定容至5mL，於510nm處測吸光度，做標準曲線。計算各樣品的黃酮含量。
實施例2不同百分比的碳源試驗
試驗方法：實施例1的步驟(3)中，液體培養基含不同百分比的碳源(培養基配方為：麥芽糖，酵母提取物2g，蛋白腖2g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO44.6g，去離子水1L)，不同百分比的碳源液體培養基中，麥芽糖的含量分別為0.5％、1％、2％、4％、6％。將配置好的不同百分比的碳源液體培養基分裝到三角瓶中，每瓶100ml，用封口膜封口，再用橡皮筋紮緊。每個百分比做3個重複，高壓蒸汽滅菌鍋121℃下滅菌30min。其他步驟同實施例1，考察碳源對桑黃生物活性(多糖和黃酮)的影響。
試驗結果：
碳源是真菌最重要的營養成分。它是碳水化合物和蛋白質的基本組成元素，又是重要的能量來源，在相同碳源的不同百分比的液體培養基中，麥芽糖的百分含量分別為0.5％、1％、2％、4％、6％。將已接種的培養基以28℃、160r/min培養7d，檢測菌絲體的多糖含量和黃酮含量，結果如圖1、表1。
表1 不同碳源百分含量下桑黃多糖和黃酮含量的差異顯著性
如圖1、表1所示，桑黃菌種在幾個含有不同碳源百分比的培養基中均能生長，但不同碳源對菌絲多糖及黃酮含量的影響有顯著差異。培養基含有2％的麥芽糖時桑黃菌株中的黃酮和多糖含量較高，而在麥芽糖含量為4％和6％時菌絲體中的多糖濃含量較高，但黃酮含量較低。在檢測多糖和黃酮含量的同時，對多糖和黃酮的總產量也進行了計算，如圖2、表2。
表2 不同碳源百分含量下桑黃多糖和黃酮總產量的差異顯著性
如圖2、表2所示，麥芽糖含量在2％時，多糖和黃酮的總產量較高，在4％和6％含量下多糖含量雖然高，但是黃酮總產量較2％時要低，所以認為，選取2％碳源含量為培養桑黃的最佳碳源百分含量。
實施例3不同百分比的氮源試驗
試驗方法：實施例1的步驟(3)中，液體培養基含不同百分比的氮源(培養基配方為：麥芽糖20g，酵母提取物，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO4 4.6g，去離子水1L)，在不同百分比的氮源液體培養基中，酵母提取物的百分含量分別為0.1％、0.2％、0.4％、0.8％、1.2％。將配置好的不同百分比的氮源液體培養基分裝到三角瓶中，每瓶100ml，用封口膜封口，再用橡皮筋紮緊。每個百分比做3個重複。高壓蒸汽滅菌鍋121℃滅菌30min。其他步驟同實施例1，考察氮源對桑黃生物活性(多糖和黃酮)的影響。
試驗結果：
氮源主要是指成分中含有較多氮的物質，主要用以真菌合成蛋白質、胺基酸等物質。大部分真菌可以有效地利用有機氮為自身提供營養。氮元素對桑黃的生長有益處。在相同氮源的不同百分含量的培養基中，酵母提取物的百分含量分別為0.1％、0.2％、0.4％、0.8％、1.2％。用相同條件培養桑黃菌種，對獲得的菌絲球進行多糖和黃酮含量測定，結果如圖3、表3。
表3 不同氮源百分含量下桑黃多糖和黃酮含量的差異顯著性
從圖3、表3中可以看出，在酵母提取物含量在0.2％和0.4％時，多糖和黃酮含量較高，較之其他氮源含量有顯著差異。為了對比得出氮源濃度的優劣，對多糖和黃酮的總產量也進行了計算，結果如圖4、表4。
表4 不同氮源百分含量下桑黃多糖和黃酮總產量的差異顯著性
如圖4，表4所示，可以看出氮源百分含量在0.4％時，桑黃多糖和黃酮的總產量均高於其他百分比，所以，選擇0.4％作為桑黃髮酵的最適氮源。
在培養溫度為28℃、搖床轉速為160r/min、發酵時間為7d的條件下，以桑黃菌絲多糖和黃酮含量為指標，研究得出，2％麥芽糖為碳源最適百分比，0.4％酵母提取物為氮源最適百分比，多糖和黃酮的含量可以達到較高值。